JPS6274296A - α―Ｌ―アスパルチル―Ｌ―フェニルアラニンメチルエステルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明ｄ、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フ
ェニルアラニンアルキルエステルヲ水性溶媒中でプロテ
アーゼを用いて反応させ、α−Ｌ−アスノξルチルーし
一フェニルアラニンアルキルエステルを製造する方法に
関する。

〔従来の技術〕

α−Ｌ−７ス・ぐルチル−Ｌ−フェニルアラニンアルキ
ルエステル（特にメチルエステル）はすぐれた甘味剤と
して知られており、その１？造法も種間知られている。

例えば、米国特許３．７８６．０３９、又は米国特許３
９３３．７２１においてはＮ−保護マス・やラギン酸無
水物分用いる化学合成法が記１取されているが、これら
の方法においては不要なβ−Ｌ−アス・セルチル−し−
フェニルアラニン誘導体を生成する為に必ずしも満足す
べきものではなう・り７た。一方、上記の欠点を克服す
る目的で、酵素を用いてＫｆチ１゛結合を生成させる方
法も検討されており、例えば米国特許４，０８６，１３
６及び特開昭６０−１６・１．４９５に記載されている
方法があるが、前者は保護基として高価なペンノルオキ
ン力ルポニル基等を用いる事、後者の方法においては腐
食性の強いギ酸を使用する事、又収率の点から必ずしも
６（４足すべきもので：Ｌ：ｊなかった。

〔発明が解決しようとする間：原点〕

本発明は、上記Ｎ−保獲アス・ぐラギン酸を用い酵素的
ニα−Ｌ−７ス／Ｆルチル−Ｌ−フェニルアラニンアル
キルエステルを製造する際つ従来＊：′こおける問題点
、即ち、使用する保護基が高価である、或１／−１は、
腐食性が強い等を解決し、Ｎ−保、】アスノクラギン酸
とＬ−フェニルアラニンアルキルエステルとを酵素によ
り効率よく結合することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

上記問題点を解決するため、発明者等′ｌｉ鋭意倹肘の
結果１驚＜べき事にＮ−アセチル−Ｌ−マス・２ラキン
酸がＬ−フェニルアラニンアルキルエステルと酵素によ
り効率よく結合する事を見出したう一方ペゾチド合成に
おけるアミン基の保護基としてアセチル基は極めて安価
である（てもかかわらず除去の際にノケトピベラノンが
多量に副生される事が知られ（蛋白質化学第１巻、赤堀
四朗逼）、効率のよい方法とは考λ、られｆ、　ａ　−
Ｌ−マス・やルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエス
テルノ製法においても米国特許３．９３３．７２１の本
文中て保護基としての記載はあるものの実施例はなく、
実質的に工業的な実施は不可能であると考えられて来、
ｔｏ しかしながら１、策〈べき事て高濃度の酸溶液において
Ｎ−アセチル−し−アスノ’？ルチル−Ｌ　−７ｘニル
アラニン及びそのモノ及びノエステル全加水分解する事
により、Ｋプチド結合を切断することなくＮ−アセチル
基のみを選択的に除去しうる事を見出し、本発明を完成
するに至った。

本発明方法において原料として用すられるＮ−アセチル
−Ｌ−アスノヤラギン酸及びＬ−フェニル−ｔ−ｙニン
アルキルエステルは既知の方法により容易（ｔζ合成で
きる。

本発明方法で用いられる酵素としては、蛋白分解酵素で
あれば特に制限；１なく、サーモライシン、トリプシン
、パ・ぐイン等あげられるが、中でもサーモライシンが
特（（好適に用いられる。又、酵素反応を行なう際の反
応液のＰＨはサーモライシンでは５〜８５、トリプシン
では７〜８、・ぐ・ンインでは６〜７、である。一方、
酵素反応はぜ１常、水溶液中で行なわれるが、その際、
反応に悪影響をおよぼさない有機溶媒が共存してもよい
事；ま言うまでもない。本発明の酵素反応は温度１０〜
９０℃、酵素活性を維持する観点から、好ましく）ま２
０〜５０℃で行なう。反応は通常約３０分から２，１時
間で完結するがこの反応時間に限定されろものではない
。本発明の方法において、両出発′吻質の使用濃度には
特に制限はないが、本酵素反応で４、生成したＮ−アセ
チル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンア
ルキルエステル＞ｉ　未反応のし一フェニルアラニンア
ルキルエステルとの付加物を形成して析出してくるので
、比校的高い方が望ましい。両出発物質の使用比率も特
に１ｉｌｌ　’Ｂ　ｉ寸ないが、反応の収率を向上させ
るために：ｄＮ−アセチルーＬ−７スノ９ラギン酸のＬ
−フェニルアラニンアルキルエステルに対する比率が大
きいほうがよい。

