JPH0123062B2 - - Google Patents
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- JPH0123062B2 JPH0123062B2 JP57150169A JP15016982A JPH0123062B2 JP H0123062 B2 JPH0123062 B2 JP H0123062B2 JP 57150169 A JP57150169 A JP 57150169A JP 15016982 A JP15016982 A JP 15016982A JP H0123062 B2 JPH0123062 B2 JP H0123062B2
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- JP
- Japan
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- hapten
- enzyme
- antigen
- galactosidase
- antibody
- Prior art date
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- Expired
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、均一相の酵素免疫法の原理を用いて
抗原又はハプテンを測定する方法及びそれを実施
するための試薬に関する。
抗原又はハプテンを測定する方法及びそれを実施
するための試薬に関する。
血清成分及び類似の生物学的物質の臨庄化学的
分析の増加数に基づき、この種の方法の自動化が
重要になつている。自動化によつてのみ、この種
の測定の増加数を克服することができ、この際に
測定に必要な操作経費を低減させることもでき
る。
分析の増加数に基づき、この種の方法の自動化が
重要になつている。自動化によつてのみ、この種
の測定の増加数を克服することができ、この際に
測定に必要な操作経費を低減させることもでき
る。
臨庄診断における重要な進歩は、免疫反応の成
分の測定法の開発であつた。従つて、ラジオイム
ノアツセイ（Radio―Immuno―Assay：RIA）
の方法により、この種の測定の感度の著るしい増
加が達成された。このRIAの欠点、即ち放射性物
質を用いて扱うべき必要性は、放射性マーキング
を酵素マーキングで代えることにより除去でき、
いわゆる酵素イムノ・アツセイ（Enzyme―
Immuno―Assay：EIA）が得られた。この方法
では、免疫反応の酵素マークされた一定量の成分
と、マークされていない未知量で存在する測定す
べき成分とを、免疫反応の共通成分即ち、特異的
に結合する蛋白質又はこれと結合しうる物質に関
して競争させる。いわゆるエリザ法（ELISA―
Methode）では、結合成分を、被測定物質とを
酵素マークされた物質とを競争させるために、遊
離のかつ結合した酵素マークされた物質の分離を
容易にするために固体形で使用している。しかし
ながら、この不均一法を分析自動装置で実施する
際には、一般に添加物調整が必要である。
分の測定法の開発であつた。従つて、ラジオイム
ノアツセイ（Radio―Immuno―Assay：RIA）
の方法により、この種の測定の感度の著るしい増
加が達成された。このRIAの欠点、即ち放射性物
質を用いて扱うべき必要性は、放射性マーキング
を酵素マーキングで代えることにより除去でき、
いわゆる酵素イムノ・アツセイ（Enzyme―
Immuno―Assay：EIA）が得られた。この方法
では、免疫反応の酵素マークされた一定量の成分
と、マークされていない未知量で存在する測定す
べき成分とを、免疫反応の共通成分即ち、特異的
に結合する蛋白質又はこれと結合しうる物質に関
して競争させる。いわゆるエリザ法（ELISA―
Methode）では、結合成分を、被測定物質とを
酵素マークされた物質とを競争させるために、遊
離のかつ結合した酵素マークされた物質の分離を
容易にするために固体形で使用している。しかし
ながら、この不均一法を分析自動装置で実施する
際には、一般に添加物調整が必要である。
抗原―酵素接合体又はハプテン―酵素接合体の
酵素活性に抗原抗体反応により影響を及ぼす均一
