JPH01247093A - アセテート・カイネース遺伝子 - Google Patents
アセテート・カイネース遺伝子Info
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- JPH01247093A JPH01247093A JP7315688A JP7315688A JPH01247093A JP H01247093 A JPH01247093 A JP H01247093A JP 7315688 A JP7315688 A JP 7315688A JP 7315688 A JP7315688 A JP 7315688A JP H01247093 A JPH01247093 A JP H01247093A
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- acetate kinase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、アセテート・カイネース（ａｃｅ ｔａ ｔ
ｅｋｉｎａｓｅ）の製造に有用なアセテート・カイネー
スをコードする遺伝子（以下、アセテート・カイネース
遺伝子という）に関する。
ｅｋｉｎａｓｅ）の製造に有用なアセテート・カイネー
スをコードする遺伝子（以下、アセテート・カイネース
遺伝子という）に関する。
アセテート・カイネースは、下記の反応式で示される反
応を触媒する酵素である。
応を触媒する酵素である。
そして、アセテート・カイネースは、ＡＴＰの製造等に
極めて有用なものである。
極めて有用なものである。
従来、アセテート・カイネースは、例えば、エツジエリ
シア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ）を培
養し、菌体よりアセテート・カイネースを分離、精製す
ることにより製造されている〔ジェイ、パイオル、ケム
、（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） 、第２６１巻、第２
９号、第１３４８７〜１３４９７頁（１９８６） ）。
シア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ）を培
養し、菌体よりアセテート・カイネースを分離、精製す
ることにより製造されている〔ジェイ、パイオル、ケム
、（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） 、第２６１巻、第２
９号、第１３４８７〜１３４９７頁（１９８６） ）。
しかしながら、上記のアセテート・カイネースの製造法
によるときには、該酵素の収率が著しく低い等の難点が
あった。
によるときには、該酵素の収率が著しく低い等の難点が
あった。
そこで、本発明者等は、上記難点を解決すべく種々検討
した結果、アセテート・カイネース遺伝子を含有するＤ
ＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得
、この組み換え体をエツジエリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ）属に属する菌株に含ませたアセテート・カイネ
ース生産能を有する菌株を培地に培養すると高収率でア
セテート・カイネースが生産されること等の知見を得、
特許出願を行なった（特願昭６２−２７３１４６及び６
２−２７３１４７号明細書）。
した結果、アセテート・カイネース遺伝子を含有するＤ
ＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得
、この組み換え体をエツジエリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ）属に属する菌株に含ませたアセテート・カイネ
ース生産能を有する菌株を培地に培養すると高収率でア
セテート・カイネースが生産されること等の知見を得、
特許出願を行なった（特願昭６２−２７３１４６及び６
２−２７３１４７号明細書）。
その後、本発明者等は、エツジエリシア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ）由来のアセテート・カイ
ネース遺伝子について更に検討した結果、エツジエリシ
ア・コリ由来のアセテート・カイネース遺伝子を初めて
単離及び構造決定することに成功し、本発明を完成した
。
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ）由来のアセテート・カイ
ネース遺伝子について更に検討した結果、エツジエリシ
ア・コリ由来のアセテート・カイネース遺伝子を初めて
単離及び構造決定することに成功し、本発明を完成した
。
すなわち、本発明は、特許請求の範囲に示されるアミノ
酸配列をコードするアセテート・カイネース遺伝子であ
る。
酸配列をコードするアセテート・カイネース遺伝子であ
る。
以下、本発明について詳細に説明する。
先ず、アセテート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ
の調製について述べる。
の調製について述べる。
例えば、大腸菌好ましくは大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１
００（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ西独、ハ
イデルベルグより入手）を培養して培養物を得る。
００（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ西独、ハ
イデルベルグより入手）を培養して培養物を得る。
上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養し
てもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養するの
が好ましい。
てもよいが、なるべく液体培養法を採用して培養するの
が好ましい。
また、上記微生物を培養する培地としては、例えば酵母
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスイープリカーあ
るいは大豆もしくは小麦敦の浸出液等の１種以上の窒素
源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩
化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩
類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタ
ミン等を適宜添加したものが用いられる。
エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスイープリカーあ
るいは大豆もしくは小麦敦の浸出液等の１種以上の窒素
源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸
マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩
化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩
類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタ
ミン等を適宜添加したものが用いられる。
なお、培地の初発ｐ）（は、７〜９に調整するのが適当
である。また培養は３０〜４２°Ｃ１好ましくは３７°
Ｃ前後で４〜２４時間、好ましくは６〜２４時間、通気
撹拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するの
が好ましい。
である。また培養は３０〜４２°Ｃ１好ましくは３７°
Ｃ前後で４〜２４時間、好ましくは６〜２４時間、通気
撹拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するの
が好ましい。
このようにして得られる培養物を、例えば３．００Ｏｒ
、ｐ、ｍ、以上、好ましくは８，０００〜１０．００Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ、で５分以上、好ましくは１０〜１５分間遠
心分離して大腸菌１１００の菌体を得る。
、ｐ、ｍ、以上、好ましくは８，０００〜１０．００Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ、で５分以上、好ましくは１０〜１５分間遠
心分離して大腸菌１１００の菌体を得る。
この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法［バイオケム、
バイオフィズ、アクタ、 （Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。
バイオフィズ、アクタ、 （Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ。
Ａｃｔａ、）、第７２巻、第６１９頁（１９６３年）］
、ケー・工ス・カービー（Ｋ、Ｓ、Ｋｉｒｂｙ）の方法
［バイオケム。
、ケー・工ス・カービー（Ｋ、Ｓ、Ｋｉｒｂｙ）の方法
［バイオケム。
ジェイ、 （Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）、第６４巻、第４
０５頁（１９５６年）コ等の方法により染色体ＤＮＡを
得ることができる。
０５頁（１９５６年）コ等の方法により染色体ＤＮＡを
得ることができる。
ついで、この染色体ＤＮＡに、突出末端を生じさせる制
限酵素、例えば５ａｕ３Ａ４ （東洋紡績社製）を、温
度３０’Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１〜１
