JPS63221246A

JPS63221246A - 乾式免疫分析要素

Info

Publication number: JPS63221246A
Application number: JP62054635A
Authority: JP
Inventors: Yukio Sudo; 幸夫須藤
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1987-03-10
Filing date: 1987-03-10
Publication date: 1988-09-14
Also published as: DE3807756A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の分野］本発明は抗原／抗体反応を利用する免疫学的分析に有用
な分析要素に関する。

［従来技術］乾式分析要素を用いて体液などに含有されている生化学
物質を定量する分析方法が知られている（例えば特開昭
４９−５３８８８号、同５５−１６４３５６号、同５９
−１０２３８８号）、乾式分析要素では一般に、被検成
分と分析要素内に含まれる試薬との反応の反応生成物ま
たは未反応成分の量を、光学的に、例えば発色、変色、
蛍光、発光等の分光測光により測定し、被検成分を定量
する。乾式分析要素を用いると、簡便、迅速に、しかも
高い精度で液体中の特定成分、例えば生化学的活性物質
の分析ができる。

乾式分析要素を利用した免疫学的分析も、例えば特開昭
４９−５３８８８号、特開昭５９−１０２３８８号、米
国特許４，４５９．３５８号等の記載により知られてい
る。

免疫学における抗原抗体反応は互いに対応する抗原また
は抗体のみに特異的に反応し結合する反応であり、自己
免疫疾患の診断、生体内微量物質の検出などに広く利用
されている。しかし操作に熟練を要するため、臨床検査
のためには簡便な操作で精度良く測定できる方法が望ま
れている。

多層分析要素を利用した簡便な抗原量測定法の一つの典
型は特開昭５９−７７３５６号に開示されたものである
。この方法で用いている分析要素は、蛍光標識抗原を含
む展開層と、多孔性媒体から成る分配層と、固定化抗体
を含む反応層を積層したもので、被検液中の抗原と標識
抗原との間での競争的な抗原抗体反応を利用し、抗原の
量が蛍光強度の減少として測定される。

また検出感度の比較的高い免疫分析法として、酵素免疫
分析（ＥＩＡ）が考えられている。典型的な方法は特公
昭５３−２７７６３号によって知られ、酵素を抗原また
はその誘導体に結合させて、酵素標識抗原をつくり、酵
素活性に対する抗原の効果の測定により、被検液中の抗
原を分析する方法である。この方法では、抗体と結合し
た酵素標識抗原（Ｂで示される）と未結合の酵素標識抗
原（Ｆで示される）とを分離する（いわゆるＢ／Ｆ分Ｍ
）か、ＢとＦとで活性が変化する酵素系が必要とされる
。

これらの系を成立させるためには、抗体と標識抗原、ま
たは抗体標識物と抗原誘導体の、いずれかの二成分が必
須であり、検体との接触前にはこれらの二成分が互いに
反応しないようにしておかないと、検出感度（信号／背
景比）が著しく低下する。これまで知られた乾式分析要
素の多くは、この要因のために、満足すべき分析感度を
得ることができなかった。

［発明の目的］本発明の目的は、高い分析感度と定量分析精度を有する
、乾式免疫学的分析要素およびその製造方法の提供にあ
る。

［発明の構成コ本発明の上記目的の第一は、一体化された少なくとも２
つの水浸透性層から成り、該層の一つは多孔性層、他の
一つは試薬層であり、試薬層は多孔性層の液体を受容す
る面と反対側に位置しており、抗原／抗体反応に関与す
る成分を水浸透性層に含む酵素活性測定用乾式分析要素
であって、上記抗原／抗体反応に関与する成分の一つは
標識抗原、他の一つは非標識および標識抗原に対する抗
体であり、被検液が接触するまで、前記抗体の実質的に
全部が多孔性層に含まれ、前記標識抗原の実質的に全部
が試薬層に含まれることを特徴とする乾式分析要素によ
って達成された。

