JPH0123060B2 - - Google Patents
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- JPH0123060B2 JPH0123060B2 JP7800181A JP7800181A JPH0123060B2 JP H0123060 B2 JPH0123060 B2 JP H0123060B2 JP 7800181 A JP7800181 A JP 7800181A JP 7800181 A JP7800181 A JP 7800181A JP H0123060 B2 JPH0123060 B2 JP H0123060B2
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
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- General Physics & Mathematics (AREA)
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、アドレナリンβ2受容体刺激性気管支
拡張剤（β―Stimulant）の酵素免疫定量法
（Enzyme Immuno assay、以下EIAという）に
よる定量方法に関するものである。
拡張剤（β―Stimulant）の酵素免疫定量法
（Enzyme Immuno assay、以下EIAという）に
よる定量方法に関するものである。
従来、種々のアドレナリンβ受容体刺激性気管
支拡張剤が臨床的に用いられているが、近年開発
された下記式(a)で表わされるクレンブテロール
（参考文献：Arznein.−Forsch.，26巻1404頁
（1976年））および下記式(b)，(c)で表わされるその
類縁体は、 特に優れた気管支拡張作用を有する、気管支喘
息、慢性気管支喘息治療剤である。
支拡張剤が臨床的に用いられているが、近年開発
された下記式(a)で表わされるクレンブテロール
（参考文献：Arznein.−Forsch.，26巻1404頁
（1976年））および下記式(b)，(c)で表わされるその
類縁体は、 特に優れた気管支拡張作用を有する、気管支喘
息、慢性気管支喘息治療剤である。
即ち、クレンブテロールおよびその類縁体はア
ドレナリンβ2受容体に対する高い選択性を有する
ので気管支に選択的に作用し、一方β1受容体刺激
による心臓に対する作用が低い。かつ又かゝるク
レンブテローンおよびその類縁体の臨床用量は、
従来のβ―Stimulantに比して著しく少なく、例
えばヒトにおけるクレンブテロールの１回当りの
服用量は20〜40μｇである。
ドレナリンβ2受容体に対する高い選択性を有する
ので気管支に選択的に作用し、一方β1受容体刺激
による心臓に対する作用が低い。かつ又かゝるク
レンブテローンおよびその類縁体の臨床用量は、
従来のβ―Stimulantに比して著しく少なく、例
えばヒトにおけるクレンブテロールの１回当りの
服用量は20〜40μｇである。
一方、一般に、薬理作用（又は副作用）は、薬
物の血液中濃度、組織中濃度と相関関係が存在し
ており、特に、ヒトにおける薬物の血液中濃度の
測定は臨床上極めて有意義である。クレンブテロ
ールおよびその類縁体は、臨床用量が極めて低い
ため、従来の測定方法ではその体液中濃度を測定
することができない。
物の血液中濃度、組織中濃度と相関関係が存在し
ており、特に、ヒトにおける薬物の血液中濃度の
測定は臨床上極めて有意義である。クレンブテロ
ールおよびその類縁体は、臨床用量が極めて低い
ため、従来の測定方法ではその体液中濃度を測定
することができない。
本発明者らは、クレンブテロールおよびその類
縁体の体液中濃度測定のための超微量定量方法に
ついて鋭意研究の結果、本発明に到達した。
縁体の体液中濃度測定のための超微量定量方法に
ついて鋭意研究の結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、クレンブテロールおよび
その類縁体のEIA法に関するものであり本発明に
よれば試料中の薬物濃度を極めて高感度に且つ再
現性良く測定可能であり、かつ又、その操作法も
簡便であり、迅速に多数の試料と処理することが
できる。
その類縁体のEIA法に関するものであり本発明に
よれば試料中の薬物濃度を極めて高感度に且つ再
現性良く測定可能であり、かつ又、その操作法も
簡便であり、迅速に多数の試料と処理することが
できる。
更に加えると、ラジオイムノアツセイ（Radio
immuno assay）法の如き特殊な施設機器等を必
要とせず、ごく一般的な設備および機器で実施す
ることができる。
immuno assay）法の如き特殊な施設機器等を必
要とせず、ごく一般的な設備および機器で実施す
ることができる。
しかして本発明によれば、下記式［］
〔式中、R1，R2は塩素原子又はトリフルオロ
