JPH01231898A - 核酸配列測定法およびそれに用いる固相担体 - Google Patents
核酸配列測定法およびそれに用いる固相担体Info
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- JPH01231898A JPH01231898A JP5627988A JP5627988A JPH01231898A JP H01231898 A JPH01231898 A JP H01231898A JP 5627988 A JP5627988 A JP 5627988A JP 5627988 A JP5627988 A JP 5627988A JP H01231898 A JPH01231898 A JP H01231898A
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- nucleic acid
- dna
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、微生物学、遺伝子工学、免疫学、法医学等の
分野における細菌やウィルス等の同定あるいは検出、哺
乳動物の染色体分析等に有用な核酸の試験に関するもの
である。
分野における細菌やウィルス等の同定あるいは検出、哺
乳動物の染色体分析等に有用な核酸の試験に関するもの
である。
更に詳しくは、互いに相補的なヌクレオチド釦の特異的
な親和性を利用した特定のヌクレオチド配列検出のため
の核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法に関するもの
である。
な親和性を利用した特定のヌクレオチド配列検出のため
の核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法に関するもの
である。
［従来技術］
臨床検査領域等を中心として、病原性の微生物やウィル
ス、あるいは発癌遺伝子に代表される異常遺伝子等の核
酸ハイブリダイゼーションアッセイ（以下ＤＮＡ−ＨＡ
と略す）による分析が実用化されている・ ＤＮＡ−ＨＡは互いに相補的なヌクレオチド配列の親和
性を利用した分析法で、基本的には次のような操作に基
づいて実行される。
ス、あるいは発癌遺伝子に代表される異常遺伝子等の核
酸ハイブリダイゼーションアッセイ（以下ＤＮＡ−ＨＡ
と略す）による分析が実用化されている・ ＤＮＡ−ＨＡは互いに相補的なヌクレオチド配列の親和
性を利用した分析法で、基本的には次のような操作に基
づいて実行される。
■被検材料中の核酸に場合によりアルカリ処理、加熱処
理、酵素処理等を加えて試料を調製する工程 ■試料と、検出しようとするヌクレオチド配列に対し相
補的な配列を有する標識プローブと接触させる工程 ■ハイブリダイゼーションを起こしくまたは起こさず）
２本鎖となった（またはならなかった）標識プローブの
有無、あるいはその量を標識量を測定することによって
決定する工程 ところで不均一系ＤＮＡ−）ＩＡの場合、標識量の測定
にあたって、ハイブリダイゼーションを起こしたものと
起こさなかったものを物理的に分離する操作が必要にな
る。この分離操作には、上記■〜■の各工程の間に試料
中の核酸を種々の結合反応を利用して固相担体に結合さ
せる方法と、クロマトグラフィー等を利用した方法があ
る。
理、酵素処理等を加えて試料を調製する工程 ■試料と、検出しようとするヌクレオチド配列に対し相
補的な配列を有する標識プローブと接触させる工程 ■ハイブリダイゼーションを起こしくまたは起こさず）
２本鎖となった（またはならなかった）標識プローブの
有無、あるいはその量を標識量を測定することによって
決定する工程 ところで不均一系ＤＮＡ−）ＩＡの場合、標識量の測定
にあたって、ハイブリダイゼーションを起こしたものと
起こさなかったものを物理的に分離する操作が必要にな
る。この分離操作には、上記■〜■の各工程の間に試料
中の核酸を種々の結合反応を利用して固相担体に結合さ
せる方法と、クロマトグラフィー等を利用した方法があ
る。
前者の固相担体を利用する方法としては、ニトロセルロ
ースフィルターやナイロンメンブレンを用いこれに試料
中の核酸を固定した後上記■以下の工程を行なう分析系
が汎用されているが、この他にも特開昭６１−２１９４
００号公報に開示されているようなマイクロプレートの
ウェルを固相担体として用いる試みもなされている。
ースフィルターやナイロンメンブレンを用いこれに試料
中の核酸を固定した後上記■以下の工程を行なう分析系
が汎用されているが、この他にも特開昭６１−２１９４
００号公報に開示されているようなマイクロプレートの
ウェルを固相担体として用いる試みもなされている。
ニトロセルロースフィルターｉ固相ｍ体への核酸やその
変性物の固定には、通常物理的な吸着が利用されており
、長時間の加熱乾燥工程等の繁雑な操作を伴なう、特開
昭６１−２１９４００号公報には標識方法の改良で感度
を上昇させてマイクロプレートのウェルを固相担体とし