相でのEIAの実施も公知である。この場合に、抗
体は酵素の活性位置に対する酵素基質の親和性
を、立体障害によるか又は酵素の適合変化又は酵
素の触媒活性を得るのに必要な適合変化を阻止す
ることによつて低下すると思われている。マーカ
ー酵素がこれに結合したハプテンで阻害されるが
相応する抗体により再び活性化される場合も公知
である。しかしながら、この方法は、従来、免疫
反応の成分の１つにより酵素活性が相応して抑制
される適当な酵素―ハプテン組み合せは僅かに発
見されているだけであるので、非常に限られて使
用可能であるにすぎない。
酵素活性に抗原抗体反応により影響を及ぼす均一
相でのEIAの実施も公知である。この場合に、抗
体は酵素の活性位置に対する酵素基質の親和性
を、立体障害によるか又は酵素の適合変化又は酵
素の触媒活性を得るのに必要な適合変化を阻止す
ることによつて低下すると思われている。マーカ
ー酵素がこれに結合したハプテンで阻害されるが
相応する抗体により再び活性化される場合も公知
である。しかしながら、この方法は、従来、免疫
反応の成分の１つにより酵素活性が相応して抑制
される適当な酵素―ハプテン組み合せは僅かに発
見されているだけであるので、非常に限られて使
用可能であるにすぎない。
従つて、本発明の課題は、免疫反応の高い特異
性の利点及びマーキング酵素の高い検出感度を示
し、従つて、一般に、均一相でも実施できるが、
ハプテンもしくは抗原又はその抗体による酵素の
特異性抑制を必要としないEIA―原理を行なう新
規の分析法を見つけることである。
性の利点及びマーキング酵素の高い検出感度を示
し、従つて、一般に、均一相でも実施できるが、
ハプテンもしくは抗原又はその抗体による酵素の
特異性抑制を必要としないEIA―原理を行なう新
規の分析法を見つけることである。
この課題の本発明による解決は、ハプテン又は
抗原に結合したマーカー酵素の熱変性に及ぼすハ
プテン特異性抗体又は抗原特異性抗体による影響
を利用する。
抗原に結合したマーカー酵素の熱変性に及ぼすハ
プテン特異性抗体又は抗原特異性抗体による影響
を利用する。
従つて、抗原特異性又はハプテン特異性の抗体
及び特定量の酵素マークされた抗原又はハプテン
の存在でインキユベート（InKubation）し、マ
ーカー酵素の活性を測定することにより均一な水
相中の抗原又はハプテンを測定する本発明の方法
は、反応溶液のインキユベートの後に反応溶液
を、マーカー酵素が抗原特異性抗体又はハプテン
特異性抗体の不存在で少なくとも50％不活性化さ
れるような温度及び時間条件下に加熱し、その
後、酵素活性を測定することよりなる。この本発
明方法はテレジア（THERESIA：Ｔ―HEremo
―RESistance―Ｉmmuno―Ａssay）と称され
る。
及び特定量の酵素マークされた抗原又はハプテン
の存在でインキユベート（InKubation）し、マ
ーカー酵素の活性を測定することにより均一な水
相中の抗原又はハプテンを測定する本発明の方法
は、反応溶液のインキユベートの後に反応溶液
を、マーカー酵素が抗原特異性抗体又はハプテン
特異性抗体の不存在で少なくとも50％不活性化さ
れるような温度及び時間条件下に加熱し、その
後、酵素活性を測定することよりなる。この本発
明方法はテレジア（THERESIA：Ｔ―HEremo
―RESistance―Ｉmmuno―Ａssay）と称され
る。
本発明は、マーカー酵素に対してではなくハプ
テン又は抗原に対する抗体がマーカー酵素の加熱
変性に、定量分析測定を構成できるように影響を
及ぼす意想外の認識に基づく。
テン又は抗原に対する抗体がマーカー酵素の加熱
変性に、定量分析測定を構成できるように影響を
及ぼす意想外の認識に基づく。
本発明方法では、一定の即ち公知量のハプテン
もしくは抗原と酵素とからの接合体Kunjugat）
を使用する。この量は、原則的には自由に選択で
きるが、試料溶液中の被測定ハプテン又は抗原に
関連する量範囲であるべきである。それというの
も遊離のハプテンもしくは抗原と酵素マークされ
たその誘導体とは、抗体に関して競争するはずで
あるからである。
もしくは抗原と酵素とからの接合体Kunjugat）
を使用する。この量は、原則的には自由に選択で
きるが、試料溶液中の被測定ハプテン又は抗原に
