JPH0376594A - ジデオキシヌクレオシド誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） ６−フルオロプリン−２′，３’−ジデオキシリボシド
は強力な抗ウィルス作用を有している為、医薬、特に最
近世界的に問題となっているエイズ（ＡＩＤＳ）の治療
薬としての利用が期待されている。

本発明は微生物を利用した６−フルオロプリン−２′，
３’−ジデオキシリボシドの製造方法に関するものであ
る。

（従来の技術） ６−フルオロプリンリボシドの製造方法はＪ、Ｏｒｇ、
Ｃｈｅｍ、　、　３４．１３９６　（１９６９）により
公知となっているが、収率が極めて低く工業的に満足す
る方法ではない。

一方微生物を利用した２′，３’−ジデオキシヌクレオ
シドの製造方法は、Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、。

ｎ、　４１９（１９８９）で公知となっている。しかし
、６−フルオロプリン−２′，３’−ジデオキシリボシ
ドの製造方法は化学合成法及び微生物を利用する方法と
もに全（知られていない。

（発明が解決しようとする課題） 高収率で効率よく６−フルオロプリン−２′３′−ジデ
オキシリボシドを製造する方法が望まれてｌハゐ。

（課題を解決するための手段） 本発明は上記課題を達成するべく鋭意検討の結果、化学
合成法により安定、安価に供給される２Ｔ、３Ｊ−ジデ
オキシヌクレオシド又は２．３−ジデオキシリボース−
１−リン酸を基質に用いて、微生物を作用させるこεに
点り、６−フルオロプリン−２′，３’−ジデオキシリ
ボシドを効率よく生産できることを見い出し、この知見
に基づいて本発明を完成するに至った。

本発明を簡単に記すと以下の通りである。

核酸塩基 ６−フルオロプリン ６−フルオロブリン シド ２’１３”’−−ジデオキシリボ 即ち本発明は ■　２．３−ジデオキシリボース−１−リン酸と６−フ
ルオロプリンに微生物を作用させて６−フルオロプリン
−２′，３’−ジデオキシリボシドを製造する方法、及
び ■２′，３’−ジデオキシヌクレオシドと無機リン酸又
はその塩と６−フルオロプリンに微生物を作用させて直
接６−フルオロプリン−２′，３’ジデオキシリボシド
を製造する方法に関する。

もちろん、本発明には、２′，３’−ジデオキシヌクレ
オシドと無機リン酸又はその塩に微生物を作用させて、
目的とする６−フルオロプリン−２′，３’−ジデオキ
シリボシドの中間体である２、３−ジデオキシリボース
−１−リン酸を生成せしめる方法、も含まれる。

本発明に使用される微生物は２′，３’−ジデオキシヌ
クレオシドと無機リン酸又はその塩を２．３−ジデオキ
シリボース−ニーリン酸に変換する酵素、並びに２，３
−ジデオキシリボース−１−リン酸と６−フルオロプリ
ンを６−フルオロプリン−２′，３’−ジデオキシリボ
シドに変換する酵素の両方の活性を有しているので、こ
れらの方法には同一の微生物を用いることができる。

これらの方法に使用される微生物は、エシェリヒア属、
フラボバクテリウム属、セラチア属、エンテロバクタ−
属、エルビニア属、シトロバクタ−属、コリネバクテリ
ウム属、ハフニア属、クルイヘラ属、サルモネラ属、及
びキサントモナス属のいずれかに属する。このような微
生物として、例えば、 を挙げることができる。

これらの微生物を用いて目的とする６−フルオロプリン
−２′，３’−ジデオキシリボシド、又はその中間体で
ある２、３−ジデオキシリボース−１−リン酸を生成せ
しめる方法は、微生物の培養中に基質を添加する培養法
を用いても良いし、また培養した菌体あるいはこの処理
物を基質に作用させる酵素法を用いても良い。

培養法を用いる場合には、炭素源、窒素源、Ｐ、Ｓ　ｓ
　Ｆｅｓ　Ｍｎ等の無機イオン、更に必要ならばビタミ
ン等の微量栄養素又は蛋白分解物、酵母エキスのような
有機窒素源を含有する通常の培地を基本とする。例えば
、中間体である２、３−ジデオキシリボース−■−リン
酸を生成する場合には、この基本培地に２′，３’−ジ
デオキシヌクレオシドと無機リン酸又はその塩を適宜添
加すればよい。

そして、２，３−ジデオキシリボース−１−リン酸から
目的とする６−フルオロプリン−２′，３’−ジデオキ
シリボシドを生産するに際し、上記基本培地に２，３−
ジデオキシリボース−１−リン酸と６−フルオロプリン
を適宜添加すればよい。

