JPH01229968A

JPH01229968A - 乾式免疫分析要素

Info

Publication number: JPH01229968A
Application number: JP5730888A
Authority: JP
Inventors: Yukio Sudo; 幸夫須藤
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1988-03-10
Filing date: 1988-03-10
Publication date: 1989-09-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の分野］本発明は抗原／抗体反応を利用する免疫学的分析に有用
な分析要素に関する。

［従来技術とその欠点コ乾式分析要素を用いて体液などに含有されている生化学
物質を定量する分析方法が知られている（例えば特開昭
４９−５３８８８号、同５５−１６４３５６号、同５９
−１０２３８８号）。乾式分析要素では一般に、被検成
分と分析要素内に含まれる試薬との反応の反応生成物ま
たは未反応成分の量を、光学的に、例えば発色、変色、
蛍光、発光等の分光測光により測定し、被検成分を定量
する。乾式分析要素を用いると、簡便、迅速に、しかも
高い精度で液体中の特定成分、例えば生化学的活性物質
の分析ができる。

乾式分析要素を利用した免疫学的分析も、例えば特開昭
４９−５３８８８号、特開昭５１−１０２３８８号、米
国特許４，４５９，３５８号等の記載により知られてい
る。

免疫学における抗原抗体反応は互いに対応する抗原また
は抗体のみに特異的に反応し結合する反応であり、自己
免疫疾患の跨断、生体内微量物質の検出などに広く利用
されている。しかし操作に熟練を要するため、臨床検査
のためには簡便な操作で精度良く測定できる方法が望ま
れている。

多層分析要素を利用した簡便な抗原履測定法の一つの典
型は特開昭５９−７７３５６号に開示されたものである
。この方法で用いている分析要素は、蛍光標識抗原を含
む展開層と、多孔性媒体から成る分配層と、固定化抗体
を含む反応層を積層したもので、被検液中の抗原と標識
抗原との間での競争的な抗原抗体反応を利用し、抗原の
量が蛍光強度の減少として測定される。

また検出感度の比較的高い免疫分析法として、酵素免疫
分析（ＥＩＡ）が考えられている。典型的な方法は特公
昭５３−２７７６３号によって知られ、酵素を抗原また
はその誘導体に結合させて、酵素標識抗原をつくり、酵
素活性に対する抗原の効果の測定により、被検液中の抗
原を分析する方法である。この方法では、抗体と結合し
た酵素標識抗原（Ｂで示される）と未結合の酵素標識抗
原（Ｆで示される）とを分離する（いわゆるＢ／Ｆ分Ｍ
）か、ＢとＦとで活性が変化する酵素系が必要とされる
。

これらの系を成立させるためには、抗体と標識抗原、ま
たは抗体標識物と抗原誘導体の、いずれかの二成分が必
須であり、検体との接触前にはこれらの二成分が互いに
反応しないようにしておかないと、検出感度（信号／背
景比）が著しく低下する。これまで知られた乾式分析要
素の多くは、この要因のなめに、満足すべき分析感度を
得ることができなかった。

［発明の技術的課題］本発明の技術的課題は第一に、高い分析感度と定量分析
精度を有する乾式免疫学的分析要素の提供、第二にその
ような免疫学的分析要素の製造方法の提供にある。

［発明の精成］本発明の上記課題の第一は、一体化された少なくとも２
つの水浸透性層から成り、該Ｊ１４の一つは多孔性層で
あり、抗原／抗体反応に関与する成分を水浸透性層に含
む免疫分析用乾式分析要素であって、上記抗原／抗体反
応に関与する成分の一つは抗原類縁体、他の一つは標識
抗体〈抗原および抗原類縁体に対する）であり、被検液
が接触するまでは、多孔性層は前記成分のうちいずれか
の成分く第一の成分とする〉を含むが、他の一成分く第
二の成分とする）を含まず、第二の成分は多孔性層より
分析要素の液体を受容する面から遠くに位置する層に含
まれ、この層は第一の成分を実質的に含まないことを特
徴とする乾式分析要素によって達成された。

抗原類縁体とは、抗原に対する抗体に、抗原と同様に結
合することのできる物質を言う。例えば、抗原と蛋白質
との化学的結合物、抗原とラテックスとの物理的結合物
、抗原と固体担体との結合物である。

