JPH01228496A - 酵素的ペプチド合成法 - Google Patents

酵素的ペプチド合成法

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JPH01228496A
JPH01228496A JP2276189A JP2276189A JPH01228496A JP H01228496 A JPH01228496 A JP H01228496A JP 2276189 A JP2276189 A JP 2276189A JP 2276189 A JP2276189 A JP 2276189A JP H01228496 A JPH01228496 A JP H01228496A
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ester
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peptide
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aminocarboxylic acid
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JP2276189A
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Maria-Regina Kula
マリア―レギーナ・クーラ
Andreas Hans-Dieter Steffan Flosheimer
アンドレアス・ハンス―デイーター・シユテフアン・フレールスハイマー
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Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Degussa GmbH
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
    • C07K1/023—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution using racemisation inhibiting agents

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、セリン−またはチオールプロテアーゼの存在
下で、カルボキシル成分としてのＮｃｔ−保護α−アミ
ノカルボン酸エステルまたはＮ（１−保護ペプチドエス
テルと、アミン成分としてのα−アミノカルボン酸、α
−アミノカルボン酸エステルまたはα−アミノカルボン
酸アミドとの反応により酵素的にペプチドを合成する方
法に関する。
〔従来の技術〕
このような方法は、すでに米国特許（ｔ＋５−ｐｓ）第
４　３３９　５３４号明細書から公矧である。しかしな
がら、この公矧法では、カルボキシル成分の保護基とし
てベンゾイル基、アセチル基、３Ｎアルコキシカルボニ
ル基、ｐ−トルエンスルホニル基’ｊたｌ’ｔｏ−＝）
ｏフエ＝ルスルホニル基を使用する。しかしながらこの
ような保護基を有するカルボキシル成分は、水性反応媒
体中で屡々低い溶解度のみを有する。
〔発明が解決しようとする課題〕
ところで、本発明方法は　Ｎ（１−ポルミル基によって
保殺されたカルボキシル成分を使用することを特徴とす
る。
欧州公開特許出願第１４９　５９４号明細書カラ、プロ
テアーゼの存在下にカルボキシル成分としてのＮ′：１
−ホルミル基で保護されたα−アミノカルボン酸または
Ｎｏ−ホルミル基で保護されたペプチドと、アミン成分
としてのα−アミノカルボン酸、α−アミツカ、ルボン