本発明の方法においては、生成するＮ−アセチルーα−
Ｌ−７スノ）０ルチル−Ｌ−フェニルアラニンアルキル
エステルはＬ−フェニルアラニンアルキルエステルとの
ｌ：１の付加物として得られるので、酸で中和すること
により遊離のＮ−アセチル−α−Ｌ−アスノソルチルー
Ｌ−フェニルアラニンアルキルエステルとした後、アセ
チル基を除去すれば容易にＡＰＭをえることができる。

７セチル基全除去するにはＮ−アセチル化合物を高濃度
の強酸の水溶液もしくはメタノール水溶液と接触させれ
ばより０本発明の方法において用いられる酸の濃度とし
ては、１．５　Ｎ以上、好１しくは１５〜６．　ＯＮが
選ばれる。強酸の種類としては塩酸、硫酸、ρ−トルエ
ンスルホン酸等があげられるが、なかでも塩酸が好適に
用いられる。Ｎ−アセチルーａ−Ｌ−アスノンルチルー
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの場合は強酸の水
溶液よりもメタノール水溶液の方がより好ましい。又、
メタノールと水の比率は特に制限はなく、任意に選択さ
れる。

以下実施例により詳細に説明するが、本発明の実施の態
様はこれに限定されないことは勿論である。

実施例１ Ｎ−アセチル−し−アメ／４’ラギン酸８．８．９（５
０ｍｍｏｌｅ　）を少量の水に懸濁し水酸化ナトリウム
水溶液でｐＨ６に調整した。Ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステル塩酸塩１０．６７！　（５０ｍｍｏｌｅ　）
を添加した後、Ｉ）ｌ′！全６．５洗し、更に水を加え
て液量を５Ｑｍｌにしな。サーモライシン０．４．９を
加え、２５℃で２４時間反応した後、得られたスラリー
を分離した。得られた白色固体はＮ−アセチル−α−Ｌ
−アス／ぐルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
ル及びＬ−フェニルアラニンメチルエステルのｌ＝１付
加物であることを確Ｕ　した。この固体中のＮ−アセチ
ル−α−Ｌ−アスノクルチルーＬ−フェニルアラニンメ
チルエステル全ＨＰＬＣにて定量したところ、３，８Ｉ
のＮ−アセチル−ａ−Ｌ−７スバルチルーし一フェニル
アラニンメチルエステルが含まれていた。これは収率が
３５冬であることを示している。

実施例１２ Ｎ−アセチル−Ｌ−アス・ぐラギンｅ８．８ｇ（５０ｍ
ｍｏｌｅ　）を少量の水に懸濁し水酸化ナトリウム水溶
液でｐＨ５，５Ｋ調整した。Ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステル塩酸塩２．１９（１０ｍｍｏｌｅ　）を添加
した後、ＰＨを５８にし、更に水を加えて液層を２５ｍ
１にした。サーモライシン０．５ｆｌｋ加Ｌ、３５゛Ｃ
で２．５時間反応させた後、得られたスラリーを分離し
、得られた固体を水で洗浄した後、乾燥した。このよう
にしてＮ−アセチル−α−Ｌ−アスノ？ルチルーし一フ
ェニルアラニンメチルエステルとＬ−フェニルアラニン
メチルエステルのｌ：１＠加主成物２．３　ｇ　（４，
６ｒｎｍｏｌｅ　）が得られた。

これは収率９２係であることをしめしている◎実施例３ Ｎ−アセチル−し−アスノ？ラギン酸８．８ｇ（５０ｍ
ｍｏｌｅ　）ｉ少量の水に懸濁し水酸化ナトリウム水溶
液でＰＨ５，５に調整した。Ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステル塩酸塩２］、、２．９（１００ｍｒｎ０１ｅ
　）を添加した後１．Ｈを６．６にし、更に水を加工て
液量を５０ｍ１にした。サーモライシン１．　ＯＩを加
え、３５°Ｃで２５時間反応させた後、得られたスラリ
ーを分離し、この固体を水で洗浄した後、乾燥した。こ
のようにしてＮ−アセチル−α−Ｌ−アスノ４ルチルー
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ−フェニルア
ラニンメチルエステルの１：１付加生成物１１．５１　
（２２，５ｒｎｍｏｌｅ　）が得られた。これは収率４
５壬であることをしめしている。

実施例４ Ｎ−アセチル−し−アス・やラギンａ４４　ｇ（２５０
ｍｍｏｌｅ　）を少量の水に懸濁し水酸化ナトリウム水
溶液でｐ）１５．５に調整した。Ｌ−フェニルアラニン
メチルエステル塩酸塩１０．５．９　（５０ｍｍｏｌｅ
　）を添加した後、ＰＨを５８にし、更に水を加えて液
量ｉ２５Ｑｍｌにした。サーモライシン２．５Ｉを加え
、３５°Ｃで２．５時間反応させた後、得られたスラリ
ーを分離し、この固体を水で洗浄した後、乾燥し次。こ
のようにしてＮ−アセチル−α−Ｌ−７スノｅルチルー
し−フェニルアラニンメチルエステルとＬ−フェニルア
ラニンメチルエステルの１：１付加生成物１１．５ｇ（
２２，５ｍｍｏｌｅ）が得られた。これは収率９２％に
あたる。