上記目的の第二は、一体化された少なくとも２つの水浸
透性層から成り、水浸透性の多孔性層と試薬層を少なく
とも有し、試薬層は該多孔性層の液体を受容する面と反
対側に位置しており、抗原／抗体反応に関与する成分を
水浸透性層に含む酵素活性測定用乾式分析要素を製造す
るに際し、前記標識抗原を含む試薬層の上に多孔性層を
設けた後、前記抗体を含み試薬層中の標識抗原を溶解ま
たは可溶化しない組成物を該多孔性層に塗布または含浸
することによって達成された。

上記目的の第二はまた、上記分析要素を製造するに際し
、前記標識抗原を含む試薬層の上に、前記抗体を含む組
成物を予め塗布または含浸した多孔性層を設けることに
より、達成された。

特に、標識抗原を含み親水性高分子を結合剤とする試薬
層を塗布等により設け、その上に多孔性層を設けた後、
前記抗体を含み試薬層の親水性高分子を膨潤させない組
成物を多孔性層に塗布または含浸する方法は、有用な方
法の一つである。試薬層の親水性高分子を膨潤さすない
組成物としては、例えばアルコール類、エーテル類、ケ
トン類のような有機溶媒の溶液が有用である０例えばエ
タノール、メタノール、アセトン、エチルセロソルブ等
が利用できる。

また、標識抗原を含む多孔性試薬層の上に、抗体を予め
含浸、塗布等により含有した多孔性層を、例えば特開昭
６１−４９５９号等のような方法で接着させる方法も有
用である。

多孔性層への含浸または塗布には公知の方法を利用でき
る。塗布には例えばディップ塗布、ドクター塗布、ホッ
パー塗布、カーテン塗布等を適宜選択して用いる。

本発明における多孔性層は、分析要素の最上層であって
もよいし、最上層と試薬層の間にある層でもよい。供給
される液体の量にほぼ比例した面積に液体を展開する、
いわゆる計量作用を有する液体展開層（以下、展開層と
いうことがある）であってもよいし、それ以外でもよい
。繊維質であってもよいし、非繊維質でもよい、天然繊
維がち成る布、合成または半合成繊維から成る布、不織
布、紙、酢酸セルロース等から成るメンブランフィルタ
−１！！ｌｉ機物または有機物粒子の結合体等のいずれ
でもよい、Ｉｆｆえば特開昭５５−１６４３５６号、同
６０−２２２７６９号等に記載された繊！！質層のほか
、特開昭４９−５３８８８号、特開昭５８−７０１６３
号、同６１−４９５９号、特願昭６０−２５６４０８号
、同６０−２７９８５９号、同６０−２７９８６０号、
同６０−２７９８６１号等に記載されたような多孔性層
も好適である。

抗原を蛍光標識するためには種々の蛍光物質を用いるこ
とができる。それらは官能成分により分類することがで
きるが、例えばアミノ基を有する蛍光物質として１−アミノナフタレン２−アミノナフタレンｐ、ｐ’−ジアミノスチルベン２−アミノアクリジンｐ、ｐ’−ジアミノベンゾフェノンイミン類ビス−３−
アミンピリジニウム塩インドール票フェノール性蛍光物質として７−ヒドロキシクマリン類３．６−シヒドロキシキサンテン頚ステロフェール類デトラサイクリンサリチル酸エステル項等が挙げられる０代表的なものは、フルオレセインであ
る。

抗原は発光物質、例えば化学発光物質で標識されてもよ
い０例えば、ルミノールで代表される２）３−ジヒドロ
−１，４−フタラジンジオン、あるいは２．４．５−）
リフェニルイミダゾール類を用いることができる。

抗原を酵素標識する場合、種々の酵素を用いることがで
きる。充分高い酵素活性が得られること、酵素の安定性
、酵素活性への結合の影響等を考慮して、酵素が選択さ
れる。特表昭５６−５００９０１号明細嘗の第１表およ
び第２表に記載されたものから選ぶことができる。代表
的なものはグルコースオキシダーゼ（Ｇ○［））、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ＞、
アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、α−アミラーゼ
、ルシフェラーゼ等である。