上記課題の第二は、一体化された少なくとも２つの水浸
透性層から成り、銀層の一つは多孔性層であり、抗原類
縁体および標識された抗体な水浸透性層に含む乾式免疫
分析要素を製造するに際し、前記抗原類縁体を含む水浸
透性層の上に多孔性層を設けた後、前記標識抗体を含み
抗原類縁体を溶解または可溶化しない組成物を該多孔性
層に塗布または含浸することによって達成された。

上記課題の第二はまた、上記分析要素を製造するに際し
、前記抗原類縁体を含む水浸透性層の上に、前記標識抗
体を含む組成物を予め塗布または含浸した多孔性層を設
けることにより、達成された。

特に、抗原類縁体を含み親水性高分子を結合剤とする試
薬層を塗布等により設け、その上に多孔性層を設けた後
、前記標識抗体を含み試薬層の親水性高分子を膨潤させ
ない組成物を多孔性層に塗布または含浸する方法は、有
用な方法の一つである。試薬層の親水性高分子を膨潤さ
せない組成物としては、例えばアルコール類、エーテル
類、ケトン類のような有機溶媒の溶液が有用である０例
えば低級アルコール類（例えばエタノール、メタノール
）、ケトン類（例えばアセトン）、エステル類（例えば
エチルセロソルブ）等が利用できる。

また、抗原類縁体を含む多孔性試薬層の上に、標識抗体
を予め含浸、塗布等により含有した多孔性層を、例えば
特開昭６１−４９５９号等のような方法で接着させる方
法も有用である。

多孔性層への含浸または塗布には公知の方法を利用でき
る。塗布には例えばデイツプ塗布、ドクター塗布、ホッ
パー塗布、カーテン塗布等を適宜選択して用いる。

本発明における多孔性層は、分析要素の最上層であって
もよいし、最上層と他の水浸透性層の間にある層でもよ
い、供給される液体の量にほぼ比例した面積に液体を展
開する、いわゆる計量作用を有する液体展開層（以下、
展開層ということがある）であってもよいし、それ以外
でもよい。繊維質であってもよいし、非繊維質でもよい
、天然繊維から成る布、合成または半合成繊維から成る
布、不織布、紙、酢酸セルロース等から成るメンブラン
フィルタ−１無機物または有機物粒子の結合体等のいず
れでもよい６例えば特開昭５５−１６４３５６号、同６
０−２２２７６９号等に記載された繊維質層のほか、特
開昭４９−５３８８８号、特開昭５８−７０１６３号、
同６１−４９５９号、特願昭６０−２５６４０８号、　
同６〇−２７９８５９号、同６０−２７９８６０号、同
６０−２７９８６１号等に記載されたような多孔性層も
好適である。

抗体を蛍光標識するためには種々の蛍光物質を用いるこ
とができる。それらは官能成分により分類することがで
きるが、例えばアミノ基を有する蛍光物質として１−アミノナフタレン２−アミノナフタレンｐ、ｐ’−ジアミノスチルベン２−アミノアクリジンｐ、ｐ’−ジアミノベンゾフェノンイミン類ビス−３−
アミノピリジニウム塩インドール類フェノール性蛍光物質として７−ヒドロキシクマリン類３．６−シヒドロキシキサンテン顕テトラサイクリンサリチル酸エステル類等が挙げられる。代表的なものは、フルオレセインであ
る。

抗体は発光物質、例えば化学発光物質で標識されてもよ
い０例えば、ルミノールで代表される２、３−ジヒドロ
−１，４−フタラジンジオン、あるいは２．４．５−　
トリフェニルイミダゾール類を用いることができる。

抗体を酵素標識する場合、種々の酵素を用いることがで
きる。充分高い酵素活性が得られること、酵素の安定性
、酵素活性への結合の影響等を考慮して、酵素が選択さ
れる。特表昭５６−５００９０１号明細書の第１表およ
び第２表に記載されたものから選ぶことができる０代表
的なものはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ア
ルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、α−アミラーゼ、
ルシフェラーゼ等である。

抗体に標識を結合させる方法および本発明に用いること
ができる標識抗原については、石川栄泊ら：「酵素免疫
測定法（第２版）Ｊ（１９８２年）河合忠編：「臨床検
査技術全書４免疫血清検査」（医学書院、１９７７年発
行）、９７−１０２頁、Ｒｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐ
ｈｙｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍｕｎ、、７４，５３８（１９
７７）、Ｃｌ１ｎｉｅａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　ＡｃＬａ　
、８３，１６１（１９７８）等の記載が参照できる。