０ユニット／−で２０分以上、好ましくは３０分〜２時
間作用させて消化し、種々の染色ＤＮＡ断片混合物を得
る。
限酵素、例えば５ａｕ３Ａ４ （東洋紡績社製）を、温
度３０’Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素濃度１〜１
０ユニット／−で２０分以上、好ましくは３０分〜２時
間作用させて消化し、種々の染色ＤＮＡ断片混合物を得
る。
そして、アセテート・カイネース遺伝子は、リンケージ
・マツプ（Ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ） ［マイクロバイ
オロジカル・レビュウズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）、第４７巻、第２号、第１８０
〜２３０頁（１９８３年）］上、ｐｕｒＦ （クルクミ
ン・フォスフォリボシルバイロフォスフエイト・アミド
トランスフェラーゼ（にｌｕｊａｍｉｎｅＰｈｏｓｐｈ
ｏｒｉｂｏｓｙｌ−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｍ
ｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子の近傍に位置づ
けられているので、前記染色体ＤＮＡ断片混合物からク
ロモゾーマル・ウオーキング（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ
Ｗａｌｋｉｎｇ）法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
第３００巻、第４号、第３５〜４２頁（１９８２年）〕
によりｐｕｒＦ遺伝子の近傍に存在するアセテート・カ
イネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片を検索することが
できる。
・マツプ（Ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ） ［マイクロバイ
オロジカル・レビュウズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）、第４７巻、第２号、第１８０
〜２３０頁（１９８３年）］上、ｐｕｒＦ （クルクミ
ン・フォスフォリボシルバイロフォスフエイト・アミド
トランスフェラーゼ（にｌｕｊａｍｉｎｅＰｈｏｓｐｈ
ｏｒｉｂｏｓｙｌ−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｍ
ｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子の近傍に位置づ
けられているので、前記染色体ＤＮＡ断片混合物からク
ロモゾーマル・ウオーキング（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ
Ｗａｌｋｉｎｇ）法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、
第３００巻、第４号、第３５〜４２頁（１９８２年）〕
によりｐｕｒＦ遺伝子の近傍に存在するアセテート・カ
イネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片を検索することが
できる。
このようにして得たＤＮＡ断片混合物から、例えば通常
のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にアセ
テート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片が含ま
れる）を得る。
のアガロースゲル電気泳動法によりＤＮＡ断片混合物を
得、更に例えばフェノール抽出等の精製手段により精製
し、また更に例えばエタノール沈澱法等の濃縮手段によ
り濃縮し、純化されたＤＮＡ断片混合物（この中にアセ
テート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片が含ま
れる）を得る。
一方、本発明において用いることのできるベクターＤＮ
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられが、具体的には例えばプラスミドｐＵｃ１９
ＤＮＡ （宝酒造社製）などが好ましい。
Ａとしては、如何なるものでもよく、例えばプラスミド
ベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクターＤＮＡ等
が挙げられが、具体的には例えばプラスミドｐＵｃ１９
ＤＮＡ （宝酒造社製）などが好ましい。
上記ベクターＤＮＡに、突出末端を生じさせる制限酵素
、例えばＥｃｏＲＩ及びＢａｍｔｌＩ （いずれも宝酒
造社製）を、温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ５
酵素濃度１０〜１０００ユニット／ｄで１時間以上、好
ましくは１〜３時間作用させて消化し、切断されたベク
ターＤＮＡを得る。
、例えばＥｃｏＲＩ及びＢａｍｔｌＩ （いずれも宝酒
造社製）を、温度３０°Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ５
酵素濃度１０〜１０００ユニット／ｄで１時間以上、好
ましくは１〜３時間作用させて消化し、切断されたベク
ターＤＮＡを得る。
次いで、上記のようにして得た大腸菌１１００由来で、
アセテート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片混
合物と、切断されたベクターＤＮＡを混合し、これに例
えば大腸菌ＤＮＡリガーゼにュー・イングランド・バイ
オ・ラプス社製）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ・
マンハイム社製）など、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼ
を、温度４〜３７°Ｃ１好ましくは４〜１６°Ｃ１酵素
濃度１〜１００ユニットで１時間以上、好ましくは６〜
２４時間作用させて組み換え体ＤＮＡを得る。
アセテート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡ断片混
合物と、切断されたベクターＤＮＡを混合し、これに例
えば大腸菌ＤＮＡリガーゼにュー・イングランド・バイ
オ・ラプス社製）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ・
マンハイム社製）など、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼ
を、温度４〜３７°Ｃ１好ましくは４〜１６°Ｃ１酵素
濃度１〜１００ユニットで１時間以上、好ましくは６〜
２４時間作用させて組み換え体ＤＮＡを得る。
この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌に−１２
、好ましくは大腸菌Ｊ Ｍ １０１ （ＡＴＣＣ３３８
７６） 、。
、好ましくは大腸菌Ｊ Ｍ １０１ （ＡＴＣＣ３３８
７６） 、。
大腸菌ＨＢ １０１ （ＡＴＣＣ３３６９４）、大腸菌
Ｄ ＨＩ （ＡＴＣＣ３３８４９）、大腸菌χ−１７７
６（ＡＴＣＣ３１２４４）、などを形質転換あるいは形
質導入してそれぞれの菌株を得る。
Ｄ ＨＩ （ＡＴＣＣ３３８４９）、大腸菌χ−１７７
６（ＡＴＣＣ３１２４４）、などを形質転換あるいは形
質導入してそれぞれの菌株を得る。
この［転換はデイ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ。
Ｍｏｒｒｆｓｏｎ）の方法〔メソヅ・イン・エンザイモ
ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
） 、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）〕
により行なうことができる。
ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
） 、第６８巻、第３２６〜３３１頁（１９７９年）〕
により行なうことができる。
また形質導入はビー・ホーン（Ｂ、１ｌｏｈｎ）の方法
〔メソヅ・イン・エンデイモロジー第６８巻、第２９９
〜３０９頁（１９７９年）〕によって行なうことができ
る。
〔メソヅ・イン・エンデイモロジー第６８巻、第２９９
〜３０９頁（１９７９年）〕によって行なうことができ
る。
そして、上記菌株よりアセテート・カイネース生産能を
有する菌株をスクリーニングすることにより、アセテー
ト・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮ
Ａに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、アセテート・カ
イネース生産能を有するエツジエリシア属に属する菌株
を得ることができる。
有する菌株をスクリーニングすることにより、アセテー
ト・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮ
Ａに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、アセテート・カ
イネース生産能を有するエツジエリシア属に属する菌株
を得ることができる。
このようにして得られた菌株より純化された新規な組み
換え体ＤＮＡを得るには、例えばビー・グーリー（Ｐ、
Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法（ジェイ、バクテリオロジー（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１０６
