JPH09509165A

JPH09509165A - ミルクからのラクトフェリンの分離

Info

Publication number: JPH09509165A
Application number: JP7521594A
Authority: JP
Inventors: ヌイジェンス，ジャン，エイチ．; ヴェーン，ハリー，エイチ．ファン
Original assignee: ファーミングベスローテンフェンノートシャップ
Priority date: 1994-02-16
Filing date: 1995-02-16
Publication date: 1997-09-16
Also published as: DE69524386D1; EP1142484A2; FI963197L; EP0744901B1; NO963163L; AU1809895A; EP0744901A1; CA2183459A1; US5919913A; FI963197A7; US5849885A; ATE209862T1; FI963197A0; WO1995022258A3; NO963163D0; MX9603369A; WO1995022258A2; US5861491A; NZ330484A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ミルク、特に非ヒト種からのヒトラクトフェリンの精製方法、およびミルク中に存在する望まないマクロ分子種からヒトラクトフェリンを分離する方法（非ヒトラクトフェリン種からの分離を含む）を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ミルクからのラクトフェリンの分離発明の分野本発明は、ミルクからのラクトフェリンの精製、特にトランスジーンによりエンコードされたヒトラクトフェリンポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物のミルクからのヒトラクトフェリンの精製に関する。背景分子生物学の分野における最近の進歩は、トランスジェニック動物、すなわち人間の介在によって導入された、生殖細胞系及び体細胞のゲノム中の外在性ＤＮＡ配列を含む非ヒト動物の製造を可能にした。種々の細胞タイプ中のこれら外来遺伝子の調節における差異は、外来遺伝子によりエンコードされたタンパク質の分離の容易のために、選択された組織における外来遺伝子産生物の所望の活性のために、又は他の理由のために、予め選択された組織たとえば乳腺における外来遺伝子の差別的発現を促進することを可能にする。トランスジェニック動物及び差別的遺伝子発現の利点は、大量の重要なタンパク質の分離、特に経済的精製方法による分離である。そのようなタンパク質は典型的には、トランスジェニック動物に対して外来性であり、そして医療品、食品添加物、栄養補助物などを包含する。しかし、外在性タンパク質は好ましくは、それらが自然に発現されるところの組織と類似の組織において発現される。たとえば、外在性ミルクタンパク質（たとえばラクトフェリン）は、好ましくはトランスジェニック動物中のミルク生成組織において発現される。その結果、分離の困難性の問題が生じる。なぜならば、該外在性タンパク質はしばしば、内在性の対応するタンパク質（もし、あるならば）、及びたぶん、非常に類似の物理化学的特性を持つ他の非所望の汚染物質を含む組織又は体液中に発現されるからである。しかも、多くの外在性タンパク質は、医療品又は食品添加物としての使用の前に、他の物質から実質的に精製、しばしば純品まで精製されなければならない。たとえば、乳房分泌細胞での発現に向けられたヒトラクトフェリンポリペプチドをエンコードするトランスジーンを含有するトランスジェニックウシ種の製造は、ＷＯ９１／０８２１６に記載されており、該公報は引用することにより本明細書に含められる。機能する内在性ウシラクトフェリン（ｂＬＦ）遺伝子及びヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）の発現をエンコードするトランスジーンを含むトランスジェニック動物からのｈＬＦの精製は、ヒトラクトフェリンと類似の物理化学的特性を持つ内在性ｂＬＦの存在により複雑にされる。機能する内在性ｂＬＦ遺伝子を欠く（たとえば、内在性ｂＬＦ対立遺伝子を機能的に破壊するための相同遺伝子ターゲティングの結果として）トランスジェニックウシにおいてさえ、トランスジーンでエンコードされたｈＬＦを他の生物学的巨大分子及び汚染物質から精製することが、しばしば望まれ、かつ／又は必要である。ｈＬＦは医薬で用いられる可能性があり、また栄養補強物としてヒト食品に入れられるかもしれない（これらは、高度に精製されたｈＬＦを典型的に必要とする）故に、ミルクから、特にトランスジェニック非ヒト動物たとえばウシ種のミルク又はミルク画分からｈＬＦを精製する方法を開発することが重要である。ヒトラクトフェリンは、第二鉄イオンを結合する一本鎖糖タンパク質である。外分泌の腺により分泌され（メーソンら、１９７８、Ｊ．Ｃlin.Path．31：316 ；テノブオら、１９８６、Ｉnfect.Ｉmmunol．51：49）、好中性白血球の顆粒中に含まれ（メーソンら、１９６９、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．130：643）、このタンパク質は、多様なスペクトルのバクテリアの生長を抑止することにより宿主非特異的防禦系の一部として機能する。ｈＬＦは、媒体中の利用しうる鉄をキレート化して、この必須金属に微生物がアクセスできなくすることにより、静菌作用を示す（ブレンら、１９７２、Ｂrit．Ｍed.Ｊ．１：69；グリフィスズら、１９７７、Ｉnfect.Ｉmmunol．15：396、スピクら、１９７８、Ｉmmunology 8：663；スチュワートら、１９８４、Ｉnt.Ｊ.Ｂiochem.16：1043）。もし第二鉄イオンがｈＬＦ結合部位を飽和するのに必要なより多く存在するなら、静菌作用は妨害されうる。ラクトフェリンは、ヒトのミルクにおける主要なタンパク質であり（約１．５mg／mlの濃度で存在する）、小腸による食品中鉄の吸収に役割を有する。ヒト乳房ミルク中に存在する鉄の事実上総てがｈＬＦに結合され、幼児処方中の遊離の鉄に比べて非常に高い効率で小腸において摂取されると報告されている（ハイド等、１９８１、Ａrch.Ｄis.Ｃhild．５６：172）。ヒトにおけるｈＬＦに結合した鉄の効率の良い摂取は、十二指腸におけるレセプターによると考えられてきた（コックスら、１９７９、Ｂiochem．Ｂiophys．Ａcta.58 8：120）。特定のラクトフェリンレセプターが、ヒトの胎児の小腸の粘膜細胞において報告された（カワカミとロネルダール、１９９１、Ａm.Ｊ．Ｐhysiol．26 1：Ｇ841）。ヒトの初乳からのｈＬＦが、研究用の凍結乾燥物として少量で（１０mg及び２５mgビン）市販入手できる（Ｃalbiochem,カリフォルニア州ラジョラ及び他の販売者）。ｈＬＦのアミノ酸配列は報告されており（メッツ‐ボウティグら、１９８４、Ｅur．Ｊ．Ｂiochem．1451：659）、ＷＯ９１／０８２１６はメッツ‐ボウティグらの先の報告と配列が少し違うｈＬＦ配列を報告している。ｈＬＦは、２つのドメインを含み、夫々は鉄結合部位及びＮ結合されたグリコシル化部位を有する。これらドメインは、互に相同性を示し、先祖遺伝子複製及び融合事象と一致する。ｈＬＦはまた、トランスフェリン類の他のメンバーとかなりの配列相同性を共有する（メッツ‐ボウティグら、１９８４、前出；ペンテコストら、１９８７、Ｊ．Ｂiol. Ｃhem.262:10134）。好中球ｈＬＦのための部分的ｃＤＮＡ配列が、ラドら（１９８７、Ｂlood 70：989）により出版されており、これは、ヒトのミルクからのｈＬＦからの直接のアミノ酸配列決定により決定されたアミノ酸配列に比べて98 ％より大きな配列同一性を示す。ヒトラクトフェリンの鉄で飽和された形及び鉄を有さない形の構造が報告されている（アンダーソンら、１９８９、Ｊ．Ｍol. Ｂiol.209：711；アンダーソンら、１９９０,．Nature 344：784）。ミルクからラクトフェリンを精製するプロトコールが報告されている。米国特許第4,436,658号明細書は、ウシミルクの脱脂しかつカゼインを含まないホエイからのウシラクトフェリンの分離を記載している。簡単に言えば、ホエイは、ｐＨ７．７〜８．８で僅か塩基性の媒体中でシリカと接触させられ、ラクトフェリンは吸着され、その後、０．５ＭＮａＣｌ／０．１Ｎ酢酸で溶出される。米国特許第4,791,193号明細書及びヨーロッパ特許出願ＥＰ0 253 395号公報（オコノギら）は、ウシミルクが弱酸性カチオン交換樹脂のカルボキシメチル基と接触させられ、吸着されたラクトフェリンは１０％ＮａＣｌ勾配で溶出される方法を同じく報告している。米国特許第4,668,771号明細書において、ｂＬＦは、不溶性担体に固定されたモノクローナル抗体を用いてウシミルクから単離される。ＷＯ８９／０４６０８は、ウシミルクホエイからウシラクトペルオキシダーゼ及びｂＬＦの画分を得る方法を記載している；ミルクホエイは、ミクロ濾過され、そしてラクトペルオキシダーゼ及びｂＬＦの選択的吸着のために大きな流速で強カチオン交換体（ｐＨ６．５）に通され、次に０．１〜０．４Ｍ及び０．５〜２．０ＭのＮａＣｌ溶液により夫々、ラクトペルオキシダーゼ及びｂＬＦを逐次溶出する。米国特許第4,997,914号明細書は、ヒトの初乳又は生乳からのｈＬＦの分離を記載している；ラクトフェリンを含む試料は、架橋多糖類の硫酸エステルと接触させられて、ｈＬＦを結合し、次に０．４〜１．５ＮａＣｌ水溶液で溶出する。科学文献もまた、ミルクからのラクトフェリンの分離のためのプロコールを報告している。これらの多数は、イオン交換クロマトグラフィを用いて天然源からＬＦを分離すること及び続く塩溶出に関する。クエリンジャンら、１９７１、Ｅ ur．Ｊ．Ｂiochem．20：420は、ＣＭセファデックスＣ‐50上でのヒトミルクからｈＬＦの分離及び続く０．３３ＭＮａＣｌでの溶出を報告している。ヨハンソン、１９６９、Ａcta Ｃhem.Ｓcand．23：683は、ＬＦの精製のためにＣＭセファデックスＣ‐50を用いた。そしてヨハンソンら、１９５８、Nature 181：996は、ＬＦ精製のためにリン酸カルシウムの使用を報告している。トレスら、１９７９、Ｂiochem．Ｂiophys．Ａcta 576：385は、モルモットミルクからのラクトフェリン分離を報告している。ミルクは、脂肪を取除きかつカゼリンを沈降させるために、遠心分離により予備処理された。ワットマンＣＭ‐52カラムが用いられ、ラクトフェリンは０．５ＭＮａＣｌ／５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５により溶出された。ロバーツとボウルスネル、１９７５、Ｊour.of Ｒeproductive Ｆertility 42：579は、脱脂されたブタミルクから分離されたラクトフェリンを報告している。ＣＭ‐セファデックスがミルクの硫酸アンモニウム第一鉄沈澱に加えられ、そして結合したラクトフェリンはｐＨ７で０．５ＭＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸塩で溶出され、次にＣＭ‐セファデックスで第二の分画が行われ、そこからラクトフェリンは０．４ＭＮａＣｌにより溶出された。ザグルスキーら、１９７９、Ｐrace i Ｍaterialy Ｚeotechnicz ne 20：87は、ウシミルクから分離されたウシラクトフェリンを報告している。脱脂されたウシミルクはＣＭ‐セファデックスＣ‐50と混合され、ラクトフェリンはカラムから０．５ＭＮａＣｎ／０．０２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７により溶出された。モグリレフスキーら、１９７５、Ｂiochem Ｊ．229：353は、ＣＭ‐セファデックスクロマトグラフィ及びＩＭ塩化ナトリウムでの溶出を用いてヒトミルクから分離されたラクトフェリンを報告している。