酸アルキルエステル、ペプチドまたはペプチドアルキル
エステルとを反応さセることはすでに公知である。
しかしながらこの公仰法は、いわゆる熱力学的に支配さ
れる合成に関し、この合成では、適当な処理によって常
に反応平衡をペプチド結合連結の方向へ動かすことが必
要である。従って、この公知法は、本質的により短い疎
水性の、または側鎖−保護されたペプチドの合成のため
のみに使用できるだけである。
〔課題を解決するだめの手段〕
本発明方法では、カルボキシル成分としてα−アミノカ
ルボン酸エステルまたはペプチドエステルを使用するの
で、いわゆる反応速度論的（ｋｉｎθｔｉｓｃｈ　）に
支配される合成が問題である。
これは使用性において、熱力学的に支配される合成より
も著るしい多面性がある。それというのも合成されるべ
きペプチドの溶解度特性を考慮する必要がないからであ
る。これによって、より長いペプチドおよび非保独の残
水性アミノ酸側鎖を有するペプチドも製造できる。酵素
の必要量は相対的に低く、新しいペプチド結合の連結は
、相対的に短い反応時間だけを必要とする。
プロテアーゼによって触媒作用を受ける反応のだめの有
利な反応媒体は、水性媒体である。
酵素により触媒作用を受ける反応を経済的に実施するた
めに、できるだけ高い基質濃度が必要である。ｆ−ホル
ミル保護基は、その有利な俗解特性に基すき、水性媒体
中でのアミノ酸−もしくはペプチド−誘導体の相轟改良
された溶解度を惹き起こす。しかしながら、これは熱力
学的に支配される合成における使用のためには根本的な
欠点を示す。それというのも、合成すべき生成物の高め
られた溶解度は収率低下もしくはペプチド結合連結の実
施不能をもたらすからである。
従って本発明方法は、反応速度論的に支配される酵素に
より触媒作用を受けるペプチド合成（ここにこの保護基
の特有の使用性がある）におけるＮ（：１−ホルミル保
護基によって保護されたアミノ酸−もしくはペプチド−
誘導体の使用をその内容としている。
本発明方法では、カルボキシル成分トシテ、Ｎ“−ホル
ミル基によって保釉されたα−アミノカルボン酸エステ
ルまたはペプチドエステルを使用する。アルコール成分
としては、基本的に任意の一価のアルコールをこれらの
エステル中に含有していてよい。特に低級アルキルエス
テル、例えばメチル−、エチル−１ｎ−プロピル−また
は１−プロぎルエステルの使用、またはベンシルエステ
ルの使用が有利である。好適なアミノカルボン酸エステ
ルの例は、トリプトファン−ｎ−プロピルエステル、チ
ロシンメチルエステル、チロシン−ｎ−プロピルエステ
ル、フェニルアラニンメチルエステル、フェニルアラニ
ンエチルエステル、グルタミン酸ジメチルエステル、ア
スパラギン販ジメチルエステル、アスパラギンペンシル
エステル、システィン−ｎ−プロピルエステル、メチオ
ニン−ｎ−プロぎルエステル、メチオニンメチルエステ
ル、リジン−ｎ−プロピルエステル、アルギニン−ｎ−
フロビルエステル、オルニチンメチルエステル、ヒスチ
ジン−ｎ−プロピルエステル、ヒスチソンエチルエステ
ル、イソロイシンメチルエステル、ロイシンメチルエス
テル、バリンメチルエステル、アラニン−ｎ−プロピル
エステル、セリン−ｎ−プロピルエステルまたはセリン
エ゛チルエステルである。
好適なペプチドエステルの例は、チロシル−ＩＪ　９７
−　ｎ−プロピルエステル、テロシルーアルイニンーｎ
−ｆロビルエステル、チロシル−グリシン−ｎ−プロぎ
ルエステル、チロシル−クリシンメチルエステル、チロ
シル−７ラニンーｎ−ｆ口ぎルエステル、ドリフトファ
ニル−リシン−ｎ−プロビルエステルマタハチロシルー
グルタミン酸−α−メチルエステルである。
本発明方法ではアミン成分としてα−アミノカルボン酸
、α−アミノカルボン酸エステルおよびα−アミノカル
