JPH0631317B2 - トリグラミン、血小板凝集抑制性ポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、血小板の凝集の有効な抑制剤である低分子量
ポリペプチドであるトリグラミンに関する。

発明の背景 糖蛋白質IIｂ−IIIａ（ＧＰIIｂ−ＧＰIIIａ）複合体と
会合する特異的受容体とフィブリノーゲンとの相互作用
が血小板の凝集にとって必須であることが証明されてい
る。刺激されていない血小板はフィブリノーゲンと結合
せず、したがって循環系で凝集しない。血小板がＡＤ
Ｐ、エピネフリン、トロンビン又はプロスタグランジン
エンドペルオキシドのようなアゴニストによって刺激さ
れると、ＧＰIIｂ−ＧＰIIIａ複合体と会合したフィブ
リノーゲン受容体が血小板表面に露出するようになり、
フィブリノーゲンと結合し、続いて血小板を凝集させる
ことになる。一般に説明されているのは、ＡＤＰが生理
学的条件下でフィブリノーゲン受容体の露出に必須の媒
介物であるということである。組織の損傷中にＡＤＰが
血小板の凝集を起させるのに十分な量で形成されること
が証拠により示唆されている。

シー．オーヤン（Ｃ．Ｏｕｙａｎｇ）及びティー．ハン
（Ｔ．Ｈｕａｎｇ）の両氏は、バイオシミカ・エ・バイ
オフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．
Ａｃｔａ）７５７、ｐ．３３２〜３４１（１９８３）に
おいて、アオハブ（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｇｒａ
ｍｉｎｅｕｓ）の毒液から得られた血小板凝集抑制性物
質の粗製の製剤を報告している。この物質は、イオン交
換クロマトグラフィー及びゲル濾過によって単離され
る、アスパラギン酸、グルタミン酸及びシステインに富
む酸性ホスホリパーゼＡとして記載された。また、オー
ヤン氏らは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
及び円板式電気泳動によってその製剤中に１２．４ｋｄ
の単一バンドを同定した。さらに、彼らは１０９個のア
ミノ酸残基を基にして１１，６８２の推定最小分子量を
報告している。

しかし、オーヤン氏らの因子の有効性にもかかわらず、
この物質のホスホリパーゼＡ活性は、赤血球に対するホ
スホリパーゼＡに溶血作用のために、該物質を臨床的に
使用することを不適当にしている。さらに、純粋でない
物質は原料の毒液に由来する１種以上の汚染性毒素を含
有するかもしれない。ヘビ毒中に見出されるある種の毒
素がナノグラム量でヒトに対して毒性であることが知ら
れている。

発明の要旨 本発明者は、オーヤン氏らにより主張された１０９個の
アミノ酸からなる蛋白質が実際の血小板凝集抑制因子を
含有する純粋でない混合物にすぎないことを見出した。

本発明者は、アオハブからホスホリパーゼＡ汚染物を含
まない実質上純粋な化学的形態で血小板凝集抑制因子を
得た。この活性な血小板凝集抑制因子（これはトリグラ
ミン（ｔｒｉｇｒａｍｉｎ）と命名された）は、化学的
均一性まで精製された。

実質上純粋な化学的形態のトリグラミンは、次のアミノ
酸配列 ＥＡＧＥＤＣＤＣＧＳＰＡＮＰＣＣＤＡＡＴＣＫＬＩＰ
ＧＡＱＣＧＥＧＬＣＣＤＱＣＳＦＩＥＥＧＴＶＣＲＩＡ
ＲＧＤＤＬＤＤＹＣＮＧＲＳＡＧＣＰＲＮＰＦＨ （ここで、アミノ酸についての記号は、下記のような認
められた生化学的意味を有する。記 号 アミノ酸残基 Ｋ リジン Ｈ ヒスチジン Ｒ アルギニン Ｄ アスパラギン酸 Ｎ アスパラギン Ｔ スレオニン Ｓ セリン Ｅ グルタミン酸 Ｑ グルタミン Ｐ プロリン Ｇ グリシン Ａ アラニン Ｃ ハーフシスチン Ｖ バリン Ｍ メチオニン Ｉ イソロイシン Ｌ ロイシン Ｙ チロシン Ｆ フェニルアラニン Ｗ トリプトファン） を有する７２個のアミノ酸よりなるポリペプチドであ
る。