標識抗体の具体例としてフルオレセインインチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）結合チロキシン（Ｔ、）抗体、ＧＯＤ
結合抗ヒト免疫グロブリン（Ｉ　ｇＧ）、ＡＬＰ結合抗
ＩｇＧ、ＰＯＤ標識抗α−フェトプロティン等がある。

酵素標識抗体を用いる場合、抗原／抗体反応の結果を測
定するために、酵素活性の測定を必要とし、酵素の基質
、酵素反応生成物の検出系が必要とされる。基質は標識
抗体と同一の府中に存在してもよいが、異なる層の中に
含まれるのが好ましい、基質または酵素標識抗体の少な
くとも一方を、酵素標識抗体の酵素反応が実質的に起こ
らない溶媒を用いて塗布または含浸することが好ましい
６基質と酵素反応生成物の検出系とは、同一層中に存在
してもよく、また異なる層の中に含まれてもよい。基質
が自己顕色性基質である場合には、酵素反応生成物の検
出系は特に必要としない。

本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することが出
来る。要素は多孔性層、試薬層のほか、支持体、展開層
、検出層、光遮蔽層、接着層、ろ過層、吸水層、下塗り
層その他の層を含む多重層の構成を有してもよい、かよ
うな分析要素として、米国特許第３，９９２，１５８号
、同４，０４２，３３５号および特開昭５５−１６４３
５６号各明細書に開示されたものがある。

光透過性水不透過性支持体を用いる場合、本発明の乾式
分析要素の実用的に採りうる構成は（１）支持体上に試
薬層、その上に展開層を有するもの。

（２）支持体上に検出層、試薬層、展開層をこの順に有
するもめ。

（３）支持体上に試薬層、光反射層、展開層をこの順に
有するもの。

（４）支持体上に検出層、試薬層、光反射層、展開層を
この順に有するもの。

（５）支持体上に検出層、光反射層、試薬層、展開層を
この順に有するもの。

（６）支持体上に第二試薬層、光反射層、第一試薬層、
展開層をこの順に有するもの。

（７）支持体上に検出層、第二試薬層、光反射層、第一
試薬層、展開層をこのｊ旧に有するもの。

検出層は一般に被検成分の存在下で生成した色素等が拡
散し、光透過性支持体を通して光学的に検出され得る層
で、親水性ポリマーにより構成することができる６色素
に対する媒染剤、例えばアニオン性色素に対してカチオ
ン性ポリマーを、含んでもよい。

上記（１）ないしく５）において試薬層は異なる複数の
層から成ってもよい、支持体と試薬Ｊｆｌまたは検出層
との間には吸水層を設けてもよい。

吸水層は一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実
質的に拡散しないような層を言い、膨潤しやすい親水性
ポリマーにより構成することができる。１記（１）ない
しく３）と（６ンにおし）で試薬層と検出層または展開
層の間にろ渦層を設けてもよい。上記（３）ないしく７
）において光反射層と検出層、試薬層または展開層との
間、試薬層と検出層との間または試薬層と展開層の間に
、さらにろ渦層を設けてもよい、試薬層が複数層から成
る場合に、試薬層と試薬層の間にさらにろ渦層を設けて
もよい。

標識抗体が含まれる層は展開層でもよく、試薬層でもよ
い。

酵素標識抗体を用いる場合に酵素反応生成物を検出する
ための試薬組成物は、標識抗体を含む層に含まれてもよ
いが、別の無孔性層または多孔性Ｉｆりに含有させても
よい。例えば酵素反応生成物との反応により中間木登生
成する組成物を第１の試薬層に、中間体と反応して染料
等を生成しｔ′）る組成物（指示薬）を試薬層と支持体
との間にある第２の試薬層に含んでもよい。また萌記の
中間体を生成する組成物を試薬層より支持体から遠い層
、例えば光反射層等に含み、指示薬を試薬層に含んでも
よい。

本発明の乾式分析要素の試薬層としては、親水性ポリマ
ーを結合剤とする実質的に均一の屑のほか、例えば特開
昭５８−７０１６３号、特開昭６１、−４９５９号、特
願昭６０−２５６４０８号、同６０−２７９８５９号、
同６０−２７９８６０号、同６０−２７９８６１号等に
記載されたような多孔性層も好適である。親水性ポリマ
ーとしては例えば、ゼラチンおよびこれらの誘導体く例
えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばヒ
ドロキシメチルセルロース）、アガロース、アクリルア
ミド重合体、メタアクリルアミド重合体、アクリルアミ
ドまたはメタアクリルアミドと各種ビニル性モノマーと
の共重合体等が利用できる。

