JPH01250755A - 免疫分析試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 （産業上の利用分野） 本発明は試料中に存在する特定の抗原または抗体を定量
分析するための免疫分析試薬に関する。

（従来の技術） 試料中に存在する特定の抗原又は抗体の定量分析には、
例えばラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと記す）が
用いられる。しかし、　ＲＩＡでは放射性元素を用いる
ため、専用の機器を設置し、資格を有するオペレータが
操作を行なわなければならず、しかも廃棄物の処理等に
も注意を要するという問題がある。

また、その他の分析方法として５例えばラテックス凝集
法が知られている。しかし、ラテックス凝集法では測定
に長時間を要するうえ、感度が低く、被検物質がごく微
量しか含まれていない場合には適用することができない
という問題がある。

そこで、本発明者らは先に特願昭５８−２２４５０９号
において、内部に親水性の標識物質を封入し１表面に抗
体もしくは抗体の一部又は抗原を固定化して担持したリ
ボソームを用いた免疫分析試薬を開示した。この試薬を
用いた免疫分析方法は以下のようなものである。すなわ
ち、抗原又は抗体が存在する試料中に上記リボソームを
加え、これと別に補体を加えると、抗原−抗体反応及び
それに伴なう補体の作用によってリボソームが破壊され
、封入されていた標識物質（例えば蛍光物質）が流出す
る。この流出した４Ｆｌ識物質の量と試料中の被検物質
の量との間には相関関係があるので、流出した標識物質
を所定の分析方法（例えば蛍光分析）によって定量する
ことにより、被検物質を定量することができる。

ところで、一種類のリボソームで測定できる被検物質の
濃度範囲は、例えば１〜１０’　ｎｇ／　ｍＱのように
通常３桁程度である。しかしながら、α−フェトプロテ
ィン（以下、ＡＦＰと略す）のような腫瘍マーカーでは
、１〜１０’ｎｇ／ａＱの濃度範囲があり、高濃度検体
を測定する場合、その被検物質を測定可能範囲にあわせ
て適宜希釈してから測定している。また、ラテックス凝
集法等では高濃度においてプロゾーン現象を起し、見か
け上、低濃度を示すという問題もある。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記問題点を解決するためになされたものであ
り、測定濃度範囲の広い免疫分析試薬を提供することを
目的とする。

〔発明の構成〕

（課題を解決するための手段と作用） 本発明の免疫分析試薬は、被検物質に対して測定感度の
異なる２種類以上のリボソームを混合して用いることを
特徴とする。

本発明に用いるリボソームは５例えば以下のような方法
により製造することができる。

まず、所望の脂質と架橋剤を溶媒中で反応させることに
より、脂質分子に官能基を導入して官能性脂質とする。

この官能基がリボソーム上における抗体もしくは抗体の
一部又は抗原を固定化するための官能基として作用する
。次に、得られた官能性脂質と、必要であればコレステ
ロール及び他の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を
加えて溶解・混合させた後、溶媒を吸引除去して乾燥す
る。この結果、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成される。

つづいて、フラスコ内に標識物質を含有する水溶液を加
え、密栓して振とうすることにより、リボソームの懸濁
液を調製する。

一方、リボソームに固定化される抗体もしくは抗体の一
部又は抗原には、必要ならば架橋剤との反応により架橋
基を導入した後、必要に応じて還元剤で処理して修飾す
る。

次いで、上記リボソーム懸濁液と抗体もしくは抗体の一
部又は抗原とを適当な緩衝液中で反応させて、リボソー
ムに抗体もしくは抗体の一部又は抗原を固定化して担持
させる。

このようにして製造されたリボソームを用いてなる免疫
分析試薬は、固定化条件を適当に選択することにより、
種々の測定感度、測定濃度範囲に調整することが可能で
ある。具体的には■感応性脂質の量を減らす、　■　リ
ボソームに抗体もしくは抗体の一部又は抗原を固定化担
持する際に、そのリボソーム量を増すあるいは固定化す
る物質量を減らす等相対的な量比をかえることにより結
果として担持量を制御する。■−度固定化後、システィ
ン処理等を用いた後処理により一部不活性化する、等が
場合に応じて用いられる。