また、本発明は、ヒト血小板のフィブリノーゲンで誘発
された凝集を抑制するための、ホスホリパーゼＡ汚染物
を実質上含まないトリグラミンの製剤に関する。

また、本発明は、ヒト血小板に対するフィブリノーゲン
の結合を抑制しかつヒト血小板のフィブリノーゲンで誘
発される凝集を抑制するための方法に係る。この方法に
よれば、ヒト血小板は実質上純粋な化学的形態でトリグ
ラミンを含有する製剤とインキュベートされる。したが
って、トリグラミンは、ヒトの血流中で血小板凝集の発
生を抑制するためヒトに投与することができる。

発明の具体的説明 トリグラミンは次のように精製される。まず、オーヤン
氏らの方法（前記のＢｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ７５７、ｐ．３３２〜３４１（１９８３））に
従ってホスホリパーゼＡ活性を有する粗調製物を得る。
次いで、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）によってトリグラミンを化学的均一性まで最終精製
する。

粗製物質の調製 アオハブ（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ ｇｒａｍｉｎｅ
ｕｓ）の毒液を集め、遠心分離し、凍結乾燥し、無水Ｃ
ａＣｌ_２を入れたデシケータ内に−２０℃で貯蔵する。
この毒液をまず次のようにＤＥＡＥセファデックスＡ−
５０カラムクロマトグラフィーによって１２個の画分に
分離する。

ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０カラムクロマトグラ
フィー：ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０を充填した
カラム（３．２×１００ｃｍ）に毒液１ｇを入れる。混
合容器中の０．００５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨはアン
モニウム水溶液により８．０に調節する）１０００ｍｌ
及び受器中の０．２５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨは氷酢
酸により６．０に調節する）１０００ｍｌによって第一
段階の勾配溶離を行う。次いで、混合容器中の０．２５
Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．０）８００ｍｌ及び受器
中の１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．２）１０００ｍｌ
によって第二段階の勾配溶離を行う。流量を１６〜１８
ｍｌ／ｈに調節し、試験管１本当り６ｍｌの溶出液を集
める。流出物は分光光度計（例えば、ＬＫＢ社製の「Ｌ
ＫＢ Ｕｖｉｃｏｒｄ」）によって２７８ｎｍ及び５℃
で連続的にモニターする。

毒液は、前記のＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０カラ
ムによって１２個の画分に分離される。第一段階の勾配
溶離では８個の画分が得られ、他の４個の画分は第二段
階の溶離で得られた。次いで画分１２を次のようにセフ
ァデックスＧ−７５カラムで再分別する。

セファデックスＧ−７５クロマトグラフィー：このカラ
ムは０．００５Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）中
で調製されたセファデックスよりなる。カラムの大きさ
は毒液の量に従う。セファデックスＧ−７５カラムから
の溶離０．００５Ｍ重炭酸アンモニウムで行う。流量は
１８ｍｌ／ｈに調節する。試験管１本当り３ｍｌの溶出
液を集める。

セファデックスＧ−５０クロマトグラフィー：セファデ
ックスＧ−７５カラムからの三番目の副次画分であっ
て、トロンビン（０．１Ｕ／ｍｌ）によって誘発される
血小板凝集に対して活性を持っている画分をセファデッ
クスＧ−５０で単一ピークが得られるまで３回再分別す
る。溶離剤として重炭酸アンモニウム（０．００５Ｍ、
ｐＨ７．８）を使用する。得られた粗製物質を次のよう
にしてさらに精製する。

化学的均一性までのトリグラミンの精製 大きい細孔のＣ−１８シリカマトリックス（例えば、
「Ｖｙｄａｃ ＴＰＲＰ」、ザセパレーションズ・グル
ープ社、ヘスバリア、Ｃａ）を入れた高性能液体クロマ
トグラフィーカラム（２５０×４．６ｍｍ）を０．１％
トリフルオル酢酸中で２０℃で平衡化させる。次いで、
上で調製した粗製物質１５０μｇを０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ ２００μｌに加えたものを上記カラムに１．０ｍｌ
／ｍｉｎの流量で注入する。カラムを３分間洗浄する。
０〜５５％アセトニトリルの勾配を用いて５０分間にわ
たり画分を溶離する。３７分間の保持時間の後に溶出す
る第一成分は、ホスホリパーゼＡ活性のない純粋なトリ
グラミンを含む。精製された物質の均一性は銀添加物
（１μｇ）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって確認される。トリグラミンは、２０％ゲ
ル上で、約９ｋｄの見かけ分子量の単一バンドとして現
れる。

