JPH01246300A - 活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法 - Google Patents
活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
本発明は、活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプ
ターの精製方法に関するものである。
ターの精製方法に関するものである。
精製された心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプター（
以下へＮＰ）は、例えば次のような目的に利用される。 ■ ＾ＮＰレセプターの構造解析を行い、レセプターの
機能発現部位及びその機能発現に影響を及ぼすレセプタ
ーの他の部位の構造を解明し、その知見をもとに＾ＮＰ
あるいは＾ＮＰと類似の生物学的活性を示す物質、又は
これらの示す生物学的活性を阻害する物質を天然より探
索又は人工的に合成すること。 ■ 構造解析の結果をもとに相補的ＤＮＡを調整し、細
菌及び動物細胞等の適当な発現系を用いて、＾ＮＰレセ
プターを大量に製造すること。 ■ へＨＰレセプターの免疫学的定量又は定性等に必要
な抗体の調整に用いること。 ■ 八ＮＰとの特異的親和性を利用し、＾ＮＰの定量又
は定性等に用いること。 そして、＾ＮＰは主として心臓の心房で産生され、血流
にのって様々な標的器官に運ばれ、＾ＮＰレセプターを
介して各種の作用を発揮する。 これまでに確認された＾ＮＰの活性は、次の通りである
。 ■ 腎臓において糸球体細胞のろ過ｔｌｌ能を昂進し、
利尿作用を発揮する。 ■ 腎臓において尿細管に働き、利尿作用を発揮する。 ■ 腎臓において傍系球体細胞に働き、昇圧酵素レニン
の分泌を抑制する。 ■ 血管において平滑筋細胞に働き、血管を拡張させる
。 ■ 副腎皮質において働き、ナトリウム貯留ホルモンと
して知られているアルドステロンの分泌を抑制する。 ■ 脳下垂体において働き、抗利尿ホルモンとして知ら
れているバソプレッシンの分泌を抑制する。 ■ 脳内において働き、飲水行動を抑制する。 ■ この他、眼圧の調整、及び肺、卵巣、腸管、脈絡最
における水代謝に関与していると推定される。 又、へＮＰレセプターの働きは次の通りである。 免疫組織学的及びｌ−１２５でｖＡ識した八ＨＰを用い
たオートラジオグラフィー等によって、へＮＰレセプタ
ーは、肺、腎臓、副腎、血管及び中枢脳神経系等を構成
する細胞の細胞膜上に多く存在することが判った。 心房で産生され、血流によって運ばれた八ＮＰはへＨＰ
レセプターと特異的に結合する。八ＮＰがへＨＰレセプ
ターに結合すると、その刺激が同じ細胞膜中にあってへ
ＨＰレセプターと強く結合しているグアニレートシクラ
ーゼ（ｃＧＭＰ合成酵素）に伝えられる。 その結果、細胞中のｅ Ｇ Ｍ Ｐ濃度が上昇し、これ
がセカンドメツセンジャーとなって八ＮＰの刺激を細胞
内に伝え、利尿及び血管拡張などの最終的な応答がひき
起こされる。 尚、細胞内に取り込まれた＾ＮＰと＾ＮＰレセプターは
ライソゾームに運ばれ分解される。 そして、＾ＨＰレセプターのように細胞膜に組み込まれ
た物質を精製する場合、目的の物質を人為的に細胞膜か
ら可溶化する必要がある。 しかし、可溶化の際に変性が起こり、目的物質が本来持
っている性質を消失してしまう。 従って、変性していないへＨＰレセプターを精製した場
合、細胞表層から単離されたへＮＰレセプター標品も、
細胞表層に存在するへＮＰレセプターと同様の特性を有
していることが保証されている必要がある。 ＾ＨＰレセプターの精製に関する最初の文献はＴｈｅＪ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｅａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ、２６２．５５１０−５５
１４（１９８７）であるが、この文献に開示されている
方法で単離精製されたへＮＰレセプターは八ＮＰとの結
合能を失っていた。
以下へＮＰ）は、例えば次のような目的に利用される。 ■ ＾ＮＰレセプターの構造解析を行い、レセプターの
機能発現部位及びその機能発現に影響を及ぼすレセプタ
ーの他の部位の構造を解明し、その知見をもとに＾ＮＰ
あるいは＾ＮＰと類似の生物学的活性を示す物質、又は
これらの示す生物学的活性を阻害する物質を天然より探
索又は人工的に合成すること。 ■ 構造解析の結果をもとに相補的ＤＮＡを調整し、細
菌及び動物細胞等の適当な発現系を用いて、＾ＮＰレセ
プターを大量に製造すること。 ■ へＨＰレセプターの免疫学的定量又は定性等に必要
な抗体の調整に用いること。 ■ 八ＮＰとの特異的親和性を利用し、＾ＮＰの定量又
は定性等に用いること。 そして、＾ＮＰは主として心臓の心房で産生され、血流
にのって様々な標的器官に運ばれ、＾ＮＰレセプターを
介して各種の作用を発揮する。 これまでに確認された＾ＮＰの活性は、次の通りである
。 ■ 腎臓において糸球体細胞のろ過ｔｌｌ能を昂進し、
利尿作用を発揮する。 ■ 腎臓において尿細管に働き、利尿作用を発揮する。 ■ 腎臓において傍系球体細胞に働き、昇圧酵素レニン