関連する量範囲であるべきである。それというの
も遊離のハプテンもしくは抗原と酵素マークされ
たその誘導体とは、抗体に関して競争するはずで
あるからである。
ハプテン特異性抗体又は抗原特異性抗体を、同
様に、添加される酵素接合体に量に依り決まり、
検査により容易に決定することのできる一定量で
添加する。この際、この量は、マーカー酵素の熱
変性を阻止するのに丁度充分であるように決め
る。
様に、添加される酵素接合体に量に依り決まり、
検査により容易に決定することのできる一定量で
添加する。この際、この量は、マーカー酵素の熱
変性を阻止するのに丁度充分であるように決め
る。
加熱不活性化そのものは、使用温度及びその使
用時間に関して、マーカー酵素が少なくとも50％
失活されるように選択する。この熱変性は、一般
的な化学法則に従がい、温度上昇に伴ない変性に
必要な作用時間は短かくなる。β―ガラクトシダ
ーゼの場合には、例えば58℃で15分の作用で、62
℃では５分の作用で、それぞれ所定の緩衝液及び
PH―値で実際に100％の失活を達成することがで
きる。この際加熱工程の条件は、所望の失活度を
得るのに丁度充分であるように選択するのが有利
である。この場合、100％の失活が丁度達成され
る際に、最も簡単な操作法が得られるが、この方
法は50％までの失活の際にも実施できる。これに
より、その用途範囲は著るしく拡大される。それ
というのも、ハプテン特異性又は抗原特異性の抗
体による熱失活の僅かな影響をこの方法に利用す
ることができるからである。
用時間に関して、マーカー酵素が少なくとも50％
失活されるように選択する。この熱変性は、一般
的な化学法則に従がい、温度上昇に伴ない変性に
必要な作用時間は短かくなる。β―ガラクトシダ
ーゼの場合には、例えば58℃で15分の作用で、62
℃では５分の作用で、それぞれ所定の緩衝液及び
PH―値で実際に100％の失活を達成することがで
きる。この際加熱工程の条件は、所望の失活度を
得るのに丁度充分であるように選択するのが有利
である。この場合、100％の失活が丁度達成され
る際に、最も簡単な操作法が得られるが、この方
法は50％までの失活の際にも実施できる。これに
より、その用途範囲は著るしく拡大される。それ
というのも、ハプテン特異性又は抗原特異性の抗
体による熱失活の僅かな影響をこの方法に利用す
ることができるからである。
マーカー酵素としては、原則的に熱変性可能で
測定容易な酵素が好適である。少なくとも２個の
酵素下位単位よりなる即ち数個のプロテイン連鎖
を有するマーカー酵素が有利である。この例は、
グルコースオキシダーゼ、マレートデヒドロゲナ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ
及びβ―ガラクトシダーゼである。最後のものが
特に有利である。
測定容易な酵素が好適である。少なくとも２個の
酵素下位単位よりなる即ち数個のプロテイン連鎖
を有するマーカー酵素が有利である。この例は、
グルコースオキシダーゼ、マレートデヒドロゲナ
ーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラーゼ
及びβ―ガラクトシダーゼである。最後のものが
特に有利である。
ハプテンとしては、この測定のために重要で、
それ自体は抗体の形成能力を有しない生理学的又
は非生理学的な低分子量化合物であり、その測定
が臨床的に適切であるものを使用することができ
る。この例には、ホルモン、作用物質、酵素基質
その他類似物がある。非生理学的ハプテンの例は
医薬品及び類似物質である。抗原には、原則的に
それ自体抗体形成を惹起する能力だけを有する類
似物が該当するが、ハプテンの場合にこれにハプ
テンと免疫原物質との間の接合体が必要である。
これらのすべての定義及び方法は当業者には公知
であり、ここで詳述する必要はない。本発明の範
囲で使用可能なハプテン又は抗原の例としては、
甲状腺ホルモン、天然及び合成のステロイドホル
モン、ジゴキシン及びジギトキシン、インシユリ
ン、チロトロピン、フエリチン、α1―フエトプロ
テイン、癌胎生抗原、HB2―抗原及び類似物が
挙げられる。
それ自体は抗体の形成能力を有しない生理学的又
は非生理学的な低分子量化合物であり、その測定
が臨床的に適切であるものを使用することができ
