JPH01257488A - ２’，３’−ジデオキシヌクレオシドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） ２’、　３’−ジデオキシアデノシン（９−β−Ｄ−（
２＃、３／−ジブオキシリがフラノシル）アデニン）、
２′，３′−ジデオキシイノシン（９−β−Ｄ　−（２
′，３′−ジブオキシリが７ラノシル）ヒポキサンチン
）、２１　、３／−ジグオキジグ７ノシン（９−β−〇
−（２′，３′−ジブオキシリがフラノシル）グアニン
）又は２′，３′−ジデオキシチミジン（９−β−Ｄ−
（２′、３／−ジデオキシリ？フラノシル）チミン）咎
の２／、３　／−ジデオキシヌクレオシドは強い抗ウィ
ルス作用を有しておシ、医薬特に最近世界的に問題とな
っているエイズ（ＡＩＤＳ）の治療薬としての利用が期
待されている。

本発明は微生物を利用し２２′，３′−ジデオキシヌク
レオシド１、特に、　２′，３′−ジデオキシアデノシ
ン、２′，３′−ジデオキシイノシン　２′，３′−ジ
デオキシグアノシン及び２′，３／−ジデオキシチミジ
ンの製造方法に関するものである。

（従来の技術） 従来の２７．３　／−ジデオキシヌクレオシドの製造方
法としてはＣｈ＠ｍ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　２
２　、１２８（１９７４）に知られているようにヌクレ
オシド類の２′位あるい、は３′位の脱酸素反応が行わ
れているが、反応に先立ち保護基を導入しなければなら
ないこと、２′位、３′位紘立体障害が大きく反応が起
きにくいこと、ヌクレオシドが過激な条件下では不安定
な為過激な反応条件や反応剤を用いることができない等
の理由によシ報告例社極めて少なく、また工業的に満足
する方法はいまだ確立されていない・ま危機生物を利用
する製造方法に関しては全く知られていない・ （発明が解決しようとする問題点） 従来の化学的方法はいずれも反応工程が長く、ｔた収車
が低いため、高収率で効率よ＜　２′，３′−ジデオキ
シヌクレオシドを製造する方法の開発が望まれている。

（問題を解決すゐための手段） 本発明者はこのような目的を達成するべく鋭意検討の結
果、化学合成法で安定、安価に供給される２′，３′−
ジデオキシウリジン又は２．３−ジブオキシリが−ニー
１−リン酸を基質に用いることＫよシ、２′，３′−ジ
デオキシヌクレオシドを酵素的に効率よく生産できるこ
とを見い出し、この知見に基ずいて本発明を完成するに
至りた。

本発明を簡単ＩＩｃ記すと以下の通シである。

２′，３′−ジデオキシチミジン） 即ち本発明は■２，３−ジデオキシリが一スー１−リン
酸と塩基に微生物を作用させて２′，３′−ジデオキシ
ヌクレオシドを製造する方法及び■２’、３′−ジデオ
キシウリジンと無機リン酸若しくはその塩と塩基に微生
物を作用させて直接２／、３７−ジデオキシヌクレオシ
ドを製造する方法である。

本発明を更によシ正確に記すと、■２．３−ジデオキシ
リ？−スー１−リン酸とアデニン、ヒポキサンチン、グ
アニン又はチミンに微生物を作用させて２′，３′−ジ
デオキシアデノシン、２′，３′−ジデオキシイノシン
　２′，３′−ジデオキシグアノシン又は２′，３′−
ジデオキシチミジンを生成せしめる方法、■２′，３′
−ジデオキシウリジンと無機リン酸若しくはその塩とア
デニン、ヒポキサンチン、グアニ／又はチミンに微生物
を作用させて直接２′，３′−ジデオキシアデノシン、
２′，３′−ジデオキシイノシン、２′，３′−ジデオ
キシグアノシン又は２′，３′−ジデオキシチミジンを
生成せしめる方法である。

もちろん、本発明には、２′，３′−ジデオキシウリジ
ンと無機リン酸又はその塩に微生物を作用させて目的と
する２′，３′−ジデオキシヌクレオシドの前駆吻質で
ある２、３−ジデオキシリボース−１−リン酸を生成せ
しめる方法も含む。

