JPH01237455A - 乾式免疫分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は抗原／抗体反応を利用する免疫学的分析に有用
な分析要素に関する。

［従来技術］ 乾式分析要素を用いて体液などに含有されている生化学
物質を定量する分析方法が知られている（例えば特開昭
４９−５３８８８号、同５５−１、６４３５６号、同５
９−１０２３８８号）。乾式分析要素では一般に、被検
成分と分析要素内に含まれる試薬との反応の反応生成物
または未反応成分の量を、光学的に、例えば発色、変色
、蛍光、発光等の分光測光により測定し、被検成分を定
量する。乾式分析要素を用いると、簡便、迅速に、しか
も高い精度で液体中の特定成分、例えば生化学的活性物
質の分析ができる。

乾式分析要素を利用した免疫学的分析も、例えば特開昭
４９−５３８８８号、特開昭５９−１０２３８８号、米
国特許４，４５９．３５８号等の記載により知られてい
る。

免疫学における抗原抗体反応は互いに対応する抗原また
は抗体のみに特異的に反応し結合する反応であり、自己
免疫疾患の診断、生体内微量物質の検出などに広く利用
されている。しかし操作に熟練を要するため、臨床検査
のためには簡便な操作で精度良く測定できる方法が望ま
れている。

多層分析要素を利用した簡便な抗原量測定法の一つの典
型は特開昭５９−７７３５６号に開示されたものである
。この方法で用いている分析要素は、蛍光標識抗原を含
む展開層と、多孔性媒体から成る分配層と、固定化抗体
を含む反応層を積層したちのて、被検液中の抗原と標識
抗原との間での競争的な抗原抗体反応を利用し、抗原の
量が蛍光強度の減少として測定される。

また検出感度の比較的高い免疫分析法として、酵素免疫
分析（ＥＩＡ）が考えられている。典型的な方法は特公
昭５３−２７７６３号によって知られ、酵素を抗原また
はその誘導体に結合させて、酵素標識抗原をつくり、酵
素活性に対する抗原の効果の測定により、被検液中の抗
原を分析する方法である。この方法では、抗体と結合し
た酵素標識抗原（Ｂで示される）と未結合の酵素標識抗
原（Ｆで示される）とを分離する（いわゆるＢ／Ｆ分離
）か、ＢとＦとで活性が変化する酵素系が必要とされる
。

これらの系を成立させるためには、抗体と標識抗原、ま
たは抗体標識物と抗原誘導体の、いずれかの二成分が必
須であり、検体との接触前にはこれらの二成分が互いに
反応しないようにしておかないと、検出感度（信号／背
景比）が著しく低下する。これまで知られた乾式分析要
素の多くは、この要因のために、満足すべき分析感度を
得ることがてきなかった。

［発明の目的］ 本発明の目的は、高い分析感度と定量分析精度を有する
、乾式免疫学的分析要素およびその製造方法の提供にあ
る。

［発明の構成］ 本発明の上記目的の第一は、一体化された少なくとも２
つの水浸透性層から成り、水浸透性層のうち少なくとも
一つが多孔性層であり、抗原／抗体反応に関与する成分
を前記水浸透性層に含む乾式免疫分析要素であって、上
記抗原／抗体反応に関与する成分の一つは標識抗原、他
の一つは非標識および標識抗原に対する抗体であり、被
検液が接触するまで、前記標識抗原が多孔性層に含まれ
、この多孔性層は抗体を実質的に含まず、前記抗体は前
記多孔性層より分析要素の液体を受容する面から遠くに
位置する第２の水浸透性層に含まれ、この層は標識抗原
を実質的に含まないことを特徴とする乾式分析要素によ
って達成された。

上記目的の第二は、一体化された少なくとも２つの水浸
透性層から成り、該層の一つは多孔性層であり、抗原／
抗体反応に関与する成分として、標識抗原と、非標識お
よび標識抗原に対する抗体とを水浸透性層に含む乾式免
疫分析要素の製造に際し、抗体を含む水浸透性層の上に
多孔性層を設けた後、前記標識抗原を含み、前記水浸透
性層中の抗体を溶解または可溶化しない組成物を、該多
孔性層に塗布または含浸することによって達成された。