る。この例には、ホルモン、作用物質、酵素基質
その他類似物がある。非生理学的ハプテンの例は
医薬品及び類似物質である。抗原には、原則的に
それ自体抗体形成を惹起する能力だけを有する類
似物が該当するが、ハプテンの場合にこれにハプ
テンと免疫原物質との間の接合体が必要である。
これらのすべての定義及び方法は当業者には公知
であり、ここで詳述する必要はない。本発明の範
囲で使用可能なハプテン又は抗原の例としては、
甲状腺ホルモン、天然及び合成のステロイドホル
モン、ジゴキシン及びジギトキシン、インシユリ
ン、チロトロピン、フエリチン、α1―フエトプロ
テイン、癌胎生抗原、HB2―抗原及び類似物が
挙げられる。
抗体形成は公知方法で適当な実験動物の免疫
化、又は細胞培養液の使用下で、かつ抗血清の取
得のもとで行ない、この抗血清は、そのままで又
は抗体の精製の後に使用することができる。一般
に、こうして得た抗血清は、直接使用できるが抗
原特異性又はハプテン特異性の抗体の精製は、こ
のために慣用の方法例えば硫酸アンモニウム分
別、免疫吸着及び類似法（これらは単独又は組合
せて使用できる）で実施することができる。ハプ
テンの場合には、ハプテンと抗体形成に適当な物
質との接合体での免疫化を実施する。このために
も、当業者に公知の物質が好適である。蛋白質例
えば種々な起源の血清アルブミン殊に牛血清アル
ブミン（RSA）及びヒト血清アルブミン
（HSA）並びにエデスチンが有利である。もちろ
ん、免疫原は、マーカー酵素に対する抗体が免疫
化の際に生じないことを確実にするために、使用
マーカー酵素とは異なることが重要である。
化、又は細胞培養液の使用下で、かつ抗血清の取
得のもとで行ない、この抗血清は、そのままで又
は抗体の精製の後に使用することができる。一般
に、こうして得た抗血清は、直接使用できるが抗
原特異性又はハプテン特異性の抗体の精製は、こ
のために慣用の方法例えば硫酸アンモニウム分
別、免疫吸着及び類似法（これらは単独又は組合
せて使用できる）で実施することができる。ハプ
テンの場合には、ハプテンと抗体形成に適当な物
質との接合体での免疫化を実施する。このために
も、当業者に公知の物質が好適である。蛋白質例
えば種々な起源の血清アルブミン殊に牛血清アル
ブミン（RSA）及びヒト血清アルブミン
（HSA）並びにエデスチンが有利である。もちろ
ん、免疫原は、マーカー酵素に対する抗体が免疫
化の際に生じないことを確実にするために、使用
マーカー酵素とは異なることが重要である。
マーカー酵素の活性の測定は、これに公知の方
法で行ない、詳述の必要はない。
法で行ない、詳述の必要はない。
前記方法は、前記のように、マーカー酵素に対
してではなくハプテン又は抗原に対する抗体によ
るハプテン又は抗原との接合体中のマーカー酵素
の熱変性に対する意想外の安定化に基づいてい
る。
してではなくハプテン又は抗原に対する抗体によ
るハプテン又は抗原との接合体中のマーカー酵素
の熱変性に対する意想外の安定化に基づいてい
る。
しかしながら、本発明方法は、ハプテン特異性
もしくは抗原特異性の抗体がこの種の熱失活の低
下に作用することができない場合にも、僅かに変
更すれば使用することができる。この場合には、
インキユベートのために、付加的になお、酵素を
通常の熱変性に対して安定にすることのできる酵
素特異性抗体を添加する。Biochem.Biophys.
Res.Comm.40巻（1970年）570〜575頁の記載か
らは、酵素特異的抗体がその酵素を熱変性に対し
て安定化することができることは公知である。し
かしながら、この安定化がハプテン特異性抗体又
は抗原特異性抗体によつて再び除かれ、従つて同
様に本発明方法でも使用可能であることは予測で
きることではなかつた。例えば、ジゴキシン抗体
は、β―ガラクトシダーゼそのものを熱変性に対
して安定化する能力はないことは認められてい
る。しかしながら、これは、β―ガラクトシダー
ゼ抗体によるこの酵素の安定性を阻害する。
もしくは抗原特異性の抗体がこの種の熱失活の低
下に作用することができない場合にも、僅かに変
更すれば使用することができる。この場合には、
インキユベートのために、付加的になお、酵素を
通常の熱変性に対して安定にすることのできる酵
素特異性抗体を添加する。Biochem.Biophys.