本発明に使用される微生物は２′，３′−ジデオキシク
リジンとリン酸を２．３−ジブオキシリが一スー１−リ
ン酸に変換する酵素と２．３−ジデオキシリ？−スー１
−リン酸と７デニン、ヒポキサンチン、グアニン又はチ
ミンを２′，３′−ジデオキシイノシン、２′，３′−
ジデオキシイノシン、２′，３′−ジデオキシグアノシ
ン又は２１．３７−ジデオキシチミジンに変換する酵素
の両方の活性を有しているので、これらの方法には同一
の微生物を用いることができる。

これらの方法に使用される微生物はエシェリヒア属、フ
ラＩバクテリクム属、セラチア属、エンテロＩ４フタ−
属、エルピニア属、シトロバクタ−属、コリネバクテリ
ウム属、ハフニア属、クルイヘラ属、サル七ネラ属、又
はキサントモナス属に属し、このような微生物の例とし
て エシェリヒア　コリ　　　　ＡＴＣＣ１０７９８（Ｅｓ
ｅｈ＠ｒｌａｈｌａ　ｃｏｉｌ）フラゲパクテリウム　
レナヌム　　　　　ＦＥＲＭ　ＢＰ−１８６２（Ｆ１ａ
ｖｏｂａｃｔ＠ｒｉｕｍ　ｒｋ＠ｎａｎｕｍ）上２チア
　ルペ７アシエンス　　　　　　ＦＥＢＭ　ＢＰ−１８
６３（Ｓ＠ｒｒａｔｉａ　　ｒｕｂ＠ｆａｃｌ＠ｎｍ）
エンテロバクタ−エアロゲ°ネス　　　　ＡＴＣＣ１３
０４８（Ｅｎｔ＠ｒｏｈａｅｔ＠ｒ　　ａｅｒｏｇ＊ｍ
ｓ　）エルビニア　カロトが？　　　　　　　　　ＦＥ
ＢＭ　ＢＰ−１５３８（Ｅｒｖｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏ
ｖｏｒａ　）シトロバクタ−フロインデイ　　　　　Ａ
ＴＣＣ８０９０（Ｃ１ｔｒｏｂａｅｔ＠ｒ　ｆｒ＠ｕｎ
ｄＩｉ　）コリネバクテリウム　ビタルメン　　　　Ａ
ＴＣＣ１０２３４（Ｃｏｒｙｎ＠ｂａｅｔ＠ｒｌｕｍ　
ｖｉ　ｔａｒｕｎｎｎ　）ハフニア　アルベイ　　　　
　　　　　　ＡＴＣＣ９７６０（Ｈａｆｎｌａ　ａｌｖ
＊ｌ　） クルイヘラ　シトロバクタ　　　　　　　ＦＥＢＭ　Ｐ
−３１４９（Ｋｌｕｙｖ＠ｒａ　ｃｉｔｒＯｐｈｌｌｍ
）サルモネラ　シ、ットムエレリＡＴＣＣ８７５９（８
ｍ１ｍｏｍｌｌａ　　ｍｅｈｏｔｔｍｕ・ｌｌ＠ｒ１　
）キサントモナス　シトリ　　　　　　　　ＦＩＲＭ　
ＢＰ−１８６１（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｍ　　ｅｉｔｒ
ｉ　）を挙げることができゐ。

これらの微生物な用いて目的とする２／、３１−ジデオ
キシヌクレオシド又はその中間体である２、３−ジブオ
キシリが一スー１−リン酸を生成せしめる方法は、微生
物の培養中に基質を添加する培養法を用いても良いし、
また培養した菌体あるいはこの処理物を基質に作用させ
る酵素法を用いても良い。

培養法を用いる場合には、炭素源、窒素源、Ｐ。

８、Ｆ・ｅ　Ｍｌｌ等の無機イオン、更に必要ならばビ
タミン等の微量栄養素または蛋白分解物、酵母エキスの
ような有機窒素源を含有する通常の培地を基本Ｋ　して
、例えば２．３−ジデオキシリボース−１−リン酸を生
成する場合にはこの基本培地に２′，３′−ジデオキシ
ウリジンとリン酸またはその塩を添加すれによい。

また、２．３−ジデオキシリボース−１−リン酸から、
例えば２′，３′−ジデオキシアデノシン、２′，３′
−ジデオキシイノシン％　２’ｔ３’−ジデオキシグア
ノシン又は２／、３′−ジデオキシチミジンを生産する
場合には、上記基本培地Ｋ　２．３−　ｙデオキシリカ
ース−１−９ン酸トアデ二ノ、とＩキサンチン、グアニ
ン又はチミンを適宜添加すればよい。