上記目的の第二はまた、上記分析要素を製造するに際し
、前記抗体を含む水浸透性層の上に、前記標識抗原を含
む組成物を予め塗布または含浸した多孔性層を設けるこ
とにより、達成された。

特に、抗体を含み親水性高分子を結合剤とする水浸透性
層を塗布等により設け、その上に多孔性層を設けた後、
前記標識抗原を含み親水性高分子を膨潤させない組成物
を多孔性層に塗布または含浸する方法は、有用な方法の
一つである。親水性高分子を膨潤させない組成物として
は、例えば低級アルコール類、エーテル類、ケトン類、
低沸点エステル類のような有機溶媒の溶液が有用である
。

例えばエタノール、メタノール、アセトン、エチルセロ
ソルブ等が利用できる。

また抗体を含む多孔性層の上に、標識抗原を予め含浸、
塗布等により含有した多孔性層を、例えば特開昭６１−
４９５９号等のような方法で接着させる方法も有用であ
る。

多孔性層への含浸または塗布には公知の方法を利用でき
る。塗布には例えばデイツプ塗布、ドクター塗布、ホッ
パー塗布、カーテン塗布等を適宜選択して用いる。

本発明における多孔性層は、分析要素の最上層であって
もよいし、最上層と他の水浸透性層の間にある層でもよ
い。供給される液体の量にほぼ比例しな面積に液体を展
開する、いわゆる計量作用を有する液体展開層（以下、
展開層ということがある）であってもよいし、それ以外
でもよい。繊維質であってもよいし、非繊維質でもよい
。天然繊維から成る布、合成または半合成繊維から成る
布、不織布、紙、酢酸セルロース等から成るメンブラン
フィルタ−１無機物または有機物粒子の結合体等のいず
れでもよい。例えば、特開昭５５−１８４３５６号、同
６０−２２２７６９号等に記載された繊維質層のほか、
特開昭４９−５３８８８号、特開昭５８−７０１６３号
、同６１−４９５９号、特願昭６０−２５６４０８号、
同６０−２７９８５９号、同６０−２７９８６０号、同
６０−２７９８６１号等に記載されたような多孔性層も
好適である。

抗原を蛍光標識するなめには種々の蛍光物質を一７＝ 用いることができる。それらは官能成分により分類する
ことができるが、例えばアミン基を有する蛍光物質とし
て １−アミノナフタレン ２−アミノナフタレン ｐ、ｐ’−ジアミノスチルベン ２−アミノアクリジン ｐ、ｐ’−ジアミノベンゾフェノンイミン類ビス−３−
アミノピリジニウム塩 インドール類 フェノール性蛍光物質として ７−ヒドロキシクマリン類 ３．６−ジヒドロキシキサンテン類 テトラサイクリン サリチル酸エステル類 等が挙げられる。代表的なものはフルオレセインである
。

抗原は発光物質、例えば化学発光物質で標識されてもよ
い。例えば、ルミノールで代表される２）３−ジヒドロ
−１，４−フタラジンジオン、あるいは２．４．５−　
）リフェニルイミダゾール類を用いることができる。

抗原を酵素標識する場合、種々の酵素を用いることがで
きる。充分高い酵素活性が得られること、酵素の安定性
、酵素活性への結合の影響等を考慮して、酵素が選択さ
れる。特表昭５６−５００９０１号明細書の第１表およ
び第２表に記載されたものから選ぶことができる。代表
的なものはグルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ア
ルカリ性ホスファターゼ（Ａ　Ｌ　Ｐ　）、α−アミラ
ーゼ、ルシフェラーゼ等である。