試薬層には必要に応じ酵素に対する基質、酸化剤、カプ
ラー、緩衝剤等を含有させることができる。試薬層に酵
素標識抗体を含む場合には、当該酵素に対する基質が必
須で！）る。

本発明の分析要素の試薬層に含有させることができる緩
衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌　第５巻　第２号、４６７ページ
より４７７ページ（１９６６年）に記載されているグツ
ド（にｏｏｄ　）の緩衝剤などを挙げることができる。

これらの緩衝剤は「蛋白賞・酵素の基礎実験法Ｊ（堀尾
武−ほか著、南江堂、１９８１年）、萌記Ｂｉｏｃｌ＋
ｅｍｉｓＬｒｙ誌第５巻等の文献を参考にして選択する
ことができる。

多孔性層を展開層として利用する場り、液体計量作用を
有する層であることが好ましい、渣体計址作用とは、そ
の表面に点着供給された液体試料を、その中に含有して
いる成分を実質的に遍在させることなく、面の方向にＩ
１１位面積当りほぼ一定量の割合で広げる作用である。

展開層その他の多孔性層を構成する材料としては、２紙
、不織布、織物生地（例えばヱ織生地）、ｕＡ物生地（
例えば、トす＝７ソト−）、ガラス繊柑Ｐ紙等を用いる
ことができる。＠間層としては、これらのうち織物、Ｍ
ｉ物等が好ましい、ｍ物等は特開昭５７−６６３５９号
に記載されたようなグロー放電処理をしてもよい、展開
層には、展開面積、展開速度等を調節するため、特開昭
６０−２２２７７０号、特願昭６１−１２２８７５号、
６１−１２２８７６号、６１−１４３７５４号に記載し
たような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有しても
よい。

多孔性層を接着し積層するための接着層を、試薬層、光
道へい層、濾過層、吸水層、検出層等の１ｑの上に設け
てもよい、接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着
することができるような親水性ポリマー、例えばゼラチ
ン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等から
なることが好ましい。

光遮蔽層は、検出層、試薬層等に生じた検出可能な変化
（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反
射測光する際に、展ｆ７Ｍ層に点着供給された被検液の
色、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等
を遮蔽するとともに光反耐層または背景層として機能す
る。光遮蔽層は。

皮膜形成能を有する親水性ポリマーをバインダーとして
、酸化チタン、硫酸バリウム等の光反射性微粒子が分散
された水浸透性の層であることが好ましい、バインダー
としてはゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミ
ド等が好ましい０分析要素には、光遮蔽層を設ける代わ
りに、またはそれと同時に、展開層、試薬層、検出層等
に酸化チタン等の光反射粒子を含有させてもよい。

［実施例］（１’Ｊ　Ｔ、−ＢＳＡの合成牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１５ｍｌ＋を３ｍｌのりん
酸緩衝液（ｐＨ８、０，０，１Ｍ）に溶解し、これにＴ
４溶液（チロキシン１０ｍｇを３ｍｌのジメチルスルフ
オキシドに溶解したもの）を静かに添加した。ン欠にこ
の液に１％ゲルタールアルデヒド０　２ｍｌをゆっくり
と添加し、４℃で３時間反応させた．反応液を２日間透
析し、凍結乾燥してＴ．−Ｂ　Ｓ　Ａを得た。

（２）抗原固定化膜の作製ニトロセルロース　メンブランフィルタ−（ミリボア社
製）に下記組成（Ａ＞の液を含浸し、１夜放置した後、
水でよく洗浄した。

（Ａ）　　　Ｔ．−ＢＳＡ（下記）　　　１５μｇ炭ｌ
ＩＩ！２緩衝液（ｐＨ９）　　　１０＋ｊ！次にこのメ
ンブランフィルタ−にＢＳＡ３００ｍｇを水１０＋＾ｌ
に溶解した液を含浸し、１夜放置した後、水でよく洗浄
し、室温で乾燥し、抗原固定化膜とした。

（３）ＦＩＴＣ凛諏抗体含有膜（布）の作製ポリエチレ
ンテレフタレート紡績糸から成るトリコット編み物に、
下記組成（Ｂ）の液を含浸し、０２燥した（ＦＩＴＣは
フルオレセインイソチオシアネートを意味する）。