このＨＰＬＣで精製されたトリグラミンのアミノ酸配列
は、この物質をピリジルエチル化してシステイン残基を
Ｓ−ピリジルエチルシステイン（エドマン分解中に安定
なシステイン誘導体）に転化した後に決定される。その
ままのＳ−ピリジルエチルトリグラミンをＮＨｚ−末端
配列決定処理に付すが、これは３５個の明瞭な残基を生
じる。さらに、キモトリプシン、トリプシン及びスタフ
イロコッカス・オウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プ
ロテアーゼによるＳ−ピリジルエチルトリグラミンの慎
重な蛋白質加水分解によって配列決定を行い、さらに個
々に分離された解裂断片の配列決定を行う。このように
して、トリグラミンの７２個のアミノ酸残基についての
完全な配列が得られた。

トリグラミンは、ＧＰIIｂ−ＧＰIIIａ複合体と会合し
た血小板上のフィブリノーゲン受容体（この受容体はＡ
ＤＰによって露出する）に対するフィブリノーゲンの結
合を特異的にかつ競争的に抑制することによって血小板
の凝集を抑制する。さらに、トリグラミンは、フィブリ
ノーゲンと一緒になって血小板を凝集させ又は表面に粘
着させるホンウイルブランド因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅ
ｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）の結合を抑制する。本発明
者の実験は、トリグラミンがＧＰIIｂ−ＧＰIIIａ複合
体に特異的に結合すること並びにトリグラミンが該複合
体と会合した受容体に対するフィブリノーゲン及びホン
ウイルブランド因子の結合を競争的に妨げることを立証
するものである。

血小板に対するフィブリノーゲンの結合のトリグラミン
による抑制 下記の実験は、トリグラミンが血小板に対するフィブリ
ノーゲンの結合を抑制できることを例示する。マスター
ド（Ｍｕｓｔａｒｄ）氏らの方法（ブリティシュ・ジヤ
ーナル・オブ・ヘマトロジー（Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍ
ａｔ．２２、ｐ．１９３〜２０４（１９７２））に従っ
て、洗浄されたヒト血小板懸濁液を調製し、これを３．
５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（シグマ、フラクシ
ョンＶ）を含有するチロイドのアルブミン溶液（ｐＨ
７．３５）に懸濁させた。この血小板懸濁液（約５×１
０^８個の血小板／ｍｌ）４２０μｌに¹²⁵Ｉ−フィブリ
ノーゲン１０μｌを添加した。この懸濁液にある一定量
のトリグラミンを添加し、次いで３分後にＡＤＰ１０μ
ｌを添加した（最後濃度１０μモル）。ＡＤＰを添加し
た後、血小板懸濁液をさらに約１０分間ゆっくりと振盪
し、インキューベートした。次いで、この血小板懸濁液
の４００μｌをエッペンドルフ遠心機において１５，０
００Ｇでシリコーンオイルを通して遠心分離した。血小
板球に結合した¹²⁵Ｉ−フィブリノーゲンの量を測定し
た。フィブリノーゲンの非特異的結合を６ｍＭ ＥＤＴ
Ａの存在下で測定した。これによりフィブリノーゲンの
結合のＩＣ₅₀、即ち５０％抑制率を決定した。

第１図は、トリグラミンの不存在下（〇−〇）又は存在
下（０．５μｇ／ｍｌ、□−□；１．０μｇ／ｍｌ、▲
−▲）での、１０μモルＡＤＰにより刺激されたヒト血
小板に対する¹²⁵Ｉ−フィブリノーゲンの結合の二重逆
数プロットである。

第１図に示すように、トリグラミンは、ＡＤＰ（１０μ
モル）で刺激された血小板に対する¹²⁵Ｉ−フィブリノ
ーゲンの結合を濃度に依存する形で２．８〜５．６×１
０^-8ＭのＩＣ₅₀でもって抑制した。このデータは、２×
１０^-8Ｍの抑制定数Ｋｉでもってトリグラミンの競争的
抑制機構と一致する。

