JPH0249714B2 - - Google Patents
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- JPH0249714B2 JPH0249714B2 JP56089942A JP8994281A JPH0249714B2 JP H0249714 B2 JPH0249714 B2 JP H0249714B2 JP 56089942 A JP56089942 A JP 56089942A JP 8994281 A JP8994281 A JP 8994281A JP H0249714 B2 JPH0249714 B2 JP H0249714B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Description
本発明は新規プラスミド（plasmid）PATM3お
よびその製造法に関する。 最近、微生物を用いるDNA（デオキシリボ核
酸）組換え実験が盛んになり、大腸菌をはじめと
する細菌を中心にして、これに導入することがで
きる有用なベクター（vector）の開発が広く行な
われている。一方、放線菌は抗生物質や生理活性
物質の生産に関して、多種多様な能力を有するこ
とから、醗酵工業の分野では古くから重要視され
てきている。にもかかわらず、放線菌の育種の手
法はきわめて限られており、それに要する時間と
労力は研究をすすめる上で大きな障害となつてい
る。したがつて、放線菌の育種改良の手段の一つ
としてDNA組み換え実験を可能とする宿主−ベ
クター系の確立が望まれ、いくつかのプラスミド
の発見とそのベクターとしての利用が試みられて
きた〔遺伝子組換え実用化技術第２集、第155〜
174頁、1981年（サイエンスフオーラム社発行）
参照〕。 さらに、DNA組換え技術を用いて特定の遺伝
子産物を大量に得るためには、コピー数の多いプ
ラスミドが有利に利用される。すなわち、コピー
数の多いプラスミドをベクターに用いることによ
つて多くの遺伝子増幅効果が期待され、より多量
の遺伝子産物を得ることができる。ところが、こ
れまでに単離された放線菌のプラスミドは一般に
コピー数が少なく、染色体当り高々20〜40個であ
る。たとえば、単離されたプラスミドの染色体当
りコピー数が約１〔モレキユラー・アンド・ジユ
ネラル・ジエネテイクス（Moleoular and
General Genetics）154巻、第155−166頁、1977
年“Physical and Genetical Characterisation
of ａ Second Sex Factor，SCP2 for
Streptomyses coelicolor A3(2)”および特開昭
55−133396号公報参照〕あるいは４ないし５〔ネ
イチヤー（Nature），284巻第526−531頁
“ADNA cloning system for interspeeies gene
transfer in antibiotic−producing
Streptomyces”〕であり、コピー数の多いもので
も20ないし40〔特開昭55−120600号公報参照〕に
すぎない。 本発明者らは、放線菌におけるDNA組換え技
術を開発する目的で、とくに遺伝子増幅効果の期
待できるコピー数の多いプラスミドの探索研究を
行なつたところ、ストレプトマイセス属に属する
菌から染色体当りのコピー数が約120〜160ときわ
めて新規プラスミドが得られることを知り、これ
に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成し
た。 本発明は、(1)約4.37メガダルトンの分子量を有
し、制限酵素切断地図 によつて特徴づけられるプラスミドPATM3およ
び(2)ストレプトマイセス（Streptomyces）属に
属しプラスミドPATM3を有する微生物を培地に
培養し生育させ、その菌体を集め溶菌し、溶菌物
からプラスミドPATM3を単離することを特徴と
するプラスミドPATM3（以下において、「P
ATM3」と略称することもある。）の製造法であ
る。 本発明において用いられるストレプトマイセス
属に属しプラスミドPATM3を有する微生物とし
ては、たとえばストレプトマイセス・カスタネオ
グロビスポラス（Streptomyces
castaneoglobisporuus）が挙げられ、具体的には
ストレプトマイセス・カスタネオグロビスポラス
IFO13669が挙げられる。IFO13669株は、財団法
人発酵研究所発行のリスト・オブ・カルチヤーズ
（Institute for Fermentation Osaka List of
Cultures1978，Sixth Edition）に収載され、該
研究所から入手することができる。 本発明に使用される培地としては、本発明方法
に用いる微生物が生育して、その菌体内にプラス
ミドPATM3を保持しうるものであればいかなる