４〜１０６６頁（１９７３年）〕、デー・ビー・フレウ
ェル（Ｄ。
換え体ＤＮＡを得るには、例えばビー・グーリー（Ｐ、
Ｇｕｅｒｒｙ）等の方法（ジェイ、バクテリオロジー（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１１６巻、第１０６
４〜１０６６頁（１９７３年）〕、デー・ビー・フレウ
ェル（Ｄ。
Ｂ、Ｃｌｅ％１ｅｌｌ）の方法〔ジェー、バクテリオロ
ジー第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９７２年）〕
などにより得ることができる。
ジー第１１０巻、第６６７〜６７６頁（１９７２年）〕
などにより得ることができる。
次いで、上記の純化された新規な組み換え体ＤＮＡに、
例えば、制限酵素Ｍｌｕｌ及び」■■（いずれも宝酒造
社製）を温度３０″Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素
濃度５〜２０ユニット／−で０．５〜２時間、好ましく
は約１時間作用させて消化し、ＤＮＡ断片混合物を得る
。
例えば、制限酵素Ｍｌｕｌ及び」■■（いずれも宝酒造
社製）を温度３０″Ｃ以上、好ましくは３７°Ｃ１酵素
濃度５〜２０ユニット／−で０．５〜２時間、好ましく
は約１時間作用させて消化し、ＤＮＡ断片混合物を得る
。
上記ＤＮＡ断片混合物よりアセテート・カイネース遺伝
子を含有するＤＮＡを単離するには、ティー・マニアテ
イス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法〔モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ） 、第１７３頁〜第１７８頁（１９８２年）
）により得ることができる。
子を含有するＤＮＡを単離するには、ティー・マニアテ
イス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法〔モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ（
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ） 、第１７３頁〜第１７８頁（１９８２年）
）により得ることができる。
上記アセテート・カイネース遺伝子を含有するＤＮＡを
用いて、実施例の項目（７）に示すような方法によって
、アセテート・カイネース遺伝子のみの全塩基配列の解
析を行い（第４図参照）、次いで前記塩基配列を有する
遺伝子によって翻訳されるポリペブタイドのアミノ酸配
列を確定する（第５図参照）。
用いて、実施例の項目（７）に示すような方法によって
、アセテート・カイネース遺伝子のみの全塩基配列の解
析を行い（第４図参照）、次いで前記塩基配列を有する
遺伝子によって翻訳されるポリペブタイドのアミノ酸配
列を確定する（第５図参照）。
二のようにして確定されたアミノ酸配列をコードする遺
伝子が本発明のアセテート・カイネース遺伝子である。
伝子が本発明のアセテート・カイネース遺伝子である。
次に、上記のようにして得られたアセテート・カイネー
ス遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した
組み換え体ＤＮＡを含み、アセテート・カイネース生産
能を有するエツジエリシア属に属する菌株を用いてアセ
テート・カイネースを生産するには、前記大腸菌１１０
０の培養法と全く同様にして培養し、培養物を得る。
ス遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した
組み換え体ＤＮＡを含み、アセテート・カイネース生産
能を有するエツジエリシア属に属する菌株を用いてアセ
テート・カイネースを生産するには、前記大腸菌１１０
０の培養法と全く同様にして培養し、培養物を得る。
培養終了後、該培養物よりアセテート・カイネースを採
取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることがで
きる。
取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることがで
きる。
例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫Ｍ塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。
などするか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて
本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪
もしくは放置して自己消化を行なわせ本酵素を菌体外に
排出させる。この溶液を濾過、遠心分離などして固形部
分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プ
ロタミン硫Ｍ塩あるいは硫酸マンガンにより除核酸した
のち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して
分画し、沈澱物を採取し、これを水に対し透析したのち
真空乾燥して粗酵素標品を得る。
更に、アセテート・カイネースの情製品を得るには、例
えばＤＥＡＥ−セルロース（ジ・エチル・アミン・エチ
ル・セルロース、米国ブラウン社製）、ＤＥＡＥ−セフ
ァデックス（ジ・エチル・アミン・エチル・セファデッ
クス、スウェーデン国ファルマシア社製） 、ＱＡＥ−
セファデックス（スウェーデン国、ファルマシア社製）
等のイオン交換物質を用いる吸着溶出法にて精製するか
、またセファデックスＧ−２００（スウェーデン国、フ
ァルマシア社製）、セファロース６Ｂ（スウェーデン国
、ファルマシア社製）等を用いるゲル濾過法、ハイトロ
キシルアパタイト （米国バイオラッド社製、バイオゲ
ルＨＴ）を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル
等を用いる電気泳動等を適宜選択、組み合わせて実施す
ることにより、高度に精製されたアセテート・カイネー
ス標品を得ることができる。
えばＤＥＡＥ−セルロース（ジ・エチル・アミン・エチ
ル・セルロース、米国ブラウン社製）、ＤＥＡＥ−セフ
ァデックス（ジ・エチル・アミン・エチル・セファデッ
クス、スウェーデン国ファルマシア社製） 、ＱＡＥ−
セファデックス（スウェーデン国、ファルマシア社製）
等のイオン交換物質を用いる吸着溶出法にて精製するか
、またセファデックスＧ−２００（スウェーデン国、フ
ァルマシア社製）、セファロース６Ｂ（スウェーデン国
、ファルマシア社製）等を用いるゲル濾過法、ハイトロ
キシルアパタイト （米国バイオラッド社製、バイオゲ
ルＨＴ）を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル
等を用いる電気泳動等を適宜選択、組み合わせて実施す
ることにより、高度に精製されたアセテート・カイネー
ス標品を得ることができる。
上記精製手段により得られる精製アセテート・カイネー
スの理化学的性質は、〔ジェイ、パイオル、ケム、 （
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、第２６１巻、第２９号、
第１３４８７〜１３４９７号（１９８６年）〕記載のア
セテート・カイネースの理化学的性質と全く同様である
。
スの理化学的性質は、〔ジェイ、パイオル、ケム、 （
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、第２６１巻、第２９号、
第１３４８７〜１３４９７号（１９８６年）〕記載のア
セテート・カイネースの理化学的性質と全く同様である
。
上述したことから明らかな如く、本発明のアセテート・
カイネース遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに
挿入した組み換え体ＤＮＡを含むエツジエリシア属に属
する菌株を培地に培養することにより、アセテート・カ
イネースを高収率で得ることができるので、本発明は産
業上極めて有用なものである。
カイネース遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに
挿入した組み換え体ＤＮＡを含むエツジエリシア属に属
する菌株を培地に培養することにより、アセテート・カ
イネースを高収率で得ることができるので、本発明は産
業上極めて有用なものである。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例
（１）大腸菌１１００株ＤＮＡの調製
大腸菌１１００（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓｌｌｏｏ
（西独、ハイデルヘルグより入手）株を、Ｔ−Ｙ培地［
１％（Ｗ／Ｖ）バクトートリプトン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒ
ｙｐｔｏｎ） （デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製〕、０
゜５％（Ｗ／Ｖ）バクトーイーストエキストラクト（Ｂ
ａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ） （デイフ
コ（Ｄｉｒｃｏ）社製〕及び０．５％（Ｗ／Ｖ） Ｎａ
Ｃ１（ｐ Ｈ７，２） ］１００ ｒｎｌに接種し、温
度３７°Ｃで８時間振盪培養し、培養物を得た。
（西独、ハイデルヘルグより入手）株を、Ｔ−Ｙ培地［
１％（Ｗ／Ｖ）バクトートリプトン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒ
ｙｐｔｏｎ） （デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製〕、０
゜５％（Ｗ／Ｖ）バクトーイーストエキストラクト（Ｂ
ａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ） （デイフ
コ（Ｄｉｒｃｏ）社製〕及び０．５％（Ｗ／Ｖ） Ｎａ
Ｃ１（ｐ Ｈ７，２） ］１００ ｒｎｌに接種し、温
度３７°Ｃで８時間振盪培養し、培養物を得た。
この培養物を１０ ＋ ＯＯＯｒ 、 ｐ ８ｍ 、で
１５分間、常法により遠心分離処理し、湿潤菌体０．５
ｇを得たのち、該菌体から斎藤、三浦の方法〔バイオケ
ム、バイオフィズ、アクタ、（Ｂｉｏｃｈｒｍ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、）、第７２巻、第６１９頁（１９
６３年）〕により染色体ＤＮＡを得た。
１５分間、常法により遠心分離処理し、湿潤菌体０．５
ｇを得たのち、該菌体から斎藤、三浦の方法〔バイオケ
ム、バイオフィズ、アクタ、（Ｂｉｏｃｈｒｍ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、）、第７２巻、第６１９頁（１９
６３年）〕により染色体ＤＮＡを得た。
次いで、この染色体ＤＮＡ６０μｇ及び制限酵素ｊ且ｊ
ＡＩ（東洋紡績社製）３ユニツトを、１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣ１，１０ｍＭ ＭｇＳＯ
４及び１ｍＭジチオスレイトール含有） （ｐＨ７，４
）に夫々混合し、温度３７°Ｃで３０分間反応させた。
ＡＩ（東洋紡績社製）３ユニツトを、１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣ１，１０ｍＭ ＭｇＳＯ
４及び１ｍＭジチオスレイトール含有） （ｐＨ７，４
）に夫々混合し、温度３７°Ｃで３０分間反応させた。
反応終了液を常法により、フェノール抽出処理し、エタ
ノール沈澱処理した後、この５ａｕ３Ａ’ｌで消化され
たＤＮＡ断片が再結合することを防止するために、モレ
キュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ）、第１３３〜１３４頁の方法でバクチリアル
・アルカリフォスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａ
ｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理により
、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行ない、常法によりフェノ
ール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理して、５ａｕ
３ＡＩで消化された大腸菌１１００株の染色体ＤＮＡ断
片５０μｇを得た。
ノール沈澱処理した後、この５ａｕ３Ａ’ｌで消化され
たＤＮＡ断片が再結合することを防止するために、モレ
キュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ）、第１３３〜１３４頁の方法でバクチリアル
・アルカリフォスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａ
ｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理により
、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行ない、常法によりフェノ
ール抽出処理し、更にエタノール沈澱処理して、５ａｕ
３ＡＩで消化された大腸菌１１００株の染色体ＤＮＡ断
片５０μｇを得た。
（２）バクテリオファージベクターＤ Ｎ Ａ （ＥＭ
ＢＬ４）を利用した大腸菌染色体ＤＮＡライブラリーの
作製 バクテリオファージベクターＤＮＡ （ＥＭＢＬ４）〔
プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ
）社製〕２０ｕｇ及び制限酵素Ｂａｍ１ｌＩ （全酒造
社製）２００ユニツトを５０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液
（１００ｍＭ ＮａＣ１及び１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏａ含有
） （ｐＨ７，４）に混合し、温度３７℃で２時間反応
させて消化液を得、原液を常法によりフェノール抽出及
びエタノール沈澱処理した後、バクテリオファージ・ベ
クター由来の中間ＤＮＡフラグメントが再結合すること
によりバクテリオファージができることを防止するため
に、エタノール沈澱物２０μｇ及び制限酵素５ａｉｌ
１００ユニツトを５０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（１０
０ｍＭ ＮａＣ１及び１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏａ含有） （
ｐＨ７，４）に混合し、温度３７℃で２時間反応させて
消化液を得、原液を常法によりフェノール抽出及びエタ
ノール沈澱処理して、」憇旧で消化されたバクテリオフ
ァージＥＭＢ Ｌ ４ ＤＮＡを得た。
ＢＬ４）を利用した大腸菌染色体ＤＮＡライブラリーの
作製 バクテリオファージベクターＤＮＡ （ＥＭＢＬ４）〔
プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ
）社製〕２０ｕｇ及び制限酵素Ｂａｍ１ｌＩ （全酒造
社製）２００ユニツトを５０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液
（１００ｍＭ ＮａＣ１及び１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏａ含有
） （ｐＨ７，４）に混合し、温度３７℃で２時間反応
させて消化液を得、原液を常法によりフェノール抽出及
びエタノール沈澱処理した後、バクテリオファージ・ベ
クター由来の中間ＤＮＡフラグメントが再結合すること
によりバクテリオファージができることを防止するため
に、エタノール沈澱物２０μｇ及び制限酵素５ａｉｌ
１００ユニツトを５０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（１０
０ｍＭ ＮａＣ１及び１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏａ含有） （
ｐＨ７，４）に混合し、温度３７℃で２時間反応させて
消化液を得、原液を常法によりフェノール抽出及びエタ
ノール沈澱処理して、」憇旧で消化されたバクテリオフ
ァージＥＭＢ Ｌ ４ ＤＮＡを得た。
次いで、このＢａｍ）ｌ Ｉで消化されたバクテリオフ
ァージＥＭＢＬ４ ＤＮＡ１μｇ、上記項目（１）で得
られた５ａｕ３ＡＩで消化された大腸菌１１００株の染
色体ＤＮＡ断片１μｇ及び２ユニツトの７４ＤＮＡリガ
ーゼ〔ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｈｅｉｍ）社製〕を、６６ｍＭ ＭｇＣｈ、 １
０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭＡ Ｔ Ｐを含
有する６６ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ７，５）
に添加し、温度１６°Ｃで１６時間反応し、ＤＮＡを連
結させた。
ァージＥＭＢＬ４ ＤＮＡ１μｇ、上記項目（１）で得
られた５ａｕ３ＡＩで消化された大腸菌１１００株の染
色体ＤＮＡ断片１μｇ及び２ユニツトの７４ＤＮＡリガ
ーゼ〔ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｈｅｉｍ）社製〕を、６６ｍＭ ＭｇＣｈ、 １
０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭＡ Ｔ Ｐを含
有する６６ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ７，５）
に添加し、温度１６°Ｃで１６時間反応し、ＤＮＡを連
結させた。
次いで、該ＤＮＡ混合物を、イン・ビトロ・パッケージ
ング（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ）法〔メ
ンズ・イン・エンデイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏ］ｏｇｙ）、第６８巻、第２８１〜２９
８頁（１９７９年）〕により、バクテリオファージの被
膜蛋白質で包み、バクテリオファージ粒子を調製した。
ング（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ）法〔メ
ンズ・イン・エンデイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏ］ｏｇｙ）、第６８巻、第２８１〜２９
８頁（１９７９年）〕により、バクテリオファージの被
膜蛋白質で包み、バクテリオファージ粒子を調製した。
次いで、このようにして得たバクテリオファージ粒子を
大腸菌ＮＭ５３９ （プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）社より入手〕を指示菌と些で
、トリプトン寒天培地［トリプトン（Ｄｉｒｃｏ（社）
製〕１％、ＮａＣｌ Ｏ，２５％、寒天１．２％で、加
圧滅菌したのち、３０−ずつ直径９ｃｍのシャーレに分
注したものである。］上に撒き、温度３７°Ｃで１６時
間静置培養したのち、約５，０００個の溶菌斑を得、こ
れをライブラリーとして使用した。