抗原に標識を結合させる方法および本発明に用いること
ができる標識抗原については、石川栄治ら＝［酵素免疫
測定法（第２版）Ｊ（１９８２年）河合忠編：［臨床検
査技術全書４免疫血清検査」（医学書院、１９７７年発
行）、９７−１０２頁、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、Ｂ　１ｏｐ
ｈｙｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍｕｎ、、７４，５３８（１９
７７）、Ｃｌ１ｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　
、８３，１６１（１９７８）等の記載が参照できる。

標識抗原の具体例としてフルオレセインイソチオシアネ
ート結合チロキシンＦ　Ｉ　ＴＣ−Ｔ４゜ＧＯＤ結合ヒ
ト免疫グロブリン（ＩｇＧ）、Ａ　Ｉ−Ｐ結合ＩｇＧ、
ＰＯＤ標識α−フェトプロティン等がある。

本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することが出
来る。要素は多孔性層、試薬層のほか、支持体、展開層
、検出層、光遮蔽層、接着層、ろ過層、吸水層、下塗り
層その他の層を含む多重層の構成を有してもよい。かよ
うな分析要素として例えば米国特許第３，９９２，１５
８号、同４，０４２，３３５号、特開昭５５−１．６４
３５６号、特開昭６２−１３８７５６号、同６２−１３
８７５７号、同６２−１３８７５８号各明細書に開示さ
れたものがある。

光透過性水不透過性支持体を用いる場合、本発明の乾式
分析要素の実用的に採りうる構成は（１）支持体上に試
薬層、その上に展開層を有するもの。

（２）支持体上に検出層、試薬層、展開層をこの順に有
するもの。

（３）支持体上に試薬層、光反射層、展開層をこの順に
有するもの。

（４）支持体上に検出層、試薬層、光反射層、展開層を
この順に有するもの。

（５）支持体上に検出層、光反射層、試薬層、展開層を
この順に有するもの。

く６）支持体上に第二試薬層、光反射層、第一試薬層、
展開層をこの順に有するもの。

（７）支持体上に検出層、第二試薬層、光反射層、第一
試薬層、展開層をこの順に有するもの。

検出層は一般に被検成分の存在下で生成した色素等が拡
散し、光透過性支持体を通して光学的に検出され得る層
て、親水性ポリマーにより構成することかてきる。色素
に対する媒染剤、例えばアニオン性色素に対してカチオ
ン性ポリマーを、含んでもよい。

上記（１）ないしく５）において試薬層は異なる複数の
層から成ってもよい。支持体と試薬層または検出層との
間には吸水層を設けてもよい。吸水層は一般に、被検成
分の存在下で生成する色素＝１１− が実質的に拡散しないような層を言い、膨潤しやすい親
水性ポリマーにより構成することができる。

」二記（１）ないしく３）、（６）において試薬層と検
出層または展開層の間にろ過層を設けてもよい。上記（
３）ないしく７）において光反射層と検出層、試薬層ま
たは展開層との間、試薬層と検出層との間または試薬層
と展開層の間に、さらにろ過層を設けてもよい。試薬層
が複数層から成る場合に、試薬層と試薬層の間にろ過層
を設けてもよい。

酵素標識抗原を用いる場合、抗原／抗体反応の結果を測
定するために、酵素活性の測定を必要とし、酵素の基質
、酵素反応生成物の検出系が必要とされる。基質は標識
抗原と同一の層中に存在してもよいが、異なる層の中に
含まれるのが好ましい。基質または酵素標識抗原の少な
くとも一方を、酵素標識抗原の酵素反応が実質的に起こ
らない溶媒を用いて塗布または含浸することが好ましい
。

基質と酵素反応生成物の検出系とは、同一層中に存在し
てもよく、また異なる層の中に含まれてもよい。基質が
自己顕色性基質である場合には、酵素反応生成物の検出
系は特に必要としない。