本発明において、リボソームに固定化用官能基を導入す
るために脂質分子との反応が行なわれる架橋剤、また必
要に応じて抗体もしくは抗体の一部又は抗原に架橋基を
導入するための架橋剤としては、例えばＮ−サクシンイ
ミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、Ｎ−サクシンイミジル４−（Ｐ−マレイミド
フェニル）ブチリ−ト（ＳＭＰＢ）、Ｎ−サクシンイミ
ジル４−（Ｐ−マレイミドフェニル）アセテート（ＳＭ
ＰＡ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）サクシン
イミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイル
オキシ）サクシンイミド（ＥＭＣ５）、　ジサクシンイ
ミジルスベレート（ＯＳＳ）、グルタルアルデヒド（Ｇ
Ａ）、フタルアルデヒド、テレフタルアルデヒド、フタ
ル酸、テレフタル酸、次式 ％式％） で表わされる脂肪族ジカルボン酸等が挙げられる。

こうして得られた免疫分析試薬は、以下のようにして使
用される。すなわち、まず被検物質を含有する被検試料
に本発明の免疫分析試薬を加え、これと別に補体を加え
る。この結果、被検物質とリボソーム上に固定化された
抗体もしくは抗体の一部又は抗原との抗原−抗体反応及
びそれに件なう補体の作用により、リボソームが破壊さ
れ、封入されている標識物質が流出する６そして、流出
した標識物質の量を光学的な手段などによって測定する
ことにより、被検物質を定量する。

この際、被検物質に対する第２抗体を加え、被検物質を
挟みこむ方法（サンドイッチイムノアッセイ）を用いて
もよい、この場合、予め緩衝液中にリボソーム試薬のほ
かに第２抗体を含有させて免疫分析試薬を調製しておき
、これを試料に加え。

更に補体を加えて、流出した標識物質の測定に基づいて
被検物質を定量する。また、予め緩衝液中にリボソーム
試薬のほかに第２抗体及び補体を含有させて免疫分析試
薬を調製しておき、これを試料に加え、流出した標識物
質の測定に基づいて被検物質を定量してもよい、ここで
、リボソーム上に固定化される抗体としてはモノクロー
ナル抗体が用いられるが、第２抗体はモノクローナル抗
体でもポリクローナル抗体でもよい。

本発明による免疫分析試薬を用いた定量分析においては
、予め測定感度・測定濃度範囲の異なるリボソームを調
製し、これを適当な割合に混合し、被検物質の測定に適
した濃度範囲を持つリボソーム試薬とする。一方、この
リボソームを含む免疫分析試薬と既知濃度の被検物質と
を反応させて検量線を作成しておき、これをもとにして
同一条件で免疫分析試薬と未知の濃度の被検物質との反
応により流出した標識物質を測定することにより定量分
析を行なう。

（実施例） 以下、本発明の詳細な説明する。

実施例１　　ヒトＡＦＰの測定 本実施例において用いた試薬のうち、ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミ
トイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）。

コレステロール及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）はシ
グマ社製のものを用いた。また、Ｎ−サクシンイミジル
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ
）及びセファデックスＧ−２５フアインはファルマシア
社製のものを用いた。他の試薬は市販品（特級）を精製
せずに使用した。なお、水は全てイオン交換水を用いた
。

■　官能性リン脂質：　ＤＰＰＥ−ジチオピリジルプロ
ピオン酸アミド（Ｄｒ’ＰＥ　−ＤＴＰ）の調製密栓付
三角フラスコにＤＰＰＥ　７０■を分取し。

クロロホルム／メタノール（５：１）混合溶媒２５−に
溶解した。次に、トリエチルアミン６０μｅ及び５ＰＤ
Ｐ　５０■を添加し、窒素置換した後、室温で１時間反
応させてジチオピリジルプロピオン酸アミド（ＤＴＰ）
を導入した。つづいて、ロータリーエバポレータにより
溶媒を除去した。

次いで、乾燥物をクロロホルム／メタノール（１０：　
ｌ）混合溶媒に溶解した後、シリカゲルカラムを用いて
精製し、　　ＤＰＰＥ−ＤＴＰの分画を回収した。更に
、ロータリーエバポレータにより約５ｍＱまで濃縮した
。ＤＰＰ［Ｅ　−ＤＴＰの収率は８０〜９５％であった
。これを窒素封入下−２０℃で保存した。