メチル基、Ｘは−N2 +を表わす。〕 で表わされるクレンブテロール類と酵素とを、該
クレンブテロール類の基ｘを介して共有結合せし
めて得られる酵素標識抗原。
メチル基、Ｘは−N2 +を表わす。〕 で表わされるクレンブテロール類と酵素とを、該
クレンブテロール類の基ｘを介して共有結合せし
めて得られる酵素標識抗原。
上記式〔〕で表わされるクレンブテロール類
と高分子化合物とを、該クレンブテロール類の基
ｘを介して共有結合せしめて得られハプテン抗原
を動物に非経口的に投与して誘発せしめることに
より得られる抗ハプテン抗体、及び少なくとも下
記試薬 (a) 上記式〔〕で表わされるクレンブテロール
類と酵素とを、該クレンブテロール類の基ｘを
介して共有結合せしめて得られる酵素標識抗
原。
と高分子化合物とを、該クレンブテロール類の基
ｘを介して共有結合せしめて得られハプテン抗原
を動物に非経口的に投与して誘発せしめることに
より得られる抗ハプテン抗体、及び少なくとも下
記試薬 (a) 上記式〔〕で表わされるクレンブテロール
類と酵素とを、該クレンブテロール類の基ｘを
介して共有結合せしめて得られる酵素標識抗
原。
(b) 上記式〔〕で表わされるクレンブテロール
類と高分子化合物とを該クレンブテロール類の
基ｘを介して共有結合せしめて得られるハプテ
ン抗原を動物に非経口的に投与して誘発せしめ
ることにより得られる抗ハプテン抗体、 (c) 第２抗体を吸着せしめた担体、から構成され
ているクレンブテロール類のエンザイムイムノ
アツセイ用キツトが提供される。
類と高分子化合物とを該クレンブテロール類の
基ｘを介して共有結合せしめて得られるハプテ
ン抗原を動物に非経口的に投与して誘発せしめ
ることにより得られる抗ハプテン抗体、 (c) 第２抗体を吸着せしめた担体、から構成され
ているクレンブテロール類のエンザイムイムノ
アツセイ用キツトが提供される。
本発明のEIA法によれば、アドレナリンβ受容
体刺激性気管支拡張剤、特に上記式(a)のクレンブ
テロール及びその上記式(b)，(c)の類縁体の薬物濃
度を極めて高感度に且つ再現性良く測定すること
ができる。
体刺激性気管支拡張剤、特に上記式(a)のクレンブ
テロール及びその上記式(b)，(c)の類縁体の薬物濃
度を極めて高感度に且つ再現性良く測定すること
ができる。
EIAの原理は、一般的には酵素標識抗原および
それに対応する抗体ならびに被検体（非標識抗
原）を混合して競合的抗原抗体反応を行なわせし
めた後、当該抗体と結合した酵素標識抗原（以下
Ｂと略す）と当該抗体に結合しなかつた遊離の酵
素標識抗原（以下Ｆと略す）とを分離し、Ｆまた
はＢ中の標識酵素活性を測定し、あらかじめ作成
しておいた検量線から被検体中の抗原を定量する
ことによつて行なわれる。そして本発明のEIAに
あつては、被検体はクレンブテロール、その類縁
体等のアドレナリンβ受容体刺激性気管支拡張剤
でありかかる化合物は対応する抗体と特異的に結
合するが、それ自身を動物に非経口的に投与して
も対応する抗体の生産を惹起させないものであ
り、従つていわゆるハプテンと言われるものであ
る。また、酵素標識抗原は、上記式〔〕で表わ
されるクレンブテロール類と酵素とを共有結合せ
しめて得られる酵素標識抗原であり、抗体とは上
記式〔〕のクレンブテロール類と高分子化合物
を共有結合せしめて得られる結合物（いわゆるハ
プテン抗原である。）を動物に非経口的に投与し
て誘発せしめることにより得られる抗体（いわゆ
る抗ヘプテン抗体である）である。また本発明に
あつてはＦとＢとの分離はいわゆる二抗体法によ
つて行なわれる。
それに対応する抗体ならびに被検体（非標識抗
原）を混合して競合的抗原抗体反応を行なわせし
めた後、当該抗体と結合した酵素標識抗原（以下
Ｂと略す）と当該抗体に結合しなかつた遊離の酵
素標識抗原（以下Ｆと略す）とを分離し、Ｆまた
はＢ中の標識酵素活性を測定し、あらかじめ作成
しておいた検量線から被検体中の抗原を定量する
ことによつて行なわれる。そして本発明のEIAに
あつては、被検体はクレンブテロール、その類縁
体等のアドレナリンβ受容体刺激性気管支拡張剤
でありかかる化合物は対応する抗体と特異的に結
合するが、それ自身を動物に非経口的に投与して
も対応する抗体の生産を惹起させないものであ
り、従つていわゆるハプテンと言われるものであ
る。また、酵素標識抗原は、上記式〔〕で表わ
されるクレンブテロール類と酵素とを共有結合せ
しめて得られる酵素標識抗原であり、抗体とは上
記式〔〕のクレンブテロール類と高分子化合物
を共有結合せしめて得られる結合物（いわゆるハ
プテン抗原である。）を動物に非経口的に投与し
て誘発せしめることにより得られる抗体（いわゆ
る抗ヘプテン抗体である）である。また本発明に
あつてはＦとＢとの分離はいわゆる二抗体法によ
つて行なわれる。
上記の如く本発明の酵素標識抗原は下記式
〔〕 〔式中、R1，R2は塩素原子又はトリフルオロ