この固体を水に分散させｐＨを１．５に調整し、酢酸エ
チルで抽出した。酢酸エチル層を減圧下に濃縮し、Ｎ−
アセチル−α−Ｌ−アスＡルチルーＬ−フェニルアラニ
ンメチルエステル１０．９ｔ−１！た。

これを水５　ｍｌ、メタノール３　ｍｌの混合溶媒に加
え、濃塩酸２Ｍｌを添加して、６０°Ｃで２０分、その
後、更にｊ塩酸５　ｍｌを添加して２５°Ｃで４日間、
反応させた。析出したα−Ｌ−アス・母ルチル−し一フ
ェニルアラニンメチルエステル塩酸塩を分離し、この結
晶中のα−Ｌ−アスノヤルチルーＬ−フェニルアラニン
メチルエステルをＨＰＬＣで定量したところ、結晶中に
は５．１　ｇ　（１７，３ｍｍｏｌｅ　）のａ−Ｌ−ア
ス／Ｊ’ルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエステル
が含まれていた。

実施例５ Ｎ−アセチル−し−アス／ぐラギン酸８．８　Ｆ　（５
０ｍｍｏｌｅ）を少量の水に懸濁し水酸化す）　ＩＪウ
ム水溶液でＰＨ５，５に調整した。Ｌ−フェニルアラニ
ンイソプロピルエステル塩酸塩２．４　ｇ（１０ｍｒｎ
ｏｌｅ）を添加した後、ＰＦｌを５８にし、更に水を加
えて液１を５０ｍ１にした。サーモライシン０．５　ｊ
ｊを加え、３５°Ｃで２５時間反応させた後、得られた
スラリーを分離し、得られた固体を水で洗浄した後、乾
燥した。このよってしてＮ−アセチル−α−Ｌ−７７、
ノぞルチル−Ｌ−フェニルアラニンイングロビルエステ
ルとＬ−フェニルアラニンイノグロビルエステルの１：
１付加生成物２．７１　（４，７ｍｍｏｌｅ　）が得ら
れた。これは収率９３係であることをしめしている。

比較例１（実施例３に対比） Ｎ−ホルミル−Ｌ−アス／Ｐラギン酸８．１．！ｉ’（
５０ｍｍｏｌｅ　）を少量の水に懸濁し、水酸化ナトリ
ウム水溶液でｐｉ−１５，５に調整した。Ｌ−フェニル
アラニンメチルエステル塩駿塩２１．２／（１００ｍｍ
ｏｌｅ　）を添加した後、ｐＨを６，５にし、更に水に
加えて液量を５０　ｒｎｌにした。サーモライシン１．
ＯＩを加え、３５°Ｃで２．５時間反応させた後、得ら
れたスラリーを分離し、この固体を水で洗浄した後、乾
燥した。このようにしてＮ−ホルミル−α−Ｌ−アスノ
ヤルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ−
フェニルアラニンメチルエステルの１：１付加゛物９．
５　Ｅ　（１９ｍｍｏｌｅ　）が得られた。これは収率
３８壬であることをしめしている。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｎ−アセチル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェ
   ニルアラニンアルキルエステルの製造法において、Ｌ−
   アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニンとの間のペプチ
   ド結合生成を媒介することが公知の酵素の存在下で、Ｎ
   −アセチル−Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニ
   ンアルキルエステルを反応させ、次にこの混合液を酸性
   にしてジペプチド生成物を得ることを特徴とする方法。
2. （２）Ｌ−フェニルアラニンエステルは低級アルキルエ
   ステルである、特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）Ｌ−フェニルアラニンエステルはメチルエステル
   である、特許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）酵素はサーモライシンである、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。
5. （５）α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメ
   チルエステルの製造方法において、Ｌ−アスパラギン酸
   とＬ−フェニルアラニンメチルエステルとの間のペプチ
   ド結合生成を媒介することが公知の酵素の存在下で、Ｎ
   −アセチル−Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニ
   ンメチルエステルを反応させ、次にこのＮ−アセチルジ
   ペプチドエステルを加水分解してアセチル基を除去する
   ことを特徴とする、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニ
   ルアラニンメチルエステルの製造方法。
6. （６）酵素はサーモライシンである、特許請求の範囲第
   ５項記載の方法。
7. （７）アセチル基を除去する条件が、１．５Ｎ以上の強
   酸の水溶液もしくはメタノール水溶液である特許請求の
   範囲第６項の方法。