の分泌を抑制する。 ■ 血管において平滑筋細胞に働き、血管を拡張させる
。 ■ 副腎皮質において働き、ナトリウム貯留ホルモンと
して知られているアルドステロンの分泌を抑制する。 ■ 脳下垂体において働き、抗利尿ホルモンとして知ら
れているバソプレッシンの分泌を抑制する。 ■ 脳内において働き、飲水行動を抑制する。 ■ この他、眼圧の調整、及び肺、卵巣、腸管、脈絡最
における水代謝に関与していると推定される。 又、へＮＰレセプターの働きは次の通りである。 免疫組織学的及びｌ−１２５でｖＡ識した八ＨＰを用い
たオートラジオグラフィー等によって、へＮＰレセプタ
ーは、肺、腎臓、副腎、血管及び中枢脳神経系等を構成
する細胞の細胞膜上に多く存在することが判った。 心房で産生され、血流によって運ばれた八ＮＰはへＨＰ
レセプターと特異的に結合する。八ＮＰがへＨＰレセプ
ターに結合すると、その刺激が同じ細胞膜中にあってへ
ＨＰレセプターと強く結合しているグアニレートシクラ
ーゼ（ｃＧＭＰ合成酵素）に伝えられる。 その結果、細胞中のｅ Ｇ Ｍ Ｐ濃度が上昇し、これ
がセカンドメツセンジャーとなって八ＮＰの刺激を細胞
内に伝え、利尿及び血管拡張などの最終的な応答がひき
起こされる。 尚、細胞内に取り込まれた＾ＮＰと＾ＮＰレセプターは
ライソゾームに運ばれ分解される。 そして、＾ＨＰレセプターのように細胞膜に組み込まれ
た物質を精製する場合、目的の物質を人為的に細胞膜か
ら可溶化する必要がある。 しかし、可溶化の際に変性が起こり、目的物質が本来持
っている性質を消失してしまう。 従って、変性していないへＨＰレセプターを精製した場
合、細胞表層から単離されたへＮＰレセプター標品も、
細胞表層に存在するへＮＰレセプターと同様の特性を有
していることが保証されている必要がある。 ＾ＨＰレセプターの精製に関する最初の文献はＴｈｅＪ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｅａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ、２６２．５５１０−５５
１４（１９８７）であるが、この文献に開示されている
方法で単離精製されたへＮＰレセプターは八ＮＰとの結
合能を失っていた。
本発明者は、＾ＨＰレセプターの構造とｉ能に関する研
究を重ねた結果、前記Ｔｂｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｒＢ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙに開示された
精製方法によって得られたへＨＰレセプターの失活原因
は、精製の過程におけるアフィニティークロマトグラフ
ィーに用いた溶出液中の成分であるドデシル硫酸ナトリ
ウムにあることを見出した。 そこで、種々の溶出試薬について詳細な検討を行なった
結果、ドデシル硫酸ナトリウムを用いず、その代りに非
イオン性又は両性の界面活性剤を用いて行えば、へＮＰ
レセプターとしての基本的な活性を保証された原品の特
異的な単離精製が可能であることを見出した。 すなわち、本発明は、八ＨＰと＾ＮＰレセプターとが結
合した複合物を、錯化剤、一価の金属塩、非イオン性及
び両性の界面活性剤の群の中から選ばれる少なくとも一
種以上の界面活性剤を含むｐＨ約６以下の溶液で処理し
、＾ＨＰに結合しているへＨＰレセプターを溶出する活
性なへＮＰレセプターの精製方法を提供するものである
。 尚、上記の活性なへＮＰレセプターの精製方法において
、界面活性剤の濃度は約０．１〜２％であることが望ま
しく、又、一価の金属塩の濃度は約０．１〜１モル／ｌ
であることが望ましく、又、錯化剤の濃度は約１〜５０
ミリモル／ｌであることが望ましい。 尚、一価の金属塩としては例えばＮａＣＩ、ＫＣＩ等が
あり、又、錯化剤としては例えばエチレンジアミン四酢
酸ナトリウム等がある。 又、上記の活性な＾ＮＰレセプターの精製方法において
、複合物は、動物の組織及び／又は動物の組織由来の細
胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ば
れる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液で
処理して＾ＮＰレセプターを抽出し、その後＾ＨＰとの
反応により得られる。 特に、この複合物は、動物の組織及び／又は動物の組織
由来の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中
から選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有す
る溶液で処理して＾ＮＰレセプターを抽出し、この抽出
物を塩析し、例えばこの抽出物に硫酸塩を添加して該硫
酸塩濃度が約２５〜７０％の範囲で沈澱するものを集め
、これと固定化へＨＰとの反応により得られたもの、あ
るいは動物の組織及び／又は動物の組織由来の細胞を非
イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ばれる少
なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液で処理し
てへＮＰレセプターを抽出し、この抽出物を有機溶媒で
分画処理し、その後固定化へＮＰとの反応により得られ
たもの、さらには動物の組織及び／又は動物の組織由来
の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶
液で処理してへＮＰレセプターを抽出し、この抽出物に
塩析又は有機溶媒による分画操作を加え、その後遠心処
理を施して夾雑物を除去した上清に対し透析処理を行い
、その後固定化へＨＰとの反応により得られたものが望
ましい。 尚、この塩析又は有機溶媒による分画を行う理由は、ア
フィニティークロマトグラフィーによる精製に先立ち、
＾ＮＰレセプターの活性を保持したまま夾雑蛋白質を除
き、精製の効率を上げる為である。 又、上記の活性な＾ＮＰレセプターの精製方法において
、非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ばれ
る界面活性剤による＾ＮＰレセプターの抽出処理後、塩
析又は有機溶媒による分画操作を加え、その後遠心処理
を施して夾雑物を除去した上清に対し透析処理を行い、
その後固定化へＮＰとの反応を行なわせて複合物を得る
のが望ましいのは、塩析又は有機溶媒による分画によっ
てへＨＰレセプターの活性を保持したまま夾雑蛋白質を
除去し、アフィニティークロマトグラフィーによる精製
の効率を上げ、そして透析によって固定化へＨＰとへＨ
Ｐレセプターとの反応を妨げる硫酸塩又は有機溶媒を取
り除く為である。 又、上記の活性な＾ＮＰレセプターの精製方法において
、非イオン性又は両性の界面活性剤としては、例えばポ
リオキシエチレンエーテル、３−［（３−コラミドプロ
ピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォ
ネイト、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルア
ンモニオ］−２−ヒドロキシループロバンスルフォネイ
ト、ルブロールＰＸ、オクチルフェノール−エチレンオ
キシドコンデンセイト、ポリオキシエチレンソルビタン
、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド等がある。 又、上記の活性な＾ＮＰレセプターの精製方法において
、動物は、ブタ、ウサギ、サル、ラット、ウマ、ウシ、
ヒツジ、及びヤギの群の中から少なくとも一種以上のも
のを選ぶことができる。 又、上記の活性なへＨＰレセプターの精製方法において
、動物の組織は、動物の肺臓及び腎臓の群の中から少な
くとも一種以上のものを選ぶことができる。 又、上記の活性な＾ＨＰレセプターの精製方法において
、動物の組織由来の細胞は動物の血管内皮細胞を選ぶこ
とができる。 又、上記の活性な＾ＨＰレセプターの精製方法において
、動物の組織及び／又は動物の組織由来の細胞を非イオ
ン性及び両性の界面活性剤の中から選ばれる少なくとも
一種以上の界面活性剤を含有する溶液で処理してへＮＰ
レセプターを抽出するに際して、該界面活性剤の濃度は
約０．１〜２％とすることが望ましい。 これは、へＨＰレセプターは脂質に富む細胞膜中に埋め
込まれた形態で存在しており、このへＨＰレセプターの
生物学的活性を保持したまま脂質とへＨＰレセプターの
結合を解き、かつ遊離したへＭｌ’レセプターの自己凝
集を防ぐ為には、界面活性剤をこの範囲の濃度で用いる
ことが望ましい結果を呈したからである。 又、この抽出工程において、該界面活性剤含有溶液のｐ
ｉは約６〜８であることが望ましい。 これは、＾ＮＰレセプターの生物学的活性がｐＨ約６〜
８で最も安定であったからによる。 尚、上記した本発明の精製法を用いて得られたへＮＰレ
セプターは、次のような特性を有していた。 ■ 構造； 主として分子量約７万のサブユニ・ソト
が２個、ジスルフィド結合でつながった二量体の＄１蛋
白質（分子量約１４万）であるが、単量体としても若干
（例えば３％以下）存在し、両者とも活性を有する。 又、Ｎ末端のアミノ酸配列の解析の結果は、レセプター
が２つの同じサブユニットから構成されていることを強
く示唆している。 ■ 活性； 第１図に示す如く、生理的条件下でへＮＰ
レセプターが示す活性を確実に有する。 八ＨＰとの結合の特異性は極めて高く、第２図に示すよ
うに＾ＮＰ類似物質、例えばアトリオペプチン■に比べ
て約１００倍である。 ■ 安定性； ＾ＮＰレセプターと八ＮＰとの結合は、
第３図に示される如＜、ｐＨ約６．５〜１０において安
定に形成される。 ＾ＮＰレセプターは溶液の場合、第４図に示される如く
、４℃で１０週間以上、又、室温で少なくとも５週間安
定である。 さらに、へＮＰレセプターを凍結乾燥しても活性は失わ
れない。
究を重ねた結果、前記Ｔｂｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｒＢ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙに開示された