更に、２′，３′−ジデオキシウリジンから２′，３／
−ジデオキシアデノシン　２′，３′−ジデオキシイノ
シン、２′，３′−ジブオキシダアノシン又は２′，３
′−ジデオキシチきシンを直接生産する場合には、上記
基本培地Ｋ　２′，３′−ジデオキシウリジンとリン酸
若しくはその塩とアデニン、ヒＩキサンチン、グアニン
又はチミンを添加した培地を用いて培養すればよい。

上記基質の添加は培養初期でも培養途中でも構わない１
、 酵素法を用いる場合の酵素源としては、炭素源、窒素源
、Ｐ％Ｂ、Ｆ＠、Ｍｕ等の無機イオン、更に必要ならば
ビタミン等の微量栄養素また社蛋白分解物、酵母エキス
のような有機ｉｌｌ素上含有する通常の培地で培養した
培養液、洗浄菌体が使用できる他に、菌体処理物も使用
できる。菌体処理物としては、アセトン乾燥菌体、菌体
の磨砕物、菌体の超音波処理物、界面活性剤あるいはト
ルエン尋の処理菌体、リゾチーム等の酵素処理菌体、菌
体より抽出し次後、塩析等によ〕分離した菌体の蛋白区
分、本反応の酵素活性を有する蛋白区分の精製物、更に
本菌体および菌体処理物の固定化物等いずれもが使用で
きる。

基質として使用する２′，３′−ジデオキシウリジンあ
るい社２．３−ジデオキシリが一スー１−リン酸の濃度
は１−１０００　ｍＭａ度が適当でＴｏシ、リン＠ま光
はその塩の濃度は中間体の２，３−ジブオキシリが−ク
ー１−リン識生成の場合には２／　、ａ　／−ジデオキ
シウリジンと等モルあるいは等セル以上加えるのがよく
、１−１０倍セル程度、更に２′，３′−ジデオキシヌ
クレオシド生成の場合には反応系でリン酸がリサイクル
できるので２．３−　ｙデオキシリ？−クー１−リン酸
生成の場合よシ少なくでき、０．０１−１０倍〜ル程度
が適当である。無機リン酸の塩は反応の進行を大きく阻
害しないものであればいずれを用いても良く、例えばナ
トリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム
塩、マグネシウム塩等の無機塩、さらＫａ）リメチルア
ンモニウム塩＠０有機塩が用いられる。

２／、３＃−ジデオキシクリジンから２′，３／−ジデ
オキシアデノシン　２′，３′−ジデオキシイノシン、
２′，３′−ジデオキシイノシンｍは２′，３′−ジデ
オキシチミジンを直接生産する場合でも、２．３−ジブ
オキシリが一スー１−リン酸から目的とする２１．３＃
−ジデオキシイノシン ２／、３′−ジブオキシダアノシン又は２′，３′−ジ
デオキシチミジンを生産する場合も、塩基であるアデニ
ン、とホキサンチン、グアニン又はチミンの添加量は２
′，３′−ジデオキシウリジン又は２，３−ジブオキシ
リが一スー１−リン酸と等セルあるいはそれ以上が適当
で１通常１−１０倍モル程度が適当である。

直接生産させる場合において、基質の２′，３／−ジデ
オキシクリジンが反応液に残っても良い場合には、これ
らアデニン、ヒーキサンテン、グアニン又はチミンの添
加量は２′，３／−ジデオキシクリジンの等モル以下で
も良い。

尚、２．３−ジブオキシリが一スー１−リン酸ハ市販の
製品を用いてもよいし、また化学合成法によシ製造した
ものを用いてもよく、更に、本発明で開示されたように
、２′，３′−ジデオキシウリジンよシ微生物の作用で
生産後、採取されたものを用いてもよい。

さて、これらを含む水溶液に前記菌体、ま九はその処理
物を加゛え、−を４−１Ｏの範囲に調製し九後、２Ｏ−
７０℃、望ましくは４０−１０℃で静置あるいは攪はん
しながら１０分−１０日間保持すると反応が進行し、反
応液中に目的とする２′，３′−ジデオキシアデノシン
等Ｏ２′，３′−ジデオキシヌクレオシド又は中間体の
２，３−ジデオキシリボース−１−リン酸が著量蓄積さ
れる。

反応液よ、９２′，３′−ジデオキシアデノシン等の２
７、ａ　／−ジデオキシヌクレオシド又は中間体の２，
３−ジブオキシリが一スー１−リン酸を採取する方法は
、水等の溶媒に対する溶解度差を利用したシ、イオン変
換樹脂中吸着樹脂を用いる方法で行うことができる。ｉ
たこれら生成物の定量線高速液体りロマトグラツィーを
用いる方法で行なえばよい。