更に、２′，３’−ジデオキシヌクレオシドから６−フ
ルオロプリン−２′，３’−ジデオキシリボシドを直接
生産する場合には、上記基本培地に２′，３’−ジデオ
キシヌクレオシドと無機リン酸又はその塩と６−フルオ
ロプリンを添加した培地を用いて培養すればよい。

上記基質の添加は培養初期でも培養途中でも構わない。

酵素法を用いる場合の酵素源としては、炭素源、窒素源
、Ｐ％　Ｓｓ　Ｆｅ、、Ｍｎ等の無機イオン、更に必要
ならばビタもン等の微量栄養素又は蛋白分解物、酵母エ
キスのような有機窒素源を含有する通常の培地で培養し
た培養液、洗浄菌体が使用できる他に、菌体処理物も使
用できる。菌体処理物としては、アセトン乾燥菌体、菌
体の磨砕物、菌体の超音波処理物、界面活性剤あるいは
トルエン等の処理菌体、リゾチーム等の酵素処理菌体、
菌体より抽出した後に塩析等により分離した菌体の蛋白
画分、本反応の酵素活性を有する蛋白画分の精製物、更
に本菌体および菌体処理物の固定化物等いずれもが使用
できる。

本発明において基質となる前述の２′，３’−ジデオキ
シヌクレオシドは、特に限定されるものではなく、２′
，３’−ジデオキシウリジン、２′３′−ジデオキシア
デノシン、２′，３’−ジデオキシイノシン、２′，３
’−ジデオキシグアノシン、２’１３′−ジデオキシチ
ミジン等、又はこれらの混合物が用いられる。また、同
様に基質さなる２゜３−ジデオキシリボース−１−リン
酸は、市販製品を用いてもよく、また、本発明で開示し
たように、２′，３’−ジデオキシヌクレオシＦから微
生物の作用により生産後、採取されたものを用いてもよ
い。また６−フルオロプリンについては一般的塩基であ
る已ポキザンチンから既知の化学合成法（Ｊ、Ａｍ、Ｃ
ｈｅｍ、Ｓｏｅ、、　出、６０７３（１９５４）、Ｊ、
Ｃｈｅ＋ｍ、５ｏｃ１（Ｃ）　、　３９４２　（１９７
１）により容易に合成するここができる。

２′，３’−ジデオキシヌクレオシドあるいは２゜３−
・ジデオキシリボース−■・−リン酸の濃度は１１００
０ｍＭ程度が適当である。更に、無機リン酸又はその塩
の濃度は中間体の２，３−ジデオキシリボース−１−リ
ン酸生成の場合には２’＋３゛−ジデオキシヌクレオシ
ドと等モルあるいは等モル以上加えるのがよ（，１−１
０倍モル程度、更に６フルオロプリンー２′，３’−ジ
デオキシリボシド生成の場合には反め系でリン酸がリサ
イクルできるので２，３−ジデオ牛シリボースー１−リ
ン酸生戒の場合より少量でよく、０．０１−１０倍モル
程度が適当であゐ。無機リン酸の塩は反応の進行を大き
く阻書しないものであればいずれを用いても良く、例え
ばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシ
ウム塩、マグネシウム塩等の無機塩、さらにはトリメチ
ルアンモニウム塩等の有機塩が用いられる。

また、２　’　、３　’−ジデオキシヌクレオシドから
６−フルオロプリン−２′，３’−ジデオキシリボシド
を直接生産する場合、２．３−ジデオキシリポ−４−１
−ＩＪン酸カら目的とする６−フルオロフ。

リン−２′，３’−ジデオキシリボシドを生産する場合
のいずれにおいても、６−フルオロプリンの添加量は２
′，３’−ジデオキシヌクレオシド又は２．３−ジデオ
キシリボース−１−リン酸と等モルあるいはそれ以上が
適当であり、通常１−１０倍モル程度が適当である。

直接生産させる場合において、基質である２′３′−ジ
デオキシヌクレオシドが反応液に残ってもよい場合には
、６−フルオロプリンの添加量ば２′，３’−ジデオキ
シヌクレオシドの等モル以下でも良い。

さて、これらを含む水溶液に前記菌体、又はその処理物
を加え、ｐＨを４−１０の範囲に調製した後、２０−７
０℃、望ましくば４０−７０　”Ｃで静置あるいは攬は
んしながら１０分−１ｏ日間保持すると反烏が進行し、
反め液中に目的とする６−フルオロプリン−２′，３’
−ジデオキシリボシド又は中間体の２．３−ジデオキシ
リボース−１−リン酸が著量蓄積される。