Res.Comm.40巻（1970年）570〜575頁の記載か
らは、酵素特異的抗体がその酵素を熱変性に対し
て安定化することができることは公知である。し
かしながら、この安定化がハプテン特異性抗体又
は抗原特異性抗体によつて再び除かれ、従つて同
様に本発明方法でも使用可能であることは予測で
きることではなかつた。例えば、ジゴキシン抗体
は、β―ガラクトシダーゼそのものを熱変性に対
して安定化する能力はないことは認められてい
る。しかしながら、これは、β―ガラクトシダー
ゼ抗体によるこの酵素の安定性を阻害する。
酵素特異性抗体の存在で実施される本発明方法
のこの種の実施例において、酵素特異性抗体及び
ハプテン特異性抗体は抗原特異性抗体の量は、前
に詳述したと同様に決められる。この場合に、ま
ず、特定の温度及び時間条件下で酵素の熱失活を
阻止する酵素特異性抗体の量及び引続きその安定
化を再び除くハプテン特異性抗体又は抗原特異性
抗体の量を測定する。遊離のハプテン又は抗原
（これは、その抗体とコンプレツクスを形成する）
の存在で、熱安定化は、酵素特異性抗体により再
び、しかもハプテン―抗体コンプレツクス又は抗
原―抗体コンプレツクスを生じる程度に、有効に
なる。
のこの種の実施例において、酵素特異性抗体及び
ハプテン特異性抗体は抗原特異性抗体の量は、前
に詳述したと同様に決められる。この場合に、ま
ず、特定の温度及び時間条件下で酵素の熱失活を
阻止する酵素特異性抗体の量及び引続きその安定
化を再び除くハプテン特異性抗体又は抗原特異性
抗体の量を測定する。遊離のハプテン又は抗原
（これは、その抗体とコンプレツクスを形成する）
の存在で、熱安定化は、酵素特異性抗体により再
び、しかもハプテン―抗体コンプレツクス又は抗
原―抗体コンプレツクスを生じる程度に、有効に
なる。
酵素―ハプテン接合体もしくは酵素―抗原接合
体及びハプテン−免疫原接合体の製造は、公知方
法で、特に二官能性架橋性反応試薬の使用下に行
なう。好適な方法は、例えばアンナールス・オ
ブ・ケミカル・ビオケミストリイ（Annals of
Chemical Biochemistry）16巻（1979年）221〜
239頁に記載されている。
体及びハプテン−免疫原接合体の製造は、公知方
法で、特に二官能性架橋性反応試薬の使用下に行
なう。好適な方法は、例えばアンナールス・オ
ブ・ケミカル・ビオケミストリイ（Annals of
Chemical Biochemistry）16巻（1979年）221〜
239頁に記載されている。
本発明方法は、非常に高い感度を有し、従つ
て、殊に酵素特異性抗体の存在で実施する際に、
非常に少量のハプテン及び抗原の測定が可能であ
る。従つて、試料中のｐｇ単位の少ない量を短時
間内で測定することができ、この際、工程即ちイ
ンキユベート、加熱工程、酵素測定の全体のため
に20〜30分より多くを必要としない。この方法は
分離操作を必要としないので、慣用の分析自動化
の実施のために特に好適である。唯一の装置変更
としては、一般にその自動分析装置が加熱帯域を
有しない場合にはそれを内蔵させる必要がある。
て、殊に酵素特異性抗体の存在で実施する際に、
非常に少量のハプテン及び抗原の測定が可能であ
る。従つて、試料中のｐｇ単位の少ない量を短時
間内で測定することができ、この際、工程即ちイ
ンキユベート、加熱工程、酵素測定の全体のため
に20〜30分より多くを必要としない。この方法は
分離操作を必要としないので、慣用の分析自動化
の実施のために特に好適である。唯一の装置変更
としては、一般にその自動分析装置が加熱帯域を
有しない場合にはそれを内蔵させる必要がある。
PH値及び使用緩衝物質に関して、本発明方法に
とつては、マーカー酵素により予め決められた条
件が当てはまる。このことは、使用マーカー酵素
に応じて、充分な酵素活性を確保するPH−及び緩
衝物質を使用することを意味する。これらの条件
は、使用される酵素に関して公知である。
とつては、マーカー酵素により予め決められた条
件が当てはまる。このことは、使用マーカー酵素
に応じて、充分な酵素活性を確保するPH−及び緩
衝物質を使用することを意味する。これらの条件
は、使用される酵素に関して公知である。
本発明のもう１つの目的は、本発明方法を実施
する試薬であり、これは、一定量のβ―ガラクト
シダーゼ―ハプテン接合体、ハプテン―抗体、緩
衝剤（PH6.0〜8.5）、β―ガラクトシダーゼ活性
測定用の系及び場合によつては、一定量のβ―ガ
ラクトシダーゼ―抗体を含有する。ハプテン接合
体量は、有利に100pM〜5μM／であり、0.01〜
50mU／テストに相応し、抗体は有利に完全血液
として10-3までの濃度まで稀釈して使用する。