エクストランドとビョールク、１９８６、Ｊour.of Ｃhromatography 358：429は、ヒト初乳及びウシミルクから分離されたラクトフェリンを報告している。脱脂されたウシ又はヒトミルクは酸性化されてｐＨ７．８に調節され、そしてＭono Ｓ（商標）カラムに与えられる。ウシ又はヒトラクトフェリンは０〜１ＭＮａＣｌの連続的塩勾配により溶出された。ウシラクトフェリンからのヒトラクトフェリンの精製が報告されている。フォレイとベイテス、１９８７、Ａnal.Ｂiochem．162：296は、ヒト初乳ホエイからのラクトフェリンの分離を報告している。ホエイは弱イオン交換樹脂（リン酸セルロース）と混合され、タンパク質は段階的な塩及びｐＨ勾配により溶出された。ラクトフェリンは、ｐＨ７．５で０．２５ＭＮａＣｌ／０．２Ｍリン酸ナトリウムにより溶出された。更に、ヨシダとイェ‐キュユン、１９９１、Ｊ．Ｄairy Ｓci．74：1439は、０〜０．５５ＭＮａＣｌの直線的勾配を有する０．０５Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．７を用いて、カルボキシメチルカチオン樹脂上でのイオン交換によりラクトフェリンを分離することを開示した。カルボキシメチル‐トヨパールカラムは、ウシミルク酸性ホエイのアルブミン画分からラクトパーオキシダーゼ及びラクトフェリンのみを吸着した。ラクトフェリンは、０．４〜０．５５ＭＮａＣｌの間で溶出され、そして２つの成分（ラクトフェリンＡとラクトフェリンＢ）に分離された。アフィニティクロマトグラフィを含めて他の方法も報告されている。たとえば、カワカミら、１９８７、Ｊ．Ｄairy Ｓci．70：752では、ヒト又はウシラクトフェリンに対するモノクローナル抗体を用いるＬＦのアフェニティクロマトグラフィが報告されている。ヒトラクトフェリンはヒト初乳から分離され、ウシラクトフェリンはウシミルク又はチーズホエイから分離された。（上記の米国特許第4,668,771号明細書も見られたい。）ハッチェンズら、１９８９、Ｃlin．Ｃ hem．35：1928では、アフィニティカラム上で一本鎖ＤＮＡを用いて、ヒトミルクを与えられた初期（pre term）幼児の尿からラクトフェリンが分離された。更に、チェンとワン、１９９１、Ｊ．Ｆood Ｓci．56：701は、アフィニティクロマトグラフィと膜濾過を組合せて、ラクトフェリンを結合するためにヘパリン‐ セファロースを用いて、ウシチーズホエイからラクトフェリンを分離する方法を報告した。チーズホエイは、結合（binding）緩衝液により希釈され、ヘパリン ‐セファロース物質に加えられた。このスラリーはミクロ濾過され、そしてラクトフェリンがｐＨ７．４で５ｍＭベロナール・ヒドロクロライド／０．６ＭＮａＣｆで溶出された。ベツワダら、１９８６、Ｃlin．Ｃhem．Ａcta 157：89は、ＬＦの精製のためにシバクロンブルーＦ３ＧＡ樹脂を用いることを報告している。フェリチン（パフドら、１９７６、Ｐrotides Ｂiol Ｆluids．23：571 ）及びヘパリン（ブラックベルグ、１９８０）ＦＥＢＳ Lett．109：180）もまた、ミルクからの精製について報告された。従って、トランスジーンによりエンコードされたヒトラクトフェリンを含むミルク、特に非ヒトトランスジェニック動物たとえばウシ種のミルクからヒトラクトフェリンを精製する方法が従来求められていた。医薬の又は食品の添加物としての使用のために、ミルクたとえばウシミルクからヒトラクトフェリンを経済的かつ効率的に精製する方法及び組成物を提供することが、本発明の目的の一つである。本発明は、これら及び他の要求を満す。約９８％以上の純度のヒトラクトフェリン組成物を提供することも、本発明の目的である。本明細書で検討される文献は、本出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。本発明が先発明の故にそのような開示より先の日付を持つという権利がないことを自認するものとして解釈されるべきではない。発明のまとめ本発明は、ミルクからのヒトラクトフェリンの精製、特にヒトラクトフェリントランスジーンを含むトランスジェニックウシ種により産生されたウシミルクからのヒトラクトフェリンの精製のための効率的かつ効果的方法を提供する。トランスジーンによりエンコードされるヒトラクトフェリンは、トランスジェニック雌ウシのミルク中の他のミルクタンパク質から実質的に精製され、かつ好ましくは、内在性ウシラクトフェリン（もしミルク中に存在するなら）から実質的に分離される。本発明は、組替えヒトラクトフェリン（ｒｈＬＦ）をエンコードするトランスジーンの発現により産生されたヒトラクトフェリンならびにミルク、典型的にはウシミルクからの他の関連するラクトフェリン類を包含するヒトラクトフェリンを分離する方法を提供する。そのような他の関連するラクトフェリン類は、切断されたｈＬＦ、ｈＬＦのアミノ酸配列変異体（突然変異又は多形性変異体）、追加的残基を含むｈＬＦ類を包含しうる。本発明はまた、ウシラクトフェリン、ヒツジラクトフェリン、ヤギラクトフェリン、マウスラクトフェリン、及びブタラクトフェリンからヒトラクトフェリン（ｒｈＬＦを含め）を精製することを可能にする方法を提供する。一般に、ｈＬＦを含むミルクまたはミルク画分は、非ラクトフェリンタンパク質及び他の物質が強カチオン交換樹脂に結合することを妨げるため及びラクトフェリンと他のタンパク質（たとえばカゼイン）又は物質（たとえばリポ多糖類）との静電相互作用を低減するために、及び複合体からラクトフェリンを遊離させるために、比較的高いイオン強度（０．２Ｍ〜０．５ＭＮａＣｌ又はＫＣｌ、好ましくは０．４ＭＮａＣｌ又はＫＣｌ）の存在下で強カチオン交換樹脂（たとえばＳＳepharose（商標）セファロース）と接触させられる。結合されたラクトフェリンを含む強カチオン交換樹脂は、典型的には遠心分離又は沈降及び続くバッチ的洗浄により及び／又は樹脂をカラムに注ぎ入れそしてビーズをほぼ同じ又は低い塩濃度を持つ緩衝液で洗うことにより、ミルク又はミルク画分中の非結合化合物から分離される。カチオン交換樹脂に結合されたラクトフェリンは、水性の、典型的には緩衝された、Ｎａｃｌ又はＫＣｌ勾配（たとえば２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中の０〜１ＭＮａＣｌの直線的勾配）により、又は０．４Ｍ以上、好ましくは少くとも０．５ＭのＮａＣｌ又はＫＣｌの水性の、好ましくは緩衝された、ＮａＣｌ又はＫＣｌ溶液でのバッチ的又は段階的溶出により溶出される。適当な溶出条件を選ぶことにより、効果的な方法によりヒトラクトフェリンは、ウシミルクから実質上精製され、かつウシラクトフェリンから実質上分離される。本発明の一つの局面において、ヒトラクトフェリン（たとえばｒｈＬＦ）は、内在的非ヒトラクトフェリン類（たとえばｂＬＦ）の微量残存からヒトラクトフェリンを分離するために、塩勾配又は段階的溶出を用いて強カチオン交換体（たとえばＳＳepharose Ｆast Ｆlow）上でのクロマトグラフィの追加的な後続段階により内在的ラクトフェリン（たとえばｂＬＦ）から更に精製され、かつ／又は任意的に、ヒトラクトフェリンをｂＬＦから更に分離するためにコンカナバリンＡ樹脂を用いるアフィニティクロマトグラフィを含めてもよい（ｂＬＦはｈＬＦよりも強くＣon Ａ樹脂に結合される）。本発明の方法において、限定された量（たとえば試料中のラクトフェリンの実質上総てを飽和的に結合するのに必要なよりも少い量）の強カチオン交換樹脂が水性条件下でミルク又はミルク画分と接触させられ（たとえばミルクまたはミルク画分に直接に樹脂を加えることにより）、それによって最も強くカチオン性のタンパク質たとえばラクトフェリンが、存在する限られた量のカチオン交換樹脂に優先的にかつ競争的に結合する。限られた量のカチオン交換樹脂という言葉により、ミルクまたはミルク画分の所定の塩強度において目的のラクトフェリン種（たとえばヒトの）の実質上総て（たとえば９９％）の分子を少くとも結合するのに丁度十分な量を意味する。従って、用いられるべき強カチオン樹脂の量は、ラクトフェリン結合の選択性を最適化するように限定される。結合されたタンパク質を有する限られた量の強カチオン交換樹脂は、典型的には遠心分離又は沈降及び続くバッチ的洗浄により及び／又は樹脂をカラムに注ぎ入れそして樹脂及び結合したタンパク質をバッチ的に洗うことにより、ミルク又はミルク画分の残余から分離される。樹脂に結合したラクトフェリンは、高濃度塩緩衝液（すなわち０．４Ｍより高濃度のＮａＣｌ又はＫＣｌ）により又は少くとも０．５ＭＮａＣｌ又はＫＣｌの最高塩濃度を持つ塩勾配により溶出される。一つの変法において、イオン種たとえばＮａＣｌ又はＫＣｌが、ミルク又はミルク画分を強カチオン交換樹脂と接触させる前に、未加工のミルク、加工ミルク又はミルク画分に加えられる。典型的には、塩（又は塩溶液）が、最終塩濃度を約０．２Ｍ〜０．５Ｍ、最も好ましくは約０．４ＭのＮａＣｌ又はＫＣｌとするようにミルク又はミルク画分に加えられて、高いイオン強度のミルク溶液を形成する。この高イオン強度ミルク溶液は、結合条件下で強カチオン交換樹脂と接触させられ、そして結合されたミルクタンパク質を含む樹脂は、典型的には遠心分離又は沈降及び続くバッチ的洗浄により、及び／又は強カチオン交換樹脂混合物をカラムに注ぎ入れ、そしてカラムから液体を除去することによりかつ／又は樹脂カラムを高イオン強度ミルク溶液とほぼ等しい又はより低いイオン強度の洗浄緩衝液により洗うことにより、高イオン強度ミルク溶液の残余を取除くことにより、高イオン強度ミルク溶液の残余中の非結合成分から分離される。強カチオン交換樹脂に結合されたラクトフェリンは、高濃度緩衝液（すなわち０．４Ｍより高いＮａＣｌ又はＫＣｌ濃度）、又は少くとも約０．５ＭＮａＣｌ又はＫＣｌの最高塩濃度を持つ塩勾配により溶出される。最適の変法において、ラクトフェリン精製の効率を低下させるであろう巨大分子間の望ましくない疎水性相互作用を低下させるために、洗剤たとえば非イオン性洗剤（たとえばＴween‐20）がミルクまたはミルク画分に加えられうる。ミルク又はミルク画分はまた、回収されたラクトフェリンの収率及び／又は純度を低下させうる望ましくない分子間相互作用を更に低下させるために、典型的には約０．２〜０．５ＭＮａＣｌ又はＫＣｌ、好ましくは０．４ＭＮａＣｌ又はＫＣｌの最終塩濃度に実質的に希釈されうる。本明細書中の総ての文献及び特許出願は、引用することにより、あたかも個々の文献又は特許出願が引用により取り込まれると明瞭にかつ個別に表示されているかの如く、本明細書に取り込まれる。図面の簡単な説明図１は、直線的塩勾配による強カチオン交換樹脂（Mono Ｓ、商標）からのｈＬＦ（図１ａ）及びｂＬＦ（図１ｂ）の差分溶出プロフィールを示す。図２は、段階的溶出による強カチオン交換樹脂（MonoＳ、商標）からのｈＬＦ（図２ａ）及びｂＬＦ（図２ｂ）の溶出プロフィールを示す。図３は、直線的塩勾配溶出（図３ａ）及び段階的溶出（図３ｂ）による強カチオン交換樹脂上でのｂＬＦからｈＬＦの分割を示す。図４は、直線的塩勾配溶出（図４ａ）及び段階的溶出（図４ｂ）に関する溶出された画分中のｈＬＦ及びｂＬＦについての比ラジオイムノアッセイを示す。図５は、直線的塩勾配溶出を用いてMonoＳ（商標）カラム上でクロマトグラフされたｈＬＦ含有ウシミルク（図５ｂ）中のｂＬＦからｈＬＦのクロマトグラフ分割を示す。図５ａは、（ｈＬＦを含まない）対照ウシミルクを示す。図６は、段階的塩溶出を用いてMono Ｓ（商標）カラム上でクロマトグラフされたｈＬＦ含有ウシミルク（図６ｂ）中のｂＬＦからｈＬＦのクロマトグラフ分割を示す。図６ａは、（ｈＬＦを含まない）対照ウシミルクを示す。図７は、直線的塩勾配が用いられた場合において、Mono Ｓ（商標）カラムに結合されたｈＬＦの量と、ｈＬＦの溶出が観察され始めたところのＮａＣｌ濃度との関係を示す。図８は、フェニルセファロースＦＦカラムからのｈＬＦ（図８ａ）及びｂＬＦ（図８ｂ）の溶出に関するプロフィールを示す。定義別記されない限り、本明細書中の総ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に普通に理解されるのと同じ意味を持つ。