ものであつてもよい。該培地に含有される炭素源
とては、たとえばグルコース、シユークロース、
グリセリン、でん粉、デキストリン、糖蜜、有機
酸などが用いられる。該培地に含有される窒素源
としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カ
ザミノ酸〔デイフコ社（米国）製〕、NZ−アミン
Ａ（シエフイールド社（米国））製〕、ソイビーン
ミール、落花生粉などの有機窒素源、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムな
どの無機窒素源が用いられる。その他、カルシウ
ム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム
塩、リン酸、マンガン塩、鉄塩、コバルト塩など
の無機塩が必要に応じて培地に添加される。さら
に栄養要求を示す菌株を用いる場合は、その生育
に必要な栄養物質を培地に添加すればよい。該栄
養物質としては、たとえば、アミノ酸類、ビタミ
ン類、核酸塩基類などが挙げられる。さらに必要
により、消泡剤（例、大豆油、ラード油など）な
どを培地に加えてもよい。また、培養に際して必
要があれば、培地に抗生物質たとえばクロラムフ
エニコールが加えられる。 培養温度は、通常約15℃ないし42℃、さらに好
ましくは約24℃ないし35℃であり、培地のPHは発
初PHが約5.5ないし8.0でありさらに好ましくは約
6.5ないし7.5である。培養時間は、通常約２ない
し８日、さらに好ましくか約２ないし４日であ
る。 次に、上記培養によつて生育された菌体を集
め、溶菌し、溶菌物からプラスミドPATM3を単
離する菌体を集める方法は、自体公知の方法に従
えばよく、たとえば、遠心分離、過などの方法
が挙げられる。 本発明方法で用いる菌の溶菌方法としては、た
とえば、溶菌酵素（例、リゾチーム）を用いる方
法が挙げられる。なお必要があれば溶菌酵素のほ
かに、プロテアーゼなどの酵素類やザルコシー
ル、ラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を
加えたり、凍結融解をほどこしたりして溶菌を容
易にすることができる。 つぎに、このようにして得られた溶菌物から、P
ATM3を単離するにはそれ自体公知の方法に従
えばよく、たとえばエタノールを用いるDNAの
沈殿法、エチジウムブロマイドを含む塩化セシウ
ム密度勾配遠心法、シヨ糖密度勾配遠心法、アフ
イニテイークロマトグラフイー、ヒドロキシルア
パタイトクロマトグラフイー、ゲル電気泳動法、
セロフアン膜などを用いる透析処理法などの適宜
組み合わせてプラスミドPATM3を単離すること
ができる。 後述の実施例１で得られたPATM3は、種々の
制限酵素による切断部位を有している。PATM3
の制限酵素切断地図を以下に示す。 上記の制限酵素切断地図は、PATM3の分子量
を4.4メガダルトンとして作製されており、各種
の制限酵素による切断個所は地図上のBamH
による切断個所（０／1.4）を基にして定められ
ている。 PATM3は各種制限酵素に対して次の感受性を
有している。
よびその製造法に関する。 最近、微生物を用いるDNA（デオキシリボ核
酸）組換え実験が盛んになり、大腸菌をはじめと
する細菌を中心にして、これに導入することがで
きる有用なベクター（vector）の開発が広く行な
われている。一方、放線菌は抗生物質や生理活性
物質の生産に関して、多種多様な能力を有するこ
とから、醗酵工業の分野では古くから重要視され
てきている。にもかかわらず、放線菌の育種の手
法はきわめて限られており、それに要する時間と
労力は研究をすすめる上で大きな障害となつてい
る。したがつて、放線菌の育種改良の手段の一つ
としてDNA組み換え実験を可能とする宿主−ベ
クター系の確立が望まれ、いくつかのプラスミド
の発見とそのベクターとしての利用が試みられて
きた〔遺伝子組換え実用化技術第２集、第155〜
174頁、1981年（サイエンスフオーラム社発行）
参照〕。 さらに、DNA組換え技術を用いて特定の遺伝
子産物を大量に得るためには、コピー数の多いプ
ラスミドが有利に利用される。すなわち、コピー
数の多いプラスミドをベクターに用いることによ
つて多くの遺伝子増幅効果が期待され、より多量
の遺伝子産物を得ることができる。ところが、こ
れまでに単離された放線菌のプラスミドは一般に
コピー数が少なく、染色体当り高々20〜40個であ
る。たとえば、単離されたプラスミドの染色体当
りコピー数が約１〔モレキユラー・アンド・ジユ
ネラル・ジエネテイクス（Moleoular and
General Genetics）154巻、第155−166頁、1977
年“Physical and Genetical Characterisation
of ａ Second Sex Factor，SCP2 for