酵素標識抗原を用いる場合に酵素反応生成物を検出する
ための試薬組成物は、標識抗原を含む層に含まれてもよ
いが、別の無孔性層または多孔性層に含有させてもよい
。例えば酵素反応生成物との反応により中間体を生成す
る組成物を第１の試薬層に、中間体と反応して染料等を
生成し得る組成物（指示薬）を第１の試薬層と支持体と
の間にある第２の試薬層に含んでもよい。また前記の中
間体を生成する組成物を試薬層より支持体から遠い層、
例えば光反射層等に含み、指示薬を試薬層に含んてもよ
い。

本発明の乾式分析要素の試薬層としては、親水性ポリマ
ーを結合剤とする実質的に均一の層のほか、例えば特開
昭５８−７０１６３号、特開昭６１、−４９５９号、特
開昭６２’−１１，６２５８号、特開昭６２−１．２８
７５６号、６２−１．３８７５７号、同６２１．３８７
５８号等に記載されたような多孔性層も好適である。親
水性ポリマーとして例えば、ゼラチンおよびこれらの誘
導体く例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（
例えばヒドロキシエチルセルロース）、アガロース、ア
クリルアミド重合体、メタアクリルアミド重合体、アク
リルアミドまたはメタアクリルアミドと各種ビニル性モ
ノマーとの共重合体等が利用できる。

試薬層には必要に応じ酵素に対する基質、酸化剤、カプ
ラー、緩衝剤等を含有させることができる。試薬層に酵
素標識抗原を含む場合には、当該酵素に対する基質が必
要とされる。

本発明の分析要素の試薬層に含有させることができる緩
衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌　第５巻　第２号、４６７ページ
より４７７ページ（１９６６年）に記載されているグツ
ド（Ｇｏｏｄ　）の緩衝剤などを挙げることができる。

これらの緩衝剤はｒ蛋白質・酵素の基礎実験法Ｊ（堀尾
武−ほか著、南江堂、１９８１年）、前記Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ誌第５巻等の文献を参考にして選択するこ
とができる。

多孔性層を展開層として利用する場合、液体計量作用を
有する層であることが好ましい。液体計量作用とは、そ
の表面に点着供給された液体試料を、その中に含有して
いる成分を実質的に偏在させることなく、面の方向に単
位面積当りほぼ一定量の割合で広げる作用である。

展開層その他の多孔性層を構成する材料としては、濾紙
、不織布、織物生地（例えば平織生地）、編物生地（例
えば、トリコット編）、ガラス繊維濾紙等を用いること
ができる。展開層としては、これらのうち織物、編物等
が好ましい。織物等は特開昭５７−６６３５９号に記載
されたようなグロー放電処理をしてもよい。展開層には
、展開面積、展開速度等を調節するため、特開昭６０−
２２２７７０号、特願昭６１−１２２８７５号、６１−
１２２８７６号、６１−１４３７５４号に記載したよう
な親水性高分子あるいは界面活性剤を含有してもよい。

多孔性層を接着し積層するための接着層を、試薬層、光
道へい層、沢過層、吸水層、検出層等の層の上に設けて
もよい。接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着す
ることができるような親水性ポリマー、例えばゼラチン
、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等からな
ることが好ましい。

光反射層は、検出層、試薬層等に生じた検出可能な変化
（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反
射測光する際に、展開層に点着供給された被検液の色、
特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等を遮
蔽するとともに背景層として機能する。光反射層として
、親水性ポリマーをバインダーとして、酸化チタン、硫
酸バリウム等の光反射性微粒子が分散された水浸透性の
層は好適である。バインダーとしてはゼラチン、ゼラチ
ン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。分析要素
には、光反射層を設ける代わりに、またはそれと同時に
、展開層、試薬層、検出層等に酸化チタン等の光反射粒
子を含有させてもよい。

［実施例１］ （１）フルオレセイン標識チロキシンの合成特開昭５９
−１７０７６８に記載されている手法により、フルオレ
セイン標識チロキシン（以下ＦＩＴＣＴ４と略記）を合
成した。