メチル基、Ｘは−N2 +を表わす。〕 で表わされるクレンブテロール類と酵素とを、該
クレンブテロール類の基ｘを介して共有結合せし
めて得られるものである。また抗ハプテン抗体は
上記式〔〕で表わされるクレンブテロール類と
高分子化合物とを該クレンブテロール類の基ｘを
介して共有結合せしめて得られるハプテン抗原を
動物に非経口的に投与して誘発せしめることによ
り得られるものである。
〔〕 〔式中、R1，R2は塩素原子又はトリフルオロ
メチル基、Ｘは−N2 +を表わす。〕 で表わされるクレンブテロール類と酵素とを、該
クレンブテロール類の基ｘを介して共有結合せし
めて得られるものである。また抗ハプテン抗体は
上記式〔〕で表わされるクレンブテロール類と
高分子化合物とを該クレンブテロール類の基ｘを
介して共有結合せしめて得られるハプテン抗原を
動物に非経口的に投与して誘発せしめることによ
り得られるものである。
上記式〔〕において、R1，R2は塩基原子又
はトリフルオロメチル基でありｘはジアゾニウム
塩（−N2 +）である。上記式〔〕の化合物は、
例えばクレンブテロールあるいは上記式〔ｂ〕，
〔ｃ〕の類縁体を通常の方法により塩酸酸性溶液
中で亜硝酸ソーダと反応させることによつて、上
記式〔〕においてｘが−N2 +である化合物が得
られる。
はトリフルオロメチル基でありｘはジアゾニウム
塩（−N2 +）である。上記式〔〕の化合物は、
例えばクレンブテロールあるいは上記式〔ｂ〕，
〔ｃ〕の類縁体を通常の方法により塩酸酸性溶液
中で亜硝酸ソーダと反応させることによつて、上
記式〔〕においてｘが−N2 +である化合物が得
られる。
かかる上記式〔〕で表わされるクレンブテロ
ール類の具体例としては、例えば下記式 で表わされるクレンブテロール類が挙げられる。
ール類の具体例としては、例えば下記式 で表わされるクレンブテロール類が挙げられる。
EIAにおいては、その測定感度、再現性等は、
被検薬と抗ハプテン抗体とが特異的結合能力を有
しているか否か、あるいは抗ハプテン抗体が酵素
標識抗原と非標識抗原、すなわち被検体中の抗原
もしくは検量線作成用標準抗原とほぼ同等な結合
能力を有するか否かに依存している。そして本発
明の如く上記式〔〕のクレンブテロール類を用
いて、以下に示す如く酵素標識抗原、あるいは抗
ハプテン抗体を調整することによつて、上記した
要求を満足する結合能力を有する酵素標識抗原、
抗ハプテン抗体が得られる。
被検薬と抗ハプテン抗体とが特異的結合能力を有
しているか否か、あるいは抗ハプテン抗体が酵素
標識抗原と非標識抗原、すなわち被検体中の抗原
もしくは検量線作成用標準抗原とほぼ同等な結合
能力を有するか否かに依存している。そして本発
明の如く上記式〔〕のクレンブテロール類を用
いて、以下に示す如く酵素標識抗原、あるいは抗
ハプテン抗体を調整することによつて、上記した
要求を満足する結合能力を有する酵素標識抗原、
抗ハプテン抗体が得られる。
また本発明においては、上記式〔〕で表わさ
れるいずれかの化合物を用いて調整される酵素標
識抗原、抗ハプテン抗体等を用いることによつ
て、クレンブテロールあるいはその類縁体のいず
れのものも定量することが可能である。酵素標識
抗原を得る際にクレンブテロール類と共有結合せ
しめる酵素としては、上記式〔〕のクレンブテ
ロール類と結合させた後においても基質特異性が
高く高感度で簡単にその活性が測定でき、しかも
安定であり、加えてその酵素の基質もしくはその
酵素活性を阻害する物質が被検体中に存在しない
酵素を選択する必要があり、かかる要求を満足す
るものとしてβ―Ｄ―ガラクトシダーゼ、グルコ
ースオキシターゼ、リパーゼ、アルカリホスフア
ターゼ，ペロキシダーゼ等が挙げられ、これらの
なかでも特に、β―Ｄ―ガラクトシダーゼが好ま
しい。上記式〔〕のクレンブテロール類と酵素
とは、上記式〔〕の基ｘの−N2 +を介して酵素
分子中に存在するフエノール残基、ヒスチジン残
基と反応せしめられて共有結合を形成し、酵素標
識抗原となる。
れるいずれかの化合物を用いて調整される酵素標
識抗原、抗ハプテン抗体等を用いることによつ
て、クレンブテロールあるいはその類縁体のいず
れのものも定量することが可能である。酵素標識
抗原を得る際にクレンブテロール類と共有結合せ
しめる酵素としては、上記式〔〕のクレンブテ
ロール類と結合させた後においても基質特異性が
高く高感度で簡単にその活性が測定でき、しかも
安定であり、加えてその酵素の基質もしくはその
酵素活性を阻害する物質が被検体中に存在しない
酵素を選択する必要があり、かかる要求を満足す
るものとしてβ―Ｄ―ガラクトシダーゼ、グルコ
ースオキシターゼ、リパーゼ、アルカリホスフア
ターゼ，ペロキシダーゼ等が挙げられ、これらの
なかでも特に、β―Ｄ―ガラクトシダーゼが好ま
しい。上記式〔〕のクレンブテロール類と酵素
とは、上記式〔〕の基ｘの−N2 +を介して酵素
分子中に存在するフエノール残基、ヒスチジン残
基と反応せしめられて共有結合を形成し、酵素標