（Ｂ）ＦＩＴＣ標識抗標識抗体溶液　１社（抗体乾燥粉
末４０μｇ含有）蒸留水　　　　　　　　　　９ｍｌ（４　）　Ｔ．測定用要素の作製厚さ１８０μ−のＰＥＴ支持体に上記（２）で作製した
抗原固定化膜〈ニトロセルロースメンブランフィルタ−
）を、さらにその上に上記（３）の標識抗体含有膜を、
特開昭６２−１３８７５６実施例３に記載された方法に
より点状部分接着した．これを１５麟鋤角に裁断し、上
下に直径１０−の窓を設けたポリスチレンフレームには
さみ込み、Ｔ，測定用要素［１］とした。

（４）チロキシンの測定チロキシン（Ｔ，）を含まない血清に既知量のＴ。

を添加したＴ，含有血清５μｌに．０．３Ｍグリシン緩
衝液（Ｐ）１９．０．０５Ｍドデシルナフタレンスルフ
オン酸ナトリウム含有）５μｌを加えたものを、各分析
要素に点着く滴下）した。３７°Ｃで１５分間放置後、
各分析要素に０．３Ｍグリシン緩衝液（上記に同じ）１
５μｌを滴下して拭き収る操作を２回繰り返して、遊離
のＦＩＴＣ標識抗体を洗い流した。

その後、蛍光光度計（日立製作所モデル６５０−１０（
Ｓ））を用い、励起波長４９５ｎｍ．蛍光波長５２５ｒ
＋＋ａで、ＰＥＴ支持体側より蛍光を測定した。得られ
た結果を第１図に示す。

第１図から明らかなように、本発明の分析要素［］］に
よりチロキシン（Ｔ４）の定量が可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はＴ，測定用分析要素の免疫分析特性を示すグラ
フである。出願人．　富士写真フィルム株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一体化された少なくとも２つの水浸透性層から成
り、水浸透性層のうち少なくとも一つが多孔性層であり
、抗原／抗体反応に関与する成分を前記水浸透性層に含
む乾式免疫分析要素であって、上記抗原／抗体反応に関与する成分の一つは抗原類縁体
、他の一つは標識された抗体であり、前記多孔性層は前
記成分のいずれか一つを含み、前記成分の他の一つを実
質的に含まず、前記多孔性層より分析要素の液体を受容
する面から遠くに位置する水浸透性層には前記他の一成
分を含み、該水浸透性層は多孔性層に含まれる前記成分
を実質的に含まないことを特徴とする乾式免疫分析要素
。
（２）標識抗体が多孔性層に含まれ、抗原類縁体が多孔
性層より分析要素の液体を受容する面から遠くに位置す
る水浸透性層に含まれることを特徴とする特許請求の範
囲（１）の乾式免疫分析要素。
（３）抗原類縁体が多孔性層に含まれ、標識抗体が多孔
性層より分析要素の液体を受容する面から遠くに位置す
る水浸透性層に含まれることを特徴とする特許請求の範
囲（１）の乾式免疫分析要素。
（４）一体化された少なくとも２つの水浸透性層から成
り、該層の一つは多孔性層であり、抗原類縁体および標
識された抗体を水浸透性層に含む乾式免疫分析要素の製
造方法であって、前記抗原類縁体を含む水浸透性層の上に多孔性層を設け
た後、前記標識抗体を含み前記抗原類縁体を溶解または
可溶化しない組成物を多孔性層に塗布または含浸するこ
とを特徴とする方法。
（５）一体化された少なくとも２つの水浸透性層から成
り、該層の一つは多孔性層であり、抗原類縁体および標
識された抗体を水浸透性層に含む乾式免疫分析要素の製
造方法であって、前記抗原類縁体を含む水浸透性層の上に、前記標識抗体
を含む組成物を予め塗布または含浸した多孔性層を設け
ることを特徴とする方法。
（６）一体化された少なくとも２つの水浸透性層から成
り、該層の一つは多孔性層であり、抗原類縁体および標
識された抗体を水浸透性層に含む乾式免疫分析要素の製
造方法であって、前記標識抗体を含む水浸透性層の上に多孔性層を設けた
後、前記抗原類縁体を含み前記標識抗体を溶解または可
溶化しない組成物を多孔性層に塗布または含浸すること
を特徴とする方法。
（７）一体化された少なくとも２つの水浸透性層から成
り、該層の一つは多孔性層であり、抗原類縁体および標
識された抗体を水浸透性層に含む乾式免疫分析要素の製
造方法であつて、前記標識抗体を含む水浸透性層の上に、前記抗原類縁体
を含む組成物を予め塗布または含浸した多孔性層を設け
ることを特徴とする方法。