（２）抗血清含有シートの作製 ゼラチン下塗りされている厚さ１８０μｍのポリエチレ
ンテレフタレート無色透明平滑フィルム上に下記の組成
（ａ）の水溶液を乾燥後の厚さが２μｍになるように塗
布し、乾燥したく吸水層）（ａ）　　ゼラチン　　　　
　　　１０ｇ水　　　　　　　　　　　　１９０Ｉ？ホ
ルマリン　　　　　　　０．２ｇ 上記吸水層を２０ｇ／ｘ２の水で湿らせた後、ミクロフ
ィルターＦＭ３００　（富士写真フィルム社製）を圧着
した。

これに下記の組成（ｂ）の塗布液を１００ＣＣ／ＩＩ２
の割合で塗布乾燥し、抗血清含有シート［１］とした。

（ｂ）　　抗チロキシン抗血清 ノニルフェノキシポリ エトキシエタノール　　０．０４１ｆ 水　　　　　　　　　　　　　　　１０Ｃ１＋ｙ（３）
ＦＩＴＣ−Ｔ４含有シートの作製ポリエチレンテレフタ
レート紡績糸（３６ゲージ、５０Ｄ）からなるＩ・リコ
ット編物を、下記組成（Ｃ）の液に浸漬後乾燥し、ＦＩ
ＴＣ−Ｔ４含有シートとした（ＦＩＴＣ−Ｔ、はフロオ
レセインイソチオシアネート結合チロキシンを意味する
〉。

（Ｃ）　　ＦＩＴＣ−Ｔ、　　　　　　　２４μｓポリ
ビニルピロリドン　　　５Ｉ？ ノニルフエノキシポリ エトキシエタノール　　　０　、１　＊ｇ水　　　　　
　　　　　　　　　２００社（４）多層シートの作製 前記抗血清含有シートと、ＦＩＴＣ−Ｔ、含有シートを
、特開昭６２−１３８７５６記載の方法に従い点状接着
によりラミネートし、チロキシン（Ｔ４）測定用多層シ
ートした。

（５）チロキシン（Ｔ４）の測定 血清を活性炭で処理してＴ、を含まない血清を得、これ
に既知量のチロキシンを添加して得た種々の濃度のチロ
キシン（Ｔ、）を含有する血清１５μβに、０．３Ｍグ
リシン−ＮａＣｆ−ＮａＯＨ緩衝液７．５μβとブロッ
カ−試薬（ドデシルナフタレンスルホン酸ナトリウム）
０１Ｍ水溶液７．５μｆを加えた混合液３０μｌを多層
分析要素に滴下した。

２５℃で３０分放置した後支持体側から反射蛍光を測定
した。反射蛍光の測定には蛍光光度計（日立製作所モデ
ル６５０−１０（Ｓ））を用い、励起波長４９５ｎｍ、
蛍光波長５２５ｎｍて測定を実施した。

得られた検量線は第１図に示ず通りである。

［実施例２］（テオフィリン免疫分析用要素の作製及び
それを用いた測定法） 次の方法に従って多層免疫分析用要素を作製した。

＝１９− （１）抗体の塗布 １８０μＩＩＰＥＴ支持体上に下記組成Ｎの液を９０ｃ
ｃ／ｚ２相当量塗布し乾燥させた後、その上に組成旦や
液を１００ｃｃ／ｗ２の割合て塗布しゼラチンのセラ１
へした状態で、グロー放電処理したポリエステル編物塗
布をラミネー１〜した後、乾燥させた。