識抗原となる。
本発明で用いる抗ハプテン抗体は前記したよう
に、上記式〔〕のクレンブテロール類と高分子
化合物とを共有結合せしめて得られるハプテン抗
原を動物に非経口的に投与して誘発せしめたもの
である。
に、上記式〔〕のクレンブテロール類と高分子
化合物とを共有結合せしめて得られるハプテン抗
原を動物に非経口的に投与して誘発せしめたもの
である。
ここで高分子化合物としては、ヒト血清アルブ
ミン（HSA）、牛血清アルブミン（BSA）など
が好ましいものとして挙げられる。
ミン（HSA）、牛血清アルブミン（BSA）など
が好ましいものとして挙げられる。
かかる高分子化合物と上記式〔〕のクレンブ
テロール類とを共有結合せしめてハプテン抗原を
得るには前記した酵素標識抗原の調整法とほぼ同
様の方法によつて得ることができる。このハプテ
ン抗原をFreund′scompleteアジユバント等のア
ジユバントと共に常法により動物に非経口的に投
与して、すなわち動物の皮内または皮下に注射し
対応する抗ハプテン抗体を生産せしめ、ついで採
血し、その後硫安分画あるいはゲル過法等の手
段でIgG分画を得ることによつて抗ハプテン抗体
を調整することができる。あるいはまた採血し、
血清を得て、そのまま用いることもできる。ここ
で用いられる動物としては兎、ヤギ、モルモツト
が挙げられるが兎が好ましい。また採血は、定期
的に血中抗体価を測定しながら最も高い時点で全
採血するのがよい。
テロール類とを共有結合せしめてハプテン抗原を
得るには前記した酵素標識抗原の調整法とほぼ同
様の方法によつて得ることができる。このハプテ
ン抗原をFreund′scompleteアジユバント等のア
ジユバントと共に常法により動物に非経口的に投
与して、すなわち動物の皮内または皮下に注射し
対応する抗ハプテン抗体を生産せしめ、ついで採
血し、その後硫安分画あるいはゲル過法等の手
段でIgG分画を得ることによつて抗ハプテン抗体
を調整することができる。あるいはまた採血し、
血清を得て、そのまま用いることもできる。ここ
で用いられる動物としては兎、ヤギ、モルモツト
が挙げられるが兎が好ましい。また採血は、定期
的に血中抗体価を測定しながら最も高い時点で全
採血するのがよい。
かくして酵素標識抗原、抗ハプテン抗体が得ら
れ、この酵素標識抗原、抗ハプテン抗体ならびに
被検体（すなわち非標識抗原）を混合して競合的
抗原抗体反応を行なわしめた後、該抗体と結合し
た酵素標識抗原(B)と結合しなかつた酵素標識抗原
(F)とを分離し、ＦあるいはＢ中の、好ましくはＢ
中の酵素活性を測定し、あらかじめ作成しておい
た検量線から被検体中の抗原を定量することによ
つてEIAの定量が行なわれる。
れ、この酵素標識抗原、抗ハプテン抗体ならびに
被検体（すなわち非標識抗原）を混合して競合的
抗原抗体反応を行なわしめた後、該抗体と結合し
た酵素標識抗原(B)と結合しなかつた酵素標識抗原
(F)とを分離し、ＦあるいはＢ中の、好ましくはＢ
中の酵素活性を測定し、あらかじめ作成しておい
た検量線から被検体中の抗原を定量することによ
つてEIAの定量が行なわれる。
ＦとＢとの分離は、本発明にあつて二抗体法に
より行なわれる。二抗体法に用いられる第２抗体
は、前記抗ハプテン抗体を調整するときに用いた
高分子化合物を動物に非経口的に投与し誘発せし
められた抗体を更に動物に非経口的に投与して誘
発せしめられた抗体を用いる。通常第２の抗体の
作成は第１の抗体を作つた動物が兎であるなら
ば、ヤギを用いて作るのが好ましい。あるいはま
た第２抗体として、兎のIgGをヤギに非経口的に
投与して誘発される抗兎IgGのIgGフラクシヨン
を用いることもできる。
より行なわれる。二抗体法に用いられる第２抗体
は、前記抗ハプテン抗体を調整するときに用いた
高分子化合物を動物に非経口的に投与し誘発せし
められた抗体を更に動物に非経口的に投与して誘
発せしめられた抗体を用いる。通常第２の抗体の
作成は第１の抗体を作つた動物が兎であるなら
ば、ヤギを用いて作るのが好ましい。あるいはま
た第２抗体として、兎のIgGをヤギに非経口的に
投与して誘発される抗兎IgGのIgGフラクシヨン
を用いることもできる。
この第２抗体を用いてＦとＢを分離するには第
２抗体を適当な担体に物理的に吸着させておい
て、Ｂを、該担体に吸着せしめられた第２抗体と
結合せしめて不溶化するいわゆる二抗体固相法が
好適である。ここで用いる担体としては、例え
ば、ポリスチレンボール、ポリスチレンプレー
ト、ポリスチレンチユーブ、ガラス板、シリコン
片、シリコンチユーブなどが挙げられる。
２抗体を適当な担体に物理的に吸着させておい
て、Ｂを、該担体に吸着せしめられた第２抗体と
結合せしめて不溶化するいわゆる二抗体固相法が
好適である。ここで用いる担体としては、例え
ば、ポリスチレンボール、ポリスチレンプレー
ト、ポリスチレンチユーブ、ガラス板、シリコン
片、シリコンチユーブなどが挙げられる。
かくして分離されたＢ中の酵素活性を測定する