精製方法によって得られたへＨＰレセプターの失活原因
は、精製の過程におけるアフィニティークロマトグラフ
ィーに用いた溶出液中の成分であるドデシル硫酸ナトリ
ウムにあることを見出した。 そこで、種々の溶出試薬について詳細な検討を行なった
結果、ドデシル硫酸ナトリウムを用いず、その代りに非
イオン性又は両性の界面活性剤を用いて行えば、へＮＰ
レセプターとしての基本的な活性を保証された原品の特
異的な単離精製が可能であることを見出した。 すなわち、本発明は、八ＨＰと＾ＮＰレセプターとが結
合した複合物を、錯化剤、一価の金属塩、非イオン性及
び両性の界面活性剤の群の中から選ばれる少なくとも一
種以上の界面活性剤を含むｐＨ約６以下の溶液で処理し
、＾ＨＰに結合しているへＨＰレセプターを溶出する活
性なへＮＰレセプターの精製方法を提供するものである
。 尚、上記の活性なへＮＰレセプターの精製方法において
、界面活性剤の濃度は約０．１〜２％であることが望ま
しく、又、一価の金属塩の濃度は約０．１〜１モル／ｌ
であることが望ましく、又、錯化剤の濃度は約１〜５０
ミリモル／ｌであることが望ましい。 尚、一価の金属塩としては例えばＮａＣＩ、ＫＣＩ等が
あり、又、錯化剤としては例えばエチレンジアミン四酢
酸ナトリウム等がある。 又、上記の活性な＾ＮＰレセプターの精製方法において
、複合物は、動物の組織及び／又は動物の組織由来の細
胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ば
れる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液で
処理して＾ＮＰレセプターを抽出し、その後＾ＨＰとの
反応により得られる。 特に、この複合物は、動物の組織及び／又は動物の組織
由来の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中
から選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有す
る溶液で処理して＾ＮＰレセプターを抽出し、この抽出
物を塩析し、例えばこの抽出物に硫酸塩を添加して該硫
酸塩濃度が約２５〜７０％の範囲で沈澱するものを集め
、これと固定化へＨＰとの反応により得られたもの、あ
るいは動物の組織及び／又は動物の組織由来の細胞を非
イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ばれる少
なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液で処理し
てへＮＰレセプターを抽出し、この抽出物を有機溶媒で
分画処理し、その後固定化へＮＰとの反応により得られ
たもの、さらには動物の組織及び／又は動物の組織由来
の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶
液で処理してへＮＰレセプターを抽出し、この抽出物に
塩析又は有機溶媒による分画操作を加え、その後遠心処
理を施して夾雑物を除去した上清に対し透析処理を行い
、その後固定化へＨＰとの反応により得られたものが望
ましい。 尚、この塩析又は有機溶媒による分画を行う理由は、ア
フィニティークロマトグラフィーによる精製に先立ち、
＾ＮＰレセプターの活性を保持したまま夾雑蛋白質を除
き、精製の効率を上げる為である。 又、上記の活性な＾ＮＰレセプターの精製方法において
、非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ばれ
る界面活性剤による＾ＮＰレセプターの抽出処理後、塩
析又は有機溶媒による分画操作を加え、その後遠心処理
を施して夾雑物を除去した上清に対し透析処理を行い、
その後固定化へＮＰとの反応を行なわせて複合物を得る
のが望ましいのは、塩析又は有機溶媒による分画によっ
てへＨＰレセプターの活性を保持したまま夾雑蛋白質を
除去し、アフィニティークロマトグラフィーによる精製
の効率を上げ、そして透析によって固定化へＨＰとへＨ
Ｐレセプターとの反応を妨げる硫酸塩又は有機溶媒を取
り除く為である。 又、上記の活性な＾ＮＰレセプターの精製方法において
、非イオン性又は両性の界面活性剤としては、例えばポ
リオキシエチレンエーテル、３−［（３−コラミドプロ
ピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォ
ネイト、３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルア
ンモニオ］−２−ヒドロキシループロバンスルフォネイ
ト、ルブロールＰＸ、オクチルフェノール−エチレンオ
キシドコンデンセイト、ポリオキシエチレンソルビタン
、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド等がある。 又、上記の活性な＾ＮＰレセプターの精製方法において
、動物は、ブタ、ウサギ、サル、ラット、ウマ、ウシ、
ヒツジ、及びヤギの群の中から少なくとも一種以上のも
のを選ぶことができる。 又、上記の活性なへＨＰレセプターの精製方法において