ボン酸アミドを使用する。
好適なα−アミノカルボン駿の例ハ、ア、Ｆ　＝　ｙ、
チロシン、フェニルアラニン、ドリフトファン、リジン
、アルギニン、ロイシン、イソロイシン、セリン、グリ
シン、メチオチン、システィン、アスパラギンまたはグ
ルタミンである。
好適なα−アミノカルボン酸エステルの例ハ、リジン−
ｎ−プロピルエステル、アラニン−ｎ−フロビルエステ
ル、アルギニン−ｎ−プロピルエステル、クルタミン駿
ジメチルエステル、セリンメチルエステル、チロシンメ
チルエステル、ロイシン−ｎ　−フロビルエステル、シ
スティン−ｎ−プロピルエステル、バリンメチルエステ
ル、バリンエチルエステル、メチオニン−ｎ−プロピル
エステルまたはグリシン−ｎ　−ｆ口ぎルエステルであ
る。
好適なα−７ミノカルボン酸アミドの例は、メチオニン
アミド、ロイシンアミド、フェニルアラニンアミド、ア
ラニンアミド、セリンアミド、チロシンアミド、アルギ
ニンアミド、リシンアミド、トリプトファンアミド、イ
ソロイシンアミド、バリンアミドまたはシスティンアミ
ドである。
本発明方法で、酵素としてセリン−またはチオールゾロ
テアーゼを使用する。好適な酵素は例えばα−キモトリ
プシン、トリプシン、カルポキシペゾチダーゼＹ１エラ
スターゼ、トロンビン、パパイン、プロメライン、カル
ボキシペプチダーゼＷ１カルボキシペプチダーゼＣまた
はプ。ティナーゼＧｌｕ−Ｃである。
Ｎ（ｉ−ホルミル基によって保獲されたカルボキシル成
分は、特に有利に、エステル化の際に生じるα−アミノ
カルボン酸エステルまたはペプチドエステルの塩酸塩と
ギ酸と無水酢酸とから成る混合物とを少なくとも１当量
の立体障害６級アミンの存在下で、反応させることによ
り製造することができる。この際ギ酸と無水酢酸との混
合比は、１０：１〜４：１（容量部）の範囲であってよ
い。
有利には、混合物を水浴上で準備し、溶液としての６級
アミンを塩化メチレン中に加え、次いで反応すべきエス
テル−塩酸塩を攪拌下に添加する。ホルミル基の導入は
約１５分のみを必要とする。引き続き反応混合物を氷冷
水で約２倍の容積まで希釈する。後処理は、容易に水溶
性の生成物では、すべての易揮発性成分を除去し、残分
をイオン交換クロマトグラフィーによって精製すること
により実施できる。水溶性の低い物質では、水相をコツ
ホの塩で飽和し、生成物を塩化メチレンで抽出すること
ができる。
塩化メチレンの除去後に、さらに次の加工に十分純粋な
生成物を得る。
３級アミンは、Ｎａ−ホルミル基によって採掘されたカ
ルボキシル成分の製造の際に、少なくとも１当量の量で
使用すべきである。例えば６当量までの過剰を使用して
もよい。６級アミンとしては、Ｎ−エチルーゾイソーグ
ロビルアミンを使用するのが有利である。他の好適な３
級アミンは、例えばＮ−エチルモルホリンまたはＮ−メ
チルモルホリンである。
本発明方法は、７．０〜１０．５の範囲の一値、室温〜
６０℃の範囲の温度で実施のが有利である。反応は、場
合によっては有機補助溶剤、例えばメタノール、エタノ
ールまたはｎ−プロパツールを含有する水性媒体中で行
なう。カルボキシル成分は、溶解度に応じて、約１Ｍま
での濃度で使用することができる。アミン成分をカルボ
キシル成分よシ過剰で使用するのが有利である。使用す
べき過剰は、とシわけ不使用アミノ戊分をいかに容易に
回収できるかに依シ決まる。一般に５倍までの過剰の使
用が推奨される。
本発明による方法は、断続的に、または、固定酵素また
はエンデイムーメンプランーリアクタ−（Ｅｎｚｙｍ−
Ｍｅｍｂｒａｎ−Ｒｅａｋｔｏｒｓ　）の使用下で、連
続的に実施することができる。
酵素的反応の直接生成物として生じたペプチド誘導体は
、その組成に応じて各々、例えば疎水性アミノ酸側鎖を
有するペプチドの場合には、適当な溶剤例えば塩化メチ