以下、実施例に従りて、本発明を更に詳細に説明する。

実施例　１ 酵母エキス０．５１７ｄｉ、ペプトン１．０ｉ／ｄｌ。

肉エキス１．０１／ｄｌおよびＮａＣｔＯ，５１／ｄｌ
　を含む培地（ｐＨ′，０）５０＋ｔ／を５０〇−容肩
付フラスコに分注し殺菌した。この培地に、ブイヨン寒
天培地にて３０℃、１６時間前培養し次第１表に示す微
生物を１白金耳ずつ接種し、３０℃にて１６時間振とり
培養した。得られた培養液よシ菌体を遠心分離により分
離した後、０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ′，０）
で洗浄し、更に遠心分離することにより洗浄菌体を調製
した。

上記洗浄菌体を２０　ｍＭの２，３−ジデオ中シ＋７　
、％−−スー１−リン酸と２０　ｍＭアデニン、おるい
は２０ｆｆ１Ｍの２，３−ジグオキシリメース−１−リ
ン酸と２０ｍＭのヒボキサンチンあるいは２０　ｍＭの
２．３−ジブオキシリが一スー１−リン酸と２０　ｍＭ
のグアニンを含む０．０５Ｍ）リスバッファー（ｐＨ′
，２）１０ｄＫ５チになるように添加し、６０℃、２４
時間反応させ次。

各反応液中に生成し次２′，３′−ジデオキシアデノシ
ン、２′，３′−ジデオキシイノシンおよび２′，３′
−ジデオキシグアノシンの濃度全高速液体クロマトグラ
フィーを用いて測定した。

実施例　２ 実施例１と同様に培養、調製した、第２表に示す微生物
の洗浄菌体を２０ｍＭの２′，３′−ジデオキシウリジ
ンを含む１００ｍＭのリン酸バッファー（Ｐ）（′，０
）１０１ＥＺＫ５％になるように添加し、６０℃、２４
時間反応させた。各反応液中に生成した２、３−ジデオ
キシリが−ニー１−リン酸の濃度を高速液体クロマトグ
ラフィーを用いて測定した・結果を第２表に示す。

実施例　３ 実施例１と同様に培養し、実施例１と同様に調製した第
３１！Ｉに示す微生物の洗浄菌体を２０ｍＭの！、３′
−ジデオキシクリジンと２０ｍＭのアデニン、あるいは
２０ｍＭＯ２′，３′−ジデオキシウリジンと２０ａＪ
ｉｆのとＩキサンチンあるいは２０　ｍＭ　ＯＺ′，３
′　−ジデオキシクリジンと２０ｍＭのグアニンを含む
１００ｍＭのリン酸バッフブーＣＦＨ′，０）１（ｌｊ
に５９１になるように添加し、６０℃、２４時間反応さ
せ九、各反応液中に生成したτ、３′−ジデオキシヌク
レオシドを実施例１と同様の方法で測定し。

その結果を第３表に示し九〇 実施例　４ 実施例１と同様の培地を用いて実施例１と同様の方法で
３７℃、１６時間培養したエシェリヒアコリＡＴＣＣ１
０７９８の培養液に、予め殺菌した２００ｍＭ　（０２
’、　３’−ジデオキシウリジンと２００−のヒポキサ
ンチンを含む５００ｍＭのリン酸バッファー５ｉ１ｉ添
加し更に１０時間培養を続けた。この培養液中に生成し
次！、３′−ジデオキシイノシンを実施例１の方法と同
様に定量した結果、３６１Ｍ；ｌ／ｄｔのジデオキシイ
ノシンが生成してい友。

実施例　５ 実施例１と同様に培養し、実施例１と同様に調製したエ
シェリヒアコリＡＴＣＣ−１０７９８の洗浄菌体ｆ：１
００ｍＭのτ、３′−ジデオキシクリジンと１００ｍＭ
のアデニンを含む１０ｍＭのリン酸バッファー（ｐｌ（
′，０）１０−に２−になる様に添加し、第４表に示す
温度で２４時間反応させた。各反応液中に生成した１、
３′−ジデオキシヌクレオシドを実施例１と同様の方法
で測定し、その結果を第４表に示した。