大腸菌ＮＭ５３９ （プロメガ・バイオチク（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）社より入手〕を指示菌と些で
、トリプトン寒天培地［トリプトン（Ｄｉｒｃｏ（社）
製〕１％、ＮａＣｌ Ｏ，２５％、寒天１．２％で、加
圧滅菌したのち、３０−ずつ直径９ｃｍのシャーレに分
注したものである。］上に撒き、温度３７°Ｃで１６時
間静置培養したのち、約５，０００個の溶菌斑を得、こ
れをライブラリーとして使用した。
（３） ｐ ｕ ｒ Ｆ遺伝子を含むＤＮＡの調製大
腸菌アセテート・カイネース発現に関与する遺伝子ａｃ
ｋＡは、前述した如く、ｐｕｒＦ遺伝子の近傍に位置づ
けられている。ｐｕｒＦ遺伝子の塩基配列は、ジェイ・
ヤン・ツオー（Ｊ、Ｙｕｎ、Ｔｓｏ）等の報告〔ジャー
ナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｓｔｒ
ｙ）、第２５７巻、第３５２５〜３５３１頁、１９８２
年〕に記載されている。このｐｕｒＦ遺伝子の塩基配列
の一部である５’ ＧＴＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＧＴＧ
３’の１６塩基のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機
（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）社製）を用いて、合
成した。この２０ｎｇのオリゴヌクレオチドの５゛末端
を（３２Ｐ ） ＡＴＰ （アマジャム社製）を用い
て、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１２２〜１２６頁、コールド・ス
プリング−ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ） （１９
８２）記載の方法に従って標識した。
腸菌アセテート・カイネース発現に関与する遺伝子ａｃ
ｋＡは、前述した如く、ｐｕｒＦ遺伝子の近傍に位置づ
けられている。ｐｕｒＦ遺伝子の塩基配列は、ジェイ・
ヤン・ツオー（Ｊ、Ｙｕｎ、Ｔｓｏ）等の報告〔ジャー
ナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｓｔｒ
ｙ）、第２５７巻、第３５２５〜３５３１頁、１９８２
年〕に記載されている。このｐｕｒＦ遺伝子の塩基配列
の一部である５’ ＧＴＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＧＴＧ
３’の１６塩基のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機
（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）社製）を用いて、合
成した。この２０ｎｇのオリゴヌクレオチドの５゛末端
を（３２Ｐ ） ＡＴＰ （アマジャム社製）を用い
て、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１２２〜１２６頁、コールド・ス
プリング−ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ） （１９
８２）記載の方法に従って標識した。
上記の方法で調製した！！ｐで標識したｐｕｒＦ遺伝子
の一部であるオリゴヌクレオチドをプローブとして用い
、項目（２）で作製した組み換え体バクテリオファージ
ＥＭＢＬ４ＤＮＡをベクターとする大腸菌１１００株染
色体ＤＮＡライブラリーを、プラーク・ハイブリダイゼ
ーション法〔（モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、第３１２〜３２８頁
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ４ （
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ） （１９８２）〕で検索し、ｐｕｒＦ遺伝子
を有するプラークを得た。該プラークをモレキュラー・
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）
、第３７１〜３７２頁、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリイ （ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）記載の方法
に従い、ｐｕｒＦ遺伝子を含むバクテリオファージＤＮ
Ａを精製し、この組み換え体バクテリオファージＤＮＡ
をｈｙ１０２と命名した。
の一部であるオリゴヌクレオチドをプローブとして用い
、項目（２）で作製した組み換え体バクテリオファージ
ＥＭＢＬ４ＤＮＡをベクターとする大腸菌１１００株染
色体ＤＮＡライブラリーを、プラーク・ハイブリダイゼ
ーション法〔（モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） 、第３１２〜３２８頁
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ４ （
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ） （１９８２）〕で検索し、ｐｕｒＦ遺伝子
を有するプラークを得た。該プラークをモレキュラー・
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）
、第３７１〜３７２頁、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリイ （ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）記載の方法
に従い、ｐｕｒＦ遺伝子を含むバクテリオファージＤＮ
Ａを精製し、この組み換え体バクテリオファージＤＮＡ
をｈｙ１０２と命名した。
該組み換え体バクテリオファージｈｙ１０２ Ｄ Ｎ
Ａを制限酵素地図ＩＩＩ、 Ｅ並Ｒ１，」憇ＨＩ、
Ｂ■ＩＩ及び５ａｌＩ（いずれも宝酒造社製）を用い、
単一消化及び二重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロ
ース電気泳動法により、移動度パターンを分析し、得ら
れた移動度パターンとバクテリオファージＤＮＡ（宝酒
造社製）をＨｉｎｄＩＩＩにより消化して得られたＤＮ
Ａ断片の標準移動度パターンとを対比することにより得
られた制限酵素地図は、第１図に示すとおりであった。
Ａを制限酵素地図ＩＩＩ、 Ｅ並Ｒ１，」憇ＨＩ、
Ｂ■ＩＩ及び５ａｌＩ（いずれも宝酒造社製）を用い、
単一消化及び二重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロ
ース電気泳動法により、移動度パターンを分析し、得ら
れた移動度パターンとバクテリオファージＤＮＡ（宝酒
造社製）をＨｉｎｄＩＩＩにより消化して得られたＤＮ
Ａ断片の標準移動度パターンとを対比することにより得
られた制限酵素地図は、第１図に示すとおりであった。
（４）アセテート・カイネース遺伝子の検索−一一プロ
ープＤＮＡの作製 組み換え体バクテリオファージｈｙ１０２ ＤＮＡ５μ
ｇを、１５μｌのＴＥ緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡを含む１
０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５））に溶解し
、これに２μ２の旧ｇｈ緩衝液〔５０μｌ１Ｍトリスー
塩酸緩衝液（ｐ Ｈ，７，５） ／ １０００ｍＭ Ｎ
ａＣ１／ １００ｍＭ ＭｇＣ１ｚ／ １０ｍＭジチオ
スレイトール〕及び３０ユニツトのＥｃｏＲＩヲ添加し
、温度３７°Ｃで２時間切断処理した。
ープＤＮＡの作製 組み換え体バクテリオファージｈｙ１０２ ＤＮＡ５μ
ｇを、１５μｌのＴＥ緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡを含む１
０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５））に溶解し
、これに２μ２の旧ｇｈ緩衝液〔５０μｌ１Ｍトリスー
塩酸緩衝液（ｐ Ｈ，７，５） ／ １０００ｍＭ Ｎ
ａＣ１／ １００ｍＭ ＭｇＣ１ｚ／ １０ｍＭジチオ
スレイトール〕及び３０ユニツトのＥｃｏＲＩヲ添加し
、温度３７°Ｃで２時間切断処理した。
このＤＮＡ全量を０．７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルを
用いた電気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動は
、ティ・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方
法〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５６〜１６１頁、コールド・ス
プリング−ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ） （１９
８２） ）に従って行なった。バクテリオファージ１ｔ
ｙ１０２ ＤＮＡ中の３．４５Ｋｂｐ Ｅ赳１？Ｉ／Ｅ
ｃｏＲＩ Ｄ Ｎ Ａ断片を含むゲル部分をゲルより切
りだして透明チューブに入れ、２ｄのＴＥ緩衝液を加え
た後、透明チューブをシールし、電気泳動により、ゲル
中から緩衝液中にＤＮＡを溶出した。
用いた電気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動は
、ティ・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方
法〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１５６〜１６１頁、コールド・ス
プリング−ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ） （１９
８２） ）に従って行なった。バクテリオファージ１ｔ
ｙ１０２ ＤＮＡ中の３．４５Ｋｂｐ Ｅ赳１？Ｉ／Ｅ
ｃｏＲＩ Ｄ Ｎ Ａ断片を含むゲル部分をゲルより切
りだして透明チューブに入れ、２ｄのＴＥ緩衝液を加え
た後、透明チューブをシールし、電気泳動により、ゲル
中から緩衝液中にＤＮＡを溶出した。
この溶液に等量の水飽和フェノールを加え、撹拌したの
ち、水層を回収し、常法に従いエタノール沈澱によりＤ
ＮＡを回収した。
ち、水層を回収し、常法に従いエタノール沈澱によりＤ
ＮＡを回収した。
得られた３、４５Ｋｂｐ ＤＮＡ１片を、（”Ｐ ）
ｄＣＴＰ （アマジャム社製）を用いてニックトラン
スレーション法により標識し、プローブを得た。ニック
トランスレーションは、宝酒造社製のキットを珀い、宝
酒造社の指示するジェイ・モル・パイオル・（Ｊ、Ｍｏ
１．Ｂｉｏｌ、）、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（
１９７７）及び、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１０９〜１１２頁
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃ
ｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ） （１９８２）記載の方法に従って行なった。
ｄＣＴＰ （アマジャム社製）を用いてニックトラン
スレーション法により標識し、プローブを得た。ニック
トランスレーションは、宝酒造社製のキットを珀い、宝
酒造社の指示するジェイ・モル・パイオル・（Ｊ、Ｍｏ
１．Ｂｉｏｌ、）、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（
１９７７）及び、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１０９〜１１２頁
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃ
ｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ） （１９８２）記載の方法に従って行なった。
（５）アセテート・カイネース遺伝子の検索−ｍ−りロ
モゾーマル・ウオーキング法によるアセテート・カイネ
ース遺伝子の検索 前述の方法で調製した！ｔｐで標識した３、４５Ｋｂｐ
ＤＮＡ断片をプローブとして用い、項目（２）で作製し
た組み換え体バクテリオファージＥＭＢ Ｌ ４ ＤＮ
Ａをベクターとする大腸菌１１００株染色体ＤＮＡライ
ブラリィを、項目（３）と同様にプラーク・ハイブリダ
イゼーション法で検索し、３．４５Ｋｂｐ ＤＮＡ断片
を有するプラークを得た。該プラークを夫々、モレキュ
ラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）、第３７１〜３７２ Ｌコールド・スプリング・
ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｔ
ｌａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９Ｂ２）記載
の方法に従って処理し、バクテリオファージＤＮＡを精
製した。３．４５Ｋｂｐ ＤＮＡ断片を含む組み換え体
バクテリオファージＤＮＡをｂｙ１２２と命名した。
モゾーマル・ウオーキング法によるアセテート・カイネ
ース遺伝子の検索 前述の方法で調製した！ｔｐで標識した３、４５Ｋｂｐ
ＤＮＡ断片をプローブとして用い、項目（２）で作製し
た組み換え体バクテリオファージＥＭＢ Ｌ ４ ＤＮ
Ａをベクターとする大腸菌１１００株染色体ＤＮＡライ
ブラリィを、項目（３）と同様にプラーク・ハイブリダ
イゼーション法で検索し、３．４５Ｋｂｐ ＤＮＡ断片
を有するプラークを得た。該プラークを夫々、モレキュ
ラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）、第３７１〜３７２ Ｌコールド・スプリング・
ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｔ
ｌａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９Ｂ２）記載
の方法に従って処理し、バクテリオファージＤＮＡを精
製した。３．４５Ｋｂｐ ＤＮＡ断片を含む組み換え体
バクテリオファージＤＮＡをｂｙ１２２と命名した。
該組み換え体バクテリオファージｈｙ１２２ ＤＮＡを
、項目（３）に記載の方法に従って、前記各種制限酵素
を用い、消化し、第２図に示す通り制限酵素地図を得た
。
、項目（３）に記載の方法に従って、前記各種制限酵素
を用い、消化し、第２図に示す通り制限酵素地図を得た
。
該組み換え体バクテリオファージｈｙ１２２ Ｄ ＮＡ
１０μｇを、１５μ尼のＴＥ緩衝液に溶解したものに、
２μ２の旧ｇｈ緩衝液、３０ユニツトの制限酵素」並Ｒ
Ｉ及び３０ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩを夫々添加し
、温度３７°Ｃで２時間反応を行ない、ＤＮＡを切断し
た。切断した組み換え体バクテリオファージｈｙ１２２
ＤＮＡより、４．５Ｋｂｐの」並ＲＩ／ Ｂ憇旧ＤＮＡ
断片を、前述のアガロースゲル電気泳動法を用いる方法
に従って単離し、６ｇｇのＥｃｏＲＴ／ Ｂａｍ旧ＤＮ
Ａ断片を得た。
１０μｇを、１５μ尼のＴＥ緩衝液に溶解したものに、
２μ２の旧ｇｈ緩衝液、３０ユニツトの制限酵素」並Ｒ
Ｉ及び３０ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩを夫々添加し
、温度３７°Ｃで２時間反応を行ない、ＤＮＡを切断し
た。切断した組み換え体バクテリオファージｈｙ１２２
ＤＮＡより、４．５Ｋｂｐの」並ＲＩ／ Ｂ憇旧ＤＮＡ
断片を、前述のアガロースゲル電気泳動法を用いる方法
に従って単離し、６ｇｇのＥｃｏＲＴ／ Ｂａｍ旧ＤＮ
Ａ断片を得た。
一方、プラスミドｐＵｃ１９ ＤＮＡ （宝酒造社製）
１ｇｇを、１８μ２のＴＥ緩衝液に溶解したものに、３
μｌの旧ｇｈ緩衝液、５ユニツトの上旧及び５ユニツト
のＥｃｏＲＩを添加し、温度３７゛Ｃで１時間消化した
のち、常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処
理を行ない、沈澱物を得た。
１ｇｇを、１８μ２のＴＥ緩衝液に溶解したものに、３
μｌの旧ｇｈ緩衝液、５ユニツトの上旧及び５ユニツト
のＥｃｏＲＩを添加し、温度３７゛Ｃで１時間消化した
のち、常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処
理を行ない、沈澱物を得た。
０．５μｇのＥｃｏＲＩ及び」Ｕ旧で消化したプラスミ
ドｐＵｃ１９ ＤＮＡ及び、０．５μｇの上記ｈｙ１２
２ ＤＮＡ由来の４．５Ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ／ Ｂａｔ
ｎＩＩＩＤＮＡ断片を、夫々７μ２の水に溶解し、１３
μ２の混液［７７ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ７
，４） ／ １５ｍＭ ＭｇＣ１ｚ／ １５ｍＭジチオ
スレイトール１０．１５ｍＭ＾ＴＰ）及び、１ユニツト
のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、温度８°Ｃで１８時間
連結反応を行なった。この反応液を用い、ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢａｃ
−ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１１９巻、第１０７２〜１
０７４頁（１９７４年）記載の形質転換法により、大腸
菌ＪＭＩＯＩ株（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換し、
薬剤耐性（アンピシリン耐性）及び、β−ガラクトシダ
ーゼ活性を検討し、形質転換株を得、その株の含有する
アセテート・カイネース遺伝子を含む組み換え体プラス
ミドＤＮＡをｐＡＫ１２２と命名した。このようにして
得られた大腸菌Ｊ Ｍ １０１ （ｐＡＫ１２２）は、
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第１５３
４号（ＦＥＲＭＢＰ−１５３４）として寄託されている
。
ドｐＵｃ１９ ＤＮＡ及び、０．５μｇの上記ｈｙ１２
２ ＤＮＡ由来の４．５Ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ／ Ｂａｔ
ｎＩＩＩＤＮＡ断片を、夫々７μ２の水に溶解し、１３
μ２の混液［７７ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ７
，４） ／ １５ｍＭ ＭｇＣ１ｚ／ １５ｍＭジチオ
スレイトール１０．１５ｍＭ＾ＴＰ）及び、１ユニツト
のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、温度８°Ｃで１８時間
連結反応を行なった。この反応液を用い、ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢａｃ
−ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１１９巻、第１０７２〜１