レン中に溶かすか、またはこのような溶剤で抽出し、塩
基性成分、殊に過剰のアミノ成分を酸で洗浄する方法で
単離できる。他の場合に、との単離は自体公知法で、分
ｉ　ＨＰＬＯおよび／またはイオン交換体クロマトグラ
フィーによって実施することができる。
イオン交換体クロマトグラフィーの際、凍結乾燥可能な
緩衝液、例えばギ酸アンモニウム暖衝液を使用するのが
有利である。
アばノ成分としてα−アミノカルボン酸エステルを使用
する場合、エステル基の所でのＮｅｔ−ホルミル−ペプ
チドエステルのけん化を、エステラーゼ酵素的に、また
は弱水酸化アルカリ金属溶液での処理によって実施でき
る。
アミン成分としてα−アミノカルボン酸アミドを使用す
る場合、生成物をｐＨ６〜８で２０〜５０座の溶液とし
て準備し、カルボキシペグチダーゼＹまたはアミダーゼ
を添加し、かつＨＰＬＣを用いてけん化する方法により
、アミド基の離脱を行なうことができる。生成物が９５
％よシ多くけん化される場合、反応を酢酸の添加によっ
て（反応混合物の５０容量パーセント）中止させる。次
いで混合物を回転させ、凍結乾燥させる。さらに次の後
処理は陰イオン交換体クロマトグラフィーおよび引き続
くケ１ルクロマトグラフイーにより行なう。このために
好適なケ１ルとしては、セファデックスＧ　１０　（Ｓ
ｅｐｈａａθＸＧ１０〕またはバイオラードＰ　２　（
Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｐ２）がこれに該描する。
Ｎａ−ホルミル保護基は、約６０°Ｃまでの適度に高め
られた温度で、約２〜６時間かけて、例えば０．３〜０
．５Ｍの稀塩酸で処理することによって離脱することが
できる。
〔実施例〕
本発明方法金欠の例によって詳述する。
例１ Ｌ、チロシンメチルエステル−塩酸塩（Ｓｅｒｖａ３７
４２９）１４ｇ（６０，４ｍモル）を、水浴上で、９８
％ギ酸８０ｔ４１と無水酢酸２０−とから成る混合物中
に溶かした。次いで塩化メチレン６６ｆｆｉ／中のＮ−
エチルーゾイソプロビルアミン６６ｍモルを加え、これ
を１５分間攪拌した。
飽和コツホ塩溶液８０−７の添加後に、反応混合物を１
Ｎ塩酸でｐｉ−１２に調節し、塩化メチレン６各７０−
で４回振出した。集めた塩化メチレン相をｐＨ２の塩酸
酸性コツホ塩半飽和溶液各々５０ばて２回掘出し、硫酸
ナトリウム上で乾燥させ、および減圧下で回転させた。
生成物は冷蔵庫内で、−晩で晶出した。これは、ＩＨ−
ＮＭＲ（ｃｎａｅ３）　Ｋ　ヨ、り、Ｎ”−ホルミル−
Ｌ−チロシンメチルエステルと同定された：δ−８．２
　ｐｐｍ（ｓ　、　１Ｈ、−０ＨＯ）、δ−４，０１）
１：１ｍ（ｅ　、　３Ｈ。
−０−ａＨ３）。
収量：　９．５．Ｓ’　（４２，５ｍモル；理論値の７
０％）ω点：１１０〜１１６℃ 〔α］Ｄ：＋２０．７°（Ｃ−１：　ＭｅＯＨ）。
このように製造されたＮ（１−ホルミル−Ｌ−チロシン
メチルエステル４４７■（２ｍモル）トＬ−アラニンー
ｎ−７’ロｔルエステルー塙酸塩４０　ｏ１ｎ９（２，
４ｍモル）全メタノール４Ｍと水９−とから成る混合物
中に溶かし、１Ｎ　　ＮａＯＨでＰＨを９．５に調節し
た。次いでα−キモトリプシン２．５ｍｇ　（Ｍｅｒｃ
ｋ　２３０７　）　”Ｉｔ水溶液（０，５Ｎ　Ｎａ”、
０．０１　Ｎ　Ｏａ”　）　０．２　ｎｄの形で添加し
た。−値を自動滴定システム（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ　
。
Ｖ工Ｔ９０Ｘ　ＴＴＡ８０）を用いて一定に保った。
５分後に、生成物の沈澱が起こった。１４分後に、メタ
ノール５０４の添加によって反応を中断した。反応混合
物を１時間放置し、次いで減圧下に回転させた。残０分
を塩化メチレン５０ｖ！１中４Ｃ入し、コツホ塩飽和ソ