抗原に標識を結合させる方法および本発明に用いること
ができる標識抗原については、石川栄治ら：「酵素免疫
測定法（第２版）Ｊ（１９８２年）河合忠編：「臨床検
査技術全書４免疫血清検査」（医学書院、１９７７年発
行）、９７−１０２頁、Ｂ　１ｏｅｈｅ＋ｍ、　Ｂ　１
ｏｐｌ＋ｙｓ、Ｒｅｓ、ｃ　ｏａ＋＋ｓｕｎ、　、７４
，５３８（１９７７）、Ｃ１１ｎｉｃａ　Ｃｌ＋ｉ＋＊
ｉｃａ　Ａｃｔａ　、８３，１６１（１９７８）等の記
載が参照できる。

ｒｓ抗原の具体例としてフルオレセインインチオシアネ
ート結ｈチロキシンＦＩＴＣＴ４゜ＧＯＤ結合ヒＩ・免
疫グロブリン（ＩｇＧ）、ＡＬＰ結合ＩｇＧ、ＰＯＤＰ
！Ａ！α−フェトプロティン等がある。

本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することが出
来る。要素は多孔性層、試薬層のほが、支持体、展開層
、検出層、光遮蔽層、接側りろ過層、吸水層、下塗り層
その他の層を含む多重層の構成を有してもよい、かよう
な分析要素として、米国特許第３．９９２．１５８号、
同４，０４２，３３５号および特開昭５５−１６４３５
６号各明細書に開示されたものがある。

光透過性水不透過性支持体を用いる場合、本発明の乾式
分析要素の実用的に採りうる構成は（１）支持体上に試
薬層、その上に展開層を有するもの。

（２）支持体上に検出層、試薬層、展開層をこの順に有
するもの。

（３）支持体上に試薬層、光反射層、展開層をこの順に
有するもの。

（４）支持体上に検出層、試薬層、光反射層、展開層を
この順に有するもの。

（５）支持体上に検出層、光反射層、試薬層、展開層を
この順に有するもの。

（６）支持体上に第二試薬層、光反射層、第一試薬層、
展開層をこの順に有するもの。

（７）支持体、上に検出層、第二試薬層、光反射層、第
一試薬層、展開層をこの順に有するもの。

上記（１）ないしく５）において試薬層は異なる複数の
層から成ってもよい、支持体と試薬層または検出層との
間には吸水層を設けてもよい、上記（１）ないしく３）
と（６）において試薬層と検出層または展開層の間にろ
過層を設けてもよい。

上記（３）ないしく７）において光反射層と検出層、試
薬層または展開層との間、試薬層と検出層との間または
試薬層と展ｒｍＭＩの間に、さらにろ過層を設けてもよ
い、試薬層が複数層から成る場合に、試薬層と試薬層の
間にさらにろ過層を設けてもよい。

本発明の乾式分析要素の試薬層としては、親水性ポリマ
ーを結合剤とする実質的に均一の層のほか、例えば特開
昭５８−７０１６３号、特開昭６１−４９５９号、特願
昭６０−２５６４０８号、同６０−２７９８５９号、同
６０−２７９８５９号、同６０−２７９８６１号等に記
載されたような多孔性層も好適である。Ｎｉ水性ポリマ
ーとして例えば、ゼラチンおよびこれらの誘導体く例え
ばフタル化ゼラチン〉、セルロース誘導体（ｒＩＡえば
ヒドロキシメチルセルロース）、アガロース、アクリル
アミド重合体、メタアクリルアミド重合体、アクリルア
ミドまたはメタアクリルアミドと各種ビニル性モノマー
との共重合体等が利用できる。

試薬層には必要に応じ酵素に対する基質、酸化剤、カプ
ラー、Ｈ衝剤等を含有させることができる。試薬層に酵
素標識抗原を含む場合には、当該酵素に対する基質が必
要とされる。

本発明の分析要素の試薬層に含有させることができる緩
衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やＢｉｏ
ｃｂｅｍｉｓＬｒｙ誌　第５巻　第２号、４６７ページ
より４７７ページ（１９６６年）に記載されているグツ
ド（Ｇｏｏｄ　）の！８剤などを挙げることができる。