する試薬であり、これは、一定量のβ―ガラクト
シダーゼ―ハプテン接合体、ハプテン―抗体、緩
衝剤（PH6.0〜8.5）、β―ガラクトシダーゼ活性
測定用の系及び場合によつては、一定量のβ―ガ
ラクトシダーゼ―抗体を含有する。ハプテン接合
体量は、有利に100pM〜5μM／であり、0.01〜
50mU／テストに相応し、抗体は有利に完全血液
として10-3までの濃度まで稀釈して使用する。
この有利な試薬の場合に、酵素活性測定用の系
は、有利に光学的に測定可能な置換分（これは、
β―ガラクトシダーゼにより離脱可能であり、光
学的に容易に測定できる）を有するガラクトシド
よりなるのが有利である。この種の光学的に測定
可能な基質の例は、ｏ―ニトロフエニル―β―Ｄ
―ガラクトシド（ONPG）であり、これは25〜
42℃で１〜10mMの濃度で使用するのが有利であ
る。
は、有利に光学的に測定可能な置換分（これは、
β―ガラクトシダーゼにより離脱可能であり、光
学的に容易に測定できる）を有するガラクトシド
よりなるのが有利である。この種の光学的に測定
可能な基質の例は、ｏ―ニトロフエニル―β―Ｄ
―ガラクトシド（ONPG）であり、これは25〜
42℃で１〜10mMの濃度で使用するのが有利であ
る。
本発明の試薬は、殊に自動分析装置、更に、遠
心分析―原理で作動するような装置上での使用に
好適である。極めて高い感度に基づき、その試薬
経費は僅かであり、同じことが操作経費に関して
もあてはまる。
心分析―原理で作動するような装置上での使用に
好適である。極めて高い感度に基づき、その試薬
経費は僅かであり、同じことが操作経費に関して
もあてはまる。
次の実施例につき更に本発明を説明する。
例 １
チロキシン（T4）の測定
緩衝剤：燐酸カリウム（PH7.0） 10mM
NaCl 0.14M
MgCl2 0.5mM
DTT（１，４―ジチオエリスリトー
ル） 1mM 反応混合物：T4―誘導体化されたβ―グリコ
シダーゼ（1μｇ／ml、ヨードアセチ
ル―T4とβ―ガラクトシダーゼとの
１対２のモル比での反応により製造）
10μ 抗―T4―羊完全血清（10-1稀釈、免
疫原：T4―エデスチン―接合体）
10μ Ｌ―チロキシン（1.25〜25mg／）
20μ 前記混合物を37℃で30分温置し、次いで62℃に
５分間加熱する。引続きONPG溶液（ｏ―ニト
ロフエニル―β―Ｄ―ガラクトシド；3.3mg／ml）
7.0μを添加し、37℃で45分間保持し、次いで
0.1MNa2CO3容液１mlを酵素反応の停止のために
添加する。引続き、遊離したニトロフエノールを
405nmで測定する。ニトロフエノール量は、誘導
体化されたβ―グルコシダーゼと安定化された抗
体に関して競争する遊離T4の量に反比例する。
添付の第１図は、種々の量の使用T4量のおける
本発明により得られた検量曲線を示す。ここで横
軸に使用T4量（ｎｇ）をとり、縦軸に405nmに
おける吸光度をとつている。
ル） 1mM 反応混合物：T4―誘導体化されたβ―グリコ
シダーゼ（1μｇ／ml、ヨードアセチ
ル―T4とβ―ガラクトシダーゼとの
１対２のモル比での反応により製造）
10μ 抗―T4―羊完全血清（10-1稀釈、免
疫原：T4―エデスチン―接合体）
10μ Ｌ―チロキシン（1.25〜25mg／）
20μ 前記混合物を37℃で30分温置し、次いで62℃に
５分間加熱する。引続きONPG溶液（ｏ―ニト
ロフエニル―β―Ｄ―ガラクトシド；3.3mg／ml）
7.0μを添加し、37℃で45分間保持し、次いで
0.1MNa2CO3容液１mlを酵素反応の停止のために
添加する。引続き、遊離したニトロフエノールを
405nmで測定する。ニトロフエノール量は、誘導
体化されたβ―グルコシダーゼと安定化された抗
体に関して競争する遊離T4の量に反比例する。
添付の第１図は、種々の量の使用T4量のおける
本発明により得られた検量曲線を示す。ここで横
軸に使用T4量（ｎｇ）をとり、縦軸に405nmに
おける吸光度をとつている。
例 ２
T4―誘導体化されたβ―ガラクトシダーゼの
代りに、ジゴキシン誘導体化されたβ―ガラクト
シダーゼを用いて例１に記載と同様に実施した。
この接合体は、ジゴキシン―ヒドロキシスクシン
イミドとβ―ガラクトシダーゼとの20対１のモル
比での反応により製造した。抗―β―ガラクトシ
ダーゼ―血清量は50μ（１対100稀釈）であつ
た。抗―ジゴキシン（羊）量（１対５稀釈硫酸ア
ンモニウム懸濁液）は50μであつた。免疫化の
ために、ジゴキシン―エデスチン接合体を免疫原
として使用した。
代りに、ジゴキシン誘導体化されたβ―ガラクト
シダーゼを用いて例１に記載と同様に実施した。
この接合体は、ジゴキシン―ヒドロキシスクシン