ーダ溶液（…１０）８ｍｌ、コツホ塩飽和塩酸溶液（ｐ
Ｈ２，０）８ｍｚおよびコツホ塩飽和塩酸溶液（ｐＨ０
，５）１０ＰＬｔで各々１回振出した。生じたＮｃｔ−
ホルミル−Ｌ−チロンルーＬ−アラニンーｎ−プロざル
エステルは、塩化メチレン溶液から自然に晶出した。
収量：４４７ｍｇ（１，２３ｍモル；理論値の６６％）
。
融点：１７４〜１７４５℃ 〔α〕君５：　＋　３．２４°（Ｃ＝１；ＭｅＯＨ）、
アミノ酸分析：　Ａｌａ　１．００　：　Ｔｙｒ　１．
０３このエステルを、希苛性ソーダ液（ｐＨ１０，０）
５０％とジオキサン５０％とから成る混合物で１０時聞
けん化した。引続き、１Ｎ塩酸でｐＨ２に調節し、ジオ
キサンを減圧下で除去し一生じたＮａ−ホルミル−Ｌ−
チロシル−Ｌ−アラニンを酢酸エステルで掘出した。集
めた酢酸エステル相を減圧下に回転させた。
ホルミル基の離脱のために残分を０．５Ｍ塩酸中に溶か
し、６時間５６℃に加温した。引き続き反応混合物を冷
却させ、生成物を凍結乾燥によって単離した。
収量：定量的。
アミノ酸分析’　Ａｌａ　１．００　；Ｔｙｒ　１．０
３〔α）Ｄ　：＋’；’、’；’°（ａ　−ｏ、２　；
　Ｉ　Ｎ　　Ｈａｌ）ＨＰＬＯ−特性値は市販物質のそ
れと同じでちった。
比較実験： 比較目的のために、ＮＣ１−ホルミル−Ｌ−チロシル−
Ｌ−アラニン−ｎ−プロピルエステルをカルボキシル成
分としてのＮｏ−ホルミル−Ｌ−チロシンとアミン成分
としてのＬ−アラニン−ｎ−プロピルエステル−塩酸塩
との反応によって製造する（熱力学的に制御される合成
）試みをした。
水溶液ｉ　ｍ　（Ｑ、５　Ｎ　Ｎａ＋；０．０１　Ｎ　
ａａ＋＋　）の形のα−キモトリゾシン２ｍ９に、各々
Ｎ（１−ホルミル７Ｌ−チロシフ　　　１６５７Ｙ　　
　　１０４，６ｍＦ　　２９．３１ＶＬ−アラニン−ｎ
−プロピル−１０２，３７Ｗ　　　　６５Ｍ？　　１８
．４■エステル−ヒドロクロリド を添加し、自動滴定システムにより一をｐＨ７，５に調
節し、かつ一定に保持した。
３つの全ての場合に、数日間の反応時間後もＮａ−ホル
ミル−Ｌ−チロンルーＬ−アラニンーｎ−プロピルエス
テルの形成は観察できなかった。
例２ 塩化メチレン６．４−中の９８％で酸９’ｔｘｔｚ無水
酢酸２ＩＩＩｌおよびＮ−エチル−ジインプロぎシフ４
フ６．４ｍモルを水浴上で準備した。次いで、Ｌ−）リ
フトファン−ｎ−プロピルエステル−塩酸塩０．９　ｇ
（３，１８ｍモル）を添加し、これを１５分間攪拌した
。引続き反応混合物を塩酸酸性飽和コツホ塩溶液（ｐＨ
３）１０ｗＬｔに注入した。この混゛合物を塩化メチレ
ン各々２０１１１で４回振出した。集めた塩化メチレン
相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、かつ減圧下で回転さ
せた。
油状生成物は薄層クロマトグラフィーおよびＨＰＬＯ−
検査で単一であった。これは、ＵＶ−分析（２８０およ
び２２０　ｎｍで最高値；水）、１Ｈ−ＮＭＲ（ＯＤＯ
１３）　　：　　δ−９，８ｐｐｍ　（ｓ　−１Ｈ・Ｈ
−Ｎ１ｎ）、δ−８，ｉ　ｐｐｍ　（ｓ　、　１Ｈ、Ｎ
”−Ｃｏ−Ｈ）、δ＝　６．８　ｐｐｍ　（ａ　、　１
　Ｈ、Ｎａ−Ｈ）および成分分析： ０％　　Ｈ％　　Ｎ％　　０％ 実測値：６５．７６　７．６１　　９．４３　１７．２
０計算値：６５．６Ｂ　　６．６１　１０．２１　１７
．５０によって、Ｎａ−ホルミル−Ｌ−）リフトファン
−ｎ−プロピルエステルとして同定された。
収量：６５０ｍ９（２，３４ｍモル：理論値の７４％） 〔α］Ｄ　：＋４．９°（０−２；　ＭｅＯＨ）このよ
うに製造されだＮ−ホルミル−Ｌ−）リフトファン−ｎ
−プロピルエステル４３Ｔｎ９（０，１６ｍモル）およ
びＬ−リジン−ｎ−プロピルエステル−２塩酸塩８８ｒ