本明細書中で述べられたものと類似又は同じ任意の方法及び物質を本発明の実施及びテストにおいて用いることが出来るが、好ましい方法及び物質が記載されている。本発明の目的のために、下記の用語を以下に定義する。本明細書中で対象に対して用いられるとき、言葉「自然に生じる」は、対象が自然中で見出されうる事実を言う。たとえば、天然源から分離されうる生物（ウイルスを含め）中に存在しかつ実験室中で人により意図的に修飾されていないポリペプチド又はポリヌクレオチドは、自然に生じる。本明細書において「実質的に純粋な」とは、対象の物質種が、存在する主たる物質種であること（すなわち、モル基準でそれが、組成物中のいかなる他の個々の物質種よりも多いこと）を意味し、好ましくは、実質的に精製された（純粋にされた）画分は、対象物質種が、存在する総ての巨大分子種の少くとも約５０％（モル基準で）を成しているところの組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する総ての巨大分子種の約８０〜９０％より多くを含む。最も好ましくは、対象物質種が、実質上均一まで精製され（慣用の検出方法により組成物中に汚染物質種を検出できない）、ここで組成物は単一の巨大分子種より本質的に成る。本明細書において、「富化された」とは、一以上の自然に生じる汚染物質種の少くとも約１０％（モル比基準で）が除去されるように目的物質種が部分的に精製されたところの組成物又は画分を言う。たとえば、ヒトラクトフェリンを発現するトランスジェニックウシのミルクからの試料は、酸沈澱によりカゼインを選択的に除去することによりヒトラクトフェリンについて富化されうる（たとえば、それによりホエイ画分はヒトラクトフェリンについて富化される）。本明細書において「ヒトラクトフェリン」は、メッツ−ボウティグら、１９８４、Ｅur．Ｊ．Ｂiochem．1451：659により記載されたのと実質上同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む（但し、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０８２１６で同定された配列不一致及び他の刊行されたタンパク質及びＤＮＡ配列に注意）。言葉「ヒトラクトフェリン」はまた、（部分的に）タンパク質分解された又はされていない（「自然に生じる」ヒトラクトフェリン）ところの自然に生じるヒト対立遺伝子変異体及び、自然に生じるヒトラクトフェリン種に比べて１以上のアミノ酸の挿入、置換又は欠失により修飾され、かつ少くとも５０の隣接するアミノ酸の、他の自然に生じるポリペプチド種に対してよりも、少くとも５０の隣接するアミノ酸の自然に生じるヒトラクトフェリンアミノ酸配列に対して任意的に配列される（aligned）（そして必要ならギャップされる）ときにより大きな配列同一性を有するところのアミノ酸配列変異体をも包含する。ヒトラクトフェリンはまた、トランスジェニック非ヒト動物たとえばウシにおいて発現された組換え的にエンコードされたヒトラクトフェリン（ｒｈＬＦ）をも包含し、ここでグリコシル化パターンは、ヒトミルクから得られた自然に生じるヒトラクトフェリンのグリコシル化パターンと異なりうる。詳細な説明ヒトラクトフェリンは、栄養補足としての医薬用途（ＰＣＴ特許出願公開W091 /13629、言及することにより本願明細書に組込まれる）および他の用途に使用され得る。そのような用途のために、ミルク中の望まない混入物、特にミルク試料中に存在する他の乳蛋白質（例えばホエイ蛋白質、カゼイン）、乳脂肪および他の混入物（例えばグラム陰性菌のリポポリサッカライド）から、部分的にもしくは本質的に精製されたヒトラクトフェリンを使用することが、しばしば必要であるかまたは好ましい。ラクトフェリンは、ＩｇＡ、カゼイン、ＳＣ、アルブミン、リゾチーム、β‐ラクトグロブリンおよびその他を含む広範な種類の乳蛋白質と相互作用をすることが報告されている。本発明は、ミルク、例えば乳腺において発現されているヒトラクトフェリントランスジーンを収容するトランスジェニックウシ種により産生されたミルクからのラクトフェリン、特にヒトラクトフェリンの、効率的なかつ速い精製を有利に提供するところの精製方法を提供する。本発明の基礎は、ラクトフェリン、特にヒトラクトフェリンが、ミルクからのラクトフェリンを精製するために、とくにヒトラクトフェリントランスジーンを発現するトランスジェニックウシ種のミルクからのヒトラクトフェリンを精製するために利用されうる強カチオン交換樹脂に著しく強い親和性を持つことを見出したことにある。ミルクまたはミルク画分のイオン強度を、約0.2〜0.5ＭＮａＣｌまたはＫＣｌまたは同等の塩、好ましくは約0.35〜0.4ＭＮａＣｌまたはＫＣｌ、より好ましくは約0.4ＭＮａＣｌまたはＫＣｌ、典型的には0.4ＭＮａＣｌに上げ、それと共に、ミルクまたはミルク画分を強カチオン交換樹脂と接触させることは、ミルクまたはミルク画分中の望まない混入物からのラクトフェリンの回収および分離を促進することが見出された。比較的高い塩条件をミルクまたはミルク画分に加えること（たとえば約0.4M ＮａＣｌの最終濃度に）は、ほとんどの混入蛋白質（例えばホエイ蛋白質、カゼイン）およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）の、強カチオン交換樹脂（例えばＭｏｎｏＳ（商標）またはＳセファロース（S Sepharose）（商標）ファストフロー（Fast Flow））への結合を強く減じ、それと同時に、ラクトフェリン（例えばｒｈＬＦ）を強カチオン交換樹脂へ効率的に結合させ、よって混入分子種からラクトフェリンの分離のための便利な基礎を提供する。ミルクまたはミルク画分のイオン強度を、約0.35 〜0.4ＭＮａＣｌに上げることは、ラクトフェリン以外のウシミルク蛋白質の強カチオン交換樹脂への結合を事実上排除することが注目される。低イオン強度の条件下でＭｏｎｏＳ（商標）に施与されたウシのホエイの溶出プロフィールは、すべての結合したホエイ蛋白質（ラクトフェリン以外）が0.3ＭＮａＣｌで溶出する（例えばウシラクトペルオキシダーゼ）かそれより下のＮａＣｌ濃度で溶出する（他の蛋白質）ことを示す。さらに、強カチオン交換樹脂および比較的高い塩濃度が、ミルクまたはミルク画分中のウシラクトフェリンからヒトラクトフェリンを分離するために使用され得ることが見出された。高められた塩濃度（生理的ミルクより少なくとも10ｍＭ大きいＮａＣｌ濃度、一般に0.2ＭＮａＣｌ以上）は、ヒトラクトフェリンの強カチオン交換樹脂への充填を促進するために使用される。高められたイオン強度ミルクまたはミルク画分は、選択された強カチオン交換樹脂へのｈＬＦのより選択的な結合を示す。好ましい実施態様においては、ヒトラクトフェリンは、トランスジェニック動物、好ましくはウシ種のミルクに、発現されかつ分泌される。ｒｈＬＦがトランスジェニックウシ種のミルクに、発現されかつ分泌されるところのこれらの実施態様において、トランスジェニックミルクは、得られたそのままで使用されるかまたは、ｒｈＬＦを精製するためにさらに処理されかのいずれかであり得る。本発明の方法により得られたヒトラクトフェリンは好ましくは、未処理のミルク（全乳）がまた使用されることができるが、ミルク画分を加工することにより得られる。好ましいミルク画分は、脱脂乳、粒状物および／またはカゼインが除かれた脱脂乳（例えばホエイ）およびラクトフェリンを含む他のミルク画分を含む。ミルクおよびミルク画分の調製ヒトラクトフェリンを発現するトランスジェニック非ヒト動物から、未処理のミルクを採収する。未処理のミルク（全乳）は任意的に、固体ＮａＣｌ、ＫＣｌまたは他の適当な塩またはそれらの水性溶液の添加により、比較的高いイオン強度（例えば0.3〜0.4ＭＮａＣｌまたはＫＣｌ）に調整され得る。所望なら、１価の塩の組合せ（例えばＮａＣｌおよびＫＣｌを一緒に）を使用することができ、そのため、ミルク中の１価のカチオンの最終濃度は約0.3〜0.4Ｍになる。全乳を、比較的高いイオン強度の条件下（例えば0.3〜0.4ＭＮａＣｌまたはＫＣｌ）で、直接強カチオン交換樹脂と接触させることができ、またはミルク画分に加工し、次いで強カチオン交換樹脂と接触させることができる。全乳を直接強カチオン交換樹脂と接触させるべきならば、全乳を強カチオン交換樹脂と接触させる前にまたはそれと同時に、イオン強度を、全乳中の塩濃度を増加させることによって、典型的には約0.35〜0.4ＭＮａＣｌまたはＫＣｌに調整する。任意的に、全乳を水性溶液、典型的には緩衝された塩溶液で希釈して、１価のカチオン（例えばＮａ⁺、Ｋ⁺またはそれらの組合せ）濃度約0.3〜0.4Ｍを有する希釈全乳を生成することができる。通常、全乳希釈剤として使用される、緩衝された塩溶液は、少なくとも約0.3〜0.4ＭのＮａＣｌ（またはＫＣｌ）濃度を有し、適当な緩衝液を用いてｐＨ６〜８に緩衝され；希釈されたミルク中の１価のカチオンの最終濃度は好ましくは0.3〜0.4Ｍ)より好ましくは0.4Ｍであり、よって、緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液によって与えられたカチオン種は、溶解された塩種（例えばＮａＣｌおよびＫＣｌ）と共に、考慮に入れられるべきである。よって、１以上の固体の塩（例えばＮａＣｌまたはＫＣｌ）を全乳に添加および溶解することによるか、または希釈剤塩溶液中に全乳を希釈することによるかのいずれかで、高イオン強度ミルク（すなわち、少なくとも約0.3〜0.4Ｍの１価のカチオンを有するミルク）を生じることができ、それによって希釈ミルク中の１価のカチオンの最終濃度は約0. 3〜O.4Ｍである。高イオン強度ミルク（希釈されたまたはされていない）は、強カチオン交換樹脂と接触するのに直接使用することができ、または強カチオン交換樹脂との接触に先立ち、ミルク画分にさらに加工されることができる。塩の添加により、イオン強度を増加させられていない全乳は典型的には、ミルク画分に加工され、ミルク画分のイオン強度は次に、１以上の塩の添加によって増加されて、１価カチオンの濃度を約0.3〜0.4Ｍに増加し、そして高イオン強度ミルク画分が強カチオン交換樹脂と接触される。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、全乳の希釈はまた、ラクトフェリン（例えばｒｈＬＦ）と、ミルク中に存在する混入マクロ分子種（例えばカゼイン、グラム陰性菌のＬＰＳ）との間の望まない分子間相互作用を減少させ得る。しかしながら、全乳またはミルク画分の著しい希釈は、あまり効率的に加工できない大体積をもたらし得る。ミルクのイオン強度を増加させることはまた、ラクトフェリン（例えばｒｈＬＦ）と、混入マクロ分子種との間の望まない分子間相互作用を実質的に減少させ、望まない限り、大体積へミルクの希釈を必要とせずに、より容易な糖製を可能にする。任意的に、妨害しない（すなわちｈＬＦの樹脂への結合を実質的に減らさない）洗浄剤、例えば非イオン性界面活性剤（例えばTween-20）を、約0.001〜0.2％、好ましくは約0.01 〜0.03％の濃度まで添加することはまた、ラクトフェリンに関係する望まない分子間相互作用を減少させるのに寄与し得る。強カチオン交換樹脂との接触に先立って、直接または、塩の添加によりイオン強度を増加させた後の全乳の、ラクトフェリンを含むミルク画分への加工は、１以上の混入種の量をさらに減少させ得る。例えば、全乳の脱脂は、望まない、かつ強カチオン交換クロマトグラフィーによるラクトフェリンの効率的な精製を妨害し得るところの脂肪種の有意の割合を除去できる。本発明の方法により得られたヒトラクトフェリンは好ましくは、トランスジェニックミルクホエイを加工することにより得られる。ミルクホエイは、トランスジェニックミルクから実質的にすべての脂肪およびカゼインを除去することによって生成されるミルク画分である。ミルクから脂肪を除去するための種々の方法（例えば遠心分離）が当業者に知られている。同様に、ミルクからカゼインを除去するための多くの手順が当業者に知られている。例えば酸沈殿またはキモシンによるカッパカゼインの蛋白質分解が、ミルクからカゼインを除去するのに使用され得る。当業者に公知の、ラクトフェリンを含むミルク画分（例えばホエイ）を生じるための他の両立できる方法が、使用され得る。