また、トリグラミンは、α−キモトリプシンで処理した
血小板に対する¹²⁵Ｉ−フィブリノーゲンの結合を１．
１×１０^-8ＭのＩＣ₅₀でもって抑制することが認めら
れ、したがって露出したフィブリノーゲン受容体に対す
る直接的効果を示している（データは示さない）。減少
した量（２×１０^-6Ｍ）のトリグラミンはＡＤＰで刺激
された血小板に対する¹²⁵Ｉ−フィブリノーゲンの結合
を抑制しなかった（データは示さない）。

単離された血小板懸濁液液中での血小板凝集のトリグラ
ミンによる抑制 下記の実験は、ＡＤＰで刺激された血小板及びキモトリ
プシンで処理した血小板の血小板凝集の抑制にトリグラ
ミンが有効であることを立証する。血小板懸濁液を前記
のように調製した。α−キモトリプシン（シグマ、等級
ＩＳ）で処理した血小板は、コルネスキー（Ｋｏｒｎｅ
ｃｋｉ）氏らにより、ジヤーナル・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８、ｐ．９
３４９〜９３５６（１９８３））に記載のように調製し
た。ただし、この場合の血小板とキモトリプシンとのイ
ンキュベーション時間は４５分から２０分に短縮した。

種々の薬量のトリグラミン（０．２５〜５．０μｇ／ｍ
ｌ）を血小板懸濁液（３×１０^８個の血小板／ｍｌ）４
２０μｌに添加した。１分間後に１０μｌのＡＤＰ（１
０μモル）及び１０μｌのフィブリノーゲン（２００μ
ｇ）を添加して血小板の凝集を開始させた。また、キモ
トリプシンで処理した血小板の凝集を誘発させるためフ
ィブリノーゲンのみ（ＡＤＰは用いない）を用いる上記
と同じ操作を行った。それぞれの系における血小板凝集
の程度をボーン（Ｂｏｒｎ）氏らによりジャーナル・オ
ブ・フィジオロジー（Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｏｎ
ｄ．））１６８、ｐ．１７８〜１９５（１９６３）に記
載の濁度測定法によって３７℃で測定した。ＡＤＰで刺
激された血小板の凝集のトリグラミンによる抑制のＩＣ
₅₀値 は１．３×１０^-7Ｍであった。キモトリプシンで
処理した血小板のトリブラミンによる抑制のＩＣ₅₀値は
２．８×１０^-8Ｍであった。データを第２図に示す。第
２図は、ＡＤＰで刺激された血小板（△−△）又はキモ
トリプシン（ＣＴ）で処理した血小板（〇−〇）のフィ
ブリノーゲンで誘発された血小板凝集に対するトリグラ
ミンの濃度に依存する抑制効果をプロットしたものであ
る。２００μｇ／ｍｌのフィブリノーゲン及び１０μモ
ルのＡＤＰを使用した、各データの点は、少なくとも５
回の実験の平均を表す。

キモトリプシンで処理した血小板は表面上に露出したフ
ィブリノーゲン受容体を有するのでそれらがフィブリノ
ーゲンと直接相互作用することが知られている。特定の
理論にしばられることを欲しないが、キモトリプシンで
処理した血小板のフィブリノーゲンで誘発された凝集に
対するトリグラミンの抑制効果は、トリグラミンが血小
板膜上のフィブリノーゲン受容体と直接相互作用するこ
とを示している。

また、トリグラミンは、安定なプロスタグランジンエン
ドペルオキシド類似体である９，１１ジデオキシ−９，
１１−メタノエポキシ−ＰＧＦｚ−α（２．５μモル）
及びトロンビン（０．５ユニット／ｍｌ）により誘発さ
れる血小板凝集を濃度に依存する形で抑制した。

さらに、血小板に富む血漿中では、トリグラミンは、Ａ
ＤＰ（１０μモル）、エピネフリン（５０μモル）、
９，１１−ジデオキシ−９，１１−メタノエポキシ−Ｐ
ＧＦｚ−α（２．５μモル）及びアラキドン酸ナトリウ
ム（２００μモル）によりそれぞれ誘発される血小板凝
集を２〜４×１０^-7ＭのＩＣ₅₀でもって抑制した。