ｎ９（０，３４ｍモル）をｎ−プロパツール０．４−と
水０．５　ｄとから成る混合物中に浴かし、−値ｆ　１
Ｎ　ＮａＯＨでＰＩ（９，２に調節した。その後、α−
キモ）　ＩＪプシン−１，４８ｍ９に水溶液（０，５Ｎ
　Ｎａ”、０．０１　Ｎ　Ｏａ”）０．２ｍｌの形で添
加した。ＰＨを自動滴定システムで一定に保持した。８
分後に反応を氷酢酸０．４ｄの添加によって中断した。
３０分後に、反応混合物を減圧下で回転させ、カチオン
交換体クロマトグラフィー［ＦＰＬＣ−装置（Ｐｈａｒ
ｍａｃ土ａ）、ＣＭ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　／　
４ＱｍＭ酢酸ナトリウム／酢酸〕および引き続くケ９ル
濾過（５ｅｐｈａｄｅｘ　ａ　１０；２０％ｎ−プロパ
ツール水浴液）にょシ後処理した。
収量：　２９．２■（０，０７２ｍモル；理論値の４５
％） ＮｃＬ−ホ／ｌ、　ミｋ　−Ｌ　−）リプトファニルー
Ｌ−１７ジンーｎ−プロピルエステルとしての同定は質
量分桁によって行なった：　Ｍ　＋　Ｈ”　＝　４３３
（Ｃ！１９Ｈ３ＯＮ４０４） エステルけん化のために、生成物を５０　ｍＭ炭酸塩−
緩衝液（ｐＨ９，５）　４．５．ｄ中に浴かし、トリジ
シン（Ｍｅｒｃｋ　２４５８１　：　ＴＣＰＫ−処理）
２．５■を加えた。４分後に、反応混合物を脱ホルミル
化のために３ＮＨＯｌでｐｉ（０，３に調節し、２時間
５６℃に加温した。次いで反応混合物を凍結乾燥させ１
、生成物をゲルクロマトグラフィー（５ｅｐｈａａｅｘ
　Ｇ　１０　：　２０％ｎ−プロパツール水溶液；　８
０　×２．６１のカラム；流入：１ｍｌ／分）によって
指尖し、かつ再度凍結乾燥させた。
収量二定全的 アミノ酸分析（キモトリプシン−触媒作用那水分解）　
’　Ｔｒｐ　１．０４　＋　Ｌｙｓ　１．００゜例６ Ｌ−チロシン−ｎ−プロピルエステル−塩酸塩７ｇ（２
７ｍモル）を、水浴上で９８％ギ酸７Ｑ＊ｌと無水酢酸
２０ｍ１とから成る混合物に加えた。その後、塩化メチ
レン２８耐中のＮ−エチルーゾイソプロビルアミン２８
ｍモルを加え、これを１５分間攪拌した。引き続き、氷
水６０ｙｔｌを加え、かつ反応混合物を減圧下に回転さ
せた。残分を塩化メチレン５　Ｑ　Ｍｔｌ中に入れ、半
飽和塩酸酸性コツホ塩浴液（ｐＨ３，０）各々２０ｍ／
で２回摂出した。集めた塩化メチレン相を硫酸ナトリウ
ムで乾燥させ、かつ減圧下で濃縮させた。残分をメタノ
ール３Ｑｍ／中にとり、再度濃縮し、さらにメタノール
２０　ｍｌ中に入れた。水８０ａ／の添加および減圧下
でのメタノーヤの除去の後に、生成ＮＣＬ−ホルミルー
Ｌ−チロシン−ｎ−プロピルエステルが沈殿した。これ
をＰ２Ｏ５で乾燥させた。
収量：４．７７．５’（１９ｍモル；理論値の７０％）
。
〔α）Ｄ　：＋２３．５°（０−１ｉ　ＭｅＯＨ）。
融点：１１３〜１１３．５℃。
ＩＨ−ＮＭＲ：δ−８，２ｐｐｍ　（ｓ　、　１　Ｈ、
−ＣＨｏ　）成分分析： ０％　　　Ｈ％　　　Ｎ％　　　０％ 実測値：　６１．４５　６．７８　　５．４６　　２５
．５計算値：６２．１４　６．８２　　５．５７　　２
５．５このように製造されたＮｃｔ−ホルミル−Ｌ−チ
ロシン−ｎ−プロピルエステル２５［］ｒｎ？（１ｍモ
ル）およびＬ−リシン−ｎ−プロビルエステル−ジヒド
ロクロリド３５０ｍ９（１，３４ｍモル）を、ｎ−プロ
パツール１．９−と水４．８ｄとから成る混合物中に溶
かし、−を、２ＮＮａＯＨで９．０に調節した。次いで
、α−キモトリプシン１．９■を水７６液（０，５Ｎ　
Ｎａ十、０．０１　Ｎ　Ｃａ”）０．２−の形で添加し
た。−値を自動滴定システムを用いて一定に保持した。
６分後に、反応を氷酢酸３ゴの添加によって中断した。
反応混合物を例２と同様に後処理した。
Ｎａ−ホルミル−Ｌ−チロシル−Ｌ　−１，１７ンーｎ