ミルクからカゼインを除去した後に、塩を添加することができるが、カゼインは一般に、高度にホスホリル化されている（すなわち負に荷電されている）ので、その添加の順序は、ラクトフェリンの有意量の損失をもたらし得、また多分静電気的相互作用により、ラクトフェリンの有意量を結合し得る；よって、低い塩濃度下でミルクからカゼインを除去することは、望まない、ラクトフェリンの有意量の除去を、その上もたらし得る。好ましい実施態様においては、脱脂およびカゼインの除去の前に、塩（例えばＮａＣｌまたはＫＣｌ）を、ヒトラクトフェリンを発現するトランスジェニック非ヒト動物の全乳に添加する；あるいは、脱脂の後であるがカゼイン除去の前に、塩を添加することができる。典型的には、ＮａＣｌおよびリン酸ナトリウム緩衝液を含む水性溶液を、全乳を希釈するのに使用して、ｐＨ６．５〜７．５で最終濃度10〜50ｍＭリン酸ナトリウム、0.3〜0.4ＭＮａＣｌを有する高イオン強度ミルクを形成する。高イオン強度ミルクは典型的には、ｐＨ７．０で最終濃度 20ｍＭリン酸ナトリウム、0.4ＭＮａＣｌを有する。任意的に、界面活性剤が、0.001〜0.2体積％、典型的には約0.02％（体積／体積）の最終濃度まで、含まれることができる。一般に、非イオン性界面活性剤、例えばTween-20が使用され、他の非イオン性界面活性剤がまた適当であり得る。したがって、この実施態様において、約0.4ＭＮａＣｌを含み、任意的に約0.02％のTween-2 0を含む脱脂ミルクが生成され、次いで、慣用の方法によるカゼインの除去のために使用されて、ラクトフェリンを含有する高イオン強度ホエイを生成する。前記の段階の後、高イオン強度ホエイを、適当な結合条件下で、強カチオン交換樹脂（例えばＳセファロース（商標）ファストフロー、ファルマシアバイオテクノロジー、ピスカタウェイ、ＮＪ）と接触させ、それによって、強カチオン交換樹脂は優先的に、高イオン強度ホエイからのラクトフェリンと結合して、ラクトフェリン‐樹脂複合体を生成する。強カチオン交換樹脂へのラクトフェリンの結合ヒトラクトフェリン（計算されたｐＩは約９．７）は本質的に、強アニオン交換樹脂ＭｏｎｏＱ（商標）に、ｐＨ４．５で結合せず、ｐＨ７．５で（すなわちそのｐＩより下のｐＨですら）ほとんど結合しない。このことは、ヒトラクトフェリン分子の表面上で、電荷がむらに分布しているという考えと一致する。しかしながら、ヒトラクトフェリンは、強カチオン交換樹脂、例えばＭｏｎｏＳ（商標）またはＳセファロース（商標）に、約ｐＨ４．５〜９．５で、約 0.5ＭＮａＣｌまたはそれより下、好ましくは0.45ＭＮａＣｌまたはそれより下に等しい１価カチオン濃度で、ほぼ完全に結合する。この発見は、たぶんアミノ末端部分に多くの塩基性アミノ酸（ＡｒｇおよびＬｙｓ）が密集するために、ヒトラクトフェリンが分子双極子として挙動するという仮説と一致する。この発見は、比較的高い塩の条件下で、強カチオン交換樹脂への可逆の吸着による、ミルクからのヒトラクトフェリンの糖製のための基礎を提供する。多数の強カチオン交換樹脂が、蛋白質精製の分野で当業者に公知である。「強カチオン交換樹脂」は、広いｐＨ範囲にわたって、拡散性のカチオンを交換するもの、例えばサルファイトまたはサルフェート基を有するものとして定義される。現在好ましい強カチオン交換樹脂は、例えばＭｏｎｏＳ（商標）カチオン交換樹脂およびＳセファロース（商標）ファストフローカチオン交換樹脂（ファルマシア／ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー、ピスカタウェイ、ＮＪから入手可能）である。リガンドＳＰが同様に適当であり、代用され得るが、ＭｏｎｏＳ（商標）およびＳセファロース（商標）ファストフローカチオン交換樹脂は目下、リガンドＳを使用する。強カチオン交換を提供する同様に帯電した基を有する樹脂がまた、本発明の目的のために有用である。ヒトラクトフェリンを含有するトランスジェニックウシホエイを含む、ミルクまたはミルク画分を強カチオン交換樹脂と接触させるのに、種々の方法を使用することができる。例えば、強カチオン交換樹脂をカラムに形成することができ、そしてラクトフェリン含有ホエイをカラムに通すことができる。カラム樹脂へのラクトフェリンの吸着後、カラムを洗浄し、次いで、ヒトラクトフェリンを溶出するのに十分なイオン強度で、好ましくはヒトラクトフェリンを効率的に溶出するのに十分であるが、もし存在するならウシラクトフェリンを実質上溶出しないイオン強度で、ヒトラクトフェリンを溶出によって脱着する。あるいは、ラクトフェリン含有ホエイを、一般に比較的高いイオン高度（例えば0.35〜0.4 ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の条件下で、ベッドの形状の強カチオン交換樹脂と接触させることができる。この場合、ラクトフェリン含有ホエイを、ベッド中の強カチオン交換樹脂と接触させ、そして適当な温度（例えば摂氏４〜３０度）で適当な期間撹拌する。そのような接触は、樹脂ビーズを直接ラクトフェリン含有ホエイに混合することにより達成することができる。次に、吸着したラクトフェリンを有する強カチオン交換樹脂を、例えば遠心分離、自然沈降によって、またはカラムに形成することによって分離し、そして可動相（すなわち、ラクトフェリンを減らされたホエイ）を実質的に除去する。所望なら、残留する、樹脂に非結合または結合した非ラクトフェリン種を除去するために、分離したラクトフェリン‐樹脂複合体を、樹脂からラクトフェリンが実質的に溶出するのを防ぐのに十分低い、しかし好ましくは、樹脂に結合されているまたはされていない非ラクトフェリンマクロ分子を溶出するのに十分高いイオン強度を有する洗浄緩衝液で洗浄することができる。典型的には、洗浄緩衝液は、0.01〜0.45ＭＮａＣｌ、５〜50ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ約７．５を含むことができる。しかし、他の洗浄溶液を使用することができる。例えば、0.3ＭＮａＣｌ、10ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ約７．５を含む洗浄緩衝液をまた使用できる。任意的に、洗浄剤、例えば非イオン性界面活性剤（例えばTween-20）を、典型的には0.01〜0.1体積％で、洗浄緩衝液中に含むことができる。分離したラクトフェリン‐樹脂複合体を、単一の洗浄段階で、又は多数の洗浄段階で洗浄することができ、または洗浄しないままにすることができる。洗浄が行われるなら、一般に、樹脂単位体積当たり少なくとも１体積の洗浄緩衝液を用いて、分離したラクトフェリン‐樹脂複合体を洗浄し、しばしば、より多い洗浄体積が使用される。特に洗浄緩衝液が低いイオン強度（例えば0.2M ＮａＣｌ未満）を有するときはそうである。洗浄は、非ラクトフェリンマクロ分子を、カラム状またはベッド状いずれかである樹脂から除去するのに役立つ。適当なイオン強度の溶液で溶出することにより、ラクトフェリンを、分離したラクトフェリン‐樹脂複合体から、選択的に脱着する。一般に、溶出緩衝液は、１価の塩（例えばＮａＣｌまたはＫＣｌ）を、少なくとも約0.3〜0.4Ｍ、典型的には0.45〜0.5Ｍまたはそれより上の濃度で含み、好ましくはまた適当な緩衝液、例えばリン酸ナトリウム（例えば５〜5OmＭ）を、約７．５のｐＨで含む。種々の塩濃度および溶出溶液の組成が可能であり、精製の規模で変わり得、よってカラムまたは樹脂ベッド性能の較正または標準化は、当業者により標準較正法を用いて行うことができる。あるいは、ヒトラクトフェリンは、カラムに充填されたラクトフェリン‐樹脂複合体から、ＮａＣｌまたはＫＣｌ勾配または段階勾配を用いた溶出によって、可動相として選択的に脱着されることができ、ヒトラクトフェリンの脱着は典型的には、精製の規模および他のカラム性能因子に依存して、約0.30〜0.75ＭＮａＣｌで生じる。カラム性能の較正および溶出プロフィールの決定は、各実施態様について、当業者により容易に決定され得る。ヒトラクトフェリンを含む画分は、ヒトラクトフェリンについて任意の便利なアッセイにより同定することができる。例えば特異的にヒトラクトフェリンに結合する抗体を用いたイムノアッセイ（ヌイジェンス（Nuijens）ら、（1992年）、J.Lab.Clin.Med．119 ：159）またはラクトフェリンを検出し、定量するための他のアッセイであるが、これらに限定されることはない。さらなる実施態様において、ラクトフェリンは、透析によってラクトフェリン ‐樹脂複合体から除去される。透析は、当業者に公知の広く行われている技術である。透析膜は、蛋白質、例えばヒトラクトフェリンが、膜の一方から他方の面に妨げられずに通るように選ばれる。本発明の場合には、ラクトフェリンを含むトランシジェニックミルクまたはミルク画分と接触する面と反対側の膜面に、強カチオン交換樹脂が存在する。ヒトラクトフェリンおよびウシラクトフェリンを含むラクトフェリンは、強カチオン交換樹脂を含む面へと透析膜を横切って、ミルクまたはミルク画分から分割され、そこでラクトフェリンは強カチオン交換樹脂に結合する。選ばれた透析膜の孔径（分子量分離）は、ラクトフェリン‐樹脂複合体がミルクまたはミルク画分へと膜を横切って通ることを防ぐ。この実施態様において、透析膜は、結合していないラクトフェリンのみ（強カチオン交換樹脂に結合したラクトフェリンではない）が膜を通過するように選ばれる。典型的には、ミルクまたはミルク画分は、約0. 35〜0.4Ｍの１価塩のイオン強度に調整され、かつ一般的には、適当な緩衝液（例えばリン酸ナトリウム、リン酸カリウム）を用いてｐＨ約７．５に緩衝される。このことは、ミルクまたはミルク画分を、強カチオン交換樹脂をミルクまたはミルク画分から分離している透析膜と接触させる前または同時になされる。任意的に、洗浄剤、例えば非イオン性界面活性剤（例えばTween-20）が、存在するとしたら約0.001〜0.2％（体積／体積）、好ましくは約0.02％（体積／体積）の濃度で、含まれることができる。ラクトフェリンが膜を横切って分割されて強カチオン交換樹脂に結合する、適当な透析期間の後、ラクトフェリンを減らされたミルクまたはミルク画分が除去され、そして強カチオン交換樹脂に結合したラクトフェリンが溶出される。それは、ラクトフェリン‐樹脂複合体を高いイオン強度の緩衝液（例えば0.45〜0.7ＭＮａＣｌまたはＫＣｌ、５〜50ｍＭリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム、ｐＨ約７．５）と、直接または透析膜を横切って接触させることにより行う。種々の代替的溶液が、強カチオン交換樹脂からラクトフェリンを溶出するのに使用することができ、それは当業者に明らかであろう。２価カチオンの塩を含む他の塩（例えばＬｉＣｌ）で置換することがまた、当業者によって、本発明を実施するために使用され得る。ラクトフェリン‐樹脂複合体から溶出されたラクトフェリンは、別の一巡りのカチオン交換クロマトグラフィーおよび／またはレクチン（たとえばコンカナバリンＡ）アフィニテイクロマトグラフィーに供されて、もし存在するならウシラクトフェリンからヒトラクトフェリンをさらに分割することができる。さらに、再クロマトグラフィーが、減成（蛋白質分解した）生成物から無傷のヒトラクトフェリンをさらに精製するために使用され得る。好ましくは、無傷のヒトラクトフェリンは、実質的に純粋な形で回収される。高いイオン強度の塩溶液を用いて、結合したラクトフェリン‐樹脂複合体からラクトフェリンを溶出した後、溶出したラクトフェリンを処理して、浄化し、濃縮することができる。好ましくは、回収したラクトフェリンは透析して塩を除去し、限外濾過し、および任意的に凍結乾燥されて、ラクトフェリンを濃縮する。適当な貯蔵および／または再構成成分（例えば緩衝液、塩、防腐剤、抗生物剤、第二鉄イオン）を、精製したラクトフェリンに加えることができる。バッチ抽出によるミルクからラクトフェリンの精製強カチオン交換樹脂を用いてのミルクからラクトフェリンのバッチ抽出は、大規模な工業的適用のために好ましい精製法であると思われる。バッチ抽出において、強カチオン交換樹脂をミルク溶液と接触させる前または同時に、塩がミルクまたはミルク画分に添加されて、高いイオン強度のミルク溶液（例えば0.4ＭＮａＣｌ）を生成するのが、一般に好ましい。(1)混入物（例えばカゼインおよびＬＰＳ）とラクトフェリンとの間の潜在的分子間静電相互作用を減少させるのに十分なように、(2)非ラクトフェリンマクロ分子の強カチオン交換樹脂への結合を減少させるのに、すなわち限定しない量の強カチオン交換樹脂（対象とするラクトフェリン種の量より多い蛋白質結合能）がミルクまたはミルク画分に加えられる場合に、ラクトフェリンの結合の選択性を保証するのに十分なように、(3)カラムが調製される前に除去され得るところの、ある非ラクトフェリン種の凝集を引き起こすのに十分なように、および(4)低い塩濃度で樹脂に保持され得、かつ高いイオン強度洗浄または塩勾配が適用されるときクロマトグラフィーカラムに捕らえられて、よってカラム性能を妨げ、かつ部分的不凝集を可能にし、および凝集物を溶出して溶出したラクトフェリンを汚染する物質（たぶんラクトフェリンを含む）の凝集を防ぐのに十分なように、イオン強度を増加させるために、塩が加えられると考えられる。しかしながら、イオン強度は、ラクトフェリンが強カチオン交換樹脂に効率的に結合されない程に、過度に高くてはならない。例えば、約0.35〜0.45ＭＮａＣｌのイオン強度が一般に好ましく、典型的には0.4ＭＮａＣｌが使用される。さらに、ミルク画分例えばホエイからラクトフェリンが抽出される（例えば酸沈殿、キモシン処理、または超遠心）とき、カゼイン除去の前にイオン強度を増加するために塩が添加されると、ラクトフェリンの回収率が増加する。この効果は多分、カゼインとの静電相互作用によるラクトフェリンのトラップによるもので、カゼイン除去の前にイオン強度を増加することにより克服され得る。例であり、限定されないものとして、ｒｈＬＦを発現するトランスジェニック非ヒト動物からのミルクは、ミルクからヒトラクトフェリンを実質的に精製するために、以下のプロトコールに従って加工され得る。第１に、固体ＮａＣｌまたは５ＭＮａＣｌ貯蔵溶液をミルクに添加して、0. 35〜0.45ＭＮａＣｌ、通常約0.4ＭＮａＣｌの最終濃度を生成させる。任意的に、非イオン性界面活性剤（Tween-20）を、0.02％（体積／体積）最終濃度まで、添加する。リン酸ナトリウムを任意的に加えて、最終濃度約20ｍＭおよび予定されるｐＨ約７．５にする（例えばＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２ＯおよびＮａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏを加えて、それぞれ最終濃度3.2ｍＭおよび16.8ｍＭにすることにより）。ミルク溶液の最終ｐＨは正確に７．５である必要はなく、しばしば約６．５〜７．０である。ｈＬＦが、ｐＨ値４．５〜９．５で、強カチオン交換樹脂（例えばＭｏｎｏＳ（商標）またはＳセファロース（商標））に効率的に結合するので、リン酸ナトリウム（または他の緩衝液）の添加を省略することができると思われる。乳脂肪は、ベックマン（Beckman）ＪＡ−１０ローターにて500ｍｌのポリアロマー管中で1600×ｇで10分間遠心分離することにより除去されて、高イオン強度スキムミルクを生成する。あるいは、自然沈降が使用され、その後、脂肪層を物理的に除去する。あるいは、強カチオン交換樹脂と共に、加工したミルクをバッチ的にインキュベートした後に遠心分離することにより、乳脂肪を除去することができる。強カチオン交換樹脂（例えばＳセファロース（商標）、ファルマシアＬＫＢ、ピスカタウエイ、ＮＪ）は典型的には、高イオン強度緩衝液（0.4ＭＮａＣｌ、20ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、任意的に0.02％のTween-20 を含む）を用いて平衡にされ、そして加工したミルク中に溶解される。高イオン強度緩衝液を用いて平衡にされた、約１ｍｌの充填され、平衡にされた強カチオン交換樹脂ビーズを、加工されたミルク試料中のラクトフェリン５〜20ｍｇ（ラクトフェリンのアッセイにより決定することができる）当たりに添加し、そして適当な撹拌時間（例えば約１時間以上、好ましくは１晩）撹拌して、ラクトフェリンを樹脂ビーズに結合させる。樹脂ビーズ（例えばファスト‐Ｓ（商標））を次に、約1600×ｇで５分間遠心分離することによりペレットにし、上澄を除去する。あるいは、ビーズを自然沈降によりペレットにした後、ラクトフェリンを減らされた、高イオン強度の脱脂乳または全乳のいずれかが除かれる。ペレットにした樹脂ビーズを、高イオン強度緩衝液の約１体積で３回洗浄し、次に、洗浄緩衝液の１体積を有する樹脂ビーズをカラムに注ぎ入れる。実質的に精製したラクトフェリンの調製物を、0.4〜1.0ＭＮａＣｌ、20ｍＭリン酸ナトリウム中、ｐＨ７．５の勾配（カラム体積の１．２５倍）でカラムから溶出する。回収したラクトフェリン中に存在する過剰の塩は、生理食塩水またはリン酸塩で緩衝した生理食塩水に対する透析（蒸留水に対する透析はラクトフェリンの沈殿を引起す傾向がある）により、除去することができる。ヒトラクトフェリンは、内因性の（非ヒト；例えばウシ）ラクトフェリンから、塩勾配または段階的溶出によって、カラムを溶出することにより分離することができ、ヒトラクトフェリン（例えばｒｈＬＦ）は、ｐＨ９．５以下では、非ヒト（例えばウシまたブタ）ラクトフェリンより、それぞれ低いまたは高いイオン強度でカラムから溶出する。例えば20 ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５の緩衝液を使用するとき、ｒｈＬＦは典型的には、ｂＬＦの効率的な溶出が生じるＮａＣｌ濃度より約50〜100ｍＭ（典型的には70ｍＭ）低いＮａＣｌ濃度で溶出する。ｂＬＦからｒｈＬＦのさらなる精製が望まれるなら、実質的な量のｒｈＬＦを含む回収した画分を、強カチオン交換樹脂および／またはコンカナバリンＡカラムで再クロマトグラフし、そして塩勾配または段階的溶出で溶出して、溶出した画分中のｂＬＦからｈＬＦをさらに分離することができる。ラクトフェリン処方本発明の方法により精製したラクトフェリンを実質的に精製する。すなわち、ラクトフェリンが、ミルク中に存在する他のミルク蛋白質および分子混入物（細菌性リポ多糖類を含む）を実質的に含まないようにする。本発明の方法により生成されたヒトラクトフェリンは、ラクトフェリンを含む、典型的には投与当たり少くとも約１ミリグラム〜数グラムのラクトフェリンを含む、医薬または栄養補足剤における処方のために適している。ヒトラクトフェリンの抗菌性および抗炎症性の故に、精製したヒトラクトフェリンについて種々の用途が可能である。例えば、ラクトフェリン、特にヒトラクトフェリンを含む抗菌性医薬および／または栄養補足剤が製造され、典型的には他の薬剤と共に、局部的感染、大規模（細菌）感染、血液由来の感染（敗血症）ならびに感染の結果生じる炎症または非感染性の炎症疾患（例えば回腸または結腸の慢性炎症疾患）の治療または予防のために、患者に投与される。ラクトフェリン、特にヒトラクトフェリンを含むそのような医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、胃管栄養、胃や腸の洗浄または他の適当な投与経路によって、生理的に相溶性の担体、典型的には水性溶液（例えば生理的食塩水中）として投与のための担体と組合せて調製される。同様に、実質的に精製したラクトフェリンを含む医薬調製物および栄養物が、典型的には他の医薬または栄養物と共に、大規模細菌感染の治療のために使用され得る。例えば、ヒトラクトフェリンを含む医薬調製物を、血液由来の細菌感染症を治療するために、単独で、または別の薬剤と共に使用することができ、または臓器移植受容者または他の免疫抑制個体（例えばＡＩＤＳ患者）を感染の影響に対して、薬を調合しまたは治療するために使用される。さらに、実質的に精製されたヒトラクトフェリンは、栄養補足剤の処方に使用することができる。例えば、ヒトへの使用のためには、精製されたヒトラクトフェリンは、幼児の処方に含まれることができ、または成人の食餌補足剤として使用されることができる。ラクトフェリンの鉄結合特性の結果として、鉄欠乏症（例えば未成熟な幼児の鉄欠乏症）を治療するのに有用な栄養調製物が、実質的に精製されたラクトフェリンを用いて処方され得る。ラクトフェリンの品質制御アッセイ精製したｈＬＦの品質制御は、下記の手順の少なくとも１つ、好ましくはそれ以上の、任意的にすべてを含むべきである： (1)非還元のおよび還元したＳＤＳ−ＰＡＧＥ、前煮沸または後煮沸なしに試料を充填する、 (2)分光分析、例えば280および465ｎｍでの吸光度測定、 (3)ｈＬＦおよびｂＬＦのラジオイムノアッセイ分析、 (4)強カチオン交換クロマトグラフィー（例えばＭｏｎｏＳ（商標））、および (5)N-末端蛋白質配列決定。以下の実施例は、説明のために提供されており、本発明を限定するものではない。実験例ラクトフェリン回収率へのイオン強度の影響カゼインを除去する前の、トランスジェニックマウスおよびウシのミルクへの塩の添加は、ホエイ画分からの精製においてそれぞれ、トランスジェニックｈＬＦおよびｂＬＦの収量を著しく増加させることを見出した。表１に示したデータは、これらの差分の回収率のための背景を提供する。ウシ全乳試料(n=10)において、ならびに10,000×ｇで30分間遠心分離した後に調製したホエイおよびカゼイン画分の試料において、競争的阻害ＲＩＡにより、ｂＬＦを測定した。全乳をｐＨ４．６に調整し、次いで、40℃で30分間ミルクをインキュベートすることにより酸沈殿を行った。結果（平均＋ＳＤ）を、それぞれの画分において見出された全ｂＬＦのパーセントとして表した。ａ：カゼインペレット中のｂＬＦ濃度は、ホエイ画分中より平均4.0倍高い。ｂ：カゼインペレット中のｂＬＦ濃度は、ホエイ画分中より平均8.0倍高い。ヒトラクトフェリンの結合へのイオン強度および洗浄剤の影響セファロースに固定化された種々のリガンドへの、¹²⁵Ｉで標識したヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）の結合に対する、塩濃度および非イオン性界面活性剤（ Tween-20）またはカチオン性界面活性剤（ポリブレン(Polybrene)）の存在の影響を測定した。セファロースを、10ｍＭのリン酸ナトリウム、0.15ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４に懸濁した。以下のリガンドをセファロースに固定化し、ｈＬＦへの結合の測定に使用した：Ｒ５９５、S. minnesotaからのＬＰＳ（ＫＤＯ⁺、Ｏ抗原なし、粗い）；Ｊ５、E. coliからのＬＰＳ（ＫＤＯ⁺、Ｏ抗原なし、粗い）；ヘパリン、ラクトフェリンに結合することが知られているポリアニオン；ＨＳＡ、ヒト血清アルブミン；およびグリシン。¹²⁵ Ｉで標識したｈＬＦを、セファロース‐リガンド樹脂と接触させ、ＮａＣｌ濃度および洗浄剤の種々の組合せにさらした。表２は、種々のセファロース‐リガンド樹脂に保持された¹²⁵Ｉ‐ｈＬＦ（すなわち放射能）のパーセントを示す。表２は、約0.25ＭＮａＣｌより大きいイオン強度および0.2％Tween-20の洗浄剤濃度は実質的に、種々のリガンド種（細菌性のＬＰＳを含む）へのｈＬＦの結合を減少させることを示す。この実験は、ＬＰＳおよびｈＬＦの相互作用が静電気的性質を有することを示す。広範囲の（すなわち50タイプより多い）、臨床的に関連したグラム陰性菌からのＬＰＳタイプへのｈＬＦの結合を測定するために、研究を行った。評価した各タイプのＬＰＳに対して種々の親和性をもってラクトフェリンが反応した。ポリミキシンＢ（ＬＰＳの毒性を中和することが知られた抗生物質）とＬＰＳとの相互作用の部位に同一のまたは極めて接近した部位に対して、ラクトフェリンがＬＰＳの脂質Ａ部分と静電気的に相互作用するように思われる。