Streptomyses coelicolor A3(2)”および特開昭
55−133396号公報参照〕あるいは４ないし５〔ネ
イチヤー（Nature），284巻第526−531頁
“ADNA cloning system for interspeeies gene
transfer in antibiotic−producing
Streptomyces”〕であり、コピー数の多いもので
も20ないし40〔特開昭55−120600号公報参照〕に
すぎない。 本発明者らは、放線菌におけるDNA組換え技
術を開発する目的で、とくに遺伝子増幅効果の期
待できるコピー数の多いプラスミドの探索研究を
行なつたところ、ストレプトマイセス属に属する
菌から染色体当りのコピー数が約120〜160ときわ
めて新規プラスミドが得られることを知り、これ
に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成し
た。 本発明は、(1)約4.37メガダルトンの分子量を有
し、制限酵素切断地図 によつて特徴づけられるプラスミドPATM3およ
び(2)ストレプトマイセス（Streptomyces）属に
属しプラスミドPATM3を有する微生物を培地に
培養し生育させ、その菌体を集め溶菌し、溶菌物
からプラスミドPATM3を単離することを特徴と
するプラスミドPATM3（以下において、「P
ATM3」と略称することもある。）の製造法であ
る。 本発明において用いられるストレプトマイセス
属に属しプラスミドPATM3を有する微生物とし
ては、たとえばストレプトマイセス・カスタネオ
グロビスポラス（Streptomyces
castaneoglobisporuus）が挙げられ、具体的には
ストレプトマイセス・カスタネオグロビスポラス
IFO13669が挙げられる。IFO13669株は、財団法
人発酵研究所発行のリスト・オブ・カルチヤーズ
（Institute for Fermentation Osaka List of
Cultures1978，Sixth Edition）に収載され、該
研究所から入手することができる。 本発明に使用される培地としては、本発明方法
に用いる微生物が生育して、その菌体内にプラス
ミドPATM3を保持しうるものであればいかなる
ものであつてもよい。該培地に含有される炭素源
とては、たとえばグルコース、シユークロース、
グリセリン、でん粉、デキストリン、糖蜜、有機
酸などが用いられる。該培地に含有される窒素源
としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カ
ザミノ酸〔デイフコ社（米国）製〕、NZ−アミン
Ａ（シエフイールド社（米国））製〕、ソイビーン
ミール、落花生粉などの有機窒素源、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムな
どの無機窒素源が用いられる。その他、カルシウ
ム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム
塩、リン酸、マンガン塩、鉄塩、コバルト塩など
の無機塩が必要に応じて培地に添加される。さら
に栄養要求を示す菌株を用いる場合は、その生育
に必要な栄養物質を培地に添加すればよい。該栄
養物質としては、たとえば、アミノ酸類、ビタミ
ン類、核酸塩基類などが挙げられる。さらに必要
により、消泡剤（例、大豆油、ラード油など）な
どを培地に加えてもよい。また、培養に際して必
要があれば、培地に抗生物質たとえばクロラムフ
エニコールが加えられる。 培養温度は、通常約15℃ないし42℃、さらに好
ましくは約24℃ないし35℃であり、培地のPHは発
初PHが約5.5ないし8.0でありさらに好ましくは約
6.5ないし7.5である。培養時間は、通常約２ない
し８日、さらに好ましくか約２ないし４日であ
る。 次に、上記培養によつて生育された菌体を集
め、溶菌し、溶菌物からプラスミドPATM3を単
離する菌体を集める方法は、自体公知の方法に従
えばよく、たとえば、遠心分離、過などの方法
が挙げられる。 本発明方法で用いる菌の溶菌方法としては、た
とえば、溶菌酵素（例、リゾチーム）を用いる方
法が挙げられる。なお必要があれば溶菌酵素のほ
かに、プロテアーゼなどの酵素類やザルコシー
ル、ラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を
加えたり、凍結融解をほどこしたりして溶菌を容
易にすることができる。 つぎに、このようにして得られた溶菌物から、P
ATM3を単離するにはそれ自体公知の方法に従
えばよく、たとえばエタノールを用いるDNAの
沈殿法、エチジウムブロマイドを含む塩化セシウ
ム密度勾配遠心法、シヨ糖密度勾配遠心法、アフ
イニテイークロマトグラフイー、ヒドロキシルア
パタイトクロマトグラフイー、ゲル電気泳動法、