て利用することにより検体中ＤＮＡの固定操作を簡略化
した例が記載されている。しかしこの方法においても、
試料中に核酸類以外の細胞成分等不純物が多量に含まれ
る場合には、溶媒による抽出操作が必要となることが多
く必ずしも簡便な方法であるとは言い難い。
変性物の固定には、通常物理的な吸着が利用されており
、長時間の加熱乾燥工程等の繁雑な操作を伴なう、特開
昭６１−２１９４００号公報には標識方法の改良で感度
を上昇させてマイクロプレートのウェルを固相担体とし
て利用することにより検体中ＤＮＡの固定操作を簡略化
した例が記載されている。しかしこの方法においても、
試料中に核酸類以外の細胞成分等不純物が多量に含まれ
る場合には、溶媒による抽出操作が必要となることが多
く必ずしも簡便な方法であるとは言い難い。
他方後者のクロマトグラフィーを利用する方法としては
、ハイトロキシルアパタイトの使用が知られている。近
年、細菌類のりポゾームＲＮＡをターゲットとして液相
系でのＤＮＡ−ＨＡの臨床診断への応用が検討されはじ
めているが、このような方法の多くは前記分離操作をハ
イトロキシルアパタイトを用いた至適リン酸濃度での２
本鎖ＤＮＡの特異的吸着を利用して行なっている（公表
特許間６０−５０１３３９号公報）、この方法において
は、液相系でハイブリダイズさせるので反応に要する時
間は１時間程度と大きく短縮されているものの、反面ハ
イトロキシルアパタイトを使用することにより固相担体
には無い問題点を生じル、スなわち、ハイトロキシルア
パタイト粒子懸濁液を均一に分注するために細心の注意
を払わなければならない点、あるいはハイトロキシルア
パタイトへの非特異的な標識プローブの吸着を除くため
の遠心分離や洗浄等繁雑な操作が必要な点等がそれであ
る。
、ハイトロキシルアパタイトの使用が知られている。近
年、細菌類のりポゾームＲＮＡをターゲットとして液相
系でのＤＮＡ−ＨＡの臨床診断への応用が検討されはじ
めているが、このような方法の多くは前記分離操作をハ
イトロキシルアパタイトを用いた至適リン酸濃度での２
本鎖ＤＮＡの特異的吸着を利用して行なっている（公表
特許間６０−５０１３３９号公報）、この方法において
は、液相系でハイブリダイズさせるので反応に要する時
間は１時間程度と大きく短縮されているものの、反面ハ
イトロキシルアパタイトを使用することにより固相担体
には無い問題点を生じル、スなわち、ハイトロキシルア
パタイト粒子懸濁液を均一に分注するために細心の注意
を払わなければならない点、あるいはハイトロキシルア
パタイトへの非特異的な標識プローブの吸着を除くため
の遠心分離や洗浄等繁雑な操作が必要な点等がそれであ
る。
したがって、固相担体を利用する方法の簡便な操作と、
液相系での反応で得られる迅速性とを兼備したＩ）ＨＡ
−ＨＡの実現が望まれている。
液相系での反応で得られる迅速性とを兼備したＩ）ＨＡ
−ＨＡの実現が望まれている。
［発明の目的１
本発明は、固相担体を用いた場合の簡便な分離操作と、
液相系の反応で得られる迅速性とを有するＤＮＡ−ＨＡ
を可能とすることを目的としている。
液相系の反応で得られる迅速性とを有するＤＮＡ−ＨＡ
を可能とすることを目的としている。
すなわち本発明は、核酸やその変性物がその他の成分と
共存する場合であっても溶媒抽出操作や加熱処理等従来
の核酸の固定に必要とされていた繁雑な操作を省略する
ことができ、しかも迅速なハイブリダイゼーションを行
ない得るという液相系の特徴を損なうことのないＤＮＡ
−ＨＡを提供するものである。
共存する場合であっても溶媒抽出操作や加熱処理等従来
の核酸の固定に必要とされていた繁雑な操作を省略する
ことができ、しかも迅速なハイブリダイゼーションを行
ない得るという液相系の特徴を損なうことのないＤＮＡ
−ＨＡを提供するものである。
［発明の構Ｉ＆］
本発明は。
ａ、試料中の核酸あるいはその変性物を固相担体に固定
し、 ｂ、得られた核酸あるいはその変性物を固定化した固相
担体と、検出すべき核酸に対して相補的塩基配列を有す
る標識プローブとを接触させてハイブリダイズさせた後
。
し、 ｂ、得られた核酸あるいはその変性物を固定化した固相
担体と、検出すべき核酸に対して相補的塩基配列を有す
る標識プローブとを接触させてハイブリダイズさせた後
。
ｃ、液相または固相の標ａ＠を測定する［程を含んでな
る核酸配列測定法であって、固相担体として強塩基性ポ
リアミノ酸で被覆したビーズ状担体を用いることを特徴
とする核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、および 強塩基性ポリアミノ酸で被覆されたビーズ状担体からな
ることを特徴とする核酸ハイブリダイゼーシ哀ンアッセ
イ用固相担体である。
る核酸配列測定法であって、固相担体として強塩基性ポ
リアミノ酸で被覆したビーズ状担体を用いることを特徴
とする核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、および 強塩基性ポリアミノ酸で被覆されたビーズ状担体からな