、動物の組織は、動物の肺臓及び腎臓の群の中から少な
くとも一種以上のものを選ぶことができる。 又、上記の活性な＾ＨＰレセプターの精製方法において
、動物の組織由来の細胞は動物の血管内皮細胞を選ぶこ
とができる。 又、上記の活性な＾ＨＰレセプターの精製方法において
、動物の組織及び／又は動物の組織由来の細胞を非イオ
ン性及び両性の界面活性剤の中から選ばれる少なくとも
一種以上の界面活性剤を含有する溶液で処理してへＮＰ
レセプターを抽出するに際して、該界面活性剤の濃度は
約０．１〜２％とすることが望ましい。 これは、へＨＰレセプターは脂質に富む細胞膜中に埋め
込まれた形態で存在しており、このへＨＰレセプターの
生物学的活性を保持したまま脂質とへＨＰレセプターの
結合を解き、かつ遊離したへＭｌ’レセプターの自己凝
集を防ぐ為には、界面活性剤をこの範囲の濃度で用いる
ことが望ましい結果を呈したからである。 又、この抽出工程において、該界面活性剤含有溶液のｐ
ｉは約６〜８であることが望ましい。 これは、＾ＮＰレセプターの生物学的活性がｐＨ約６〜
８で最も安定であったからによる。 尚、上記した本発明の精製法を用いて得られたへＮＰレ
セプターは、次のような特性を有していた。 ■ 構造； 主として分子量約７万のサブユニ・ソト
が２個、ジスルフィド結合でつながった二量体の＄１蛋
白質（分子量約１４万）であるが、単量体としても若干
（例えば３％以下）存在し、両者とも活性を有する。 又、Ｎ末端のアミノ酸配列の解析の結果は、レセプター
が２つの同じサブユニットから構成されていることを強
く示唆している。 ■ 活性； 第１図に示す如く、生理的条件下でへＮＰ
レセプターが示す活性を確実に有する。 八ＨＰとの結合の特異性は極めて高く、第２図に示すよ
うに＾ＮＰ類似物質、例えばアトリオペプチン■に比べ
て約１００倍である。 ■ 安定性； ＾ＮＰレセプターと八ＮＰとの結合は、
第３図に示される如＜、ｐＨ約６．５〜１０において安
定に形成される。 ＾ＮＰレセプターは溶液の場合、第４図に示される如く
、４℃で１０週間以上、又、室温で少なくとも５週間安
定である。 さらに、へＮＰレセプターを凍結乾燥しても活性は失わ
れない。
【実施例１】
［へＮＰレセプター■抽出画分の調製３５倍溶液の１ｍ
Ｍ炭酸ナトリウム溶液ａｌ１８．３（５ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴ＾）、５μｇ／ｍ１ロ
イペプチン、５μｇ／ｍｌペプスタチン及び０．５Ｊフ
エニルメチルスルフオニルフルオロライド（＋’ＭＳＦ
）含有、以下ホモジナイズ溶液）中で、新鮮なウシ肺組
織１にｇをワーリングブレンダーを用いて細切、懸濁し
た。 この懸濁液を５，０ＯＯｘ Ｂで３０分間遠心して得た
沈渣を同量のホモジナイズ溶液に懸濁し、再び５，０Ｏ
Ｏｘｇで３０分間遠心した。 同様の操作を３回縁り返して得た沈渣を１、 ＩＩ ７
、４の生理的リン酸ｌＪ！街液（以下ＰＢＳ＞に１０
糟ＨのＥＤＴ＾、５μｇ／＋ｅｌのロイペプチン、５μ
ｇ／＋ｓｌのペプスタン及び０．５ｍＭのＰＭＳＦを含
有させた溶液に懸濁し。 ５、ＯＯＯＸｇで３０分間遠心した。 この沈渣を０．５％のトリトンＸ−１００，５μ８／論
１のロイペプチン、５μｇ／ｍｌのペプスタチン及び０
．５ｍＭのＰｔ４ＳＦを含有する４１のＰＢＳ中に１夜
懸濁した後、１０．０ＯＯｘ ｇで３０分間遠心し、上
清を得た。 次に、この上清を一定の速度で撹拌しつつ、固形の硫酸
アンモニウムを濃度２５％となるまでゆるやかに加えて
よく溶解し、さらに１時間撹拌を続けた後、１０，０Ｏ
Ｏｘｇで３０分間遠心し、上清を得た。 次いで、この上清に対し前記と同様に濃度７０％となる
まで硫酸アンモニウムを加え、さらに１時間撹拌を続け
た後、１０，０ＯＯｘ ｇで３０分間遠心し、沈渣を得
た。 以上の操作を５回繰り返し、５Ｋｇのウシ肺組織（■抽
出画分として２０１）から得た沈渣を、約２１のＰＢＳ
（さらに０．５％トリトンＸ−１００，１０ｍＭ ＥＤ
Ｔ＾、０．５μ［１／ＩＩＩロイペプチン、０．５μｇ
／ｍｌペプスタチン及び０．０５１１Ｍｒ’ＭｓＦ含有
）に溶解し、同じＰ［１Ｓ４０ｆに対し透析した後、０
．５μＨ／ｍｌロイペプチン、０．５Ｍｇ／彌１ペプス
タチン及び０．５Ｊ ＰＭＳＦを加え、３５，０００ｘ
ｇで６０分間遠心し、上清Ｚ１を得た。 ［へＮＰレセプターの精製］ ゲルろ適用アクリルアミドゲルカラム（１，５Ｘ６ｅ＋
＊）を前置した＾ＮＰ固定化ゲルろ適用アクリルアミド
ゲルカラム（１，Ｏｘ ２．５ｃｍ）を０．２％トリト
ンＸ−１ｏ。 を含むＰＢＳで平衡化し、１５〜２５℃において３５１
／時間の流速で前記の操作により得たへＮＰレセプター
■抽出画分をカラム内に導入した。 前置カラムを除去後、へＨＰ固定化カラムを次に示す溶
液各々１００１ずつで洗滌した。 ｉ ） ＰＢＳ（サラ（ＣＯ，２％ トリドア Ｘ−１
００，５，ｕＢ／ｍｌＯイベブチン、５μ［１／ ＩＩ
Ｉペプスタチン及び０．５ｍＨＰＭＳＦ含有） ｉｉ ） １０ｍＭ １ｌｅｐｅｓ ｐＨ７，４（さら
に５翰Ｍ ＥＤＴ＾、０．５ＨＮａＣＩ及び０．５％ト
リトンＸ−１００含有）ｉｉｉ ） １０＋ｅＭ ｌ１