ゼラチン　　　　　　　　　　　２５ｙ界面活性剤　　
　　　　　　　　　２ｇ（オリン社サーファクタント１
０Ｇ） 蒸留水　　　　　　　　　　　４４４ｇニトロテトラゾ
リウムブルー （ＮＴＢ）　　　　　　　　　　　　３．２ｇ比 ゼラチン　　　　　　　　　　２０ｙ 界面活性剤　　　　　　　　　　２ｇ （オリン社サーファクタント］ＯＧ） 水　　　　　　　　　　　　　　　　２６０ｇクエン酸
　　　　　　　　　　　　３ｇ２Ｏ− （ｐＨを７．７に調整） ジアホラーゼ１％液　　　　　２０ｙ 次いてテオフィリン抗体溶液（米国サイバ社製ｒＥＭＩ
ＴＪテオフィリン１００アッセイキットの試薬Ａ）を５
％ポリビニルピロリドンを含む蒸留水１２１１に溶解し
たもの）を８００　ｃ肩２の面積に塗布して乾燥し、多
層免疫分析要素の下地とした。

（２）標識抗原の組込 グロー放電処理したポリエステル編物を下記組成の液に
浸漬し、乾燥し、標識抗原含有シートとした。

（３）多層免疫素子の調製 前記く１）の下地と（２）の標識抗原含有シートをラミ
ネート接着し、多層免疫分析素子とした。

（４）上記免疫分析要素を用いたテオフィリンの検量線 上記（３）で作製した免疫分析要素を１５ｚｚ角に裁断
し、上下に直径１０ｚｘの穴があいたプラスチックマウ
ントにはさみこみ、テオフィリンをそれぞれ０．２．５
，５．１０．２０．４０μｇ／ｘ１含有の血清キャリブ
レータ−（サイバ社製「エミツト」キット中）とサイバ
社製「エミツト」テオフィリンキットの緩衝液を重量比
で１＝４の比率で混合した溶液を各３０μ！点着し、富
士写真フィルム社製「ドライツム１００ＯＪアナライザ
の光学系を用いて、波長５４０ｎｍの反射吸光度変化（
点着５分後と１分後の差）を測定した。得られた結果を
第２図に示す。第２図より血清中のテオフィリン量に対
し２．５〜４０μｇ／ｘｌの間で良好な検量線が得られ
ていることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図はチロキシンの検量線、第２図はテオフィリンの
検量線を示すグラフである。 出願人　　　富士写真フィルム株式会社第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）一体化された少なくとも２つの水浸透性層から成り
   、水浸透性層のうち少なくとも一つが多孔性層であり、
   抗原／抗体反応に関与する成分を前記水浸透性層に含む
   乾式免疫分析要素であって、 上記抗原／抗体反応に関与する成分の一つは標識抗原、
   他の一つは前記非標識および標識抗原に対する抗体であ
   り、前記多孔性層は前記標識抗原を含み前記抗体を実質
   的に含まず、前記多孔性層より分析要素の液体を受容す
   る面から遠くに位置する他の水浸透性層には前記抗体を
   含み前記標識抗原を実質的に含まないことを特徴とする
   乾式免疫分析要素。 ２）特許請求の範囲１）において多孔性層が液体展開層
   であることを特徴とする分析要素。 ３）一体化された少なくとも２つの水浸透性層から成り
   、該層の一つは多孔性層であり、抗原／抗体反応に関与
   する成分として、標識抗原と、非標識および標識抗原に
   対する抗体とを水浸透性層に含む乾式免疫分析要素の製
   造方法であって、前記抗体を含み、該多孔性層より分析
   要素の液体を受容する面から遠くに位置する水浸透性層
   の上に、多孔性層を設けた後、前記標識抗原を含み前記
   水浸透性層中の抗体を溶解または可溶化しない組成物を
   多孔性層に塗布または含浸することを特徴とする方法。 ４）一体化された少なくとも２つの水浸透性層から成り
   、該層の一つは多孔性層であり、抗原／抗体反応に関与
   する成分として、標識抗原と、非標識および標識抗原に
   対する抗体とを水浸透性層に含む乾式免疫分析要素の製
   造方法であって、前記抗体を含み、該多孔性層より分析
   要素の液体を受容する面から遠くに位置する水浸透性層
   の上に、前記標識抗原を含む組成物を予め塗布または含
   浸した多孔性層を設けることを特徴とする方法。