セロフアン膜などを用いる透析処理法などの適宜
組み合わせてプラスミドPATM3を単離すること
ができる。 後述の実施例１で得られたPATM3は、種々の
制限酵素による切断部位を有している。PATM3
の制限酵素切断地図を以下に示す。 上記の制限酵素切断地図は、PATM3の分子量
を4.4メガダルトンとして作製されており、各種
の制限酵素による切断個所は地図上のBamH
による切断個所（０／1.4）を基にして定められ
ている。 PATM3は各種制限酵素に対して次の感受性を
有している。
【表】
これらの結果は過剰の制限酵素をPATM3DNA
に反応させて得られたものである。切断個所の数
は1.2％（ｗ／ｖ）または1.5％（ｗ／ｖ）のいず
れかのアガロースゲル電気泳動で分離可能な断片
の数から決定されたものを示す。なおSalによ
る切断個所数は７％（ｗ／ｖ）のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動の結果から決定した。用いた制
限酵素の略称は、次の通りである。 (1) EcoRは、エシエリキア・コリRY13（R1）
（Escherichia coli）から得られた酵素である。 (2) Bglは、バシラス・グロビギー（Bacillus
globigii）から得られた酵素である。 (3) BamHは、バシラス・アミロリクエフア
シエンスＨ（Bacillus amyloliquefaciens）か
ら得られた酵素である。 (4) Hindは、ヘモフイルス・インフルエンザ
Rd（Haemophilus influenzae）から得られた
酵素である。 (5) Kpnは、クレブシエラ・ニユーモニア
OK8（Klebsiella pnueumoniae）から得られた
酵素である。 (6) Smaは、セラチア・マルセツセンスSb
（Serratia marcescens）から得られた酵素で
ある。 (7) Xhoは、キサントモナス・ホルシコーラ
（Xanthomonas holcicola）から得られた酵素
である。 (8) Salは、ストレプトミセス・アルブスＧ
（Streptomyces albus）から得られた酵素であ
る。 上記(1)〜(8)の制限酵素は、宝酒造株式会社、ニ
ユーイングランド・バイオラブズ社
（NawEngland Biolabs，Inc.）（米国）から入手
することができる。 PATM3の分子量は、電子顕微鏡観察による方
法、制限酵素消化およびアガロースゲル電気泳動
による方法など自体公知の方法により決定するこ
とができる。 上記の方法により測定したPATM3の分子量
は、約4.37メガダルトンであり、その誤差範囲は
±0.05メガダルトンである。 PATM3のコピー数は、DNAを3H―チミジン
でラベルし、プラスミドと染色体の放射活性を測
定する自体公知の方法により決定することができ
る〔モレキユラー・アンド・ジエネラル・ジエネ
テイクス154巻、第155〜166頁、1977年
“Physical and Genetical Characterisation of
ａ Seond Sex Fector，SCP2，for
Streptomyces coelicolorA3(2)”参照〕。 上記方法によつて測定したPATM3のコピー数
は約120ないし160であつた。 本発明により得られたプラスミドPATM3は、
種々の制限酵素による切断部位を有ており、この
事実はこのプラスミドを修飾して多くの有用なベ
クターを開発できることを示している。また本発
明のプラスミドあるいは誘導体に目的とする遺伝
子をくみこみ、これを適当な宿主微生物に導入し
て、宿主を形質転換させることも可能である。と
りわけ、本発明のプラスミドは、放線菌など醗酵
工業上重要な微生物に対し、ベクターとして有利
に利用できる。すなわち、放線菌からの遺伝情報
を本発明のプラスミドを用いてクローン化し、こ
れを目的とする微生物に導入することによりたと
えば、放線菌による抗生物質、生理活性物質、酵
素などの二次代謝産物の生産の増大をもたらすこ
とができる。 さらに、本発明のプラスミドは微生物遺伝子の
みならず、高等動植物の遺伝子（たとえば、ソマ
トスタチン、インスリンなどをコードする遺伝子
や窒素固定に関与する遺伝子）をクローニングす
るためのベクターとしても利用可能である。 さらに、本発明のプラスミドPATM3のコピー
数は約120ないし160と、従来知られている放線菌
のプラスミドに比し、非常に多い。したがつて、
本発明のプラスミドをベクターとして用いること
により、クロニングされた遺伝子の増幅効果を通
じて、多量の遺伝子産物を得ることが可能であ
る。 上記利用において、目的とする遺伝子を含む組
み換えプラスミドの作製方法それ自体は公知であ
る。たとえば、サイエンテイフイツク・アメリカ
ン（Scientific American）1975年第233巻No.１第
24〜33頁に記載されている。 また、得られた組み換えプラスミドを宿主へ移
入する方法それ自体も公知であり、たとえば放線
菌を宿主として用いる場合については、ネイチヤ
ー（Nature）第274巻第398〜400頁（1978年）に
記載されている。 また、本発明のプラスミドをベクターとして用
い、目的とする物質の生合成に必要な遺伝子を組
み込んだプラスミドを導入された宿主微生物を自
体公知の方法で培養して目的とする物質を培地中
あるいは菌体内に生成蓄積させ、その培養物から
目的とする物質を分離精製することにより、目的
とする物質を製造できる。 本発明のプラスミドは、放線菌のプラスミドで
あるから、放線菌を宿主とする系に用いることが
できるばかりではなく、他のグラム陽性菌、たと
えばバシラス（Bacillus）、コリネバクテリウム
（Corynebacterium）、ブレビバクテリウメ
（Brevibacterium）などの細菌のベクターとして
も使用できる可能性がある。 次に実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明
するが、本発明はこれに限定されるべきのもので
はない。なお、パーセント（％）はとくにことわ
りのないかぎり、重量／容量パーセント（ｗ／ｖ
％）を表わす。 実施例 １ ストレプトマイセス・カスタネオグロビスポラ
スIFO13669からのプラスミドPATM3の単離・ト
リプテイケースソイブロス（Trypticase Soy
Broth）〔Baltimore Biologicals社製（米国）〕
10mlを大型試験管（20mmφ×245mm）に分注後滅
菌し、これにストレプトマイセス・カスタネオグ
ロビスポラスIFO13669を接種して28℃で２日間
振とう培養した。この培養物の全量を、400mlの
前記の培地を２の坂口フラスコに分注して予め
滅菌したものに移植して、28℃で４日間往復振と
う機上で培養した。培養物を8000回転で10分間遠
心して菌体を集め、これをTES緩衝液〔30mMト
リスアミノメタン、5mM EDTA（エチレンジア
ミンテトラアセテート）および50mM NaCl：PH
8.0〕で２回洗浄して湿菌体を得た。この菌体を
TES緩衝液にけん濁したのち均一化し、OD600
が0.9になるようにTES緩衝液で調整した。この
調整液400mlを8000回転で10分間遠心して菌体を
集めこれに120mlの25％シユークロース液（TES
緩衝液にとかしたもの）、20mlの0.25M EDTA液
（PH8.0）、40mlのリゾチーム液（生化学工業製、
上記25％シユークロース液にリゾチームの濃度が
５mg／mlになるよう溶解したもの）および４mlの
Ｒ NaseA TypeI―Ａ液（シグマ社製、予め
100℃で10分熱処理したもの。RNaseA TypeI―
Ａの濃度５mg／ml）を加えてよく混合させた。こ
れを37℃に保ち、ときどきゆるく撹拌しながら30
分反応させた。この反応液に10％ザルコシール液
（和光純薬製、ソジウム―Ｎ―ラウロイルザルコ
シネイトをTES緩衝液にとかしたもの）を加え
て混合後、さらに30分保温した。これに20mlのプ
ロナーゼＰ液（科研化学工業製、予め37℃で30分
自己消化したもの、プロナーゼＰ濃度５mg／ml）
を加えてさらに37℃で30分反応させた。反応終了
後、32mlの10％SDS液（和光純薬製、ソジウム・
ドデシル・サルフエイトを水にとかしたもの）お
よび68mlの5MNaClを加えてよく混合し、０℃に
一夜放置した。この溶液を10000回転で40分遠心
して上清を集め、上清の２倍量の冷却エタノール
を加えて−20℃に一夜放置したのち、10000回転
で30分遠心して沈澱を集めた。残在するエタノー
ルを完全に除去したのち、40mlの0.4％ザルコシ
ール液（TES緩衝液に溶解したもの）に沈澱を
溶解させた。得られた溶液に固体のセシウムクロ
ライドおよび1.5mlのエチジウムブロマイド溶液
（ジメチルスフオキサイドに30mg／mlになるよう
に溶したもの）をくわえて密度を1.600となるよ
うにし、ベツクマン製超遠心機（米国）で20℃、
38000回転で40時間遠心した。遠心プラスミドバ
ンドは、紫外線下（302nm）で螢光バンドとして
検出された。このバンドを分画して集め、再度同
一条件下で超遠心を行ないプラスミド画分を得
た。このプラスミド画分にこれと等量のｎ−ブタ
ノールを加えてゆつくり混合させながらエチジウ
ムブロマイドを抽出して除去した。ここに得られ
た水層を多量の0.1×SSC＋1mMEDTA
（15mMNaCl、1.5mMクエン酸ナトリウム・２水
塩、1mMEDTA、PH・8.0）に対して３回透析を
行ない、DNAとして180μgのPATM3を得た。 DNA分子の電子顕微鏡観察の結果、PBR322を
標準として、PATM3の平均外形の長さから対応
する分子量を求めた〔メソツド・イン・エンジモ
ロジー（Method in Enzymology12巻part Ｂ第
361〜377頁、1968年アカデミツクプレス、ニユー
ヨーク（米国）参照〕ところ、数十回の観察で、
4.37±0.05の範囲内にありその平均値は4.34メガ
ダルトンであつた。また各種制限酵素によつてP
ATM3を単一消化、二重消化、あるいは三重消
化して得られたDNA断片をアガロースゲル電気
泳動にかけ、その移動度から分子量を算出した
〔ジヤーナル・オブ・バイロロジー（Journal of
Virology）14巻1235〜1244頁1974年参照〕とこ
ろ、十数回の検索で、4.37±0.05の範囲内にあり
その平均値は4.38メガダルトンであつた。上記に
おいて、酵素はすべて宝酒造製を使用し、反応す
べて供給者によつて定められた条件にしたがつ
た。また、分子量は、λDNAをHindで分解し
て得られた断片の標準移動物物のパターンを基に
して決定した〔ジヤーナル・オブ・モレキユラ
ー・バイオロジー（Journal of Molecular
Biology）98巻551〜564頁1975年参照〕。 なお、SalIによる切断によつて生ずる２つの小
さな断片の分子量は７％（ｗ／ｖ）のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分離し〔メソツド・イ
ン・エンジーモロジー（Methods in
Enzymology）第68巻、第265〜266頁、1979年
（アカデミツクプレス社発行）参照〕、その移動度
から、PBR322DNAをTaqI〔サーマス・アクアテ
イカス（Thermus Aquaticus）YTIから得られ
た制限酵素、Naw Englabd Biolabs Inc.製〕で
分解して得られた断片の標準移動のパターンを基
にして決定した〔コールド・スプリング・ハーバ
ー・シンポジウム（Cold Spring Harbor
Symposium）43巻77−90頁1979年“Complete
Nucleotide Scquence of the Escherichia coli
Plasmid PBR322”参照〕。
に反応させて得られたものである。切断個所の数
は1.2％（ｗ／ｖ）または1.5％（ｗ／ｖ）のいず
れかのアガロースゲル電気泳動で分離可能な断片
の数から決定されたものを示す。なおSalによ
る切断個所数は７％（ｗ／ｖ）のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動の結果から決定した。用いた制
限酵素の略称は、次の通りである。 (1) EcoRは、エシエリキア・コリRY13（R1）
（Escherichia coli）から得られた酵素である。 (2) Bglは、バシラス・グロビギー（Bacillus
globigii）から得られた酵素である。 (3) BamHは、バシラス・アミロリクエフア
シエンスＨ（Bacillus amyloliquefaciens）か
ら得られた酵素である。 (4) Hindは、ヘモフイルス・インフルエンザ
Rd（Haemophilus influenzae）から得られた
酵素である。 (5) Kpnは、クレブシエラ・ニユーモニア
OK8（Klebsiella pnueumoniae）から得られた
酵素である。 (6) Smaは、セラチア・マルセツセンスSb
（Serratia marcescens）から得られた酵素で
ある。 (7) Xhoは、キサントモナス・ホルシコーラ
（Xanthomonas holcicola）から得られた酵素
である。 (8) Salは、ストレプトミセス・アルブスＧ
（Streptomyces albus）から得られた酵素であ
る。 上記(1)〜(8)の制限酵素は、宝酒造株式会社、ニ
ユーイングランド・バイオラブズ社
（NawEngland Biolabs，Inc.）（米国）から入手
することができる。 PATM3の分子量は、電子顕微鏡観察による方
法、制限酵素消化およびアガロースゲル電気泳動
による方法など自体公知の方法により決定するこ
とができる。 上記の方法により測定したPATM3の分子量
は、約4.37メガダルトンであり、その誤差範囲は
±0.05メガダルトンである。 PATM3のコピー数は、DNAを3H―チミジン
でラベルし、プラスミドと染色体の放射活性を測
定する自体公知の方法により決定することができ
る〔モレキユラー・アンド・ジエネラル・ジエネ
テイクス154巻、第155〜166頁、1977年
“Physical and Genetical Characterisation of
ａ Seond Sex Fector，SCP2，for
Streptomyces coelicolorA3(2)”参照〕。 上記方法によつて測定したPATM3のコピー数
は約120ないし160であつた。 本発明により得られたプラスミドPATM3は、
種々の制限酵素による切断部位を有ており、この
事実はこのプラスミドを修飾して多くの有用なベ
クターを開発できることを示している。また本発
明のプラスミドあるいは誘導体に目的とする遺伝
子をくみこみ、これを適当な宿主微生物に導入し
て、宿主を形質転換させることも可能である。と
りわけ、本発明のプラスミドは、放線菌など醗酵
工業上重要な微生物に対し、ベクターとして有利
に利用できる。すなわち、放線菌からの遺伝情報
を本発明のプラスミドを用いてクローン化し、こ
れを目的とする微生物に導入することによりたと
えば、放線菌による抗生物質、生理活性物質、酵
素などの二次代謝産物の生産の増大をもたらすこ
とができる。 さらに、本発明のプラスミドは微生物遺伝子の
みならず、高等動植物の遺伝子（たとえば、ソマ
トスタチン、インスリンなどをコードする遺伝子
や窒素固定に関与する遺伝子）をクローニングす
るためのベクターとしても利用可能である。 さらに、本発明のプラスミドPATM3のコピー
数は約120ないし160と、従来知られている放線菌
のプラスミドに比し、非常に多い。したがつて、
本発明のプラスミドをベクターとして用いること
により、クロニングされた遺伝子の増幅効果を通
じて、多量の遺伝子産物を得ることが可能であ
る。 上記利用において、目的とする遺伝子を含む組
み換えプラスミドの作製方法それ自体は公知であ
る。たとえば、サイエンテイフイツク・アメリカ
ン（Scientific American）1975年第233巻No.１第
24〜33頁に記載されている。 また、得られた組み換えプラスミドを宿主へ移
入する方法それ自体も公知であり、たとえば放線
菌を宿主として用いる場合については、ネイチヤ
ー（Nature）第274巻第398〜400頁（1978年）に
記載されている。 また、本発明のプラスミドをベクターとして用
い、目的とする物質の生合成に必要な遺伝子を組
み込んだプラスミドを導入された宿主微生物を自
体公知の方法で培養して目的とする物質を培地中
あるいは菌体内に生成蓄積させ、その培養物から
目的とする物質を分離精製することにより、目的
とする物質を製造できる。 本発明のプラスミドは、放線菌のプラスミドで
あるから、放線菌を宿主とする系に用いることが
できるばかりではなく、他のグラム陽性菌、たと
えばバシラス（Bacillus）、コリネバクテリウム
（Corynebacterium）、ブレビバクテリウメ
（Brevibacterium）などの細菌のベクターとして
も使用できる可能性がある。 次に実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明
するが、本発明はこれに限定されるべきのもので
はない。なお、パーセント（％）はとくにことわ
りのないかぎり、重量／容量パーセント（ｗ／ｖ
％）を表わす。 実施例 １ ストレプトマイセス・カスタネオグロビスポラ
スIFO13669からのプラスミドPATM3の単離・ト
リプテイケースソイブロス（Trypticase Soy
Broth）〔Baltimore Biologicals社製（米国）〕
10mlを大型試験管（20mmφ×245mm）に分注後滅
菌し、これにストレプトマイセス・カスタネオグ
ロビスポラスIFO13669を接種して28℃で２日間
振とう培養した。この培養物の全量を、400mlの
前記の培地を２の坂口フラスコに分注して予め
滅菌したものに移植して、28℃で４日間往復振と
う機上で培養した。培養物を8000回転で10分間遠
心して菌体を集め、これをTES緩衝液〔30mMト
リスアミノメタン、5mM EDTA（エチレンジア
ミンテトラアセテート）および50mM NaCl：PH
8.0〕で２回洗浄して湿菌体を得た。この菌体を
TES緩衝液にけん濁したのち均一化し、OD600
が0.9になるようにTES緩衝液で調整した。この
調整液400mlを8000回転で10分間遠心して菌体を
集めこれに120mlの25％シユークロース液（TES
緩衝液にとかしたもの）、20mlの0.25M EDTA液
（PH8.0）、40mlのリゾチーム液（生化学工業製、
上記25％シユークロース液にリゾチームの濃度が
５mg／mlになるよう溶解したもの）および４mlの
Ｒ NaseA TypeI―Ａ液（シグマ社製、予め
100℃で10分熱処理したもの。RNaseA TypeI―
Ａの濃度５mg／ml）を加えてよく混合させた。こ
れを37℃に保ち、ときどきゆるく撹拌しながら30
分反応させた。この反応液に10％ザルコシール液
（和光純薬製、ソジウム―Ｎ―ラウロイルザルコ
シネイトをTES緩衝液にとかしたもの）を加え
て混合後、さらに30分保温した。これに20mlのプ
ロナーゼＰ液（科研化学工業製、予め37℃で30分
自己消化したもの、プロナーゼＰ濃度５mg／ml）
を加えてさらに37℃で30分反応させた。反応終了
後、32mlの10％SDS液（和光純薬製、ソジウム・
ドデシル・サルフエイトを水にとかしたもの）お
よび68mlの5MNaClを加えてよく混合し、０℃に
一夜放置した。この溶液を10000回転で40分遠心
して上清を集め、上清の２倍量の冷却エタノール
を加えて−20℃に一夜放置したのち、10000回転
で30分遠心して沈澱を集めた。残在するエタノー
ルを完全に除去したのち、40mlの0.4％ザルコシ
ール液（TES緩衝液に溶解したもの）に沈澱を
溶解させた。得られた溶液に固体のセシウムクロ
ライドおよび1.5mlのエチジウムブロマイド溶液
（ジメチルスフオキサイドに30mg／mlになるよう
に溶したもの）をくわえて密度を1.600となるよ
うにし、ベツクマン製超遠心機（米国）で20℃、
38000回転で40時間遠心した。遠心プラスミドバ
ンドは、紫外線下（302nm）で螢光バンドとして
検出された。このバンドを分画して集め、再度同
一条件下で超遠心を行ないプラスミド画分を得
た。このプラスミド画分にこれと等量のｎ−ブタ
ノールを加えてゆつくり混合させながらエチジウ
ムブロマイドを抽出して除去した。ここに得られ
た水層を多量の0.1×SSC＋1mMEDTA
（15mMNaCl、1.5mMクエン酸ナトリウム・２水
塩、1mMEDTA、PH・8.0）に対して３回透析を
行ない、DNAとして180μgのPATM3を得た。 DNA分子の電子顕微鏡観察の結果、PBR322を
標準として、PATM3の平均外形の長さから対応
する分子量を求めた〔メソツド・イン・エンジモ
ロジー（Method in Enzymology12巻part Ｂ第
361〜377頁、1968年アカデミツクプレス、ニユー
ヨーク（米国）参照〕ところ、数十回の観察で、
4.37±0.05の範囲内にありその平均値は4.34メガ
ダルトンであつた。また各種制限酵素によつてP
ATM3を単一消化、二重消化、あるいは三重消
化して得られたDNA断片をアガロースゲル電気
泳動にかけ、その移動度から分子量を算出した
〔ジヤーナル・オブ・バイロロジー（Journal of
Virology）14巻1235〜1244頁1974年参照〕とこ
ろ、十数回の検索で、4.37±0.05の範囲内にあり
その平均値は4.38メガダルトンであつた。上記に
おいて、酵素はすべて宝酒造製を使用し、反応す
べて供給者によつて定められた条件にしたがつ
た。また、分子量は、λDNAをHindで分解し
て得られた断片の標準移動物物のパターンを基に
して決定した〔ジヤーナル・オブ・モレキユラ
ー・バイオロジー（Journal of Molecular
Biology）98巻551〜564頁1975年参照〕。 なお、SalIによる切断によつて生ずる２つの小
さな断片の分子量は７％（ｗ／ｖ）のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分離し〔メソツド・イ
ン・エンジーモロジー（Methods in
Enzymology）第68巻、第265〜266頁、1979年
（アカデミツクプレス社発行）参照〕、その移動度
から、PBR322DNAをTaqI〔サーマス・アクアテ
イカス（Thermus Aquaticus）YTIから得られ
た制限酵素、Naw Englabd Biolabs Inc.製〕で
分解して得られた断片の標準移動のパターンを基
にして決定した〔コールド・スプリング・ハーバ
ー・シンポジウム（Cold Spring Harbor
Symposium）43巻77−90頁1979年“Complete
Nucleotide Scquence of the Escherichia coli
Plasmid PBR322”参照〕。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 約4.37（±0.05）メガダルトンの分子量を有
し、制限酵素切断地図 によつて特徴づけられるプラスミドPATM3。 ２ ストレプトマイセス属に属しプラスミドP
ATM3を有する微生物を培地に培養し生育させ、
その菌体を集め溶菌し、溶菌物からプラスミドP
ATM3を単離することを特徴とするプラスミドP
ATM3の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56089942A JPS57206699A (en) | 1981-06-10 | 1981-06-10 | Plasmid patm 3 and its preparation |
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|---|---|---|---|
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- 1982-06-09 CA CA000404751A patent/CA1190491A/en not_active Expired
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