この反応により　ＤＰＰＥに導入されたジチオピリジル
基が固定化用官能基となる。

■　リボソームの調製 使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（２／１）混合溶媒に溶解した。

５　ｍＭ（Ｄ　ＤＰＰＣ２００ｔｔ　１．１ｏＩｌ１Ｍ
ノコレスチロール１００μ２及び１ｍＭのＤＰＰＥ−Ｄ
ＴＰ　（■で得られた官能性リン脂質）５０μｉを１０
ａｌｌ容量のナシ型フラスコに入れ、更にクロロホルム
２ｍＪｌを加えてよく混合した０次に、約４０℃の水ｍ
中でロータリーエバポレータにより溶媒を除去した。再
びクロロホルム２ａｌｌを加えて充分に撹拌した後、再
度ロータリーエバポレータにより溶媒を除去した。この
操作を数回繰り返すと、フラスコ壁面に均一な脂質薄膜
が形成された。つづいて、フラスコをデシケータ中に移
して真空ポンプで約１時間吸引し、溶媒を完全に除去し
た。

次いで、０．２Ｍのカルボキシフルオレセイン（イース
トマン・コダック社製、ＰＨ７，４，浸透圧２８０鳳Ｏ
ｓ＋ａ　：以下ＣＦと記す）　１００μＡを添加し、フ
ラスコ内部を窒素で置換した後、密栓して約６０℃の水
浴中に約１分間浸漬した。つづいて。

Ｖｏｒｔｅｘミキサーを用い、フラスコ壁面の脂質薄膜
が完全に消失するまでフラスコを激しく振とうした。こ
の操作によりリボソーム懸濁液が調製された。更に、リ
ボソーム懸濁液に０．０１Ｍの１１ＥＰＥＳ緩衝液（０
，８５％ＮａＣＱ含有、ｐＨ７，４５：以下、ＨＢＳと
記す）を少量添加した後、全て遠心チューブに移し、４
℃において２７０００Ｘｇで２０分間遠心する操作を数
回繰り返した。最後にｌｄの１１ＢＳに懸濁させた。

■　抗ヒトＡＦＰ抗体の修飾 １ｗ：／ｍＱの抗ヒトＡＦＰ抗体２　ｍＱ　ｔｔ　ＣＨ
Ｂｓ障呻瑣ｉと１０ｍＭの５ｐｏｐエタノール溶液１０
μＱを添加して窒素置換した後、室温で３０分間反応さ
せ、抗ヒトＡＦＰ抗体にジチオピリジル基を導入した。

次に、予め０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｏ、ｇｓ％ＮａＣ４含
有、ｐＨ４，５）で平衡化したセファデックスＧ−２５
フアインカラム（ゲル体積約１５ｄｌ）を用いたゲルろ
過により未反応の５ＰＤＰを除去して精製し、タンパク
質分画のみを回収した。

次いで、この分画にジチオトレイトール（以下、ＤＴＴ
と略す）約２０■を加え、窒素置換後、室温で２０分間
反応させ、ジチオピリジル基をＳＨ基と置換して修飾し
た。つづいて、　　ＨＢＳで平衡化したセファデックス
Ｇ−２５フアインカラムを用いたゲルろ過によりＤＴＴ
を除去して精製し、タンパク質分画のみを回収した。

■　抗ヒトＡＦＰ抗体固定化リボソームの調製■で得ら
れたリボソーム懸濁液１ｄを４℃において２７０００Ｘ
　ｇで２０分間遠心したリボソーム沈査と、■で得られ
た０、８■タンパク質／ｍＱの修飾された抗ヒトＡＦＰ
抗体溶液２−とを混合し。

窒素置換した後、密栓して２０℃でゆっくり振とうしな
がら１晩反応させた。次に、）ＩＢＳで遠心洗浄して未
反応の抗体を除去した。

更に、２７０００ｘｇで２０分間遠心したリボソーム沈
査の重量を測定し、１重量％濃度になるようにＱＶＢ−
で希釈した。そして、０．０５％濃度となるようにアジ
化ナトリウムを添加し、４℃で保存した。こうして得ら
れたリボソームをリポソ、−ム■とする。

■　免疫分析試薬によるヒトＡＦＰ濃度の検量線作成遊
離のウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体を第２抗体として用いたサ
ンドイッチアッセイにより、以下のようにしてヒトＡＦ
Ｐ′ａ度を定量し、検量線を作成した。