イミドとβ―ガラクトシダーゼとの20対１のモル
比での反応により製造した。抗―β―ガラクトシ
ダーゼ―血清量は50μ（１対100稀釈）であつ
た。抗―ジゴキシン（羊）量（１対５稀釈硫酸ア
ンモニウム懸濁液）は50μであつた。免疫化の
ために、ジゴキシン―エデスチン接合体を免疫原
として使用した。
熱変性は、62℃に５分間加熱することにより行
なつた。ONPGを用いる測定は、37℃で10分間
行なつた。
なつた。ONPGを用いる測定は、37℃で10分間
行なつた。
添付第２図は種々の量のジゴキシン標準溶液を
用いて得られた検量曲線を示している。横軸に試
料50μ当りのジゴキシン量（ｐｇ）を、縦軸に
405nmにおける吸光度差を示す。
用いて得られた検量曲線を示している。横軸に試
料50μ当りのジゴキシン量（ｐｇ）を、縦軸に
405nmにおける吸光度差を示す。
第１図は種々異なるT4使用量における本発明
方法により得られた検量曲線を示す図、第２図は
種々異なる量のジゴキシン標準溶液を用いて得ら
れた検量曲線を示す図である。
方法により得られた検量曲線を示す図、第２図は
種々異なる量のジゴキシン標準溶液を用いて得ら
れた検量曲線を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 抗体又はハプテンを含有する水溶液を抗原特
異性抗体又はハプテン特異性抗体及び特定量の酵
素マークされた抗原又はハプテンと共にインキユ
ベートし、マーカー酵素の活性を測定することに
より均一水相中の抗原又はハプテンを測定する場
合に、インキユベートの後に、マーカー酵素が抗
原特異性抗体又はハプテン特異性抗体の不存在で
少なくとも50％失活されるような温度及び時間の
条件下で反応溶液を加熱し、その後酵素活性を測
定することを特徴とする、均一相中の抗原又はハ
プテンを測定する方法。 ２ インキユベートのために、付加的に酵素特異
性の抗体を添加し、加熱の温度条件及び時間条件
を、マーカー酵素が酵素特異性抗体の不存在下に
少なくとも50％失活されるように選択する、特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ３ マーカー酵素として少なくとも２種の下位単
位よりなる酵素を使用する、特許請求の範囲第１
項又は第２項に記載の方法。 ４ マーカー酵素としてガラクトシダーゼを使用
する、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ 一定量のβ―ガラクトシダーゼ―ハプテン接
合体、ハプテン―抗体、緩衝剤（PH6.0〜8.5）、
ガラクトシダーゼ活性測定用の系を含有すること
を特徴とする抗原測定用又はハプテン測定用試
薬。 ６ 一定量のβ―ガラクトシダーゼ―ハプテン接
合体、ハプテン―抗体、緩衝剤（PH6.0〜8.5）、
ガラクトシダーゼ活性測定用の系及び一定量のβ
―ガラクトシダーゼ―抗体を含有する、特許請求
の範囲第５項記載の試薬。 ７ β―ガラクトシダーゼ―ハプテン接合体の量
は100pM〜5μM／であり、抗体は完全血液の
形で存在する、特許請求の範囲第５項又は第６項
記載の試薬。 ８ 酵素活性測定用の系は、β―ガラクトシダー
ゼにより分解可能で、光学的に測定可能な物質を
有するガラクトシドより成つている、特許請求の
範囲第５項から第７項までのいずれか１項に記載
の試薬。 ９ ｏ―ニトロフエニル―β―Ｄ―ガラクトシド
１〜10mMを含有する、特許請求の範囲第８項記
載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19813134361 DE3134361A1 (de) | 1981-08-31 | 1981-08-31 | Verfahren zur enzymimmuno-bestimmung in homogener phase |
| DE3134361.9 | 1981-08-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5845561A JPS5845561A (ja) | 1983-03-16 |
| JPH0123062B2 true JPH0123062B2 (ja) | 1989-04-28 |
Family
ID=6140504
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57150169A Granted JPS5845561A (ja) | 1981-08-31 | 1982-08-31 | 均一相中の抗原又はハプテンの測定法及び測定用試薬 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4510240A (ja) |