ることを特徴とする核酸ハイブリダイゼーシ哀ンアッセ
イ用固相担体である。
本発明における強塩基性ポリアミノ酸被覆ビーズ状担体
は、例えばビーズを強塩基性ポリアミノ酸の水溶液中に
浸漬して強塩基性ポリアミノ酸を物理的に吸着させた後
、これを洗冷することによって得ることができる。［ジ
ェイ・ロイフ等（Ｊ。
は、例えばビーズを強塩基性ポリアミノ酸の水溶液中に
浸漬して強塩基性ポリアミノ酸を物理的に吸着させた後
、これを洗冷することによって得ることができる。［ジ
ェイ・ロイフ等（Ｊ。
Ｒａｕｃｈ、ｅｔ ａｌ、）ジャーナル・オン・リュー
マトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏ
ｌｏｇｙ ） １２；３，４８２（１９８５）］ この他、ビーズ上にカルボキシル基等の適当な官使基を
導入し、強塩基性ポリアミノ酸のアミノ基と反応させて
化学的に両者を結合させることも町詣である。
マトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏ
ｌｏｇｙ ） １２；３，４８２（１９８５）］ この他、ビーズ上にカルボキシル基等の適当な官使基を
導入し、強塩基性ポリアミノ酸のアミノ基と反応させて
化学的に両者を結合させることも町詣である。
本発明で利用される強塩基性ポリアミノ酸としては、ポ
リーＬ−リジン（以下ＰＬＬと略す）。
リーＬ−リジン（以下ＰＬＬと略す）。
ポリーＬ−アルギニン（以下ＰＬＡと略す）、ポリーＬ
−ヒスチジン等が挙げられる。これら強塩基性ポリアミ
ノ酸は、市販されているものを用いれば良い。
−ヒスチジン等が挙げられる。これら強塩基性ポリアミ
ノ酸は、市販されているものを用いれば良い。
一方本発明におけるビーズ状担体の材質は、ポリスチレ
ン、ガラス、ナイロン等強塩基性ポリアミノ酸で被覆で
きるものであれば特に限定されるものではないが、中で
もポリスチレンやガラスは強Ｎ）人性ポリアミノ酸の吸
着性に優れており好ましい材質として挙げることができ
る。
ン、ガラス、ナイロン等強塩基性ポリアミノ酸で被覆で
きるものであれば特に限定されるものではないが、中で
もポリスチレンやガラスは強Ｎ）人性ポリアミノ酸の吸
着性に優れており好ましい材質として挙げることができ
る。
またビーズ状担体は１強塩基性ポリアミノ酸吸着面積を
大きくするために表面を粗面化することもできる。ある
いは必要に応じてビーズ状担体を着色したり表面に文字
や記号を付すこζによってビーズの識別性を高めること
もできる。
大きくするために表面を粗面化することもできる。ある
いは必要に応じてビーズ状担体を着色したり表面に文字
や記号を付すこζによってビーズの識別性を高めること
もできる。
固相担体の形状はビーズ状であればよく、したがって文
字どおり球形のものをはじめとして、多面体状のものや
表面に凹凸を設けたもの等を用いることもできる。免疫
分析等の分野では固相担体としてマイクロプレートのウ
エルギも利用されるが、本発明ではビーズ状のものを利
用することによって迅速なハイブリダイズを可使として
いるのである。
字どおり球形のものをはじめとして、多面体状のものや
表面に凹凸を設けたもの等を用いることもできる。免疫
分析等の分野では固相担体としてマイクロプレートのウ
エルギも利用されるが、本発明ではビーズ状のものを利
用することによって迅速なハイブリダイズを可使として
いるのである。
本発明によるＤＮＡ−ＨＡに用いる標識プローブとして
は、従来のＤＮＡ−ＨＡに利用されていたものと同様の
ものが使用できる。すなわち、放射性同位元素、蛍光物
質、発光物質、酵素等で直接的に標識されたもの、ある
いはアビジン−ビオチンシステムや抗原・抗体反応等を
利用して間接的に標識を付したもの等が利用できる。
は、従来のＤＮＡ−ＨＡに利用されていたものと同様の
ものが使用できる。すなわち、放射性同位元素、蛍光物
質、発光物質、酵素等で直接的に標識されたもの、ある
いはアビジン−ビオチンシステムや抗原・抗体反応等を
利用して間接的に標識を付したもの等が利用できる。
本発明のＤＮＡ−ＨＡにおいて、強塩基性ポリアミノ酸
被覆ビーズ状担体に固定される試料由来の核酸の変性物
としては、具体的には例えばつざのようなものが挙げら
れる。
被覆ビーズ状担体に固定される試料由来の核酸の変性物
としては、具体的には例えばつざのようなものが挙げら
れる。
Ｏ試料に由来する２木釦ＤＮＡをアルカリ処理、加熱等
の操作により１木鎖ＤＮＡとしたもの０試料に由来する
ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏＤ Ｎ Ａ増幅【サエキ等（
Ｓａｅｋｉ ｅｔ ａｌ、）サイエンス （ＳＣＩＥＮ
ＣＥ）２３０．１３５０（１９８５）］により増幅した
ものＯランダムプライマーと逆転写酵素等を用い、試料
中のＲＮＡからｃＤＮＡを導き、このｃＤＮＡについて
ｉｎ ｖｉｔｒｏＤ Ｎ Ａ増幅を行なったものつづい
て本発明のＤＮＡ−ＨＡ中の工程ａについて具体的に説
明する。
の操作により１木鎖ＤＮＡとしたもの０試料に由来する
ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏＤ Ｎ Ａ増幅【サエキ等（
Ｓａｅｋｉ ｅｔ ａｌ、）サイエンス （ＳＣＩＥＮ
ＣＥ）２３０．１３５０（１９８５）］により増幅した
ものＯランダムプライマーと逆転写酵素等を用い、試料
中のＲＮＡからｃＤＮＡを導き、このｃＤＮＡについて
ｉｎ ｖｉｔｒｏＤ Ｎ Ａ増幅を行なったものつづい
て本発明のＤＮＡ−ＨＡ中の工程ａについて具体的に説
明する。
細胞や核構造の破壊によって遊離した核酸あるいはその
変性物は、それらを含有する試料溶液と強Ｉ！！基性ポ
リアミノ酸被覆ビーズ状担体とを接触させることによっ
て固定される。このとき核酸やその変性物以外の種々の
物質が試料溶液中に共存するものと考えられるが、本発
明においては特にこれらの物質を予め分離しておく必要
はない、こうして得られた核酸あるいはその変性物を固
定した強１′！！基性ポリアミノ酸被覆ビーズ状担体は
、必要ならば適当な緩衝液等で予め洗浮した後に工程す
に供される。
変性物は、それらを含有する試料溶液と強Ｉ！！基性ポ
リアミノ酸被覆ビーズ状担体とを接触させることによっ
て固定される。このとき核酸やその変性物以外の種々の
物質が試料溶液中に共存するものと考えられるが、本発
明においては特にこれらの物質を予め分離しておく必要
はない、こうして得られた核酸あるいはその変性物を固
定した強１′！！基性ポリアミノ酸被覆ビーズ状担体は
、必要ならば適当な緩衝液等で予め洗浮した後に工程す
に供される。
試料溶液中の核酸やその変性物の純度が高くかつ少縫し
か存在しない場合強塩基性ポリアミノ酸被覆ビーズ状拒
体の表面に核酸固定活性が残存することも考えられるが
、そのようなときには必要に応じて標識プローブと接触
させる前にサケ精子ＤＮＡｈｇを用いる公知のブロック
法を応用してブロッキングを行なうとバックグラウンド
信号を低減させることができる。
か存在しない場合強塩基性ポリアミノ酸被覆ビーズ状拒
体の表面に核酸固定活性が残存することも考えられるが
、そのようなときには必要に応じて標識プローブと接触
させる前にサケ精子ＤＮＡｈｇを用いる公知のブロック
法を応用してブロッキングを行なうとバックグラウンド
信号を低減させることができる。
−力木発明によるＤＮＡ−ＨＡｍ固相担体は、必要に応
じて標識プローブやその測定に有用な蛍光試薬や発光試
薬等と組み合わてキー７トとすることができる。
じて標識プローブやその測定に有用な蛍光試薬や発光試
薬等と組み合わてキー７トとすることができる。
［発明の作用］
本発明における強墳基性ポリアミノ酸被覆ビーズ状担体
は、抽出操作や担体の加熱操作を行なうことなく試料溶
液と接触させるだけで核酸やその変性物を迅速にかつ簡
便に固定化する作用を有するものである。
は、抽出操作や担体の加熱操作を行なうことなく試料溶
液と接触させるだけで核酸やその変性物を迅速にかつ簡
便に固定化する作用を有するものである。
先に引用したジェイ・ロイフ等は抗体検出用抗原として
の純粋なりＮＡの固定にＰＬＬを利用しているが１本発
明者等はＰＬＬをはじめとする強塩基性ポリアミノ酸が
ＤＮＡ−ＨＡにおいて共存する物質の中から核酸やその
変性物を効率的に分離するために用い得ることを発見し
本発明に至ったものである。
の純粋なりＮＡの固定にＰＬＬを利用しているが１本発
明者等はＰＬＬをはじめとする強塩基性ポリアミノ酸が
ＤＮＡ−ＨＡにおいて共存する物質の中から核酸やその
変性物を効率的に分離するために用い得ることを発見し
本発明に至ったものである。
以下実施例に基づき本発明を更に詳細に説明する。
［実施例］
実施例１３強強塩基性ポリアミノ酸してＰＬＬを用いた
ヒト由来細胞中のＤＮＡの検出 ０ＦＬＬ被覆ビーズの調製 ０、ＩＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，３）に１０団
／層ｌ濃度でＰＬＬｊｉ！酸１１！（Ｎｏ、Ｐ−１３９
９、シグマ社製）ヲ溶かし、この中にポリスチレンビー
ズ（１／６インチ、活水化学］二業■Ｓりを浸漬して室
温で１０間感作させた。これを０．０２５Ｍ ）リスー
塩酸＃ｌ衝液（ｐＨ７，４）で洗浄してＰＬＬ被覆ビー
ズを得た。
ヒト由来細胞中のＤＮＡの検出 ０ＦＬＬ被覆ビーズの調製 ０、ＩＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，３）に１０団
／層ｌ濃度でＰＬＬｊｉ！酸１１！（Ｎｏ、Ｐ−１３９
９、シグマ社製）ヲ溶かし、この中にポリスチレンビー
ズ（１／６インチ、活水化学］二業■Ｓりを浸漬して室
温で１０間感作させた。これを０．０２５Ｍ ）リスー
塩酸＃ｌ衝液（ｐＨ７，４）で洗浄してＰＬＬ被覆ビー
ズを得た。
Ｏ標識プローブ
Ａｌｕ ｆａｓｉ１７ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（３００ｂｐ
、オンコア社製）をプローブとし、 １２５■標識ｄｃ