イオン交換樹脂からのラクトフェリンの溶出パターン種々のｐＨの種々の緩衝液（コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ヒープス（Hepes）、トリス、エタノールアミン、N-メチルピペラジン）中のＮａＣｌを用いた溶出プロフィールの測定のために、種々のｐＨの種々の緩衝溶液中の、50マイクログラムの蛋白質（ｈＬＦシグマ（Sigma）１‐表５の説明文参照−およびｂＬＦ、シグマ、セントルイス、ＭＯ）を、１ｍｌのＭｏｎｏＳ（商標）（強カチオン交換体）またはＭｏｎｏＱ（商標）（強アニオン交換体）樹脂を適当な緩衝液中で平衡したものを含むファルマシア（Pharmacia）HR5/5カラムに、ＦＰＬＣ（商標）システム（ファルマシア（Pharmacia）、ピスカタウェー（Piscataway）、ＮＪ）を用いて施与した。各カラムを緩衝液２ｍｌで洗浄した後、緩衝液30ｍｌ中の、０〜1. 0 ＭＮａＣｌの直線的塩濃度勾配を、１ｍｌ／分の流速で適用した。280ｎｍでの吸光度測定によりピークをモニターした。種々の緩衝液系中のｈＬＦおよびｂＬＦの溶出を表３に示す。表３は、ｈＬＦが、ｐＨ４．５〜９．５で、ＭｏｎｏＳ（商標）にほとんど完全に結合することを示し、塩基性アミノ酸残基がｈＬＦ中に密集されることを示す。実際、ｈＬＦのN-末端は、密集した塩基性アミノ酸残基を含み、よってｈＬＦはマクロ分子の双極子のように見える。ｈＬＦは、文献データと対照的に、３つのピークに溶出する。ｈＬＦピークＩ、IIおよびIIIの、還元および非還元のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析（表２および４参照）は、ｈＬＦの分解を示さなかった。すべてのピークが同じ割合のＦｅ‐ｈＬＦ（非還元の、非煮沸のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）を含んでいた。ＲＩＡによって検出したｈＬＦの量は、クロマトグラムに対応する。ｈＬＦは、ｐＨ４．５でＭｏｎｏＱ（商標）に結合せず、ｐＨ７．５（そのｐＩより下のｐＨ値）でわずかに結合する。このことは、電荷がｈＬＦ分子の上にわたって、一様でなく分布されているという考えと関連する。これらの研究結果に基づいて、ｈＬＦの精製のために、ほぼ中性のｐＨで強カチオン交換樹脂を選択した。ミルクからのラクトフェリンのバッチ精製ヒトのミルク、ウシのミルクおよび、そのミルク中にｒｈＬＦを発現するトランスジェニックマウスからのミルクから、バッチ抽出法によって、ラクトフェリンを精製した。固体ＮａＣｌを加えて、最終濃度0.4Ｍにし、Tween-20を加えて最終濃度0.02％（体積／体積）にした。リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて、20ｍＭ最終濃度にしたが、最終ｐＨは７．５に調整しなかった。ベックマン（Beckman）ＪＡ−１０ローターにて、500 ｍｌのポリアロマー管中で、1600×ｇにて10分間遠心分離することにより、乳脂肪を除去した。開始の緩衝液（0.4ＭのＮａＣｌ、20ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、0.02％のTween‐20）で平衡にしたパックされたＳセファロース（商標）ファストフローを、加工したミルクに、加工したミルク中のラクトフェリン５〜10ｍｇ当たりパックされた樹脂ビーズ約１ｍｌの比率で加えた。混合物を20時間撹拌し、樹脂ビーズを、1600×ｇで５分間遠心分離することにより分離した。上澄を除去し、ビーズを、開始の緩衝液の１体積で３回洗った。次に樹脂をカラム中に注ぎ入れ、１体積の、20ｍＭリン酸ナトリウム、0.4ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５で洗った。1.25（倍のカラム）体積の20ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中での0.4〜1.0ＭＮａＣｌの勾配を用いて、10ｍｌ／分の流速で、ラクトフェリンをカラムから溶出した。この方法により回収したラクトフェリンの結果を表４に示し、ゲル電気泳動、分光学、およびＭｏｎｏＳ（商標）樹脂でのクロマトグラフィーの実施によって測定した、精製ラクトフェリン試料の質を表にした。ｈＬＦに特異的なサンドゥイッチタイプＲＩＡにおいて測定した、精製した天然のｈＬＦおよびトランスジェニックｒｈＬＦの投与‐応答曲線は、市販の入手可能な、精製したヒトミルク誘導（由来の）ｈＬＦの標準曲線と平行であった。アミノ末端蛋白質配列分析は、精製した天然のｈＬＦおよびトランスジェニックｒｈＬＦのシグナル配列が正確に完全に除かれ、N-末端減成を示さないことを示した。ｂＬＦに特異的な競争的阻害ＲＩＡにて測定した、精製したｂＬＦの投与‐応答曲線は、市販の入手可能な、ウシミルク由来のｂＬＦの標準曲線と平行であった。Ｍｏｎｏ S（商標）クロマトグラフィーによる、精製ｈＬＦ調製物の評価マウスミルクからのトランスジェニックｒｈＬＦを用いて精製の研究（ＭｏｎｏＳ（商標）カラムでの、20ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中の０〜１ＭＮａＣｌの直線的勾配）過程の間に、少なくとも約95％のトランスジェニックｒｈＬＦが0.7ＭＮａＣｌで溶出し、一方、ヒトミルクから精製した、市販の入手可能なｈＬＦ調製物（シグマアンドカルビオケム(Sigma and Calbioche m)）は、約0.5、0.6および0.7ＭＮａＣｌで、３つのピークとして溶出した（示したｈＬＦピークＩ、IIおよびIII、また表３および５を参照）。新鮮なヒトミルクから精製したｈＬＦは常に、約0.7ＭＮａＣｌで溶出した。ｂＬＦは約0 .8ＭＮａＣｌで溶出する。表５は、ＭｏｎｏＳ（商標）カラムでの、種々のラクトフェリンおよびその他の調製物の溶出パターンを示す。 20ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５（緩衝液Ａ）中の50μｇの蛋白質を、ＦＰＬＣシステム（ファルマシア）を用いて、ＭｏｎｏＳ（商標）カラム（ファルマシア HR5/5、樹脂１ｍｌ含有）に施与した。カラムを緩衝液Ａ５ｍｌで洗浄した後、30mｌの緩衝液Λ中０〜1.0ＭＮａＣｌの直線的塩勾配を、１ｍｌ／分の流速で適用した。0.2ｃｍのフローセルを用いて、フルスケール感度0.01で、280ｎｍにおける吸収測定によって、ピークをモニターした。以下の略号を使用した：ｈＬＦＳｉｇｍａ１、精製したヒトミルク誘導「天然」ｈＬＦ、シグマ（Sigma）社から；ｈＬＦＳｉｇｍａ２、繰り返し凍結し、かつ解凍したＳｉｇｍａ１；ＨＬＦＳｉｇｍａ３、シグマ（Sigma）社からの、「天然」ｈＬＦの異なるロット；ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍｈＬＦ、カルビオケム(Cal biochem)社からのヒトミルク誘導ｈＬＦ；ｈＬＦＧＰＥ１、２および３、３％の全鉄飽和を有する、３人のドナーの新鮮なヒトミルク試料の、強カチオン交換クロマトグラフィーにより精製した、約３％の鉄飽和レベルを有する、ｈＬＦ調製物；ｈＬＦＧＰＥ４、４℃で１週間貯蔵したヒトミルク試料から精製したｈＬＦ；ＦｅｈＬＦＳｉｇｍａ１および２、シグマ社による鉄で完全に飽和した、精製したヒトミルク誘導ｈＬＦの種々のロット；Ａｒｇ−ｍｏｄ．ｈＬＦＧＰＥ、Ａｒｇ（アルギニン）残基を化学的に変性した、精製したヒトミルク誘導ｈＬＦ；ＦｅｈＬＦＧＰＥ、鉄で飽和した、精製したヒトミルク誘導ｈＬＦ；Ｄｅｇｌｙｃ．ｈＬＦＧＰＥ、N-グリコシダーゼで完全に脱グリコシル化した、精製したヒトミルク誘導ｈＬＦ；Ｎｅｕｒａ．ｈＬＦＧＰＥ、シアル酸残基をノイラミニダーゼで除去した、精製したヒトミルク誘導ｈＬＦ；Ｔｒｙｐ．ｈＬＦＧＰＥ１、２および３、トリプシンと共に（モル比ｈＬＦ：トリプシン＝７．５：１）、それぞれ１分間、３時間および24時間インキュベートした後、大豆トリプシン阻害剤を添加した、精製したヒトミルク誘導ｈＬＦ；Ｔｒａｎｓ．ｈＬＦＧＰＥ１および２、ｃＤＮＡ（成熟したｈＬＦに融合した、ウシａＳ１カゼインのシグナル配列をコードする）および、それぞれ0.2および2.0ｍｇ／ｍｌでｒｈＬＦを発現する、ゲノムのｈＬＦトランスジーン構成物を収容するマウスのミルクから精製したｈＬＦ；２９３ｒＨＬＦ、組織培養（２９３細胞）で発現された組換えｈＬＦ；２９３Ｕｎｇｌｙｃ．ｒｈＬＦ；ツニカマイシン（tunicamycin）の存在中で２９３細胞により発現された、精製された、グリコシル化されていない、分解していないｒｈＬＦ；ｂＬＦＳｉｇｍａ、シグマ社からの精製したウシミルク誘導ｂＬＦ；ｂＬＦＧＰＥ、新鮮なウシミルクから、強カチオン交換クロマトグラフィーにより精製したｂＬＦ；Ａｒｇ−ｍｏｄ．ｂＬＦＧＰＥ、Ａｒｇ残基を化学的に変性した、精製したｂＬＦ；ｍＬＦＧＰＥ、新鮮なマウスミルクから、強カチオン交換クロマトグラフィーにより精製したネズミのラクトフェリン；ｍＤＦＧＰＥ、マウスミルクで、強カチオン交換クロマトグラフィーにより精製した、ネズミのドムフェリン（ｍＤＦは、トランスフェリン族に属する８０ＫＤ蛋白質である）；ｍＴＦＳｉｇｍａ、シグマ社から購入した、精製した、マウスの（セロ‐）トランスフェリン；ｈＴＦＳｉｇｍａ、シグマ社から購入した、精製した、ヒトセロトランスフェリン；ｐＬＦＧＰＥ、豚のミルクから、強カチオン交換クロマトグラフィーにより精製したブタラクトフェリン；ヒツジのホエイおよびヤギのホエイ、それぞれヒツジとヤギのミルクから調製したホエイ画分。文献において、マキノら（1992年）のJ.Chromato．579:346は、0.88、0.97および1.05ＭＮａＣｌで、ＭｏｎｏＳカラムから溶出するｈＬＦの３つのピークはそれぞれ、二鉄（III）の、一鉄（III）の、およびアポラクトフェリンを示すことを報告している。しかしながら、鉄を用いたｈＬＦの飽和についての本願の研究結果は、２個の鉄（III）原子は各ｈＬＦ分子中に、配位結合的に組み込まれ、よってミルクからの本質的にすべてのｈＬＦがアポラクトフェリンまたは二鉄（III）のいずれかであることを示す。天然のｈＬＦ（新鮮なヒトのミルクから精製されたｈＬＦ；吸光度測定により飽和された鉄３％のみ）およびＦｅ‐ ｈＬＦ（吸光度測定および非還元の、非煮沸のＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより測定されたように、鉄で完全に飽和された）は、ｐＨ７．５で、ＭｏｎｏＳ（商標）カラムから、正確に（実験の分解能の限界内で）同じ場所（約0.7ＭＮａＣｌ）に溶出する。完全に脱グリコシル化された（N-グリコシダーゼを用いて）、ノイラミニダーゼ処理された、および天然のｈＬＦは、ｐＨ７．５で、ＭｏｎｏＳ（商標）カラムから、正確に（実験の分解能の限界内で）同じ場所（約0.7 ＭＮａＣｌ）に溶出する。ｈＬＦピークＩおよびIIの相対量は、トランスジェニックマウスのホエイの延長された（４日間）透析で、増加した。さらに、ｈＬＦピークIIおよびＩは、非還元または還元したＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより、ｈＬＦの減成が観察され得る前、天然ｈＬＦ（ピークIII）の限定されたトリプシンによる蛋白質分解後に現れる。これらの観察に基づいて、ｈＬＦ調製物におけるピークIIおよびＩは、ピーク III（天然ｈＬＦ）の限定された蛋白質分解によって、例えばアルギニンでのセリンプロテアーゼ分解を用いて、生じ得る。この考えは、市販の入手可能な、精製したｈＬＦに存在するｈＬＦピークＩ、IIおよびIIIの、アミノ末端蛋白質配列分析の結果（表６および７参照）と調和する。先端を切ったｈＬＦ異形体の生物学的活性は、天然のｈＬＦと異なっていることがあり得る（例えばｈＬＦの細胞リセプターへの結合、インビトロでの循環におけるクリアランス速度、キロミクロン残余のエンドサイトーシスを阻害する能力、および／または抗菌特性）ので、ｈＬＦのN-末端の蛋白質分解は、重要であり得る。表６および７は、表５におけるいくつかの蛋白質のN-末端配列分析を示す。