０７４頁（１９７４年）記載の形質転換法により、大腸
菌ＪＭＩＯＩ株（ＡＴＣＣ３３８７６）を形質転換し、
薬剤耐性（アンピシリン耐性）及び、β−ガラクトシダ
ーゼ活性を検討し、形質転換株を得、その株の含有する
アセテート・カイネース遺伝子を含む組み換え体プラス
ミドＤＮＡをｐＡＫ１２２と命名した。このようにして
得られた大腸菌Ｊ Ｍ １０１ （ｐＡＫ１２２）は、
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第１５３
４号（ＦＥＲＭＢＰ−１５３４）として寄託されている
。
（６）アセテート・カイネース遺伝子を含むプラスミド
ｐＡＫ１２２ Ｄ Ｎ Ａの調製 上記で得られたプラスミドｐＡＫ１２２ Ｄ Ｎ Ａを
含有する大腸菌１０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３４）
を、トリプトン１％（Ｗ／Ｗ） 、酵母エキス０．５％
（Ｗ／Ｗ）及びＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）からなる培
地１２に、該培地を用い、温度３７°Ｃで２４時間前培
養して得られた大腸菌ＪＭ１０１（ρ１Ｋ１２２）の培
養液２０−を接種し、温度３７°Ｃで３時間振盪培養し
たのち、０．２ｇのクロラムフェニコールを添加し、更
に同一温度で２０時時間項養を行ない、培養液を得た。
ｐＡＫ１２２ Ｄ Ｎ Ａの調製 上記で得られたプラスミドｐＡＫ１２２ Ｄ Ｎ Ａを
含有する大腸菌１０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３４）
を、トリプトン１％（Ｗ／Ｗ） 、酵母エキス０．５％
（Ｗ／Ｗ）及びＮａＣ１０，５％（Ｗ／Ｖ）からなる培
地１２に、該培地を用い、温度３７°Ｃで２４時間前培
養して得られた大腸菌ＪＭ１０１（ρ１Ｋ１２２）の培
養液２０−を接種し、温度３７°Ｃで３時間振盪培養し
たのち、０．２ｇのクロラムフェニコールを添加し、更
に同一温度で２０時時間項養を行ない、培養液を得た。
次いで、この培養液を、常法により６０００ｒ、ｐ、ｍ
。
。
で１０分間遠心分離処理して湿潤菌体２ｇを得、これを
２０−の２５％（讐／Ｖ）ショ糖を含有する３５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ８，０）に懸濁した後
、更に、これにリゾチーム（シグマ社製）１０■、０．
２５Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，０） ８ ｔｒｉおよ
び２０％（Ｗ／Ｖ） ドデシル硫酸ナトリウム溶液８
ｒｄを夫々添加し、温度６０°Ｃで３０分間保温して溶
菌し、溶菌液を得た。この溶菌液に、５ＭＮａＣ１溶液
１３ｍ１を添加し、温度４°Ｃで１６時間処理したもの
を常法により、１５０００ｒ、ｐｌｍ。
２０−の２５％（讐／Ｖ）ショ糖を含有する３５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ８，０）に懸濁した後
、更に、これにリゾチーム（シグマ社製）１０■、０．
２５Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，０） ８ ｔｒｉおよ
び２０％（Ｗ／Ｖ） ドデシル硫酸ナトリウム溶液８
ｒｄを夫々添加し、温度６０°Ｃで３０分間保温して溶
菌し、溶菌液を得た。この溶菌液に、５ＭＮａＣ１溶液
１３ｍ１を添加し、温度４°Ｃで１６時間処理したもの
を常法により、１５０００ｒ、ｐｌｍ。
で３０分間遠心分離して抽出液を、常法によりフェノー
ル抽出処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得
た。
ル抽出処理及びエタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得
た。
次いで、この沈澱物を通常の減圧乾燥処理したものを、
１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝
液（ｐ Ｈ７，５） ６ ｍｆｆに溶解し、さらに、こ
れに塩化セシウム６ｇ及びエチジウムブロマイド（１９
■／ｍｆ）０．２ｄを添加したものを、常法により３９
０００ｒ、ｐ、ｍ、で４２時間超遠心分離機を用いて平
衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組み換え体プラスミ
ドｐＡＫ１２２ Ｄ Ｎ Ａを単離し、また更に、ｎ−
ブタノールを使用してエチジウムブロマイドを除去した
のち、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ ）リス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析を行ない純化され
た組み換え体プラスミドｐＡＫ１２２ Ｄ Ｎ Ａ ５
００μｇを得た。
１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝
液（ｐ Ｈ７，５） ６ ｍｆｆに溶解し、さらに、こ
れに塩化セシウム６ｇ及びエチジウムブロマイド（１９
■／ｍｆ）０．２ｄを添加したものを、常法により３９
０００ｒ、ｐ、ｍ、で４２時間超遠心分離機を用いて平
衡密度勾配遠心分離処理を行ない、組み換え体プラスミ
ドｐＡＫ１２２ Ｄ Ｎ Ａを単離し、また更に、ｎ−
ブタノールを使用してエチジウムブロマイドを除去した
のち、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ ）リス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析を行ない純化され
た組み換え体プラスミドｐＡＫ１２２ Ｄ Ｎ Ａ ５
００μｇを得た。
該組み換え体プラスミドｐＡＫ１２２ Ｄ Ｎ Ａを項
目（３）に記載の方法に従って、各種制限酵素を用い消
化し、第３図に示す通り制限酵素地図を得た。
目（３）に記載の方法に従って、各種制限酵素を用い消
化し、第３図に示す通り制限酵素地図を得た。
（７） アセテート・カイネース遺伝子を含有するＤ
ＮＡの塩基配列の解析 項目（６）で得られた組み換え体プラスミドｐＡＫ１２
２ＤＮＡ１５μｇを、制限酵素ＭｌｕＩ及び」■■（い
ずれも全酒造社製）で切断し、アセテート・カイネース
遺伝子を含有する２、９ＫｂＤＮＡ断片５μｇを得、こ
のＤＮＡ断片をプラスミドｐＵｃ１８及びｐＵｃ１９Ｄ
Ｎ Ａ ＜いずれも全酒造社製）のＳｍａ Ｉ及び−
Ｐｓｔ１部位にクローニングし、得られた組み換え体プ
ラスミドＤＮＡを用いて大腸菌Ｊ Ｍ １０１ （ＡＣ
ＴＴ３３８７６）を形質転換し、形質転換株、大腸菌Ｊ
ＭＩＯＩ （ｐＡＫ１２４−８）及びＪ ＭＩＯＩ（ｐ
ＡＫ１２４−９）を夫々得た。
ＮＡの塩基配列の解析 項目（６）で得られた組み換え体プラスミドｐＡＫ１２
２ＤＮＡ１５μｇを、制限酵素ＭｌｕＩ及び」■■（い
ずれも全酒造社製）で切断し、アセテート・カイネース
遺伝子を含有する２、９ＫｂＤＮＡ断片５μｇを得、こ
のＤＮＡ断片をプラスミドｐＵｃ１８及びｐＵｃ１９Ｄ
Ｎ Ａ ＜いずれも全酒造社製）のＳｍａ Ｉ及び−
Ｐｓｔ１部位にクローニングし、得られた組み換え体プ
ラスミドＤＮＡを用いて大腸菌Ｊ Ｍ １０１ （ＡＣ
ＴＴ３３８７６）を形質転換し、形質転換株、大腸菌Ｊ
ＭＩＯＩ （ｐＡＫ１２４−８）及びＪ ＭＩＯＩ（ｐ
ＡＫ１２４−９）を夫々得た。
なお、ＤＮＡの制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼによる連結及び形質転換方法は、前記項目（５）に記
載の方法に、また、ＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳
動による単離は、前記項目（４）に記載の方法に準拠し
た。このようにして得られた形質転換株は、ヘルパーフ
ァージＭ１３ＫＯ７（全酒造社製）を感染させ、メッシ
ング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の方法〔メンズ・イン・エンデ
イモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）、第１０１巻、第２０〜７８頁（１９８３） ）に
従い一本鎖ＤＮＡを調製した。
ゼによる連結及び形質転換方法は、前記項目（５）に記
載の方法に、また、ＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳
動による単離は、前記項目（４）に記載の方法に準拠し
た。このようにして得られた形質転換株は、ヘルパーフ
ァージＭ１３ＫＯ７（全酒造社製）を感染させ、メッシ
ング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の方法〔メンズ・イン・エンデ
イモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）、第１０１巻、第２０〜７８頁（１９８３） ）に
従い一本鎖ＤＮＡを調製した。
得られた１本鎖ＤＮＡによるシーフェンシングは、７−
ＤＥＡＺＡシークエンスキット （全酒造社製）を用い
上記メッシングの方法に従って行なった。また、ブライ
マーは、システム１プラスＤＮＡ合成機（ベックマン社
製）を用いて合成した。
ＤＥＡＺＡシークエンスキット （全酒造社製）を用い
上記メッシングの方法に従って行なった。また、ブライ
マーは、システム１プラスＤＮＡ合成機（ベックマン社
製）を用いて合成した。
更に、塩基配列の解析のためのゲル電気泳動は、８％（
Ｗ／Ｖ）ポリアクリルアミドゲル（富士写真フィルム社
製）を用いて行なった。
Ｗ／Ｖ）ポリアクリルアミドゲル（富士写真フィルム社
製）を用いて行なった。
得られたアセテート・カイネース遺伝子のみの全塩基配