ヒト血小板に対する¹²⁵Ｉ−トリグラミンの結合と¹²⁵Ｉ
−フィブリノーゲンの結合との間にはいくつかの類似性
が存在する。両リガンドの結合は、ＥＤＴＡにより；Ｇ
ＰIIｂ−ＧＰIIIａ複合体と相互作用するモノクロナー
ル抗体（コラー（Ｃｏｌｌｅｒ）氏、ジャーナル・オブ
・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）７６、ｐ．１０１〜１０８（１９
８５）及びベンネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）氏ら、プロシ
ーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・オブ・ザ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ）８０、ｐ．２４１７〜
２４２１（１９８３））により；フィブリノーゲン分子
上の推定血小板結合個所を表わす合成ペプチドＡｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ガートナー（Ｇａｒｔｎｅ
ｒ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６０、ｐ．１１８
９１〜１１８９４（１９８５）及びプロー（Ｐｌｏｗ）
氏ら、同上Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８２、ｐ．８０５７〜８０６１（１９８
５））により；γ−鎖のＣ末端部分のチロシルペンタデ
カペプチド Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（クロツエヴィアク
（Ｋｌｏｃｚｅｗｉａｋ）氏ら、バイオケミストリー
（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２３、ｐ．１７６７〜１
７７４（１９８４））によりそれぞれ抑制される。トリ
グラミンもフィブリノーゲンもグランツマン氏血小板無
力症の患者の血小板に十分に結合することは認められな
かった。これらの患者はＧＰIIｂ−ＧＰIIIａ複合体が
不足している。フィブリノーゲンは休眠している血小板
に対しては結合せず、したがってＡＤＰによるか又は蛋
白質加水分解酵素処理による血小板の刺激がフィブリノ
ーゲン結合個所を露出させるための要件である。他方、
休眠している血小板、ＡＤＰで刺激された血小板及びキ
モトリプシンで処理した血小板上のトリグラミン結合個
所の数は類似しており、ＡＤＰによって露出したフィブ
リノーゲン結合個所の総数の５５０％にもなる。

ＡＤＰで刺激された血小板に対する¹²⁵Ｉ−トリグラミ
ンの結合親和性は、解離定数に基づいて判断すると、Ａ
ＤＰで刺激された血小板に対する¹²⁵Ｉ−フィブリノー
ゲンの結合親和性よりもほぼ１５倍大きい。したがっ
て、モノクロナール抗体及び合成ペプチドの双方とも、
血小板に対するフィブリノーゲンの結合をＡＤＰで刺激
された血小板に対するトリグラミンの結合よりも有効に
抑制することが認められた。ＡＤＰで刺激された血小板
に対するトリグラミンの結合親和性はモノクロナール抗
体の結合親和性と類似している。それは血小板に対する
合成ペプチドの結合親和性よりも数倍大きい。

また、本発明者は、１０^-8Ｍの濃度でのトリグラミンが
トロンビンで刺激されたヒト血小板に対する高度に精製
されたホンウィルブランド因子の結合を特異的に妨げる
ことを立証した。第５図は、トロンビン（０．５Ｕ／ｍ
ｌ）で刺激された血小板に対する¹²⁵Ｉ−ホンウィルブ
ランド因子の結合に及ぼすトリグラミンの効果を示す。
第５図は、トロンビン（０．５Ｕ／ｍｌ）で活性化され
た血小板（〇−〇）及びリストセチン（０．７５ｍｇ／
ｍｌ）で誘発された血小板（□−□）に対する¹²⁵Ｉ−
ホンウィルブランド因子（ＶＷＦ）の結合のトリグラミ
ンによる抑制率をプロットしたものである。ホンウィル
ブランド因子の最終濃度は５μｇ／ｍｌであった。ホン
ウィルブランド因子の全特異的結合量は対照例試料にお
いて３８０±５５ｎｇ／１０^８血小板であった。これに
対して、トリグラミンは、リストセチン（０．７５ｍｇ
／ｍｌ）で刺激された血小板に対するホンウィルブラン
ド因子の結合を妨げない（対照例、７５４±１４０ｎｇ
／１０^８血小板）。ホンウィルブランド因子がトロンビ
ンで刺激された血小板上のＧＰIIｂ−ＧＰIIIａ複合体
及びリストセチンで刺激された血小板上のＧＰＩｂに対
して結合することは周知である。したがって、本発明者
は、トリグラミンがＧＰＩｂに対するホンウィルブラン
ド因子の結合を妨げないものと結論する。