ＴＰ （アマ−ジャム社製）を使ってニックトランスレ
ーション法により標識し １２５工標識プローブとした
。
、オンコア社製）をプローブとし、 １２５■標識ｄｃ
ＴＰ （アマ−ジャム社製）を使ってニックトランスレ
ーション法により標識し １２５工標識プローブとした
。
０試ネ１溶液の調製
細胞浮遊液３００解に細胞溶解液１００−を加え、３７
℃で３０分間反応させた０反応後２規定の水酸化ナトリ
ウム水溶液２０μを加えて５分間アルカリ処理し１次い
で２規定の塩酸２０−を加え中和して試料溶液とした。
℃で３０分間反応させた０反応後２規定の水酸化ナトリ
ウム水溶液２０μを加えて５分間アルカリ処理し１次い
で２規定の塩酸２０−を加え中和して試料溶液とした。
なお細胞溶解液としては、プロティナーゼＫ（ベーリン
ガー・マンハイム社製）を４ｍｇ／ｍｌ含有する２％ド
デシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略す）溶液を用い
た。
ガー・マンハイム社製）を４ｍｇ／ｍｌ含有する２％ド
デシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略す）溶液を用い
た。
細胞は、ヒト由来細胞としてヒト肝ガン細胞（Ｋ Ａ）
を、対照としてマウス骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕｌ）を、各々
試験管１本当り１００〜２０万個となるように：ＪＪ整
して用いた。
を、対照としてマウス骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕｌ）を、各々
試験管１本当り１００〜２０万個となるように：ＪＪ整
して用いた。
０ＤＮＡ−ＨＡ
前記ＰＬＬ被覆ビーズを前記試料溶液中に浸漬し、６５
℃で１時間核酸変性物を固定させた後０．０２５Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）３００ｐＩ２で洗浄した
。
℃で１時間核酸変性物を固定させた後０．０２５Ｍトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）３００ｐＩ２で洗浄した
。
このＰＬＬ被覆ビーズの入った試験管へ、標識プローブ
を含むハイブリダイゼーション溶液２００−を分注した
。
を含むハイブリダイゼーション溶液２００−を分注した
。
ハイブリダイゼーション溶液は、
！Ｘ食塩
０ＸＰＭ
ｌＯ謙ＭＥ Ｄ Ｔ Ａ
０．１ ％ＳＤＳ
を含む０．０５Ｎ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
、ただしＩＸＰＭの組成は０．０２％ポリビニルピロリ
ドン、０．０２％フィコール、および０．０２％ウシ血
清アルブミンである。また標識プローブは試験管１本当
り２Ｘ １１０５ｃｐ （Ｓ、Ａ、：４Ｘ ＩＯ’ｃｐ
＊／ Ｐｇ−［ＩＮＡ）となるように添加した。
、ただしＩＸＰＭの組成は０．０２％ポリビニルピロリ
ドン、０．０２％フィコール、および０．０２％ウシ血
清アルブミンである。また標識プローブは試験管１本当
り２Ｘ １１０５ｃｐ （Ｓ、Ａ、：４Ｘ ＩＯ’ｃｐ
＊／ Ｐｇ−［ＩＮＡ）となるように添加した。
６５℃で１時間ハイブリダイズさせた後ハイブリダイゼ
ーション溶液を除去し、洗浄液３００−でＰＬＬ被覆ビ
ーズを洗すし、γ−カウンターによりビーズ上の標識プ
ローブに由来する放射線量を計数した。結果は、第１図
に示すとおりである。なお洗浄液１ｉ、１％ｓＤｓ含有
０．ｌＸ５ＳＣ（ＩＸＳＳＣの組成は０．１５Ｍ食塩、
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）を用いた。
ーション溶液を除去し、洗浄液３００−でＰＬＬ被覆ビ
ーズを洗すし、γ−カウンターによりビーズ上の標識プ
ローブに由来する放射線量を計数した。結果は、第１図
に示すとおりである。なお洗浄液１ｉ、１％ｓＤｓ含有
０．ｌＸ５ＳＣ（ＩＸＳＳＣの組成は０．１５Ｍ食塩、
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）を用いた。
ヒト由来の細胞は、プローブとして用いたＡｌｕｆａｍ
ｉｌｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ（３００ｂｐ）と特異的にハ
イブリダイズする反復配列を含むＤＮＡを有しているた
め、細胞数の増加とともにＰＬＬ被覆ビーズ上でのハイ
ブリダイズの割合が高まっていることがｉｕ察された。
ｉｌｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ（３００ｂｐ）と特異的にハ
イブリダイズする反復配列を含むＤＮＡを有しているた
め、細胞数の増加とともにＰＬＬ被覆ビーズ上でのハイ
ブリダイズの割合が高まっていることがｉｕ察された。
一方対照として用いたマウス骨髄腫細胞では、細胞数を
増やしても標識プローブとのハイブリダイズは起こらな
いことが確認された。更に、マウス骨髄腫細胞を用いた
場合のカウント数は、細胞数とは関係な（５００ｃｐｍ
以下であり、標識プローブの非特異吸着は０．２５％以
下と低いものであった。
増やしても標識プローブとのハイブリダイズは起こらな
いことが確認された。更に、マウス骨髄腫細胞を用いた
場合のカウント数は、細胞数とは関係な（５００ｃｐｍ
以下であり、標識プローブの非特異吸着は０．２５％以
下と低いものであった。
実施例２２強ｆ！！基性ポリアミノ酸としてＰＬＬを用
いた結核菌の検出 ０ＦＬＬ被覆ビーズの調製 ＰＬＬ被覆ビーズは、実施例１．と同じものを用いた。
いた結核菌の検出 ０ＦＬＬ被覆ビーズの調製 ＰＬＬ被覆ビーズは、実施例１．と同じものを用いた。
Ｏ標識プローブ
プローブＤＮＡとして２５■ｅ「オリゴヌクレオチド合
成プローブ（１木釦）を塩化タリウムを用いてＮａ１２
５Ｎで標識し、標識プローブとした。
成プローブ（１木釦）を塩化タリウムを用いてＮａ１２
５Ｎで標識し、標識プローブとした。
なお合成プローブは、アプライドバイオシステムのＤＮ
Ａ合成機を使ってβ−シアノエチルアミダイド法により
合成したしたものを用いた。
Ａ合成機を使ってβ−シアノエチルアミダイド法により
合成したしたものを用いた。
Ｏ試料溶液の調製
寒天培地（１％小川培地、栄研化学■製）表面の被検菌
のコロニーをかきとって減菌水に浮遊させ、ナン／＜−
１マクフアーランドスタンダードで１２ｉ数が試験管１
本当り ３Ｘ １０５〜３Ｘ １０Ｂとなるように調整
した。得られた各菌体浮遊液１００−に溶解試薬１００
解を加え、室温で１時間放置して菌体内のＲＮＡを溶出
させ試料溶液とした。
のコロニーをかきとって減菌水に浮遊させ、ナン／＜−
１マクフアーランドスタンダードで１２ｉ数が試験管１
本当り ３Ｘ １０５〜３Ｘ １０Ｂとなるように調整
した。得られた各菌体浮遊液１００−に溶解試薬１００
解を加え、室温で１時間放置して菌体内のＲＮＡを溶出
させ試料溶液とした。
なお溶解試薬としては、実施例１と同じものを用いた。
被検菌は、結核菌としてマイコバクテリウム・ツヘルク
ロシス（ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕＩ＋ ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ）を、対間としてマイコバクテリウム・ア
ビウム（Ｌす］）を用いた。
ロシス（ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕＩ＋ ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ）を、対間としてマイコバクテリウム・ア
ビウム（Ｌす］）を用いた。
ＱＤＮＡ−ＨＡ
ＰＬＬ被覆ビーズを前記試料溶液中に侵清し、６５℃で
１蒔間放置してＲＮＡを固定後０．０２５＞！ トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）３０（ｍ’で洗浄した。こ
のＰＬＬ被覆ビーズの入った試験管へ、標識プローブを
含むハイブリダイゼーション溶液２００９（ｌを分注し
た。
１蒔間放置してＲＮＡを固定後０．０２５＞！ トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）３０（ｍ’で洗浄した。こ
のＰＬＬ被覆ビーズの入った試験管へ、標識プローブを
含むハイブリダイゼーション溶液２００９（ｌを分注し
た。
ハイブリダイゼーション溶液の組成は。
６Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ
１Ｏ■）ＩＥ Ｄ Ｔ Ａ
ＸＰＭ
Ｏ０５％ＳＤＳ
である、また標識プローブは試験管１本ちり ３×１０
５ ｃｐｓ （Ｓ、Ａ、：５ Ｘ １０１ｃｐｓ／ｊｉ
ｇ−ＤＮＡ）となるように加えた。
５ ｃｐｓ （Ｓ、Ａ、：５ Ｘ １０１ｃｐｓ／ｊｉ
ｇ−ＤＮＡ）となるように加えた。
６５℃で１時間ハイブリダイズさせた後ハイブリダイゼ
ーション溶液を除去し、更に０．１％ＳＤＳ含有０．Ｉ
Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ溶液３００解で洗浄し、γ−カウンター
でＰＬＬ被覆ビーズ上の標識プローブに由来する放射線
縫を計数した。結果は第２図に示すとおり、ＴＢ特異性
を持つプローブを用いているため対照のマイコバクテリ
ウム・アビウムとはハイブリダイズしていないことがわ
かる。
ーション溶液を除去し、更に０．１％ＳＤＳ含有０．Ｉ
Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ溶液３００解で洗浄し、γ−カウンター
でＰＬＬ被覆ビーズ上の標識プローブに由来する放射線
縫を計数した。結果は第２図に示すとおり、ＴＢ特異性
を持つプローブを用いているため対照のマイコバクテリ
ウム・アビウムとはハイブリダイズしていないことがわ
かる。
実施例３９強塩基性ポリアミノ酸としてＰＬＡを用いた
ヘルペスシンプレックスウィル スの定量 ０ＰＬＡ＊覆ビーズの調製 ＰＬＬにかえてＰＬＡ硫酸塩（Ｎｏ、ｐ−４０１７、シ
グマ社５Ａ）を用いる他は、実施例１と同様の操作によ
りＰＬＡ被覆ビーズを得た。
ヘルペスシンプレックスウィル スの定量 ０ＰＬＡ＊覆ビーズの調製 ＰＬＬにかえてＰＬＡ硫酸塩（Ｎｏ、ｐ−４０１７、シ
グマ社５Ａ）を用いる他は、実施例１と同様の操作によ
りＰＬＡ被覆ビーズを得た。
０標識プローブ
Ａｌｕ ｆａｍｉｌｙ ｆｒａｇｍｅｎｔＤ Ｎ Ａに
かえてヘルペスウィルスＩ型（以下Ｈ５Ｖ−Ｉと略す）
ＤＮＡのビーグル■（以）” ＢｇｌＩ［と略す）断片
（５，３ｋｂ）を利用する他は、実施例１と同様の操作
により標識プローブを得た。
かえてヘルペスウィルスＩ型（以下Ｈ５Ｖ−Ｉと略す）
ＤＮＡのビーグル■（以）” ＢｇｌＩ［と略す）断片
（５，３ｋｂ）を利用する他は、実施例１と同様の操作
により標識プローブを得た。
Ｈ３Ｖ−Ｉ ＢｇｌＩＩ断片は１次のような操作にし
たがって調製した。まず感染細胞より抽出精製したＨ３
Ｖ−１（ＷＴ−５１）のＤＮＡおよびプラスミドベクタ
ーｐＮＥｏ （ファルマシア社製）を各々ＢｇｌＩＩで
切断後、ライゲーションキット（賓酒造株製）を用いて
リコンビナイトブラスミドを作成した０次いで該プラス
ミドを大腸菌ＪＷＩ Ｏ３に導入し、形質転換したもの
の中から他のウィルスＤＮＡと交差性を示さないクロー
ンヲ選び、大ｒ逢培？ｊ後ＤＮＡを回収・精製してＨ３
Ｖ−ＩＢｇＩｎ断片を１１）だ。
たがって調製した。まず感染細胞より抽出精製したＨ３
Ｖ−１（ＷＴ−５１）のＤＮＡおよびプラスミドベクタ
ーｐＮＥｏ （ファルマシア社製）を各々ＢｇｌＩＩで
切断後、ライゲーションキット（賓酒造株製）を用いて
リコンビナイトブラスミドを作成した０次いで該プラス
ミドを大腸菌ＪＷＩ Ｏ３に導入し、形質転換したもの
の中から他のウィルスＤＮＡと交差性を示さないクロー
ンヲ選び、大ｒ逢培？ｊ後ＤＮＡを回収・精製してＨ３
Ｖ−ＩＢｇＩｎ断片を１１）だ。
Ｏ試ネ１溶液の調製
１０ｐｇ 〜２５ｍｇノＤ Ｎ Ａを含ムｌｏｍＭ）
’） スー塩酸緩衝液（ｐＨ７，３，１腸ＭＥＤＴＡ含
有）２００−に２規定の水酸化ナトリウム水溶液２０〆
を加えて５分間アルカリ処理し、次いで２規定の塩ｍ２
０−を加え中和して試料溶液とした。
’） スー塩酸緩衝液（ｐＨ７，３，１腸ＭＥＤＴＡ含
有）２００−に２規定の水酸化ナトリウム水溶液２０〆
を加えて５分間アルカリ処理し、次いで２規定の塩ｍ２
０−を加え中和して試料溶液とした。
ＤＮＡは感染細胞から抽出・精製したＨ３Ｖ−■のＤＮ
Ａ、並びに対照としての入ファージ旧ｎｄ■断片にッポ
ンジーン■製）を用いた。
Ａ、並びに対照としての入ファージ旧ｎｄ■断片にッポ
ンジーン■製）を用いた。
０ＤＮＡ−ＨＡ
標識プローブを試験管１本当り ３．６Ｘ １０５１０
５ｃｐ、Ａ、： ８Ｘ １０１ｃｐ腸／１１ｇ−ＤＮ
Ａ）となるように添加する他は、実施例１と同様の操作
にしたがってＤＮＡ−ＨＡを行なった。結果は第３図に
示すとおりである。
５ｃｐ、Ａ、： ８Ｘ １０１ｃｐ腸／１１ｇ−ＤＮ
Ａ）となるように添加する他は、実施例１と同様の操作
にしたがってＤＮＡ−ＨＡを行なった。結果は第３図に
示すとおりである。
Ｈ３Ｖ−ＩのＤＮＡ量の増加にともなって、ハイブリダ
イズの割合が定量的に高まっていることがわかる。
イズの割合が定量的に高まっていることがわかる。
［発明の効果］
本発明は、強塩基性ポリアミノ酸を被覆したビーズ状担
体を利用することによって、液相系の迅速な反応と固相
担体を用いた場合の簡便性とを兼ね備えたビーズ法をＤ
ＮＡ−ＨＡに導入したものである。ビーズ法は免疫測定
の分野では簡便な方法としてよく知られ汎用されている
が、ＤＮＡ−ＨＡの分野においては核酸やその変性物を
固相上に捕捉・固定する過程が免疫測定法における抗原
抗体反応はど特異的でなく、シたがって吸着能や選択性
の点から実現が困難であった０本発明では核酸やその変
性物の吸着能を向上させることによってＤＮＡ−ＨＡに
おけるビーズ法を実現したのである。
体を利用することによって、液相系の迅速な反応と固相
担体を用いた場合の簡便性とを兼ね備えたビーズ法をＤ
ＮＡ−ＨＡに導入したものである。ビーズ法は免疫測定
の分野では簡便な方法としてよく知られ汎用されている
が、ＤＮＡ−ＨＡの分野においては核酸やその変性物を
固相上に捕捉・固定する過程が免疫測定法における抗原
抗体反応はど特異的でなく、シたがって吸着能や選択性
の点から実現が困難であった０本発明では核酸やその変
性物の吸着能を向上させることによってＤＮＡ−ＨＡに
おけるビーズ法を実現したのである。
更に本発明によるＤＮＡ−ＨＡは、試料中に不純物が多
く含まれる場合でも、攪拌、振とう、そして溶媒層の分
離という機械化が困難な操作を伴なう抽出操作を省くこ
とが可ｆｌとなるうえ、ビーズ状担体を反応容器中へ投
入することができる。
く含まれる場合でも、攪拌、振とう、そして溶媒層の分