列を第４図に、また、該遺伝子から翻訳されるポリペプ
チドのアミノ酸配列を第５図に夫々示した。
列を第４図に、また、該遺伝子から翻訳されるポリペプ
チドのアミノ酸配列を第５図に夫々示した。
（８）大腸菌Ｊ Ｍ １０１ （ｐＡＫ１２２）の培養
及び粗酵素液の調整 大腸菌Ｊ ＭＩＯＩ（ｐＡＫ１２２） （ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１５３４）を、ＬＢ−ａｍｐ培地〔バクトトリブト
ン１％（Ｗ／Ｗ） 、酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｗ）
、ＮａＣ１Ｏ，５％（Ｗ／Ｗ）及びアンピシリン５０ｔ
１ｇ／ｉｆ） ３ｍｌにて温度３７°Ｃで１８時間振盪
培養を行なった。この培養液０．５ ｍｌを、１０ｒｎ
ｌの上記ＬＢ−ａｍｐ培地に接種し、温度３７°Ｃで６
時間振盪培養したのち、３５００ｒ、ｐ、ｍ、で１０分
間遠心分離処理して湿潤菌体を得、該菌体を１０ｍＭ
ＭｇＣ１ｇ及び１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，５）２ｒｒＩに懸濁し、常法により
超音波破壊処理し、粗酵素液を得た。このようにして得
られた粗酵素液中のアセテート・カイネース活性の測定
は、下記の方法により行い、その結果を下表に示した。
及び粗酵素液の調整 大腸菌Ｊ ＭＩＯＩ（ｐＡＫ１２２） （ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１５３４）を、ＬＢ−ａｍｐ培地〔バクトトリブト
ン１％（Ｗ／Ｗ） 、酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｗ）
、ＮａＣ１Ｏ，５％（Ｗ／Ｗ）及びアンピシリン５０ｔ
１ｇ／ｉｆ） ３ｍｌにて温度３７°Ｃで１８時間振盪
培養を行なった。この培養液０．５ ｍｌを、１０ｒｎ
ｌの上記ＬＢ−ａｍｐ培地に接種し、温度３７°Ｃで６
時間振盪培養したのち、３５００ｒ、ｐ、ｍ、で１０分
間遠心分離処理して湿潤菌体を得、該菌体を１０ｍＭ
ＭｇＣ１ｇ及び１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，５）２ｒｒＩに懸濁し、常法により
超音波破壊処理し、粗酵素液を得た。このようにして得
られた粗酵素液中のアセテート・カイネース活性の測定
は、下記の方法により行い、その結果を下表に示した。
得られた粗酵素液中のアセテート・カイネース活性の測
定は、トーツス（Ｔｈｏｍａｓ）等の方法〔ジャーナル
・オブ・バクテリオロジーＵｏｕｒｎａｌ ｏｆＢａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１４４巻、第６７２〜６８２
頁（１９８０年）〕を改良して、生成するＮＡＤＰＨの
モル数を算出することにより行なった。
定は、トーツス（Ｔｈｏｍａｓ）等の方法〔ジャーナル
・オブ・バクテリオロジーＵｏｕｒｎａｌ ｏｆＢａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１４４巻、第６７２〜６８２
頁（１９８０年）〕を改良して、生成するＮＡＤＰＨの
モル数を算出することにより行なった。
すなわち、５ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭグルコース、
０．５ｍＭＮＡＤＰ、５ｍＭＡＤＰ及び５ｍＭアセチル
リン酸を含有する０、１ｍＭＨＥＰＥＳｌｉ衝液（ｐＨ
７，０）中に、５ユニツト／＠ｌのグルコース６リン酸
デバイドロゲナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）
及び２１ユニツトのへキソキナーゼ（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）を添加し、この溶液２．４ ｆｄに５０
倍希釈した粗酵素液０．１−を混合したのち、３４０ｎ
ｍの吸収の変化より、生成したＮＡＤＰＨの量を算出し
た値を下表に示した。
０．５ｍＭＮＡＤＰ、５ｍＭＡＤＰ及び５ｍＭアセチル
リン酸を含有する０、１ｍＭＨＥＰＥＳｌｉ衝液（ｐＨ
７，０）中に、５ユニツト／＠ｌのグルコース６リン酸
デバイドロゲナーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）
及び２１ユニツトのへキソキナーゼ（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）を添加し、この溶液２．４ ｆｄに５０
倍希釈した粗酵素液０．１−を混合したのち、３４０ｎ
ｍの吸収の変化より、生成したＮＡＤＰＨの量を算出し
た値を下表に示した。
また、比較のため、プラスミドｐＵｃ１９ ＤＮＡを有
する大腸菌ＪＭＩＯＩ株〔大腸菌１０１ （ｐＵｃ１９
） ）についても同様にアセテート・カイネース活性を
測定した。結果を下表に示した。
する大腸菌ＪＭＩＯＩ株〔大腸菌１０１ （ｐＵｃ１９
） ）についても同様にアセテート・カイネース活性を
測定した。結果を下表に示した。
（本頁以下余白）
上表より明らかな如く、本発明のアセテート・カイネー
ス遺伝子によって形質転換された大腸菌ＪＭＩＯＩ （
ｐＡＫ１２２）を用いたものは、対照の大腸菌ＪＭ１０
１ （ｐｌＪｃ１９）を用いたものに比しＮＡＤＰＨ生
成量が著しく増加しており、アセテート・カイネースが
発現されていることが判る。
ス遺伝子によって形質転換された大腸菌ＪＭＩＯＩ （
ｐＡＫ１２２）を用いたものは、対照の大腸菌ＪＭ１０
１ （ｐｌＪｃ１９）を用いたものに比しＮＡＤＰＨ生
成量が著しく増加しており、アセテート・カイネースが
発現されていることが判る。
第１図は、組み換え体バクテリオファージｈｙｔ。
２ ＤＮＡの制限酵素地図であり、第２図は、組み換え
体バクテリオファージｈｙ１２２ Ｄ Ｎ Ａの制限酵
素地図であり、第３図は、組み換え体プラスミドｐＡＫ
１２２ Ｄ Ｎ Ａの制限酵素地図であり、第４図は、
実施例のアセテート・カイネース遺伝子のみの全塩基配
列を示す図であり、また、第５図は・第４図に示す塩基
配列を有する遺伝子から翻訳されるポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す図である。
体バクテリオファージｈｙ１２２ Ｄ Ｎ Ａの制限酵
素地図であり、第３図は、組み換え体プラスミドｐＡＫ
１２２ Ｄ Ｎ Ａの制限酵素地図であり、第４図は、
実施例のアセテート・カイネース遺伝子のみの全塩基配
列を示す図であり、また、第５図は・第４図に示す塩基
配列を有する遺伝子から翻訳されるポリペプチドのアミ
ノ酸配列を示す図である。
Claims (1)
- （１）下記に示されるアミノ酸配列をコードするアセテ
ート・カイネース遺伝子。 【遺伝子配列があります。】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7315688A JPH0648986B2 (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | アセテート・カイネース遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7315688A JPH0648986B2 (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | アセテート・カイネース遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01247093A true JPH01247093A (ja) | 1989-10-02 |
| JPH0648986B2 JPH0648986B2 (ja) | 1994-06-29 |
Family
ID=13510033
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7315688A Expired - Fee Related JPH0648986B2 (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | アセテート・カイネース遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0648986B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040031866A (ko) * | 2002-10-07 | 2004-04-14 | 주식회사 진켐 | 데옥시당의 중간체인티디피-4-케토-6-데옥시-디-글루코즈의 생합성 방법, 이를위한 재조합 효소들, 재조합 벡터들 및 형질전환체들 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1321185C (zh) * | 2005-12-20 | 2007-06-13 | 哈尔滨工业大学 | 乙酸激酶基因 |
-
1988
- 1988-03-29 JP JP7315688A patent/JPH0648986B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20040031866A (ko) * | 2002-10-07 | 2004-04-14 | 주식회사 진켐 | 데옥시당의 중간체인티디피-4-케토-6-데옥시-디-글루코즈의 생합성 방법, 이를위한 재조합 효소들, 재조합 벡터들 및 형질전환체들 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0648986B2 (ja) | 1994-06-29 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |