JPH01235581A - 新規シュードモナス属菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なシュードモナス属菌に間するものであ
る。

従来、−ｍに蛋白質を微生物によって生産させるという
場合、微生物を培養し、微生物菌体を磨砕後、蛋白質を
抽出、精製することにより得ていた。

また、一般に遺伝子組換えの微生物生産の宿主としては
、大腸菌が主に使用されているが、大腸菌では、組換え
遺伝子によって合成されるペプチドや蛋白質は細胞内に
とどまり培地中に分泌生産されないため、自づとその生
産量は制限されていた。

その上、細胞磨砕によりペプチド、蛋白質を抽出１１３
することは、操作が煩雑になるなどの欠９点が措摘され
ている。

鵜高は、先に、遺伝子組換えにおける宿主菌として蛋白
質を菌体外に分泌する微生物を求めて研究した結果、蛋
白質を多量に分泌生産する微生物として、約１　、２０
０株のなかからバチルス・プレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｂｒｅｖｉｓ）　４株、新菌株バチルス・フロテイホ
ーマンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｆｏｒ＋ｍ
ａｎｓ）１株の計５株を分離同定するに至った。　　［
Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋＋＋、、４０　（３）、　５２３−５２８（１
９７６）］また、一方、分泌宿主−ベクターとして枯草
菌も利用され、α−アミラーゼ、インターフェロンなど
各種異種蛋白質を培地中に蓄積させることに成功してい
るが、菌体内外の強い１０テアーゼにより生産量が制限
されたり、分解されたりして、良好な結果は得られてい
ない。

先に、鵜高らは、バチルス・ステアロサーモフィルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ）　ＤＹ−５の耐熱性α−アミラーゼ遺伝子をプラ
スミド　ｐＵＢｌｌｏに組込んだｐＢＡＭ１０＋を保有
するバチルス−プレビス４７及び枯草菌を３７℃、４８
時間培養した時、バチルス・プレビス４７では約１５．
ｏ００Ｕ／＋＋＋Ｉ、枯草菌では３，０００υ／ＩＩＩ
Ｉ程度のα−アミラーゼをそれぞれ培地中に生産ＭＦａ
するのを確認した。　　［Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　
、　１６４゜＜３１，１１３２−１１８７（１９８５）
］ここに、全く同一の１ラスミドを保有するバチルス・
プレビス４７と枯草菌とでは、耐熱性α−アミラーゼの
生産においてバチルス・プレビス４７の方が約５倍も生
産効率のよいという事実から蛋白質生産菌の有する蛋白
質分泌能を用いることにより異種遺伝子産物を効率良く
分泌生産させうろことが判明した。

そこで、本発明者らは、蛋白質を著量分泌しする苗が遺
伝子聞損えにおける宿主菌としてすぐれたものであると
の発想から、このような菌株を求めて鋭意２別を行った
ところ、各種資料から分離した約　１００．０００株の
なかから菌体外に著量の蛋白質を生産する株を単離した
。

ここに単離された株について、種の同定を行ったところ
、はとんどはバチルス属に−するものと同定された。

本発明者等は、更にｉｉ芭選別を行ったところ、バチル
ス属以外にも、蛋白質を著量に菌体外に分泌生産する菌
株を単層することに成功したのである。ここに単離され
た株について、種の同定を行ったところ、シュードモナ
ス属に属するものと同定され１本発明を完成するに到っ
た。

本発明は、菌体外に著量の蛋白質を生産するシュードモ
ナスｖＬ菌である。

従来、バチルス属において、蛋白質を生産する菌株は知
られているが、シュードモナス属菌で蛋白質す５　ｇ／
を以上もの著１菌体外に生産する苗株は知られていない
。

本発明においてはじめて分離された新菌株、即ち、菌体
外に著量の蛋白質を生産するシュードモナス属の新菌株
は全く新規である。

本発明においては、蛋白質を５ｇハ以上培地中に分泌生
産する菌株を目標に選択分離された。

まず、土壌などの試料から分離された約１００．０００
株の菌株をＴ２寒天平板培地（１％グルコース、１％＾
プトン、０．５％肉エキス、０．２％酵母エキス、１．
５％寒天末、ｐＨ７，０）に接種し、平板培地上でコロ
ニー周辺が５％過塩素酸により白濁する！Ｉ菌を選択し
た６次に、ここに分離した細菌株をＴ２液体培地（１５
０ｍ１容三角フラスコ、培地量１０ｍ１　）でＳ盪培養
（３０℃、４８時閘）し、その培養ｒ液中に１．２ｇ／
１以上の蛋白質を生産する菌株を８０株得々菌体外蛋白
質の測定においては、培養液に等ＩのＱ、２Ｎ　ＮａＯ
Ｈを加え攪拌後１０．ＯＯＯｒｐｍ　Ｘ　５分遠心分離
処理して菌体を除き、上清に等量の１０％トリクロル酢
酸を加えてｌＯ分後３．０００ｒｐｎ＋Ｘ　ｉｏ分間遠
心分離して沈殿を集め、ＩＮ　Ｍａｉｌで溶解した後Ｌ
ｏｗｒｙ法［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、　１９３．２６
５（１９５１）］によって定量し蛋白質量は牛血清アル
ブミンとして換算した。

蛋白質高生産培地として第１表に示す培地を選んだ。

第１表　蛋白質高生産培地 これらの５種類の培地のすべての培地に、先に得られた
８０株の菌を振盪培養し、いずれかの培地で菌体外蛋白
質を５ｇハ以上生産する菌株を３１株選択した。

これら３１株を、　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　
ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｎ＋１−ｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ　（第８版）　、　Ｂｅｒｇｅｙ’Ｍａ
ｎｕａｌ　ｏｆ　５ｙｓｔｅ＋ｎａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｉｇｙ　ｖｏｌ、ｌ及び、ＴｈｅＰｒｏｋａｒ
ｙｏｔｅ　（Ａ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｎ　）Ｉａｂｉ
ｔａｔｓ。

ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）によって同定したと
ころ、６株は、まず、好気性、ダラム染色陰性、桿菌、
胞子を形成しない点においてシュードモナス属に属する
ものと認められたそのうち、）１５０１株をその他の形
態的性質、各培地における生育状態、生理学的性質につ
いて、シュードモナス属の従来知られている菌種と比較
検討した結果、シュードモナス属のどの菌種とも異って
いた。

従って、本菌種はシュードモナス属の新１ｉ１１１とし
て同定された。

かくて、本菌種はシュードモナスｓｐ、Ｈ３Ｏ１と命名
された。シュードモナスｓｐ、Ｈ３Ｏ１はＦＥＲＭ　Ｐ
−９７４２として微工研に寄託されている。

次にシュードモナス　ｓｐ、　）１５０１の国学的性質
を示す。

（Ｂ）各培地における生りｔ状聾 〈ｃ＋ｆｆｉ埋７的す つづきあり （Ｄ＞酸及びガスの生成 （Ｅ）炭素源の資化性 Ａｃｅｔａｔｅ　　　　　　　　　　　　＋５ｕｃｃ　
１ｎａｔｅ　　　　　　　　　　　＋Ｆｕｍａｒａｔｅ
　　　　　　　　　　　−Ｌ−Ｍａｌａｔｅ　　　　　
　　　　　　＋β−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｌａｔｅ　
　　　　　＋Ｌａｃｔａｔｅ　　　　　　　　　　　　
＋Ｃ１ｔｒａｔｅ　　　　　　　　　　　　＋置−Ｋｅ
ｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ　　　　　　　−Ｇｌｙｃｅｒ
ｏｌ　　　　　　　　　　　＋しＡｌａｎｉｎｅ　　　
　　　　　　　＋Ｌ−Ａｓｐａｒｔａｔｅ　　　　　　
　　　　−Ｌ−Ｇｌｕｔａｓａｔｅ　　　　　　　　　
　＋しＡｒｇｉｎｉｎｅ　　　　　　　　　−Ｌ−Ｐｒ
ｏｌｉｎｅ　十 Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　　　　　　　　　　＋Ｄ−Ｆｕ
ｃｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　−Ｍａ
ｌｔｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｃ　　　　　　　　　　　　　　　
−Ｌａｃｔｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　−Ｏ−八ｒａｂｉｎｏｓｅ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　−＾ｒａｂｉｔｏｌ　＋ ５ｔａｒｃｈ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
−Ｉｎｕｌｉｎ　ト ０ｘａｌａｔｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　−Ｅｔｈｙｌｅ＋＋　ｇｌｙｃｏｌ　　　　　　　　
　　　−Ｌ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　　　　　　　　　　
　−Ｄ−Ｒｉｂｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　　
＋Ｍａｎｎｉｔｏｌ　　　　　　　　　　　　＋Ｄ−Ｘ
ｙｌｏｓｅ　ト レ＾ｒａｂｉｎｏｓｅ　　　　　　　　　十Ｌ−Ｒｈａ
ｍｎｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　　−Ｇｌｕｃ
ｏｓｅ　十 Ｄ−Ｍａｎｎｏｓｅ　＋ １ｌ−Ｇａｌａｃｔｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　
　＋し一１１ｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌ　ｉｎｅ　　　　　
　　　　　　　　）Ｉｎｏｓｉ＋＋ｅ　　　　　　　　
　　　　　　　＋Ｂｅｔａｉｎｅ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　−Ｄ−Ｆｒｕｃｔｏｓｅ　十 ５ｕｃｒｏｓｅ Ｔｒｅｈａｒｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　−Ｉ
Ｃ１ｕｃｏｎａｔｅ　　　　　　　　　　　　　　　　
−−１’ｒｏｐｉｏｎａｔｃ ＭａｌｎｎａＬｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　
−Ｄ（−）−Ｔａｒｔｒａｔｅ− ３ｏｒｂｉｔｏｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　
−Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　　　　　　　　
　−Ｅｔｈａｎｏｌ　＋ ｎ−Ｂｕｔａｎｏｌ　　　　　　　　　　　　　　＋Ｂ
ｅｎｚｏａｔｅ　　　　　　　　　　　　　　　　−ｍ
−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ　　　　　　　　　
−ｐ−１１ｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ　　　　　　
　　　−Ｐｈｅｎｏ　Ｉ　　　　　　　　　　　　　　
　　　−Ｇｌｙｃｉｎｅ　　　　　　　　　　　　　　
　　−Ｌ−３ｅｒｉｎｅ　　　　　　　　　　　　　　
＋し−Ｌｃｕｃｉｎｅ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　）Ｌ−１ｓｏｌｅｕｃｉｎｅ　　　　　　　
　　　　　　＋Ｌ−Ｖａｌｉｎｅ　　　　　　　　　　
　　　　　　＋Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ　　　　　　　　　　
　　　　　−Ｌ−Ｏｒｎ　ｉ　ｔｈ　ｉｎｅ　　　　　
　　　　　　　　　−Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　　　　
　　　　　　　　　＋Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ
　　　　　　　　　　＋Ｒａｆｆ１ｎｏｓｅ　　　　　
　　　　　　　　　　　−Ｃｒｅａｔｉｎｅ　　　　　
　　　　　　　　　　　　＋Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ
　　　　　　　　　　　　−Ｄ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔ
ｅ　　　　　　　　　　　　　−本発明は、菌体外に著
量の蛋白質を生産するシュードモナス属菌で、特にシュ
ードモナスｓｐ。

Ｈ５Ｏ１である。

本発明のシュードモナス　ｓｐ、Ｈ３Ｏ１を培養するこ
とにより著量生産した蛋白質の性質次第では、それ自体
食糧蛋白質やゲル化剤、膨化剤等の食品加工素材または
、ガラス様素材、紙、人工皮革等の表面加工等の工業素
材としての利用等産業上の有用性が非常に高い。

また、本発明のンユードモナスｓｐ、Ｈ３Ｏ１を遺伝子
組換えの宿主菌として利用した場合遺伝子組換えによる
生産物を効率良く菌体外に分泌することができるので、
遺伝子組換えにおける°宿主菌としてきわめてｉぐれた
ものになるであろう。

この系は、医薬品、良質な食糧蛋白質やゲル化剤、膨化
剤等の食品加工素材または、ガラス様素材、紙、人工皮
革等の表面加工の工業素材などの生産手段としての活用
が期待できる。

以上のように本発明の有用性は産業上極めて意義深いも
のである。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する
。

実施例１ 前記第１表記載の５ＰＣ培地５ｏｏＩＩ１１を２Ｑ容の
ジャーファーメンタ−に分注し、常法により　１２１℃
２０分滅菌した後、冷却した。

別に、　５ＰＣ培地５１分注した試験管をオートクレー
ブすることにより滅菌し、これにシュードモナスｓｐ、
Ｈ３Ｏ１を１白金耳摺種し、３７℃で１４時間振盪培養
した。この前培養物５ｍｌをジャーファーメンタ−に接
種し、３７℃４８時間通気量０．５１／を回転数４００
ｒｐ＋ｓで培養した。培養終了後、培養物に等ｌの０．
２Ｎ　ＮａＯＨを加え攪拌１ｋ　　１０１００００ｒｐ
　５分遠心分鑓処理して菌体を除き、上ｉｆｆｌｏＯｍ
ｌに専属の１０１トリクロル酢酸を加え１０分後　３０
００ｒｐ＋＋＋８１０分間遠心分離して沈殿を集めた。

５％トリクロル酢酸で洗浄し、遠心分離に沈殿を集めＩ
Ｎ　Ｎａ０１１で溶解した１＆Ｌｏｗｒｙ法によって定
量した。蛋白質は牛血清アルブミンに換算して示した。

その結果、菌体外に生産された蛋白質量は９ｇ／Ｉであ
った。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 菌体外に著量の蛋白質を生産する新規シュードモナス属
   菌。