これらの緩衝剤はｒ蛋白質・酵素の基礎実験法Ｊ（堀尾
武−ほか著、南江堂、１９８１年）、前記Ｂｉｏｃｈｅ
＋＊１ｓＬｒｙ誌第５巻等の文献を参考にして選択する
ことができる。

多孔性層を展開層として利用する場合、液体計量作用を
有する層であることが好ましい、液体計量作用とは、そ
の表面に点着供給された？ｌＩ体試料を、その中に含有
している成分を実質的に偏在させることなく、面の方向
に単位面積当りほぼ一定量の割なで広げる作用である。

展開層その他の多孔性層を構成する材料としては、１紙
、不織布、織物生地〈例えば平織生地）、編物生地（例
えば、トリコット＃ｉ）、ガラス繊維ｒ紙等を用いるこ
とができる。展開層としては、これらのうち織物、編物
等が好ましい、織物等は特開昭５７−６６３５９号に記
載されたようなグロー放；処理をしてもよい。展開層に
は、ＲＲ凹面積展開速度等を調節するため、１キ開昭６
０−２２２７７０号、特願昭６１−１２２８７５号、６
１−１２２８７６号、６　］−−１４３７５４号に記載
したような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有して
もよい。

多孔性層を接着し積層するための接着層を、試薬層、光
道へい層、８１過層、吸水層、検出層等の層の上に設け
てもよい、接着層は水で１５ｊ潤したときに多孔性層を
接着することができるような親水性ポリマー、例えばゼ
ラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等
からなることが好ましい。

光遮蔽層は、検出層、試薬層等に生じた検出可能な変化
（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反
射測光する際に、展開層に点着供給された被検液の色、
特に試料が全血である場会のヘモグロビンの赤色等を遮
蔽するとともに光反射層または背景層として機能する。

光遮蔽層は、皮膜形成能を有する親水性ポリマーをバイ
ンダーとして、酸化チタン、硫酸バリウム等の光反射性
微粒子が分散された水浸透性の層であることが好ましい
。バインダーとしてはゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリ
アクリルアミド等が好ましい０分析要素には、光遮蔽層
を設ける代わりに、またはそれと同時に、展ｒＭ層、試
薬層、検出層等に酸化チタン等の光反射粒子を含有させ
てもよい。

Ｃ実施例］　（７４測定用多層免疫一体型要素）〔１〕
フルオレセイン標識チロキシンの合成特開昭５９−１７
０７６８に記載されている手法により、フルオレセイン
標識チロキシン（以下ＦＩＴＣ−Ｔ、）を合成した。

〔２〕抗チロキシン抗血清の分散液の調製下記の処方の
液をホモジナイザーで１時間分散し、抗チロキシン抗血
清分散液を調製した。

抗チロキシン抗血清　　　　　　　１ｉ＋１（凍結乾燥
粉末として）ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（＊）　　０．２Ｈアセトン　
　　　　　　　　　　１００ｇ＊　ｒｌ＝　１５Ｃ３）　多Ｒシー　トノｌｉｌ：ｖＡゼラチン下塗りされている厚さ１８０μ屑のポリエチレ
ンテレフタレート無色透明平滑フィルム上に下記の組成
（ａ）の水溶液を乾燥後の厚さが２μｌになるように塗
布し、０２燥した（試薬層）（ａ）　　ゼラチン　　　
　　　　１０ｇ水　　　　　　　　　　　　１９０ｇホルマリン　　　　　０．２ＦＩＦＩＴＣ−７，１２０μｇさらに上記試薬層の上に乾燥後の厚さが約２μｌになる
ようにゼラチンを塗布し、タイミング層とした。

上記タイミング層を約３０ｇ／ｚ”の水で湿らせた後、
ポリエチレンテレフタレート紡績紙（３６ゲージ、５０
Ｄ）からなるトリコット編物を圧着し、乾燥されて展開
層とした。