特定の理論にしばられることを欲しないが、トリグラミ
ンはＧＰIIｂ−ＧＰIIIａ複合体におけるフィブリノー
ゲンの領分と同じ領分に結合し得るか、又はフィブリノ
ーゲン受容体の領分に極めて近接して結合し得る。

また、本発明者は、トリグラミンとＧＰIIIａ及びビト
ロネクチン受容体を含有する黒色腫細胞との間の相互作
用を確認した。トリグラミンは、フイブロネクチンで覆
われた基質に対する該細胞の付着を妨げ、細胞の拡がり
を抑制する。この試験では、０．２ｎモルのトリグラミ
ンの生物活性はペプチドであるグリシン−アルギニン−
グリシン−アスパラギン酸−セリン（ＧＲＧＤＳ）の１
００ｎモルに相当した。この確認は、マウスにおける黒
色細胞線の転移をＧＲＧＤＳにより抑止するためのハン
フリーズ（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ）氏らの成功した努力
（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３３、ｐ．４６７〜
４７０）に鑑みて興味がある。

血小板の凝集を抑制するため慣用されている方法は、血
小板の刺激を抑制することに頼っている。他方、トリグ
ラミンは、血小板の凝集を起させるフィブリノーゲンの
結合の直接的な競争的抑制剤として作用する。ＧＰIIｂ
−ＧＰIIIａ複合体に対するモノクロナール抗体は可能
性ある血小板凝集抑制剤であるが、モノクロナール抗体
は非常に大きい分子である。これらは一般に１８０ｋｄ
又はそれ以上の分子量を有する。このような分子、特に
ネズミに由来するモノクロナール抗体はヒトにおける免
疫原であることが知られている。

他方、トリグラミンは分子量が８ｋｄの比較的小さいポ
リペプチドである。したがって、トリグラミンは、モノ
クロナール抗体よりもはるかに免疫原性が少ないことが
期待される。さらに、ＧＰIIｂ−ＧＰIIIａ複合体に対
するフィブリノーゲンの結合を競争的に抑制させる際の
トリグラミンの作用は非常に特異的である。トリグラミ
ンは、免疫原性を伴なうことなくモノクロナール抗体の
特異的な領分及び高い結合親和性を持っている。

また、トリグラミンは、止血性血小板栓塞の形成の抑制
を望むいかなる状況においても投与することができる。

トリグラミンは循環系から迅速に除去されるものと思わ
れる。トリグラミンは、有効性持続時間が短い強力な血
液凝固防止剤が必要である状況において血小板凝集を抑
制するのに特に有用である。したがって、トリグラミン
は、動脈や臓器の取扱い並びに血小板と人工表面との相
互作用が血小板の凝集及び消耗を生じさせるような末梢
動脈の手術（動脈の接合）及び心臓血管手術において有
用であろう。凝集した血小板は血栓塞栓症を形成させる
恐れがある。トリグラミンはこれらの外科患者に対して
血小板の消耗を防ぐため投与することができる。

体外の血液循環は、血液に酸素を付与するために心臓血
管手術に日常的に使用されている。血小板は体外の循環
回路の表面に粘着する。この粘着は、血小板膜上のＧＰ
IIｂ／IIIａと循環回路の表面に吸着されたフィブリノ
ーゲンとの間の相互作用に左右される（グラスツコ（Ｇ
ｌｕｓｚｋｏ）氏ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・
フィジオロジー（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）２
５２、ｐ．Ｈ６１５〜６２１、１９８７）。人工表面か
ら離れた血小板は、そこなわれた止血機構を示す。トリ
グラミンはこのような粘着を防止するために投与するこ
とができる。

また、トリグラミンが、傷害の際の有効な止血に対して
重大である、血小板膜上の糖蛋白質Ｉｂとホンウィルブ
ランド因子との間の相互作用を妨げないことは有益であ
る。このために、そしてトリグラミンの止血効果が短時
間であるために、トリグラミンは外科患者における正常
な止血の再開を妨げない。正常な出血時間への迅速な復
帰はトリグラミン投与の停止とともに起る。

トリグラミンのその他の用途としては、血栓溶解療法を
中止した後の血小板血栓塞栓症の予防並びに冠状動脈及
びその他の動脈の血管形成術後の血小板血栓塞栓症の予
防が含まれよう。多くの臨床センターにおいてこれらの
処置を受けた患者は、トリグラミンと比較して弱い血小
板凝集抑制剤である抗血小板薬剤を既に投与されてい
る。