反烏液より６−フルオロプリン−２′，３’−ジデオキ
シリボシド又は中間体の２．３−ジデオキシリボース−
１−リン酸を採取する方法は、水等の溶媒に対する溶解
度差を利用したり、イオン変換樹脂や吸着樹脂を用いる
方法で行うことができる。

またこれら生成物の定量は高速液体クロマトグラフィー
を用いる方法で行えばよい。

以下、実施例に基づいて、本発明を更に詳細に説明する
。

（実施例） 実施例１ 酵母エキス０．５　ｇ　／　ｄｉ、ペプトン１．０ｇ、
／７、肉エキス１．０ｇ／ｄｉおよびＮａＣ１４０゜５
ｇ／ｄ１を含む培地（ｐＨ７，０）　５０−を５００−
容肩付フラスコに分注し殺菌した。この培地に、ブイヨ
ン寒天培地にて３０℃、１６時間前培養した第１表に示
す微生物を１白金耳ずつ接種し、３０℃にて１６時時間
上う培養した。得られた培養液より菌体を遠心分離によ
り分離した後、０．０５　Ｍリン酸バッファー＜ｐ）Ｊ
７．０）で洗浄し、更に遠心分離することにより洗浄菌
体を調製した。

上記洗浄菌体を、２（ｌａＭの２．３−ジデオキシリボ
ース−１−リン酸と２０ｍＭ６−フルオロプリンを含む
０．０５Ｍ）リスバッファー（ｐＨ７，２）　　１０−
に５％になるように添加し、５０℃、２４時間反応させ
た。

反応液中に生成した６−フルオロプリン−２′３′−ジ
デオキシリボシドの濃度を高速クロマトグラフィーを用
いて測定し、その結果を第１表に示した。

実施例２ 実施例１と同様の方法により培養及び調製した第２表に
示す微生物の洗浄菌体を、２０−の２′３′−ジデオキ
シウリジン、２′，３’−ジデオキシアデノシン、２′
、３′−ジデオキシイノシン、２′，３’−ジデオキシ
グアノシン、又は２′，３’−ジデオキシチミジンのそ
れぞれと２０ｍＭの６−フルオロプリンを含む１００＋
ｗＭのリン酸バッファー　（ｐＨ７，０）　　１０　ｔ
ａｌに５％になるように添加し、５０℃、２４時間反応
させた。各反応液中に生成した６−フルオロプリン−２
’　、３　’−ジデオキシリボシドを実施例１と同様の
方法で測定し、その結果を第２表に示した。

実施例３ 実施例１と同様の方法により培養及び調製した第３表に
示す微生物の洗浄菌体を、各々２０ｄの２′，３’−ジ
デオキシウリジン、２′，３’−ジデオキシアデノシン
、２′，３’−ジデオキシイノシン　２ｒ、３ｔ−ジデ
オキシグアノシン、又は２′３′−ジデオキシチミジン
を含む１００ｎ＋Ｈのリン酸バフファー（ｐＨ７゜０）
１０ｍ／に５％になるように添加し、５０℃、２４時間
反応させた。各反応液中に生成した２、３−ジデオキシ
リボース−１−リン酸の濃度を高速液体クロマトグラフ
ィーを用いて測定し、その結果を第３表に示した。

実施例４ 実施例１と同様の方法により培養及び調製したエシェリ
ヒアコリＡＴＣＣ１０７９８の洗浄菌体を、１００１の
２′，３’−ジデオキシウリジンと１００ｍＭの６−フ
ルオロプリンを含む１０１ｍＭのリン酸バッフｙ　−（
ｐＨ７，０）　　１０　ｍｌに２％になるように添加し
、第４表に示す各一定温度条件下で２４時間反応させた
。各反応液中に生成した６−フルオロプリン−２′，３
’−ジデオキシリボシドを実施例１と同様の方法で測定
し、その結果を第４表に示した。

第　　　４　　　表 実施例５ 実施例１と同様の培地を用いて実施例１と同様の方法で
３７℃、１６時間培養したエシェリヒアコリＡＴＣＣ１
０７９８の培養液に、予め殺菌した２００Ｉｌ１Ｍの２
′，３’−ジデオキシウリジンと２００ｍＭの６−フル
オロプリンを含む５００ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ
７，０）５　ｍｌを添加し、更に１０時間培養を続けた
。この培養液中に生成した６−フルオロプリン−２′，
３’−ジデオキシリボシドを実施例１と同様の方法で定
量した結果、２）ｎ＋ｇ／ｄＪの６−フルオロプリン−
２′，３’−ジデオキシリボシドが生成した。