離という機械化が困難な操作を伴なう抽出操作を省くこ
とが可ｆｌとなるうえ、ビーズ状担体を反応容器中へ投
入することができる。
そのため、従来の免疫反応用装こと同様の機構を利用し
て、容易にＤＮＡ−ＨＡの自動化を図ることができるも
のと考えられる。
て、容易にＤＮＡ−ＨＡの自動化を図ることができるも
のと考えられる。
第１図は実施例１．の結果を、第２図は実施例２、の結
果を、第３図は実施例３．の結果を示すグラフである０
図中、縦軸は試験管１本当りの強塩基性ポリアミノ酸被
覆ビーズ上の標識プローブに由来する放射線量の計数値
を、横軸は試験管１本当りの細胞数またはウィルスの精
製ＤＮＡの量を示す。
果を、第３図は実施例３．の結果を示すグラフである０
図中、縦軸は試験管１本当りの強塩基性ポリアミノ酸被
覆ビーズ上の標識プローブに由来する放射線量の計数値
を、横軸は試験管１本当りの細胞数またはウィルスの精
製ＤＮＡの量を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ａ、試料中の核酸あるいはその変性物を固相担体に
固定し、 ｂ、得られた核酸あるいはその変性物を固定化した固相
担体と、検出すべき核酸に対して相補的塩基配列を有す
る標識プローブとを接触させてハイブリダイズさせた後
、 ｃ、液相または固相の標識量を測定する工程を含んでな
る核酸配列測定法であって、固相担体として強塩基性ポ
リアミノ酸で被覆したビーズ状担体を用いることを特徴
とする核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法 ２）強塩基性ポリアミノ酸で被覆されたビーズ状担体か
らなることを特徴とする核酸ハイブリダイゼーションア
ッセイ用固相担体
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5627988A JPH01231898A (ja) | 1988-03-11 | 1988-03-11 | 核酸配列測定法およびそれに用いる固相担体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5627988A JPH01231898A (ja) | 1988-03-11 | 1988-03-11 | 核酸配列測定法およびそれに用いる固相担体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01231898A true JPH01231898A (ja) | 1989-09-18 |
Family
ID=13022651
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5627988A Pending JPH01231898A (ja) | 1988-03-11 | 1988-03-11 | 核酸配列測定法およびそれに用いる固相担体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01231898A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2673953A1 (fr) * | 1991-03-13 | 1992-09-18 | Bioprobe Systems Sa | Procede de sequencage non radioactif d'adn. |
| US7070921B2 (en) | 2000-04-28 | 2006-07-04 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
| US7632651B2 (en) | 1997-09-15 | 2009-12-15 | Mds Analytical Technologies (Us) Inc. | Molecular modification assays |
-
1988
- 1988-03-11 JP JP5627988A patent/JPH01231898A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2673953A1 (fr) * | 1991-03-13 | 1992-09-18 | Bioprobe Systems Sa | Procede de sequencage non radioactif d'adn. |
| US7632651B2 (en) | 1997-09-15 | 2009-12-15 | Mds Analytical Technologies (Us) Inc. | Molecular modification assays |
| US7070921B2 (en) | 2000-04-28 | 2006-07-04 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
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