ことによつて、EIAの定量が行なわれる。
ことによつて、EIAの定量が行なわれる。
以上に述べた酵素標識抗原、抗ハプテン抗体等
はキツト化するのが取扱いに便利である。
はキツト化するのが取扱いに便利である。
しかして本発明によれば、少なくとも下記試薬
(a) 上記式〔〕で表わされるクレンブテロール
類と酵素とを、該クレンブテロール類の基ｘを
介して共有結合せしめて得られる酵素標識抗
原、 (b) 上記式〔〕で表わされるクレンブテロール
類と高分子化合物とを該クレンブテロール類の
基ｘを介して共有結合せしめて得られるハプテ
ン抗原を動物に非経口的に投与して誘発せしめ
ることにより得られる抗ハプテン抗体。
類と酵素とを、該クレンブテロール類の基ｘを
介して共有結合せしめて得られる酵素標識抗
原、 (b) 上記式〔〕で表わされるクレンブテロール
類と高分子化合物とを該クレンブテロール類の
基ｘを介して共有結合せしめて得られるハプテ
ン抗原を動物に非経口的に投与して誘発せしめ
ることにより得られる抗ハプテン抗体。
(c) 第２抗体を吸着せしめた担体、から構成され
ているクレンブテロールおよびその類縁体のエ
ンザイムイムノアツセイ用キツトが提供され
る。
ているクレンブテロールおよびその類縁体のエ
ンザイムイムノアツセイ用キツトが提供され
る。
これらのキツトに用いられる上記試薬(a)，(b)，
(c)は前述した方法によつて製造される。
(c)は前述した方法によつて製造される。
かかるキツトには、緩衝化剤、クレンブテロー
ルあるいはその類縁体の標準溶液，酵素定量用試
薬等が付加される。この酵素定量用試薬としては
例えば酵素活性測定用基質、発色剤、酵素反応停
止剤等が挙げられる。
ルあるいはその類縁体の標準溶液，酵素定量用試
薬等が付加される。この酵素定量用試薬としては
例えば酵素活性測定用基質、発色剤、酵素反応停
止剤等が挙げられる。
以上に述べた如く本発明によればアドレナリン
β受容体刺激性気管支拡張剤であるクレンブテロ
ールあるいはその類縁体の好ましいEIA法が提供
される。
β受容体刺激性気管支拡張剤であるクレンブテロ
ールあるいはその類縁体の好ましいEIA法が提供
される。
以下本発明を実施例により更に詳細に説明す
る。
る。
参考例
〔クレンブテロール―HSAの製法〕
小型フラスコに純水0.4mlを入れ、これにクレ
ンブテロール３mgを溶解し、更にINHclを加えて
溶液のPHを1.5に調整する。冷時、撹拌下（しや
光下）NaNO2溶液0.2ml（NaNO215mg／mlH2O）
を滴下し、約30分間反応させる。アンモニウスル
フアメート溶液を徐々に滴下し、過剰のニトロソ
ニウムイオンを分解する。
ンブテロール３mgを溶解し、更にINHclを加えて
溶液のPHを1.5に調整する。冷時、撹拌下（しや
光下）NaNO2溶液0.2ml（NaNO215mg／mlH2O）
を滴下し、約30分間反応させる。アンモニウスル
フアメート溶液を徐々に滴下し、過剰のニトロソ
ニウムイオンを分解する。
かくして得られたクレンブテロールのジアゾ化
体の溶液をHSAのリン酸緩衝液（0.1モル溶液、
PH7.4）１mlに徐々に滴下する。
体の溶液をHSAのリン酸緩衝液（0.1モル溶液、
PH7.4）１mlに徐々に滴下する。
反応液をIN NaOHでPH7.5に維持しながら冷
時一夜撹拌する。
時一夜撹拌する。
反応終了後、リン酸緩衝液（0.01モル，PH7.5）
を透析外液として用いて透析を行ない低分子化合
物を除去すると、クレンブテロール―HSA溶液
が得られる。
を透析外液として用いて透析を行ない低分子化合
物を除去すると、クレンブテロール―HSA溶液
が得られる。
実施例 １
〔抗ハプテン抗体（抗クレンブテロール血清）
の製法〕 クレンブテロール―HSA0.5mgをcomplete
Freund′sアジユバントと共に家兎背部皮内に注
射し初回免疫を行う。その後２週間隔で0.2〜0.5
mgの蛋白で免疫し、免疫開始後２〜４ケ月に酵素
免疫測定法に使用可能な抗血清が得られた。
の製法〕 クレンブテロール―HSA0.5mgをcomplete
Freund′sアジユバントと共に家兎背部皮内に注
射し初回免疫を行う。その後２週間隔で0.2〜0.5
mgの蛋白で免疫し、免疫開始後２〜４ケ月に酵素
免疫測定法に使用可能な抗血清が得られた。
実施例 ２
〔クレンブテロール〜β―Ｄ―ガラクトシダー
ゼ（酵素標識抗原）の製法〕 小型バイアルビン中の純水0.4mlにクレンブテ
ロール0.02mgを溶解させ、2NHcl0.01mlを加え、
PH１とする。遮光下、冷時撹拌しながら0.2mlの
NaNO2溶液（0.1mg／ml）をゆつくりと滴下し、
全量滴下後30分放置する。
ゼ（酵素標識抗原）の製法〕 小型バイアルビン中の純水0.4mlにクレンブテ
ロール0.02mgを溶解させ、2NHcl0.01mlを加え、
PH１とする。遮光下、冷時撹拌しながら0.2mlの