上記展開層に下記の組成（Ｌ＋）の塗布液を１２０　ｃ
ｃ／ｘ”の割合で塗布、乾燥し、ＴＪＩ定ｍ一体型多層
分析要素（１）を作製した。

＜ｂ＞抗チロキシン抗血清分散液　　　５Ｎポリビニル
ピロリドン　　　　２５ｇノニルフェノキシポリエトキシエタノール（＊）　　０．２１ＦＩメチル
アルコール　　　　　５００ｄ＊ｎ＝１５また、塗布液（ｂ　）の組成を下記（ｃ）に変えた以外
は全く同様にしてＴ、ｉ走用一体型多層分析要素（２）
を作製した。

（Ｃ）抗チロキシン抗血清分散液　　　５ｚ／ポリビニ
ルとロリドン　　　　２５ｙノニルフエノキシポリエトキシエタノール（＊）　　０．２ｘｆｌ水　　
　　　　　　　　　　　　　５００ｚｆ〔４〕チロキシ
ン（Ｔ、）り）測定血清を活性炭で処理してＴ４フリー血清を得、これに既
知量のチロキシンを添加して得た種々の濃度のカリブレ
ーション用チロキシン（Ｔ、）含有血清１０μ！に０．３Ｍグリ　シン′−Ｎ　ａ　ＣＲ−Ｎ　ａ　ＯＨ１
ｉｉ衝ン１　５μｍとブロッカ−試薬（ドデシルナフタ
レスルホン酸ナトリウム）０．１Ｍ水溶液５μｌを加え
た混合物２０μｌを各多層分析要素の展開層に滴下した
。

２５℃で３０分放置した後ポリエチレンテレフタレート
フィルム側から反射蛍光を測定した０反射蛍光の測定に
は日立製作所製蛍光光度Ｚｔ　６５０−１０　（Ｓ）を
用い、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２５ｎｍで測定
を実施した。

得られた検量線は第１図に示す通りである。

第１図より分析要素（１）は分析要素（２）に較べて著
しく性能が良いことがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の免疫分析要素の蛍光測定により得ら
れたＴ、の検ｌ線である。出願人　　富士写真フィルム株式会社第１図Ｔ４（μｇ／ｊｆ）手続補正書昭和６３年３月２５日

Claims

【特許請求の範囲】１）一体化された少なくとも２つの水浸透性層から成り
、該層の一つは多孔性層、他の一つは試薬層であり、試
薬層は多孔性層の液体を受容する面と反対側に位置して
おり、抗原／抗体反応に関与する成分を水浸透性層に含
む乾式免疫分析要素であって、上記抗原／抗体反応に関与する成分の一つは標識抗原、
他の一つは非標識および標識抗原に対する抗体であり、
前記抗体の実質的に全部が多孔性層に含まれ、前記標識
抗原の実質的に全部が試薬層に含まれることを特徴とす
る乾式免疫分析要素。２）特許請求の範囲１）において多孔性層が液体展開層
であることを特徴とする分析要素。３）一体化された少なくとも２つの水浸透性層から成り
、該層の一つは多孔性層、他の一つは試薬層であり、試
薬層は多孔性層の液体を受容する面と反対側に位置して
おり、抗原／抗体反応に関与する成分を水浸透性層に含
む乾式免疫分析要素の製造方法であって、前記標識抗原を含む試薬層の上に多孔性層を設けた後、
前記抗体を含み試薬層中の標識抗原を溶解または可溶化
しない組成物を多孔性層に塗布または含浸することを特
徴とする方法。４）特許請求の範囲３）において多孔性層が液体展開層
であることが特徴である方法。５）一体化された少なくとも２つの水浸透性層から成り
、該層の一つは多孔性層、他の一つは試薬層であり、試
薬層は多孔性層の液体を受容する面と反対側に位置して
おり、抗原／抗体反応に関与する成分を水浸透性層に含
む乾式免疫分析要素の製造方法であって、前記標識抗原を含む試薬層の上に、前記抗体を含む組成
物を予め塗布または含浸した多孔性層を設けることを特
徴とする方法。６）特許請求の範囲５）において多孔性層が液体展開層
であることが特徴である方法。