JPH01275600A - アンチトロンビン−３の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、疎水性クロマトを利用したアンチトロンビン
−ＩＩＩの精製方法に関する。

［従来の技術］ アンチトロンビン−■は血漿中に存在するα２グロブリ
ンに属する糖蛋白質の一種で、その分子量は６５，００
０〜６８，０００であり、プロテアーゼ阻害活性を有し
、トロンビンの凝固活性を強く阻害する。

また、トロンビンに対する阻害作用のみならず、その他
の凝固因子、例えば、活性化Ｘ因子、活性化■因子など
に対する阻害作用をも有している。

その他、プラスミンやトリプシンに対す３阻害作用のあ
ることも報告されている。

これらの阻害作用は、一般にヘパリンの共存下でより速
やかに進行することが知られている。

このような薬理作用を有するアンチトロンビン−■は、
凝固異常亢進の補正、具体的には汎発性血管異常症（Ｄ
　Ｉ　Ｃ）を目的として用いられるものである。

［発明が解決しようとする課８］ ところで、アンチトロンビン−ＩＩＩの精製工程におい
て、パイロジエン又は夾雑蛋白の混在が危惧されており
、その除去方法が種々検討されている。

また、血漿蛋白成分に混在する可能性のある肝炎ウィル
ス等を不活性化するために行う６０℃、１０時間の液状
加熱処理により生成する熱変性蛋白の存在も新たな問題
となりつつある。最近、この熱変性蛋白を除去する方法
として、固定化ヘパリンを用いて再処理する方法が提案
されている（特開昭６３−２３８９６号公報）。しかし
、この方法はパイロジエンの除去等にはあまり有効でな
いことが判明している。

そこで本発明者らはこれらの事情に鑑み、種々研究を重
ねた結果、アンチトロンビン−■含有水溶液を疎水性ク
ロマト担体で処理することにより、所期の目的を達成し
、安全性により優れたアンチトロンビン−■製剤を調製
できることを見出し、本発明を完成した。

［課題を解決するための手段］ 本発明で使用されるアンチトロンビン−■は、ヒト由来
のもので、医薬として使用できる程度に精製されたもの
であれば特に制限されるものではなく、例えば、ヒトの
全血、血漿、血清または凝固した血液から圧搾された血
清等から精製することができる。

アンチトロンビン−■を調製するための出発原料として
は、例えば、血漿、コーンの冷エタノール法で得られる
画分■、ＩＶ−１、ＩＶ−４または■−１＋ＩＶ−４、
クエン酸含有血漿から血液凝固第■因子を回収した後の
残渣画分等が使用される。

アンチトロンビン−ＩＩＩの精製法としては、例えば、
特開昭４８−３５０１７号公報、特公昭５つ一７６９３
号公報に開示の方法が例示される。

また、アンチトロンビン−ＩＩＩの純度は特に限定され
ないが、−膜内には高度精製品の方が効果が大である。

アンチトロンビン−■含有水溶液の蛋白濃度としては、
０．１〜１０　（Ｗ／Ｖ）％程度が例示される。

また、アンチトロンビン−■含有水溶液は、本発明の疎
水性クロマト処理に付す前に加熱処理（５０〜７０℃、
５〜３０時間程度）を行っておくことが好ましい。

本発明で用いる疎水性基をリガンドとする不溶性担体は
以下のようなものである。

疎水性基としては、アルキル基（炭素数１〜１０程度、
好ましくは３〜５程度）、置換基を有していてもよいフ
ェニル基等が挙げられる。

不溶性担体としては、セルロース、アガロース、デキス
トラン、ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体、ポリ
ビニル系、ポリスチレン系等が挙げられる。

疎水性基をリガンドとする不溶性担体としては、アルキ
ル型セファロース（例えば、オクチル型セファロース等
）、フェニル型セファロース、アルキル型ポリビニル（
例えば、ブチル型ポリビニル等）等が市販されており、
これら以外のものについても市販品と同様な方法または
これに準する方法によって容易に製造することができる
。

本発明における精製工程は、一般にアンチトロンビン−
■含有水溶液を、疎水性基をリガンドとする不溶性担体
に接触させることにより行われるが、その方法としては
カラム法、バッチ法の何れにて行ってもよい。

接触条件は、ｐＨ６〜９程度、塩濃度１〜５Ｍ程度が例
示される。このような条件を具備する溶媒としては、３
Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７，５）　、２Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７゜５）等が例示される。

本発明の精製方法を具体的に説明すると、バッチ法にて
行う場合、上記条件に調整したアンチトロンビン−■含
有水溶液を、同じ条件で平衡化した当該疎水性クロマト
用担体に接触させる。その条件としては、該担体１ν！
に対して該水溶液１〜１００　ｉｆを用い、２〜２０℃
で３０分〜２時間程度混和させる方法が挙げられる。そ
の後に遠心分離にて上澄を回収する。