NaNO2溶液（0.1mg／ml）をゆつくりと滴下し、
全量滴下後30分放置する。
その後0.01mlアンモニウムスルホネート溶液
（25mg／ml）を加え遊離ニトロソニウムイオンを
除去した。
（25mg／ml）を加え遊離ニトロソニウムイオンを
除去した。
0.2mlの0.01Mリン酸緩衝液PH7.5（0.1MNacl，
1mMMgcl2を含む）にβ―Ｄ―ガラクトシダー
ゼ0.05mg（Ｅ，coli，470μ／mg．シクマ社製）を
混合したものに上記クレンブテロールのジアゾ化
体溶液0.1mlを徐々に添加する。その間、溶液を
1NNaOHでPH7.6〜PH7.7に調節する。
1mMMgcl2を含む）にβ―Ｄ―ガラクトシダー
ゼ0.05mg（Ｅ，coli，470μ／mg．シクマ社製）を
混合したものに上記クレンブテロールのジアゾ化
体溶液0.1mlを徐々に添加する。その間、溶液を
1NNaOHでPH7.6〜PH7.7に調節する。
２時間放置後、上記緩衝液0.2mlを加え全量0.5
mlとした。直ちに上記緩衝液を透折外液として透
折を行なつた。透折後これをクレンブテロール〜
β―Ｄ―ガラクトシダーゼの原液とし冷時保存し
た。
mlとした。直ちに上記緩衝液を透折外液として透
折を行なつた。透折後これをクレンブテロール〜
β―Ｄ―ガラクトシダーゼの原液とし冷時保存し
た。
参考例 ２
〔第２抗体を吸着せしめた担体の製造〕
マイルズ―イエダ社製のウサギ―1gGに対する
ヤギ抗体（1gG fraction of anti―rabbitlgG
（Gout））を0.05Mリン酸緩衝液（PH7.5，0.1％
NaN3を含む）で50倍希釈し、その中にポリスチ
レンボール（1/4インチ）を４℃で一液浸す。
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.6，0.1％BSA，0.1M
Nacl及び1mMMgcl2を含む。以下A1緩衝液とい
う）で３回洗浄後、同一の緩衝液中で冷時保存し
た。
ヤギ抗体（1gG fraction of anti―rabbitlgG
（Gout））を0.05Mリン酸緩衝液（PH7.5，0.1％
NaN3を含む）で50倍希釈し、その中にポリスチ
レンボール（1/4インチ）を４℃で一液浸す。
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.6，0.1％BSA，0.1M
Nacl及び1mMMgcl2を含む。以下A1緩衝液とい
う）で３回洗浄後、同一の緩衝液中で冷時保存し
た。
実施例 ３
(a) 〔測定法〕
(1) 〔サンプルの調製〕
小試験管にA2緩衝液（0.1Mリン酸緩衝液、PH
6.6，0.1M.Nacl，1mMMgcl2を含む）0.3mlを入
れ、つづいて血奨0.1mlを入れ混合する。この小
試験管を沸とう水中で1min間加熱する。直ちに
氷水中で冷却し、遠心し、その上清をサンプルと
した。
6.6，0.1M.Nacl，1mMMgcl2を含む）0.3mlを入
れ、つづいて血奨0.1mlを入れ混合する。この小
試験管を沸とう水中で1min間加熱する。直ちに
氷水中で冷却し、遠心し、その上清をサンプルと
した。
(2) 〔方法〕
まず小試験管に、A2緩衝液で調製したスタン
ダードクレンブテロール（0.125〜64pg）0.1ml又
はサンプル0.1mlを入れ、これに５％BSAを含む
緩衝液で8000倍に希釈した。クレンブテロール〜
β―Ｄ―ガラクトンダーゼ0.05mlを加える。更に
５％BSAを含むA2緩衝液で40000倍に希釈した抗
血清0.05mlを加えよく混合し、４℃、一夜放置さ
せた。これにA2緩衝液0.2mlを混合し、そこに第
２抗体をコートしたポリスチレンボール（1/4イ
ンチ）を入れ、５時間撹拌（室温）を行なつた。
ダードクレンブテロール（0.125〜64pg）0.1ml又
はサンプル0.1mlを入れ、これに５％BSAを含む
緩衝液で8000倍に希釈した。クレンブテロール〜
β―Ｄ―ガラクトンダーゼ0.05mlを加える。更に
５％BSAを含むA2緩衝液で40000倍に希釈した抗
血清0.05mlを加えよく混合し、４℃、一夜放置さ
せた。これにA2緩衝液0.2mlを混合し、そこに第
２抗体をコートしたポリスチレンボール（1/4イ
ンチ）を入れ、５時間撹拌（室温）を行なつた。
上記で撹拌を行なつたボールをA1緩衝液で２
回洗浄し、ボールを予め新しい試験管に移す。こ
れにA1緩衝液0.2mlを入れておいてβ―Ｄ―ガラ
クトシダーゼの基質である４―MUG（４―メチ
ルウムベリフエリルクリコシド：４―
methylumbelliferyl glucoside）溶液0.2ml（１
mg／10ml水）を加え、軽くボルテツクスミキサー
にかけ37℃、1.5時間インキユベーシヨンを行な
つた。酵素反応は2.5mlの0.1Mグリシン緩衝液PH
10.3を加えて停止させた。
回洗浄し、ボールを予め新しい試験管に移す。こ
れにA1緩衝液0.2mlを入れておいてβ―Ｄ―ガラ