表５の溶出パターン、表６および７のN-末端蛋白質配列データならびに、文献で公開されているトランスフェリンおよびラクトフェリンのデータに基づいて、トランスフェリン／ラクトフェリンのアミノ末端配列は、これらの分子の、強カチオン交換樹脂への結合特性を決定すること、および天然の（ピークIII）ｈＬＦは、強カチオン交換クロマトグラフィーによって、減成産生物（ピークＩおよびII）から精製され得ることを、発明者らは結論した。かくして、天然のｈＬＦおよび減成産生物（ピークＩおよびII物質）を分離し、かつその量を定量的に検出することにより、ｈＬＦの品質制御評価のために、およびそのような減成産生物から天然ｈＬＦを調製的に精製するために、例えば均質な天然ｈＬＦまたは所望なら精製したピークＩまたはピークII物質の薬剤処方のために、強カチオン交換クロマトグラフィーを使用することができる。表５に示されたような非ヒトおよびヒトラクトフェリン種の差分溶出パターンに基づいてならびに、精製したｈＬＦおよびｂＬＦの混合物、およびｈＬＦをスパイク（spike）したウシのミルクを用いたＭｏｎｏＳ（商標）での実験（下記参照）から、発明者らはまた、非ヒトラクトフェリン（例えばｂＬＦ）からトランスジェニックに製造したｒｈＬＦの分離が、イオン強度（塩濃度）を増加させる緩衝液を用いた、塩勾配または段階的溶出の使用によって、強カチオン交換クロマトグラフィーを用いて成し遂げることができることを結論した。トランスジェニックマウスのミルク中に産生したトランスジェニックｒｈＬＦは、ヒトのミルクから誘導したｈＬＦと同じイオン強度のところに溶出することに注目すべきである。さらに、ＭｏｎｏＳ（商標）に結合した、ヒツジおよびヤギのホエイ画分からのすべての蛋白質が、0.6ＭＮａＣｌより低いＮａＣｌ濃度で溶出された（表５）。このことは、トランスジェニックｒｈＬＦは、強カチオン交換クロマトグラフィーにより、ヒツジおよびヤギのラクトフェリン種から分離できることを示す。ｈＬＦおよびｂＬＦのクロマトグラフィーによる分離表８は、ｈＬＦおよびｂＬＦが溶出する異なる塩強度を証明する、直線的塩勾配を用いたＭｏｎｏＳ（商標）でのｈＬＦおよびｂＬＦの溶出パターンを示す。溶出パターンにおける差が、試験したｐＨ値では、比較的ｐＨ感度がよくなかったので、ＭｏｎｏＳ（商標）でのｈＬＦおよびｂＬＦの分離の最適化を、生理学的ｐＨ（ｐＨ７．５）の近辺で決定した。図１に示したように、緩衝液Ａ（ 20ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）中のＨＬＦＳｉｇｍａ３（パネルＡ）またはＢＬＦＳｉｇｍａ（パネルＢ）100μｇを、ファルマシアのＦＰＬＣシステムを用いて、ＭｏｎｏＳ（商標）カラム（ファルマシアＨＲ５／５、平衡にした樹脂ビーズ１ｍｌ含有）に施与した。緩衝液Ａ５ｍｌを用いてカラムを洗浄した後、緩衝液Ａ30ｍｌ中０〜1.0ＭＮａＣｌの直線的塩勾配を、１ｍｌ／分の流速で適用した。280ｎｍでの吸収を測定して（フルスケール0.02 ）、ピークをモニターした。図２は、段階的な溶出プログラム（塩濃度0.6〜1.0ＭＮａＣｌの逐次増加）を用いた、ＭｏｎｏＳ（商標）でのｈＬＦおよびｂＬＦの差分の溶出パターンを示す。緩衝液Ａ中のｈＬＦＳｉｇｍａ３（パネルＡ）またはｂＬＦＳｉｇｍａ（パネルＢ）100μｇを、ファルマシアのＦＰＬＣシステムを用いて、ＭｏｎｏＳ（商標）カラム（ファルマシアＨＲ５／５、平衡にした樹脂ビーズ１ｍｌ含有）に施与した。緩衝液Ａ５ｍｌを用いてカラムを洗浄した後、１ｍｌ／分の流速で、塩濃度を、緩衝液Ａ中０Ｍ〜0.6ＭＮａＣｌに段階的に増加させた。10分後、緩衝液Ａ中0.6Ｍ〜1.0ＭＮａＣｌの別の段階的増加を、１ｍｌ／分の流速で適用した。280ｎｍでの吸収によって、ピークをモニターした。図３は、直線的塩勾配または段階的溶出のいずれかを用いて、ＭｏｎｏＳ（商標）カラムで、精製した蛋白質の混合物の分離による、ｈＬＦおよびｂＬＦの実質的な精製を示す。100μｇのｈＬＦおよび100μｇのｂＬＦをそれぞれ、緩衝液Ａ中でカラムに施与し、上記したように、直線的ＮａＣｌ勾配（パネルＡ）または段階的溶出（パネルＢ）により溶出させた。直線的勾配溶出のために使用した条件下では、主たるｈＬＦピークは0.67ＭＮａＣｌで溶出し、かつ主たるｂＬＦピークは0.75ＭＮａＣｌで溶出した（図３、パネルＡ）。段階的溶出プログラムを用いると、主たるｈＬＦピークは0.6ＭＮａＣｌ段階緩衝液中に溶出し、かつ主たるｂＬＦピークは1.0ＭＮａＣｌ段階緩衝液中に溶出した（図３、パネルＢ）。図４は、図３の下での勾配方式（パネルＡ）および段階式（パネルＢ）の溶出の溶出画分におけるｈＬＦおよびｂＬＦを定量するための特異的ラジオイムノアッセイを示す。ｈＬＦおよびｂＬＦのトップ画分の純度は、ＲＩＡにより測定すると、約９５％を超えた（すなわち、約５％未満の交差汚染）。ｂＬＦからｈＬＦの分離は、直線的勾配溶出より、段階的溶出の方がいくらか良好であった。精製したｈＬＦを未処理のウシのミルクに加え、強カチオン交換樹脂を用いてのウシのミルク中のｂＬＦからのｈＬＦのクロマトグラフィーによる精製を決定するために使用した。リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５（20ｍＭ）、ＮａＣｌ（0.4Ｍ）、Tween -20（0.02％）および、ｈＬＦ（100μｇ／ｍｌ）または緩衝液単独のいずれかを添加したウシのミルクを、室温で20分間撹拌した（最終ｐＨは６．６）。脱脂乳（４℃で30分間、15,000×ｇで遠心分離して得た）を、１ＮのＨＣｌを用いてｐＨ４．７に調整し、40℃で30分間インキュベートした。ホエイ画分（４℃で30 分間、15,000×ｇで遠心分離して得た）を、１ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調整し、さらに20℃で５分間、15,000×ｇで遠心分離して清浄化した後、0.22 μｍの濾紙を通して濾過した。ホエイの１ｍｌ試料を、0.4ＭＮａＣｌ、20ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡にしたＭｏｎｏＳ（商標）カラムに施与した。次に、カラムを18ｍｌの、0.4ＭＮａＣｌ、20ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５を用いて、１ｍｌ／分にて洗浄した。280ｎｍでの吸収を測定して（フルスケール0.01）、ピークをモニターした。図５は、18ｍｌの20ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中の0.4〜1.0ＭＮａＣｌの直線的塩勾配を引き続き適用したときのクロマトグラムを示し；パネルＡはｂＬＦのみを有するウシのホエイ（スパイクされていない）を示し、パネルＢはｂＬＦおよびｈＬＦを含むウシのホエイ（スパイクされている）を示す。図６は、塩濃度を、20ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中で0.4Ｍから0.6ＭＮａＣｌに段階的に増加したときのクロマトグラムを示し；10分後、20ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中で 0.6Ｍから1.0ＭＮａＣｌの別の段階的増加を適用し；パネルＡはｂＬＦのみを有するウシのホエイ（スパイクされていない）を示し、パネルＢはｂＬＦおよびｈＬＦを含むウシのホエイ（スパイクされている）を示す。段階的溶出を用いた、ｂＬＦからのｈＬＦの分離は、試験した条件下では、直線的塩勾配を用いたときに見られるより良好であった。ｈＬＦの溶出を開始し、そして完了するのに必要とされる溶出緩衝液の体積ならびに塩強度は、カラムに結合したｈＬＦの量に関係がある。ｈＬＦの量を増加しつつカラムが充填されるとき、塩濃度の少しの増加（0.4Ｍから0.5ＭＮａＣｌへ段階的に）がｈＬＦの溶出を容易にかつ優先的に開始する。樹脂に結合するｈＬＦが多いと、ｈＬＦの溶出を開始するのに必要とされる塩濃度が低くなり、かつ生じるｈＬＦピークのテーリングが大きくなることが観察された。溶出体積への塩濃度の影響 100μｇのｈＬＦをＭｏｎｏＳ（商標）カラムに充填し、20ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中でＮａＣｌ濃度を変えた溶出緩衝液を適用して、結合したｈＬＦを完全に溶出した。表９は、ｈＬＦを完全に溶出するのに要した塩濃度のそれぞれの体積（ｍｌ）を示す。低い方の塩濃度を用いると、溶出したピークの鋭さが減ずることに言及される。これらの結果は、大規模精製中に洗浄緩衝液（例えば0.4ＭＮａＣｌ）の体積が限定されるべきであることを示し、これは、試験した条件下で、充填した樹脂の体積に対して多量の体積で樹脂を洗浄すると、結合したｈＬＦを完全に溶出するからである。ｈＬＦのスケールアップ精製種々に変えた量のｈＬＦを、１ｍｌのＭｏｎｏＳ（商標）カラムに充填し、直線的塩勾配（30ｍｌの20ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中０〜1.0ＭＮａＣｌ）を、１ｍｌ／分の流速で適用した。ｈＬＦの溶出が始まるのが観察されたＮａＣｌ濃度ならびにｈＬＦの溶出が完了したＮａＣｌ濃度を記録した。表10はその結果を示す。図７は、直線的塩勾配（30ｍｌの20ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中０〜 1.0ＭＮａＣｌ）を、１ｍｌ／分の流速で適用したとき、１ｍｌのＭｏｎｏＳ（商標）カラムに結合したｈＬＦの量と、ｈＬＦの溶出が始まるのが観察されたＮａＣｌ濃度との関係を描く。図７のデータは、ＭｏｎｏＳ（商標）の最大結合能力（樹脂１ｍｌ当たり結合したｈＬＦのｍｇ）を示す。Ｓセファロース（商標）ファストフローを用いた実験は同様な結果を生じた。コンカナバリンＡでのアフィニティクロマトグラフィーｈＬＦとｂＬＦとの間に存在するグリコシル化の差異が、レクチンクロマトグラフィーによるｈＬＦとｂＬＦの分離のために使用され得る。コンカナバリンＡに結合したｈＬＦは、50ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、0.14ＭＮａＣｌ中 50ｍＭのα‐メチル-D-マンノピラノシドを用いて完全に溶出することができたが、一方ｂＬＦは、200ｍＭのα‐メチル-D-マンノピラノシドを用いたときでさえ、あまり溶出されなかった。このように、コンカナバリンＡクロマトグラフィーは、ｂＬＦからｈＬＦを分離する、例えば強カチオン交換クロマトグラフィー（すなわち、強カチオン交換樹脂での再クロマトグラフィーに代わるもの）によって作られたｈＬＦ調製物において、痕跡量のｂＬＦを除去するのに使用することができる。強カチオン交換樹脂の例は、次のものを含むが、これらに限定されない：樹脂提供者 S Sepharose Fast Flow ファルマシア(Pharmacia) SP Sephadex C-50 ファルマシア(Pharmacia) SP Sephadex C-25 ファルマシア(Pharmacia) Mono S^TM ファルマシア(Pharmacia) SP Sepharose Fast Flow ファルマシア(Pharmacia) SP Sepharose Big Beads ファルマシア(Pharmacia) A9 50 W X2 バイオラッド(BioRad) A9 50 W X4 バイオラッド(BioRad) A9 50 W X8 バイオラッド(BioRad) A9 50 W X12 バイオラッド(BioRad) A9 50 W X16 バイオラッド(BioRad) Protein Pak SP 15 HR ミリポア/ウォーターズ(Millipore/Waters) Protein Pak SP 40 HR ミリポア/ウォーターズ(Millipore/Waters) Parcosil PepKat セルバ(Serva) Parcomer PekKat セルバ(Serva) Fractogel EMD SO₃650（M）メルク(Merck) ＨＩＣを用いてのｈＬＦおよびｂＬＦの分離疎水性相互作用クロマトグラフィー（hydrophobic inter action chromatogra phy）（ＨＩＣ）は、分子上の疎水性表面の差異に基づいて蛋白質を分離する。