第　　４　　表 実施例　６ 実施例１と同様に培養し、実施例１と同様に調製したエ
シェリヒアコリＡＴＣＣ１０７９８の洗浄菌体を５０ｍ
Ｍのτ、３′−ジデオキシウリジンと５０ｍＭのチミン
を含む２５　ｍＭのリン酸／クツファー（ＰＨ′，０）
５１に２１になる様に添加し、５０℃の温度で２４時間
反応させた６反応中に生成した２′，３′−ジデオキシ
チミジンを実施例１と同様の方法で測定し次結果、１２
２■／ｄｉ生成していたことが確聞でき九− （効　果） 本発明の方法は従来の化学合成法に比較して、反応が簡
単でしかも目的とする２′，３′−ジデオキシアデノシ
ン、τ、３′−ジデオキシイノシンおよびτ、３゛−ジ
デオキシグアノシンを高収率で製造できる優れた方法で
ちる。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）エシェリヒア属、フラボバクテリウム属、セラチ
   ア属、エンテロバクター属、エルビニア属、シトロバク
   ター属、コリネバクテリウム属、ハフニア属、クルイヘ
   ラ属、サルモネラ属又はキサントモナス属に属し、２，
   ３−ジデオキシリボース−１−リン酸及び塩基から２′
   ，３′−ジデオキシヌクレオシドを生成する能力を有す
   る微生物を水性溶媒中で２，３−ジデオキシリボース−
   １−リン酸及び塩基に作用せしめることを特徴とする２
   ′，３′−ジデオキシヌクレオシドの製造方法。
2. （２）塩基がアデニンで２′，３′−ジデオキシヌクレ
   オシドが２′，３′−ジデオキシアデノシンであること
   を特徴とする請求項（１）記載の製造方法。
3. （３）塩基がヒポキサンチンで２′，３′−ジデオキシ
   ヌクレオシドが２′，３′−ジデオキシイノシンである
   ことを特徴とする請求項（１）記載の製造方法。
4. （４）塩基がグアニンで２′，３′−ジデオキシヌクレ
   オシドが２′，３′−ジデオキシグアノシンであること
   を特徴とする請求項（１）記載の製造方法。
5. （５）塩基がチミンで、２′，３′−ジデオキシヌクレ
   オシドが２′，３′−ジデオキシチミジンであることを
   特徴とする請求項（１）記載の製造方法。
6. （６）２，３−ジデオキシリボース−１−リン酸がエシ
   ェリヒア属、フラボバクテリウム属、セラチア属、エン
   テロバクター属、エルビニア属、シトロバクター属、コ
   リネバクテリウム属、ハフニア属、クルイヘラ属、サル
   モネラ属、又はキサントモナス属に属し、 （イ）２′，３′−ジデオキシウリジン及び（ロ）無機
   リン酸又はその塩とから２，３−ジデオキシリボース−
   １−リン酸を生成する能力を有する微生物を水性溶媒中
   で （イ）２′，３′−ジデオキシウリジン及び（ロ）無機
   リン酸又はその塩に作用せしめることにより生産された
   ものである請求項（１）記載の製造方法。
7. （７）エシェリヒア属、フラボバクテリウム属、セラチ
   ア属、エンテロバクター属、エルビニア属、シトロバク
   ター属、コリネバクテリウム属、ハフニア属、クルイヘ
   ラ属、サルモネラ属、又はキサントモナス属に属し、 （イ）２′，３′−ジデオキシウリジン、 （ロ）無機リン酸又はその塩、 及び（ハ）塩基、とから ２′，３′−ジデオキシヌクレオシドを生成する能力を
   有する微生物を水性溶媒中で （イ）２′，３′−ジデオキシウリジン、 （ロ）無機リン酸又はその塩、 及び（ハ）塩基に作用せしめることを特徴とする２′，
   ３′−ジデオキシヌクレオシドの製造方法。
8. （８）塩基がアデニンで２′，３′−ジデオキシヌクレ
   オシドが２′，３′−ジデオキシアデノシンであること
   を特徴とする請求項（７）記載の製造方法。
9. （９）塩基がヒポキサンチンで２′，３′−ジデオキシ
   ヌクレオシドが２′，３′−ジデオキシイノシンである
   ことを特徴とする請求項（７）記載の製造方法。
10. （１０）塩基がグアニンで２′，３′−ジデオキシヌク
    レオシドが２′，３′−ジデオキシグアノシンであるこ
    とを特徴とする請求項（７）記載の製造方法。
11. （１１）塩基がチミンで２′，３′−ジデオキシヌクレ
    オシドが２′，３′−ジデオキシチミジンであることを
    特徴とする請求項（７）記載の製造方法。