−プロピルエステル（酢酸塩として）の収量：２９６ｍ
９（０，６７ｍモル；理論値の６７％）〔α］　　：＋
６．４°（０＝１；ＭｅＯＨ）融点：＞３２０°Ｃ アミノ酸分析’　Ｔｙｒ　１．０４　：　Ｌｙｓ　１．
００例４ 例６で製造されたＮｏ−ホルミル−Ｌ−チロシ／Ｉ／　
−Ｌ　−ＩＪ−）ノーｎ−プロピルエステル２９．４ｍ
９（６７μモル）およびＬ−メチオニンアミド−塩酸塩
（５ｅｒｖａ　２８８２２　）　２７．１１”９　（１
４７μモル）−と、ｎ−プロパツール０．１　ｄおよび
０．２Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，５）　０．４　ｍｌ中
に準備した。
…値を２　Ｎ　ＮａＯＨで９．２に調節した。次いで、
）　＋）　ｙ　シフ　（Ｍｅｒｃｋ　２４５８１　：　
ＴＰＣＫ処理）　０．４１ｍ９を水ｆ＆　Ｗｊ、（０，
５Ｎ　Ｈａ＋、０．０１　Ｎ　Ｏａ＋＋）　０．２Ｉｆ
ｌの形で加えた。６０秒後に、反応を酢酸０．３ｄの添
加によって中断した。反応混合物を例２と同様に後処理
した。
Ｎａ−ホルミル−Ｌ−チロシル−Ｌ−リシル−Ｌ−メチ
オニ／アミドの収量：　１８．５■（３９，６μモル：
理論匝の５９％）。
〔α］、；５：　＋　３．６°（０＝　０．２　：　Ｍ
ｅＯＨ８５％）アミノ酸分析’　Ｔｙｒ　１．１４　：
　Ｌｙｓ　０．９８　：　Ｍｅｔｌ、００ 例５ 例６で製造されたＮ（１−ホルミル−Ｌ−チロシン−ｎ
−プロピルエステル３７．７〜（１５μモル）およびＬ
−アルギニン−ｎ−プロピルエステル−２塩酸塩７５′
Ｉｎ９（２６μモル）をｎ−プロパツール０．３ｄおよ
び０．２Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，５）　０．４５　ｍ
ｌ中に準備した。ＰＨ全２ＮＮａＯＨで９．２に調節し
た。次いで、α−キモトリプ’１７０．９ｍ９”ｋ水溶
液（［］、５　Ｎ　Ｎａ”、０．０１Ｎ　Ｏａ”　）　
０．２　ｍｌの形で加えた。…値を山勘滴定システムを
用いて一定に保持した。５分後に・反応を酢酸０．３ｍ
／の添加によって中断した。反応混合物金側２と同様に
後処理した。
Ｎａ−ホルミル−Ｌ−チロシル−Ｌ−フルキ゛ニンーｎ
−プロピルエステルの収量：４８．９１ｎ９（９，６μ
モル；理論値の６４％）。
〔α几　ニー２．６９°（Ｃ−Ｑ、７　；　ＭｅＯＨ５
０％）アミノ酸分析’　Ｔ７ｒ　１．００　＋　ｋｒｇ
ｌ、１０例６ Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル−塩ｅ塩１００　
、！ｉ’　（０，４６モル）を水浴上で９８％ギ酸４０
０　ｍｌと無水酢酸７５ｍ１とから成る混合物に加えた
。引き続きジインプロピルエチルアミン０．４８モル（
塩化メチレン４８０　ｍｌ中）を添加し、室温で１５分
間攪拌した。後処理は例２と同様に行なった。生じたＮ
（：１−ホルミル−Ｌ−フェニルアラニン−メチルエス
テルを、ＩＨ−ＮＭＲ（ｃＤα、）　　：　　δ−８，
１ｐｐｍ　（ｓ　　、　　Ｉ　Ｈ２Ｈ−Ｃ！Ｏ−Ｎ“）
を用いて同定した。
改点：４３°Ｃ 〔α］Ｄ　：＋２４．９°（Ｃ−２：　ＭｅＯＨ）収（
ｔ　：　７０．４　！　（０，３４モル；理論値の７４
％）こうして段遺されたＮ（！−ホルミルーし一フェニ
ルアラニンメチルエステル０．８３９　（４ｍモル）お
よびＬ−ロイシンアミド−塩酸塩１．６６．９（８ｍモ
ル）を、５　Ｑ　ｍＭ　）リス緩衝液（ｒ）］９　）　
９０−１中に俗かした。ＰＨイ直を２　Ｎ　ＮａＯＨで
９．０に調節した。引き続きα−キモトリプシン３５ｍ
９　（０，Ｉ　Ｎ　Ｎａ”　／　０．０５　Ｎ　Ｏａ＋
＋水浴液水浴液５冫ｌ中加した。１５分後に、反応をメ
タノール３５０　ｍｌの添加によって中断した。さらに
６０分後、反応混合物を減圧下で４０ｍ１に濃縮した。