マトリックスは、疎水性リガンド（フェニル基またはブチル基のような）を含む。高い塩濃度（例えば＞１Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄）の存在中で、分子上の疎水性表面がさらされ、そして樹脂に結合する。蛋白質は、塩濃度を減少させることによって溶出される。ｂＬＦは、ブチルトヨパール（Toyopearl）６５０Ｍカラムに結合することができることが、ヨシダにより報告された（J.Diary Sci.72(1989)1446-1450 ）。ｂＬＦは、脱イオン水を用いては溶出されないが、0.25Ｍの酢酸を用いると溶出される。ヒトの涙からのＬＦがまた、ＨＩＣカラムに結合することが報告された（バイヤー（Baier）ら、（1990）、J.Chromat. 525、319-328）。逆相（フェニル）ＨＰＬＣを用いると、ハッチェンス(Hutchens)ら（PNAS USA 88(1991) ,2994-2998）は、ヒトＬＦおよびＬＦ減成産生物が分離できることを示した。ヒトＬＦのトリプシンによって生じるフラグメントを、逆相（オクタデシル）ＨＰＬＣを用いて分離できた（シマザキら、（1993）、J.Diary Sci.76、946-955）。従来技術は、ｈＬＦおよびｂＬＦがＨＩＣを用いて分離できることを示唆しない。本発明はしたがって、ｈＬＦおよびｂＬＦを分離するのにＨＩＣを用いることおよび対応する方法を含む。緩衝液Ａ（50ｍＭＮａＰｉｐＨ７．５、2.5Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄）中に希釈された、50μｇの純粋なｈＬＦまたはｂＬＦを、１ｍｌのフェニルセファロースＦＦ（high sub;ファルマシア）カラムに、0.2ｍｌ／分の流速で充填した。５ｍｌの緩衝液Ａでの洗浄後、すべてのｈＬＦを、約11ｍｌの80％緩衝液（緩衝液Ｂ＝50ｍＭＮａＰｉ、ｐＨ７．５）を用いて、ブロック式に溶出した。これらの条件下では、ｂＬＦの溶出は観察されなかった。すべてのｂＬＦは、100％緩衝液Ｂの引き続くブロック（５ｍｌ含有）を用いて溶出した。この結果は、ｈＬＦおよびｂＬＦがこの技術を用いて分離できることを明らかに示す。不都合は、蛋白質が溶出する塩濃度が比較的高いことである。この技術を、Ｓセファロースクロマトグラフィー後に得られるｂＬＦからトランスジェニックｈＬＦをさらに分離するために使用できる。マウスドムフェリン（Domferrin）本発明の別の観点は、N-末端配列 lys-ala-val-arg-val-gln-trp-xxx-ala-va l-ser-asn-glu-glu、８０ＫＤの、ＳＤＳＰＡＧＥによる非常におおよその分子量およびあるＭｏｎｏＳからの溶出プロフィール（それによって、蛋白質が、約0.22Ｍの塩濃度にて得られる）を有する、分離された、マウスのドムフェリン蛋白質である。本発明は、カチオン交換クロマトグラフィーによるそのような蛋白質の調製を含む。マウスのドムフェリンの幾つかの好ましい特性をまとめることができる：１．独特の位置（すなわち、0.22Ｍ塩；マウスのラクトフェリンは0.26Ｍ塩で溶出する）で、ＭｏｎｏＳから溶出する。２．この蛋白質は、マウスのラクトフェリンと異なり、かつマウスのマウスのトランスフェリンと異なる（かつ、他のラクトフェリンおよびトランスフェリン種と異なる）‐上記の表参照、独特のN-末端配列を有する。３．ＳＤＳ‐ＰＡＧＥでの移動パターンは、-80ＫＤ蛋白質を示す（ぼやけたバンドが観察され、これはおそらくグリコシル化の差異による）。さらなる情報：４．免疫拡散アッセイにおいて、マウスのドムフェリンと、抗マウストランスフェリンまたは抗ヒトトランスフェリン抗体との交差反応性は観察されない。５．マウスのドムフェリンは、ペルオキシダーゼ活性を有していない（ラクトペルオキシダーゼアッセイで試験した）。本発明を、理解を明快にする目的で説明することにより、いくらか詳細に記載してきたが、請求の範囲内で、いくらかの変更および変形が実施され得ることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 1/22 9356−4ＨＣ０７Ｋ 1/22 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ミルクからのヒトラクトフェリンを実質的に精製する方法であって、ヒトラクトフェリンを含むミルクまたはミルク画分を、高められたイオン強度条件下で、ヒトラクトフェリン‐樹脂複合体を形成するのに適した結合期間、強カチオン交換樹脂と接触させること；結合しないままであるミルクまたはミルク画分を除去し、そしてヒトラクトフェリン‐樹脂複合体を回収すること；およびヒトラクトフェリン‐樹脂複合体からヒトラクトフェリンを溶出するのに十分なイオン強度を有する塩溶液を用いて、回収したヒトラクトフェリン‐樹脂複合体からヒトラクトフェリンを溶出することから成る段階を含む方法。２．該ミルクまたはミルク画分を強カチオン交換樹脂と接触させる該段階が、ミルクまたはミルク画分中のヒトラクトフェリンの予想された量にほぼ等しいかそれより少ない結合能を有するところの、限定された量の該強カチオン交換樹脂を用いて行われる請求項１記載の方法。３．ミルクまたはミルク画分を該強カチオン交換樹脂と接触させることに先立ち、ミルクまたはミルク画分が、ＮａＣｌまたはＫＣｌの添加により、約0.35〜0.4Ｍ塩に調整される請求項１記載の方法。４．トランスジェニックウシミルクホエイが、該強カチオン交換樹脂と接触させるために使用されるミルク画分である請求項１記載の方法。５．回収したヒトラクトフェリン‐樹脂複合体を、ヒトラクトフェリンの溶出に先立ち、洗浄緩衝液で洗うことからなる中間の段階をさらに含む請求項１記載の方法。６．回収したヒトラクトフェリン‐樹脂複合体が、カラムに注ぎ込まれる請求項５記載の方法。７．強カチオン交換樹脂が、ＭｏｎｏＳ（商標）およびＳセファロース（商標）から成る群より選択される請求項１記載の方法。８．ヒトラクトフェリンを溶出するための塩溶液が、少なくともO.4ＭＮａＣｌまたは0.4ＭＫＣｌである請求項１記載の方法。９．実質的にウシラクトフェリンを溶出することなく、実質的にヒトラクトフェリンを溶出するところの塩溶液を有する溶出段階を含む段階的溶出によって、ヒトラクトフェリンが溶出される請求項１記載の方法。 10．ヒトラクトフェリンが塩勾配によって溶出され、かつウシラクトフェリンから分離される請求項７記載の方法。 11．溶出されたヒトラクトフェリンを回収し、回収したヒトラクトフェリンを強カチオン交換樹脂またはコンカナバリンＡ樹脂に充填し、そして実質的に精製された形で、樹脂からヒトラクトフェリンを溶出することからなる段階をさらに含む請求項１記載の方法。 12．ミルクまたはミルク画分を接触する段階が、実質的にヒトラクトフェリン透過性である透析膜を横切って行われる請求項１記載の方法。 13．高められたイオン強度条件が、非イオン性洗浄剤が添加されているまたは添加されていないところのミルクまたはミルク画分に、外因性のＮａＣｌまたはＫＣｌおよび／または緩衝液および／または洗浄剤を添加することによって生成される請求項１記載の方法。 14．試料中のｈＬＦ減成産生物から天然のヒトラクトフェリンを精製する方法であって、適当な結合条件下で試料を強カチオン交換樹脂と接触させること、塩勾配溶出または段階的溶出を適用することによって、分離可能なピークとして天然ヒトラクトフェリンを溶出すること、および無傷のアミノ末端配列を有する天然ヒトラクトフェリンから実質的に成るピークを回収することから成る段階を含む方法。 15．減成産生物が、エンコードされたヒトラクトフェリン蛋白質に比べてアミノ末端アミノ酸が欠損しているところのヒトラクトフェリン種を含む請求項14記載の方法。 16．減成産生物が、天然ヒトラクトフェリンが溶出するより低い塩濃度で溶出する請求項14記載の方法。 17．試料中のウシラクトフェリンからヒトラクトフェリンを分離する方法であって、試料を強カチオン交換樹脂と接触させることおよび、優先的にヒトラクトフェリンを溶出するが、ヒトラクトフェリンと共にウシラクトフェリンを実質的に溶出しないところの塩溶液を用いて、樹脂からヒトラクトフェリンを溶出することを含む方法。 18．ｈＬＦおよびｂＬＦが、塩濃度の段階的増加によって分離される請求項17記載の方法。 19．ｈＬＦおよびｂＬＦが、塩勾配を用いた溶出により分離される請求項17記載の方法。 20．強カチオン交換樹脂が、ＭｏｎｏＳ（商標）またはファストセファロース（商標）Ｓ（商標）であり、適当な結合条件が、高められたイオン強度を含み、かつヒトラクトフェリンの溶出が、優先的にヒトラクトフェリンを溶出するが、ヒトラクトフェリンと共に非ヒトラクトフェリンを実質的に溶出しないところの塩溶液を用いて成し遂げられる請求項17記載の方法。 21．そのミルクにおける組換えヒトラクトフェリンの発現及び分泌をエンコードするトランスジーンを収容するトランスジェニック動物のミルクから、実質的に純粋な組換えヒトラクトフェリンを分離する方法であって、組換えヒトラクトフェリンを含む該トランスジェニック動物のミルクまたはミルク画分を得ること；該ミルクまたはミルク画分を、ヒトラクトフェリンが樹脂に結合するのに適当な結合条件下で、強カチオン交換樹脂と接触させること；段階的塩勾配または直線的塩勾配を用いて、強カチオン交換樹脂から組換えヒトラクトフェリンを溶出することからなる段階を含む方法。 22．強カチオン交換樹脂が、ＭｏｎｏＳ（商標）またはファストセファロース（商標）Ｓ（商標）であり、適当な結合条件が、高められたイオン強度を含み、かつヒトラクトフェリンの溶出が、少なくとも0.5ＭＮａＣｌの塩溶液を用いて溶出することにより成し遂げられる請求項 21記載の方法。 23．適当な結合条件が、約0.35〜0.4ＭＮａＣｌに調整したミルクまたはミルク画分であり、溶出が、実質的に少なくとも0.4M ＮａＣｌまたはＫＣｌから成る塩溶液を用いて成し遂げられる請求項21記載の方法。 24．トランスジェニック非ヒト動物のミルクにおいて産生され、かつ強カチオン交換樹脂および／またはコンカナバリンＡ樹脂により該ミルクから実質的に精製された、組換えヒトラクトフェリン。 25．溶液からＬＰＳを除去する方法であって、ＬＰＳを含む溶液を、固定したｈＬＦを含む樹脂と接触させること、および固定したｈＬＦを含む樹脂に結合した溶液の部分を回収することからなる段階を含む方法。 26．固定したｈＬＦを含む樹脂が、セファロースに共有的に結合したｈＬＦである請求項24記載の方法。 27．ヒトラクトフェリンが、ウシラクトフェリンを含むミルクまたはミルク画分から精製され、それによってヒトラクトフェリンがウシラクトフェリンから、塩溶液を用いた差分溶出により分離される請求項１記載の方法。 28．ウシラクトフェリンからヒトラクトフェリンを分離するのに、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用する方法。 29．ヒトおよびウシのラクトフェリンの分離方法であって、該ラクトフェリンを含む混合物を、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、そしてウシラクトフェリンから分離してヒトラクトフェリンを溶出することを含む方法。 30．N-末端配列lys-ala-val-arg-val-gln-trp-xxx-ala-val-ser-asn-glu-glu、８０ＫＤの、ＳＤＳＰＡＧＥによる非常におおよその分子量および、それによって蛋白質が、約0.22Ｍ塩濃度で得られるところのＭｏｎｏＳからの溶出プロフィールを有する、単離されたマウスのドムフェリン蛋白質。 31．抗マウストランスフェリンまたは抗ヒトトランスフェリン抗体との交差反応性を示さない請求項30記載の単離されたマウスのドムフェリン蛋白質。 32．ペルオキシダーゼ活性を有していない請求項30または31記載の単離されたマウスのドムフェリン蛋白質。 33．マウスのドムフェリン蛋白質の精製方法であって、該ドムフェリンの源を強カチオン交換クロマトグラフィーに供することを含む方法。 34．マウスのドムフェリンを精製するのに、カチオン交換クロマトグラフィーを使用する方法。