また、トリグラミンはある種の腫瘍細胞（例えば黒色
腫）及び転移の拡がりを予防するのに有用であり得る。
これは、トリグラミンが黒色腫細胞の付着及び拡がりを
抑止することが認められたためである。

トリグラミンは、これを血流中に相当な量で供給させる
簡便な手段のいずれによっても投与することができる。
好ましい投与経路としては今のところ静脈内投与が考慮
される。トリグラミンは水溶性であり、したがって溶液
状で有効に投与することができる。

トリグラミンは蛋白質加水分解に対して比較的安定であ
り、したがって経口投与も実施可能である。経口投与
は、適当なバインダー材料で賦形させたトリグラミンの
錠剤、カプセルなどの形態をとる。

トリグラミンのインビボでの作用効果を下記のハムスタ
ーでの研究によって立証する。

ハムスターでの研究 雌の黄色シリアンハムスター（体重９０〜１５０ｇ）を
随意に飼料及び水をとれるように維持した。ただし、ハ
ムスターをこの実験に使用する前は一夜断食させた。麻
酔剤（６５ｍｇ／ｋｇのナトリウムペントバルビター
ル、腹腔内）を投与した後、手術の用意のため毛をそっ
た。自然呼吸を容易にするため気管にポリエチレン（Ｐ
Ｅ−１００）チューブを差し込んだ。補足的な麻酔剤用
の並びに各種の制御剤及び実験用薬剤の投与用の静脈内
経路を作るため右の股静脈にカニュールの差し込みを行
った。また、動脈血圧を連続的にモニターするためカテ
ーテルを右の頚動脈に導入し、直腸温度プローブも挿入
した。動物体の温度は加熱用パッド及びランプによって
３７℃に維持した。

毛をそった下腹部を中央線に沿って切開することにより
開き、小腸の一部を外に出し、ルーサイト製目視台上に
垂れ下げた。露出した組織は、加温した（３７℃）哺乳
動物用リンゲル溶液を連続的に注ぎかけることによって
加温加湿状態に保持した。実験溶液を右の股静脈にハー
バードポンプにより０．１９９ｍｌ／ｍｉｎの流量で１
０分間注入した。小腸壁と腸間膜の接合部にある動脈管
（外径１００〜２００μｍ）を、注入を開始してから４
分後に切断した。血液は、上記の注ぎかけ系によって流
し去り、廃液は目視台を取り囲む凹みから真空によって
除去した。出血はツアイス社製の解剖用顕微鏡（２０
Ｘ）により観察し、切断時から止血性栓塞の形成による
出血の停止までの出血時間を記録した。各動物はそれ自
身の対照例として使用し、そして出血時間は両者とも塩
水及び選定された実験用薬剤の注入中に決定した。反復
測定がその後の出血時間応答に影響しないことを保障す
るため、トリグラミンの代りに第二の塩水注入によって
６匹の動物を評価した。これらの２回の塩水注入の平均
出血時間の間には差異は見出されなかった。さらに４匹
の動物にトリグラミンを注入するとともに、それが全身
血圧に直接的な効果を及ぼすかどうか決定するために動
脈血圧を連続的にモニターした。さらに、絶対的対照例
とするために１匹のハムスターにＰＧＩｚ類似体（２ｎ
ｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）のイロプルロスト（Ｉｌｏｐｌｒｏ
ｓｔ）（ベンレックス・ラボラトリーズ社、シダー・ク
ノールズ．ＮＪ）を投与した。この動物では、出血は、
注入を完了してから約９分後までは止まらなかった。

連続的に注入されたトリグラミンは、３．０２分±０．
４３の対照例出血時間を基準として、薬量に依存する形
でハムスターの腸間膜の出血時間を著しく増大させた。
第３図を参照されたい。第３図は、ハムスターの腸間膜
損傷部からの出血時間に対するトリグラミンの連続注入
のインビボでの効果をプロットしたものである。また、
トリグラミン注入を停止させると出血時間が正常値のに
迅速に復帰した。第４図を参照されたい。第４図は、ト
リグラミン（８０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）の注入前、注入
中及び注入後のハムスターの腸間膜からの出血時間の棒
グラフである。