１〜１０’ｎｇ／ｍＱの範囲で濃度を変化させたヒトＡ
ＦＰ　１０１２ニ、ＧＶＢ”　（ＧＶＢ−に０．５ｍＭ
のＭｇＣＭ、水溶液及び０．１５ｍＭのＣａＣＱ２水溶
液を含有したもの）で１０倍希釈してリボソームの濃度
を０．１重量％とじた免疫分析試薬１０μｅを添加し、
３７℃において１０分間保持した。

次に、予めＱＶＢ＋テ０．１ｗ／　ｍｌ　トナルＪｌ：
　ウニ希釈したウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体（Ｄａｋｏ社製
）２５μｅを添加し、３７℃において５分間保持した。

つづいて、　ＧＶＢ＋で希釈した補体〔モルモット血清
）（５ＣＨ，。）２５μ悲を添加し、３７℃において３
０分間反応させて、被検物質に対応した量のＣＦを流出
させた１次いで、０．ＯＩＭのＥＤＴＡ−ベロナール緩
衝液１００μａでこの反応を停止させ、各濃度のヒトＡ
ＦＰ溶液について、流出したｌＩＦ量をＭＴＰ−３２蛍
光分光計（コロナ電気製）により。

励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍの条件で測定
し、た。

この測定に基づいて、抗体固定化リボソームの補体に対
するバックグラウンドを除去するために、次式により相
対蛍光強度を測定した。

Ｆａ−Ｆ 相対蛍光強度＝７「〒ニー　Ｘ　１００　（％）ここで
、Ｆｅ：実測した蛍光強度、Ｆｏ：抗原を除いた時（リ
ボソームが補体及び第２抗体と共存している時）の蛍光
強度、Ｆａ：脱イオン水を添加しリボソームを全て破壊
した時の蛍光強度。

である。

なお、上記のように試薬の濃度を０．１重量％とした場
合、　リボソームを１００％破壊したときのＣＦ濃度（
蛍光強度から換算）は、５　Ｘ　１０−’河であった。

上記のようにしてヒトＡＦＰ濃度と相対蛍光強度との関
係を示す検量線を得た。これを第１図に示す。

第１図で示した特性のうち１曲線Ａで示したのが・リボ
ソーム■よりなる免疫分析試薬を用いた場合の検量線で
ある。また修飾抗体の濃度を１／１０に低下させた以外
上記の方法と全く同一にして得たリボソーム■よりなる
免疫分析試薬を用いた場合の検量線を曲線Ｂで示してい
る。さらに、これらの測定感度・測定濃度範囲の異なる
二種類のリボソーム１．ＩＩを以下の第１表に示す割合
で混合して用いてなる免疫分析試薬による検量線を、そ
れぞれ曲線Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆとして第１図に示した。

第１表 この結果から、■（６０％）＋■（４０％）の曲線りで
示した場合が、最も広い測定濃度範囲を有することがわ
かる。このように、被検物質に対するＨ１９定感度及び
測定濃度範囲が異なるリボソームを混合することで、よ
り広い濃度範囲の測定が可能になる。

実施例２ モノクローナル抗ヒトフェリチン抗体を実施例１と同様
にし、さらに１／２０に修飾抗体濃度を低下させたもの
を用いて、各々担持量の異なる３種類の抗固定化リボソ
ームｍ、　■、ｖを得た。そして実施例１と同様に、種
々の割合でこれらのリボソームを混合して用いた結果、
これらｎｒ、　■、　ｖのリボソームをそれぞれｍ：Ｉ
Ｖ：Ｖ＝＝６：３：１の割合で混合してなる免疫分析試
薬を用いた場合に１０−１〜１０”ｎｇ／ａＱの範囲で
ヒトフェリチンの測定が可能であった。

〔発明の効果〕

以上、詳述したように、本発明の免疫分析試薬を用いる
ことにより、広範囲の濃度にわたり正確な被検物質の定
量ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例におけるヒトＡＦＰの測定結
果を示した検量線図である。 代理人　弁理士　　則　近　憲　佑 同　　松山光之 ｔ＝ｔ−ＡＦＰ　　　　（ｎｌ／−ｄ２）第１図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質及び糖脂質のうち少くとも一方を組成の
   一部とし、表面に抗体もしくは抗体の一部あるいは抗原
   を担持し内部に水溶性の標識物質を封入したリボソーム
   と補体とからなる免疫分析試薬において、測定対象物質
   に対する感度の異なるリボソームを２種類以上混合した
   ことを特徴とする免疫分析試薬。