冷却時に生成物が晶出し、メタノール、／水から再結晶
させた。
ω点：＞２８０°Ｃ 生成物は質量分析（Ｍ＋Ｈ”＝３０６；Ｃよ。Ｈ２３Ｎ
３０３　）によって、Ｎ“−ホルミル−Ｌ−フェニルア
ラニル−ロイ７ンアミドと゛して同定された。
アミノ酸分析：　Ｐｈｅ　１．００　；　Ｌｅｕ　１．
１０収量：　０．７６　ｊｉ　（２，５ｍモル；理論値
の６２％）例７ 例１で製造されたＮｏ−ホルミル−Ｌ−チロシンメチル
エステル１．１２ｇ（５ｍモル）オヨヒＬ−アラニン８
．９１　、！９　（０，１モル）’に、１００ｍＭ　）
リス緩衝液（ｐＨ８，６）　９５ｊｔＪ中に溶かした。
反応溶液を２Ｎ　ＮａＯＨで−１８，６に調節した。
次いでカルボキシペプチダーゼＹ　（Ｏａｒｂｉｏｔｅ
ｃｈ）２０ｍ９を添加した。反応の間に、ＰＨを自動滴
定システムを用いて一定に保持した。６０分後に反応を
氷酢酸５０−の添加によって中断させた。
さらに６０分後に、反応混合物全減圧下で２５−まで濃
縮した。生成物′ｆ！：２回のゲルクロマトグラフィー
処理によって単離し、ｆｆ４製した（５×１０ｇ＆カラ
ム；セファデックスＧ１０、水溶液；流入：２ｔｘｌ／
分）。生じたＮ“−ホルミル−Ｌ−チロンルーＬ−アラ
ニン全’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）：δ−８，１ｐｐｍ
　（ｓ　＝　１　Ｈ、Ｈ−ＣＯ−、”　）”用いて同定
した。
７ミ／酸分析：　Ｔｙｒ　１．００　：　Ａｌａ　０．
８９収量：　０．５６９　（２ｍモル；理論値の４０％
）引き続き、生成物を０．５　Ｎ　ＨＣｌ５００　ｔｔ
ｔ中に溶かし、５６°Ｃで６時間攪拌した。脱ホルミル
化ゾペプチドは、市販のＬ−チロシル−Ｌ−アラ、二ン
と同様のＨＰＬＯ−溶離特性値を有した。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、セリン−またはチオールプロテアーゼの存在下に、
    カルボキシル成分としてのＮ＾α−保護α−アミノカル
    ボン酸エステルまたはＮ＾α−保護ペプチドエステルと
    、アミノ成分としてのα−アミノカルボン酸、α−アミ
    ノカルボン酸エステルまたはα−アミノカルボン酸アミ
    ドとの反応により酵素的にペプチドを合成する方法にお
    いて、Ｎ＾α−ホルミル基によつて保護されたカルボキ
    シル成分を使用することを特徴とする酵素的ペプチド合
    成法。 ２、少なくとも１当量の立体障害３級アミンの存在下に
    、α−アミノカルボン酸−またはペプチドエステル−塩
    酸塩と、ギ酸および無水酢酸から成る混合物との反応に
    よつて、Ｎ＾α−ホルミル基により保護されたカルボキ
    シル成分を製造する、請求項１記載の方法。 ３、３級アミンとして、Ｎ−エチル−ジイソプロピルア
    ミンを使用する、請求項２記載の方法。
JP2276189A 1988-02-03 1989-02-02 酵素的ペプチド合成法 Pending JPH01228496A (ja)

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DE19883803124 DE3803124A1 (de) 1988-02-03 1988-02-03 Verfahren zur enzymatischen peptidsynthese

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EP0326799A3 (de) 1990-10-10
DE3803124A1 (de) 1989-08-10
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