クトシダーゼの基質である４―MUG（４―メチ
ルウムベリフエリルクリコシド：４―
methylumbelliferyl glucoside）溶液0.2ml（１
mg／10ml水）を加え、軽くボルテツクスミキサー
にかけ37℃、1.5時間インキユベーシヨンを行な
つた。酵素反応は2.5mlの0.1Mグリシン緩衝液PH
10.3を加えて停止させた。
螢光強度は、励起波長360nm，螢光波長450nm
を用いて、螢光分光光度計にて測定を行なつた。
を用いて、螢光分光光度計にて測定を行なつた。
(b) 〔検量線の作成〕
前記〔測定法〕に記載の標準クレンブテロール
溶液、酵素標識抗原及び抗ハプテン抗体を用いて
第１図に示す如き検量線を作成した。この検量線
より本発明のEIAの測定可能範囲は0.125〜
64pg／チユーブである。
溶液、酵素標識抗原及び抗ハプテン抗体を用いて
第１図に示す如き検量線を作成した。この検量線
より本発明のEIAの測定可能範囲は0.125〜
64pg／チユーブである。
(c) 〔血奨中のクレンブテロールの濃度測定〕
雄性ラツト（300ｇ）にクレンブテロール10μg
を経口投与した後、耳静脈より経時採血し、得ら
れた血奨中のクレンブテロールの濃度を上記測定
法(a)に準じて測定した。
を経口投与した後、耳静脈より経時採血し、得ら
れた血奨中のクレンブテロールの濃度を上記測定
法(a)に準じて測定した。
結果は第２図に示したとおりである。
実施例 ４
健常人３名にクレンブテロールを20μg1回経口
投与した時の血清中のクレンブテロール濃度の経
時変化を本発明の方法により測定した。
投与した時の血清中のクレンブテロール濃度の経
時変化を本発明の方法により測定した。
結果は第３図に示したとおりである。
実施例 ５
〔クレンブテロール定量用キツトの調整〕
下記した方法によつて、それぞれ試薬を調整
し、クレンブテロールEIA法測定用キツトを作成
した。
し、クレンブテロールEIA法測定用キツトを作成
した。
(a) 酵素標識抗原
前記〔クレンブテロール〜β―Ｄ―ガラクトシ
ダーゼコンジゲートの製法〕で得られる原液を５
％BSAを含むA2緩衝液で10000倍に希釈して総量
25mlとなし、その2.5mlずつを５ml容のガラスビ
ンに分注して酵素標識抗原を調整した。
ダーゼコンジゲートの製法〕で得られる原液を５
％BSAを含むA2緩衝液で10000倍に希釈して総量
25mlとなし、その2.5mlずつを５ml容のガラスビ
ンに分注して酵素標識抗原を調整した。
(b) 抗ハプテン抗体
前記〔抗ハプテン抗体の製法〕で得られる抗ハ
プテン抗体を５％BSAを含むA2緩衝液で50000倍
に希釈して総量25mlとなし、その2.5mlずつを５
ml容のガラスビンに分注して抗ハプテン抗体を調
整した。
プテン抗体を５％BSAを含むA2緩衝液で50000倍
に希釈して総量25mlとなし、その2.5mlずつを５
ml容のガラスビンに分注して抗ハプテン抗体を調
整した。
(c) 第二抗体を吸着せしめた担体
前記〔測定法〕の〔方法〕において記載したと
同様の方法にて、ウサギ―IgGに対するヤギ第２
抗体（IgG fraction of anti―rabbit I′gG
（Goot））をスチレンボールに吸着せしめ、A1緩
衝液中に保存し、第２抗体を吸着せしめた担体を
調整した。
同様の方法にて、ウサギ―IgGに対するヤギ第２
抗体（IgG fraction of anti―rabbit I′gG
（Goot））をスチレンボールに吸着せしめ、A1緩
衝液中に保存し、第２抗体を吸着せしめた担体を
調整した。
(d) 酵素活性測定用基質
β―ガラクトシダーゼの基質である４―
MUG10mgをA1緩衝液100mlに溶解し、それを各
10mlずつ20ml容のガラスビンに分注して酵素活性
測定用基質を調整した。
MUG10mgをA1緩衝液100mlに溶解し、それを各
10mlずつ20ml容のガラスビンに分注して酵素活性
測定用基質を調整した。
(e) クレンブテロール標準溶液
５％BSAを含むA2緩衝液にクレンブテロール
を溶解せしめ、250pg／mlの濃度の溶液50mlを
得、その５mlを10ml容のビンに分注した。
を溶解せしめ、250pg／mlの濃度の溶液50mlを
得、その５mlを10ml容のビンに分注した。
第１図は濃度既知のクレンブテロール溶液を用
い作成した検量線を表わし、第２図は雄性ラツト
にクレンブテロールを経口投与し、血奨中のクレ
ンブテロール濃度を、第３図は健常人にクレンブ
テロールを経口投与し、血奨中のクレンブテロー
ル濃度を本発明のEIA法によつて測定した時の結
果を表わす。
い作成した検量線を表わし、第２図は雄性ラツト
にクレンブテロールを経口投与し、血奨中のクレ
ンブテロール濃度を、第３図は健常人にクレンブ
テロールを経口投与し、血奨中のクレンブテロー
ル濃度を本発明のEIA法によつて測定した時の結