| EP (1) | EP0073515B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5845561A (ja) |
| AT (1) | ATE12317T1 (ja) |
| DE (2) | DE3134361A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1194415A (en) * | 1982-05-05 | 1985-10-01 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoglobulin half-molecules and process for producing hybrid antibodies |
| US4629689A (en) * | 1984-08-29 | 1986-12-16 | Allied Corporation | Binding assay with amplified read-out and gas-phase detection |
| US5190864A (en) * | 1986-04-15 | 1993-03-02 | Northeastern University | Enzyme amplification by using free enzyme to release enzyme from an immobilized enzyme material |
| US4937188A (en) * | 1986-04-15 | 1990-06-26 | Northeastern University | Enzyme activity amplification method for increasing assay sensitivity |
| JP3553060B2 (ja) * | 1990-01-02 | 2004-08-11 | モトローラ・インコーポレイテッド | マイクロコンピュータにおける逐次割込み |
| JP2965658B2 (ja) * | 1990-10-22 | 1999-10-18 | 株式会社東芝 | タービン制御方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4190496A (en) * | 1971-05-14 | 1980-02-26 | Syva Company | Homogeneous enzyme assay for antibodies |
| US4341866A (en) * | 1980-06-02 | 1982-07-27 | Syva Company | Antienzyme termination in enzyme immunoassays |
-
1981
- 1981-08-31 DE DE19813134361 patent/DE3134361A1/de not_active Withdrawn
-
1982
- 1982-08-18 US US06/409,278 patent/US4510240A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-08-30 EP EP82107974A patent/EP0073515B1/de not_active Expired
- 1982-08-30 AT AT82107974T patent/ATE12317T1/de not_active IP Right Cessation
- 1982-08-30 DE DE8282107974T patent/DE3262682D1/de not_active Expired
- 1982-08-31 JP JP57150169A patent/JPS5845561A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3262682D1 (en) | 1985-04-25 |
| JPS5845561A (ja) | 1983-03-16 |
| EP0073515A1 (de) | 1983-03-09 |
| DE3134361A1 (de) | 1983-03-10 |
| EP0073515B1 (de) | 1985-03-20 |
| US4510240A (en) | 1985-04-09 |
| ATE12317T1 (de) | 1985-04-15 |
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