ｅｐｅｓ ｐＨ７，４（さらに５ｍＭ ＥＤＴ＾及び０
．１％ＣＩＩ Ａ Ｐ Ｓ含有） 次いで、０．１ｍＭ酢酸ナトリウムＭ、衝液ｐＨ５，０
（さらに５ｍＭＥＤＴ＾、０．５Ｍ ＮａＣ１及び０．
２％ルブロールＰＸ含有）により、流速を１．５ｍｌ／
時間に減じて溶出を行ない、溶出液を３隋１ずつ分取し
た。 へＮＰレセプター画分は波長２８０ｎｍの紫外線の吸収
により確認した。 又、へＮＰレセプター画分は限外ろ過により濃縮した。 以上の操作により得たへＮＰレセプターは１２０μｇで
あり、そしてこれは活性なものであった。
Ｍ炭酸ナトリウム溶液ａｌ１８．３（５ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴ＾）、５μｇ／ｍ１ロ
イペプチン、５μｇ／ｍｌペプスタチン及び０．５Ｊフ
エニルメチルスルフオニルフルオロライド（＋’ＭＳＦ
）含有、以下ホモジナイズ溶液）中で、新鮮なウシ肺組
織１にｇをワーリングブレンダーを用いて細切、懸濁し
た。 この懸濁液を５，０ＯＯｘ Ｂで３０分間遠心して得た
沈渣を同量のホモジナイズ溶液に懸濁し、再び５，０Ｏ
Ｏｘｇで３０分間遠心した。 同様の操作を３回縁り返して得た沈渣を１、 ＩＩ ７
、４の生理的リン酸ｌＪ！街液（以下ＰＢＳ＞に１０
糟ＨのＥＤＴ＾、５μｇ／＋ｅｌのロイペプチン、５μ
ｇ／＋ｓｌのペプスタン及び０．５ｍＭのＰＭＳＦを含
有させた溶液に懸濁し。 ５、ＯＯＯＸｇで３０分間遠心した。 この沈渣を０．５％のトリトンＸ−１００，５μ８／論
１のロイペプチン、５μｇ／ｍｌのペプスタチン及び０
．５ｍＭのＰｔ４ＳＦを含有する４１のＰＢＳ中に１夜
懸濁した後、１０．０ＯＯｘ ｇで３０分間遠心し、上
清を得た。 次に、この上清を一定の速度で撹拌しつつ、固形の硫酸
アンモニウムを濃度２５％となるまでゆるやかに加えて
よく溶解し、さらに１時間撹拌を続けた後、１０，０Ｏ
Ｏｘｇで３０分間遠心し、上清を得た。 次いで、この上清に対し前記と同様に濃度７０％となる
まで硫酸アンモニウムを加え、さらに１時間撹拌を続け
た後、１０，０ＯＯｘ ｇで３０分間遠心し、沈渣を得
た。 以上の操作を５回繰り返し、５Ｋｇのウシ肺組織（■抽
出画分として２０１）から得た沈渣を、約２１のＰＢＳ
（さらに０．５％トリトンＸ−１００，１０ｍＭ ＥＤ
Ｔ＾、０．５μ［１／ＩＩＩロイペプチン、０．５μｇ
／ｍｌペプスタチン及び０．０５１１Ｍｒ’ＭｓＦ含有
）に溶解し、同じＰ［１Ｓ４０ｆに対し透析した後、０
．５μＨ／ｍｌロイペプチン、０．５Ｍｇ／彌１ペプス
タチン及び０．５Ｊ ＰＭＳＦを加え、３５，０００ｘ
ｇで６０分間遠心し、上清Ｚ１を得た。 ［へＮＰレセプターの精製］ ゲルろ適用アクリルアミドゲルカラム（１，５Ｘ６ｅ＋
＊）を前置した＾ＮＰ固定化ゲルろ適用アクリルアミド
ゲルカラム（１，Ｏｘ ２．５ｃｍ）を０．２％トリト
ンＸ−１ｏ。 を含むＰＢＳで平衡化し、１５〜２５℃において３５１
／時間の流速で前記の操作により得たへＮＰレセプター
■抽出画分をカラム内に導入した。 前置カラムを除去後、へＨＰ固定化カラムを次に示す溶
液各々１００１ずつで洗滌した。 ｉ ） ＰＢＳ（サラ（ＣＯ，２％ トリドア Ｘ−１
００，５，ｕＢ／ｍｌＯイベブチン、５μ［１／ ＩＩ
Ｉペプスタチン及び０．５ｍＨＰＭＳＦ含有） ｉｉ ） １０ｍＭ １ｌｅｐｅｓ ｐＨ７，４（さら
に５翰Ｍ ＥＤＴ＾、０．５ＨＮａＣＩ及び０．５％ト
リトンＸ−１００含有）ｉｉｉ ） １０＋ｅＭ ｌ１
ｅｐｅｓ ｐＨ７，４（さらに５ｍＭ ＥＤＴ＾及び０
．１％ＣＩＩ Ａ Ｐ Ｓ含有） 次いで、０．１ｍＭ酢酸ナトリウムＭ、衝液ｐＨ５，０
（さらに５ｍＭＥＤＴ＾、０．５Ｍ ＮａＣ１及び０．
２％ルブロールＰＸ含有）により、流速を１．５ｍｌ／
時間に減じて溶出を行ない、溶出液を３隋１ずつ分取し
た。 へＮＰレセプター画分は波長２８０ｎｍの紫外線の吸収
により確認した。 又、へＮＰレセプター画分は限外ろ過により濃縮した。 以上の操作により得たへＮＰレセプターは１２０μｇで
あり、そしてこれは活性なものであった。
【実施例２】
実施例１において、［＾ＨＰレセプター■抽出画分の調
整］過程で行なった塩析処理の代りに、有機溶媒（例え
ばアセトン４０％）による分画操作を行なう他は同様に
行ない、活性なへＮＰレセプターを得た。
整］過程で行なった塩析処理の代りに、有機溶媒（例え
ばアセトン４０％）による分画操作を行なう他は同様に
行ない、活性なへＮＰレセプターを得た。
【実施例３】
実施例１において、ＰＢＳの代りにｐＨ７，４の生理的
トリス塩酸Ｉｉ液（Ｔ［ｌＳ）を用いて同様に行ない、
活性なへＨＰレセプターを得た。
トリス塩酸Ｉｉ液（Ｔ［ｌＳ）を用いて同様に行ない、
活性なへＨＰレセプターを得た。
第１図〜第５図は、ＡＮＰレセプターの特性を示すグラ
フである。 図面の浄書 ＡＮ’Ｐ （ｐＥ？、／′ｍｌ） 第 １ １フ １ １００ １００００
１０００００’）Ｌｉｇａｎｄ Ｃｏｎｃ
ｅｎ＝ｒａｔｌｏｎ （ｐｇ／／／ｌ１ｎ１）第２図 Ｈ 第 ３ 図 ２ ４ ５ Ｂ １０
：”ｔ ｅ ｅ ｋ 第 ４ 図 Ｌｙｏｐｈｉｌｔｚｉｎｇ Ｔｉｍｅｓ第 ５
！♂ 手 続 補 正 書 昭和６３年５月１０日 特許庁長官膜 −１、事件の