果を表わす。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記式［］ 〔式中、R1，R2は塩素原子又はトリフルオロ
メチル基，Ｘは−N2 +を表わす。〕 で表わされるクレンブテロール類と酵素とを、該
クレンブテロール類の基Ｘを介して共有結合せし
めて得られる酵素標識抗原。 ２ 上記式［］においてＸが−N2 +である特許
請求の範囲第１項記載の酵素標識抗原。 ３ 酵素がβ―Ｄ―ガラクトシダーゼである特許
請求の範囲第１項又は第２項記載の酵素標識抗
原。 ４ 少なくとも下記試薬 (a) 下記式［］ 〔式中、R1，R2は塩素原子又はトリフルオロ
メチル基、Ｘは−N2 +を表わす。〕 で表わされるクレンブテロール類と酵素とを、該
クレンブテロール類の基Ｘを介して共有結合せし
めて得られる酵素標識抗原、 (b) 上記式［］で表わされるクレンブテロール
類と高分子化合物とを該クレンブテロール類の
基Ｘを介して共有結合せしめて得られるハプテ
ン抗原を動物に非経口的に投与して誘発せしめ
ることにより得られる抗ハプテン抗体、 (c) 第２抗体を吸着せしめた担体、からの構成さ
れているクレンブテロール類のエンザイムイム
ノアツセイ用キツト。 ５ 第２抗体を吸着せしめた担体がスチレンボー
ルである特許請求の範囲第４項記載のクレンブテ
ロール類のエンザイムイムノアツセイ用キツト。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7800181A JPS57192867A (en) | 1981-05-25 | 1981-05-25 | Enzyme immunoassay method of clenbuterol and its analog |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7800181A JPS57192867A (en) | 1981-05-25 | 1981-05-25 | Enzyme immunoassay method of clenbuterol and its analog |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57192867A JPS57192867A (en) | 1982-11-27 |
| JPH0123060B2 true JPH0123060B2 (ja) | 1989-04-28 |
Family
ID=13649557
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7800181A Granted JPS57192867A (en) | 1981-05-25 | 1981-05-25 | Enzyme immunoassay method of clenbuterol and its analog |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS57192867A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6111664A (ja) | 1984-06-28 | 1986-01-20 | Ono Pharmaceut Co Ltd | プロスタグランジン類の酵素免疫測定用試薬組成物及び該組成物を用いたプロスタグランジン類の測定方法 |
| CN1300584C (zh) * | 2002-12-05 | 2007-02-14 | 国家饲料质量监督检验中心(北京) | 盐酸克伦特罗检测试剂条及其制造方法 |
| CN1332203C (zh) * | 2005-11-10 | 2007-08-15 | 上海交通大学 | 检测动物性食品中盐酸克伦特罗的快速测试方法 |
| CN104569408B (zh) * | 2014-12-30 | 2016-06-22 | 无锡中德伯尔生物技术有限公司 | 一种非诺特罗的胶体金检测卡及其制备方法 |
| CN106153607A (zh) * | 2016-08-23 | 2016-11-23 | 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 一种盐酸克伦特罗化学发光法定量测定试剂盒 |
| CN109490537A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-03-19 | 武汉上成生物科技有限公司 | 一种瘦肉精试纸条及其制备方法 |
-
1981
- 1981-05-25 JP JP7800181A patent/JPS57192867A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS57192867A (en) | 1982-11-27 |
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