（発明の効果） 本発明によれば、従来製造方法が公知でなかった６−フ
ルオロプリン−２′，３’−ジデオキシリボシドを微生
物を用いた簡便な方法でしかも高収率で製造できること
から、強力な抗ウィルス作用を有する６−フルオロプリ
ン−２′，３’−ジデオキシリボシドを、抗ウィルス剤
、特にエイズ（ＡＩＤＳ）の治療薬として用いる研究が
進展するものと期待される。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）エシェリヒア属、フラボバクテリウム属、セラチ
   ア属、エンテロバクター属、エルビニア属、シトロバク
   ター属、コリネバクテリウム属、ハフニア属、クルイヘ
   ラ属、サルモネラ属及びキサントモナス属のいずれかに
   属し、２，３−ジデオキシリボース−１−リン酸及び６
   −フルオロプリンから６−フルオロプリン−２′，３′
   −ジデオキシリボシドを生成する能力を有する微生物を
   、水性溶媒中で２，３−ジデオキシリボース−１−リン
   酸及び６−フルオロプリンに作用せしめることを特徴と
   する６−フルオロプリン−２′，３′−ジデオキシリボ
   シドの製造方法。
2. （２）２，３−ジデオキシリボース−１−リン酸が、エ
   シェリヒア属、フラボバクテリウム属、セラチア属、エ
   ンテロバクター属、エルビニア属、シトロバクター属、
   コリネバクテリウム属、ハフニア属、クルイヘラ属、サ
   ルモネラ属、及びキサントモナス属のいずれかに属し、 イ）２′，３′−ジデオキシヌクレオシド及びロ）無機
   リン酸又はその塩 とから２，３−ジデオキシリボース−１−リン酸を生成
   する能力を有する微生物を、水性溶媒中でイ）２′，３
   ′−ジデオキシヌクレオシド及びロ）無機リン酸又はそ
   の塩に作用せしめること により生産されたものである請求項（１）に記載の製造
   方法。
3. （３）２′，３′−ジデオキシヌクレオシドが２′，３
   ′−ジデオキシウリジンである請求項（２）に記載の製
   造方法。
4. （４）２′，３′−ジデオキシヌクレオシドが２′，３
   ′−ジデオキシアデノシンである請求項（２）に記載の
   製造方法。
5. （５）２′，３′−ジデオキシヌクレオシドが２′，３
   ′−ジデオキシイノシンである請求項（２）に記載の製
   造方法。
6. （６）２′，３′−ジデオキシヌクレオシドが２′，３
   ′−ジデオキシグアノシンである請求項（２）に記載の
   製造方法。
7. （７）２′，３′−ジデオキシヌクレオシドが２′，３
   ′−ジデオキシチミジンである請求項（２）に記載の製
   造方法。
8. （８）エシェリヒア属、フラボバクテリウム属、セラチ
   ア属、エンテロバクター属、エルビニア属、シトロバク
   ター属、コリネバクテリウム属、ハフニア属、クルイヘ
   ラ属、サルモネラ属、又はキサントモナス属に属し、 イ）２′，３′−ジデオキシヌクレオシド、ロ）無機リ
   ン酸又はその塩、及び ハ）６−フルオロプリン、とから ６−フルオロプリン−２′，３′−ジデオキシリボシド
   を生成する能力を有する微生物を、水性溶媒中で イ）２′，３′−ジデオキシヌクレオシド、ロ）無機リ
   ン酸又はその塩、及び ハ）６−フルオロプリンに作用せしめることを特徴とす
   る６−フルオロプリン−２′，３′−ジデオキシリボシ
   ドの製造方法。
9. （９）２′，３′−ジデオキシヌクレオシドが２′，３
   ′−ジデオキシウリジンである請求項（８）に記載の製
   造方法。
10. （１０）２′，３′−ジデオキシヌクレオシドが２′，
    ３′−ジデオキシアデノシンである請求項（８）に記載
    の製造方法。
11. （１１）２′，３′−ジデオキシヌクレオシドが２′，
    ３′−ジデオキシイノシンである請求項（８）に記載の
    製造方法。
12. （１２）２′，３′−ジデオキシヌクレオシドが２′，
    ３′−ジデオキシグアノシンである請求項（８）に記載
    の製造方法。
13. （１３）２′，３′−ジデオキシヌクレオシドが２′，
    ３′−ジデオキシチミジンである請求項（８）に記載の
    製造方法。