表示 特願昭６３−７３２０９号 ２、発明の名称 活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製
方法３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 株式会社 サイチックリサーチ ４、代理人 発明の詳細な説明 ７、補正の内容 （１）明細書第１０ページ第５〜９行目［＾ＮＰ・・・
いた、」を削除する。 手 続 補 正 書 昭和６３年６月父日
フである。 図面の浄書 ＡＮ’Ｐ （ｐＥ？、／′ｍｌ） 第 １ １フ １ １００ １００００
１０００００’）Ｌｉｇａｎｄ Ｃｏｎｃ
ｅｎ＝ｒａｔｌｏｎ （ｐｇ／／／ｌ１ｎ１）第２図 Ｈ 第 ３ 図 ２ ４ ５ Ｂ １０
：”ｔ ｅ ｅ ｋ 第 ４ 図 Ｌｙｏｐｈｉｌｔｚｉｎｇ Ｔｉｍｅｓ第 ５
！♂ 手 続 補 正 書 昭和６３年５月１０日 特許庁長官膜 −１、事件の
表示 特願昭６３−７３２０９号 ２、発明の名称 活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製
方法３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 株式会社 サイチックリサーチ ４、代理人 発明の詳細な説明 ７、補正の内容 （１）明細書第１０ページ第５〜９行目［＾ＮＰ・・・
いた、」を削除する。 手 続 補 正 書 昭和６３年６月父日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）心房性ナトリウム利尿ペプチドと心房性ナトリウ
ム利尿ペプチドレセプターとが結合した複合物を、錯化
剤、一価の金属塩、非イオン性及び両性の界面活性剤の
群の中から選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を
含むｐＨ約６以下の溶液で処理し、心房性ナトリウム利
尿ペプチドに結合している心房性ナトリウム利尿ペプチ
ドレセプターを溶出することを特徴とする活性な心房性
ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法。 （２）特許請求の範囲第１項記載の活性な心房性ナトリ
ウム利尿ペプチドレセプターの精製方法において、界面
活性剤の濃度が約０．１〜２％であるもの（３）特許請
求の範囲第１項記載の活性な心房性ナトリウム利尿ペプ
チドレセプターの精製方法において、一価の金属塩の濃
度が約０．１〜１モル／ｌであるもの。 （４）特許請求の範囲第１項記載の活性な心房性ナトリ
ウム利尿ペプチドレセプターの精製方法において、錯化
剤の濃度が約１〜５０ミリモル／ｌであるもの。 （５）特許請求の範囲第１項記載の活性な心房性ナトリ
ウム利尿ペプチドレセプターの精製方法において、複合
物が、動物の組織及び／又は動物の組織由来の細胞を非
イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ばれる少
なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液で処理し
て心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターを抽出し、
固定化心房性ナトリウム利尿ペプチドとの反応により得
られたもの。 （６）特許請求の範囲第１項又は第５項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、複合物が、動物の組織及び／又は動物の組織由来
の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶
液で処理して心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプター
を抽出し、この抽出物を塩析し、固定化心房性ナトリウ
ム利尿ペプチドとの反応により得られたもの。 （７）特許請求の範囲第１項又は第５項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、複合物が、動物の組織及び／又は動物の組織由来
の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶
液で処理して心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプター
を抽出し、この抽出物に硫酸塩を添加して該硫酸塩濃度
が約２５〜７０％の範囲で沈澱するものを集め、これと
固定化心房性ナトリウム利尿ペプチドとの反応により得
られたもの。 （８）特許請求の範囲第１項又は第５項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、複合物が、動物の組織及び／又は動物の組織由来
の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶
液で処理して心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプター
を抽出し、この抽出物を有機溶媒で分画処理し、固定化
心房性ナトリウム利尿ペプチドとの反応により得られた
もの。 （９）特許請求の範囲第１項又は第５項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、複合物が、動物の組織及び／又は動物の組織由来
の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶
液で処理して心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプター
を抽出し、この抽出物に塩析又は有機溶媒による分画操
作を加え、その後遠心処理を施して夾雑物を除去した上
清に対し透析処理を行い、固定化心房性ナトリウム利尿
ペプチドとの反応により得られたもの。 （１０）特許請求の範囲第１項、第２項、第５項、第６
項、第７項、第８項、又は第９項記載の活性な心房性ナ
トリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法において、
界面活性剤が、ポリオキシエチレンエーテル、３−［（
３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−
プロパンスルフォネイト、３−［（３−コラミドプロピ
ル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシル−プロ
パンスルフォネイト、ルブロールＰＸ、オクチルフェノ
ール−エチレンオキシドコンデンセイト、ポリオキシエ
チレンソルビタン、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド
の群の中から選ばれる少なくとも一種以上のもの。 （１１）特許請求の範囲第５項〜第９項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、動物が、ブタ、ウサギ、サル、ラット、ウマ、ウ
シ、ヒツジ及びヤギの群の中から選ばれる少なくとも一
種以上のもの。 （１２）特許請求の範囲第５項〜第９項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、動物の組織が、動物の肺臓及び腎臓の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上のもの。 （１３）特許請求の範囲第５項〜第９項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、動物の組織由来の細胞が動物の血管内皮細胞であ
るもの。 （１４）特許請求の範囲第５項〜第９項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、非イオン性又は両性の界面活性剤の群の中から選
ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液
中の該界面活性剤の濃度が約０．１〜２％であるもの。 （１５）特許請求の範囲第５項〜第９項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、非イオン性又は両性の界面活性剤の群の中から選
ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液
のｐＨが約６〜８であるもの。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7320988A JPH01246300A (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | 活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7320988A JPH01246300A (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | 活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01246300A true JPH01246300A (ja) | 1989-10-02 |
Family
ID=13511535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7320988A Pending JPH01246300A (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | 活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01246300A (ja) |
-
1988
- 1988-03-29 JP JP7320988A patent/JPH01246300A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1987 * |
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