本発明者は、アオハブの毒液からトリグラミンを単離す
るのに成功した。前記した精製法に従ってその他のハブ
属（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ）から単離し得る蛋白質
であって、前記した分子と同一の又は実質的に同一のア
ミノ酸配列を有する蛋白質は本発明の範囲内に包含され
ることを理解されたい。

本発明に従ってトリグラミンを化学的均一性まで精製す
ることがこの分子のアミノ酸配列決定を可能にした。こ
の分子はまず第一に天然源であるアオハブの毒液から精
製されたが、トリグラミンは当業者に知られた遺伝子工
学技術によって製造できることも意図される。しかし
て、本明細書に開示したトリグラミンのアミノ酸配列に
基づいて、このアミノ酸配列に相当する合成遺伝子を有
利に製造し、この遺伝子を適当なクローニング中介物に
よって適当な宿主に導入することができる。また別法と
して、アオハブの毒液産生細胞から天然遺伝子を取得
し、次いで組換え及びクローニングを行なうことによっ
てトリグラミンを製造し得ることが意図される。したが
って、本発明の範囲は本明細書に開示したクロマトグラ
フフ操作に従うことによって単離されたトリグラミンに
限られないのみならず、遺伝子工学技術に従って製造し
得るトリグラミンをも包含することが理解される。

本発明は、その精神又は必須の特色から逸脱することな
く、その他の特別の形で具体化でき、したがって本発明
の範囲を示すものとして特許請求の範囲を参照すべきで
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、トリグラミンの不存在下（〇−〇）又は存在
下（０．５μｇ／ｍｌ、□−□；１．０μｇ／ｍｌ、▲
−▲）での、１０μモルＡＤＰにより刺激されたヒト血
小板に対する¹²⁵Ｉ−フィブリノーゲンの結合の二重逆
数プロットである。 第２図は、ＡＤＰで刺激された血小板（△−△）又はキ
モトリプシン（ＣＴ）で処理した血小板（〇−〇）のフ
ィブリノーゲンで誘発された血小板凝集に対するトリグ
ラミンの濃度に依存する抑制効果をプロットしたもので
ある。 第３図は、ハムスターの腸間膜損傷部からの出血時間に
対するトリグラミンの連続注入のインビボでの効果をプ
ロットしたものである。 第４図は、トリグラミン（８０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ）の
注入前、注入中及び注入後のハムスターの腸間膜からの
出血時間の棒グラフである。 第５図は、トロンビン（０．５Ｕ／ｍｌ）で活性化され
た血小板（〇−〇）及びリストセチン（０．７５ｍｇ／
ｍｌ）で誘発された血小板（□−□）に対する¹²⁵Ｉ−
ホンウィルブランド因子（ＶＷＦ）の結合のトリグラミ
ンによる抑制率をプロットしたものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン シィー ホルト 米国ペンシルベニア州 フィラデルフィア モアランド ストリート 323 (72)発明者 ハンナ ルカシーウィッツ ポーランド ワルシャワ 00―102 マル シャル コウスカ 111Ａ アパートメン ト 1008 (56)参考文献 Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．179（１）, 42−49（1988)

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のアミノ酸配列 ＥＡＧＥＤＣＤＣＧＳＰＡＮＰＣＣＤＡＡＴＣＫＬＩＰ
   ＧＡＱＣＧＥＧＬＣＣＤＱＣＳＦＩＥＥＧＴＶＣＲＩＡ
   ＲＧＤＤＬＤＤＹＣＮＧＲＳＡＧＣＰＲＮＰＦＨ を有する実質上純粋な化学的形態のポリペプチド。
2. 【請求項２】次式 ＥＡＧＥＤＣＤＣＧＳＰＡＮＰＣＣＤＡＡＴＣＫＬＩＰ
   ＧＡＱＣＧＥＧＬＣＣＤＱＣＳＦＩＥＥＧＴＶＣＲＩＡ
   ＲＧＤＤＬＤＤＹＣＮＧＲＳＡＧＣＰＲＮＰＦＨ のポリペプチドからなり、ホスホリパーゼＡ汚染物を含
   まない、ヒト血小板のフィブリノーゲンで誘発される凝
   集を抑制するための製剤。
3. 【請求項３】ポリペプチドが実質上純粋な化学的形態に
   ある請求項２記載の製剤。