カラム法にて行う場合、上記条件に調整したアンチトロ
ンビン−■含有水溶液を、同じ条件で平衡化され且つカ
ラム充填された当該疎水性クロマト用担体にて展開し、
非吸着画分を回収する。

こうして得られたアンチトロンビン−■は、必要に応じ
て、さらに精製した後、公知の方法にて製剤化される。

［発明の効果］ 本発明の精製方法によれば、アンチトロンビン−■含有
水溶液に含まれるパイロジエン、夾雑蛋白、加熱処理に
より生成した熱変性蛋白等を効果的に除去することがで
き、安全性に優れたアンチトロンビン−■製剤を提供す
ることができる。

しかも、処理工程が簡便であり、大量製造にも好適な方
法であるので、工業的製法として極めて有用である。

［実施例］ 本発明をより詳細に説明するため実施例を挙げて説明す
るが、本発明はこれらによってなんら限定されるもので
はない。

実施例１ コーンの冷アルコール分画法で得られた画分■−１のペ
ースト１０ｋｇを生理食塩水１００ｇに懸濁し、硫酸バ
リウムを５（ν／Ｖ）％になるように加え、室温で３０
分間攪拌し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バリ
ウムに吸着させて除去した。

この上澄液をｐＨ６，５に調整し、ポリエチレンク＋）
　ニア　−ル＃　４．０００を１３　（Ｗ／Ｖ）％にな
るように加え、生じた沈澱を遠心分離して除き、さらに
ポ＋Ｊ　エチＬ／　ンク！Ｊ　：７−ル＃４．ＯＯＯヲ
３０　（Ｗ／Ｖ）％になるように加え、生じた沈澱を遠
心分離して回収した。この沈澱を冷生理食塩水約２ｆｌ
に溶解し、予め生理食塩水で調整されたヘパリンセファ
ロースのカラムに注入し、アンチトロンビン−■をカラ
ムに吸着させた。このカラムを０．４Ｍの塩化ナトリウ
ム溶液で洗浄して不純蛋白を除いた後、２．０Ｍの塩化
ナトリウム溶液をカラムに流して溶出してくる部分を回
収した。

このアンチトロンビン−ＩＩＩの水溶液にクエン酸ナト
リウムを０．６Ｍの濃度に加え、ｐＨ７，８に調整した
後、６０℃で１０時間の加熱処理を施した後、塩化ナト
リウム（最終濃度３Ｍ）及びクエン酸ナトリウム（最終
濃度２０　ｍ　Ｍ　）を添加し、ｐＨ７，５に調整した
。一方、３Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭクエン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したブチル型ポリ
ビニル系担体（ブチル−トヨパール６５０、東洋曹達■
製）にアンチトロンビン−■含有水溶液を接触させたの
ちに上記緩衝液で展開し、未吸着画分を回収した。

続いて、０．９％塩化ナトリウム溶液に対して一夜透析
を行いつつ濃縮してアンチトロンビン−ＩＩＩの１　（
Ｗ／Ｖ）％水溶液を得、必要に応じて、濾過又は遠心分
離を行って澄明な液とした。

このアンチトロンビン−ＩＩＩの１　（Ｗ／Ｖ）％水溶
液にマンニトール２　（Ｗ／Ｖ）％とクエン酸ナトリウ
ム０、　２（Ｗ／Ｖ）％を加え、塩化ナトリウムが０．
５％になるように少量の冷蒸留水希釈し、ＩＮの水酸化
ナトリウムでｐＨ７，６に調整した後、滅菌したミリポ
アフィルタ−で除菌濾過し、５００単位つづ分注し、凍
結乾燥を行って乾燥製剤とした。

実施例２ 画分ＩＶ−１ペーストの代わりに、画分■−１＋ＩＶ−
４を用いる以外は全て実施例１に準じて処理を行い、実
施例１と同様なアンチトロンビン−■製剤を得た。

実施例３ 画分ＩＶ−１ペーストの代わりに、クエン酸含有血漿を
低温で処理して血液凝固第■因子を回収した後の残渣画
分を用いる以外は全て実施例１に準じて処理を行い、実
施例１と同様なアンチトロンビン−■製剤を得た。

実験例１ （１）パイロジエンの除去 実施例１に準じて、疎水性クロマト処理を行い、その前
後のアンチトロンビン−■含有画分中のパイロジエンを
調べる試験を２回行った（各々第１サンプル及び第２サ
ンプルと称する）。なお、試験方法は日本薬局方収載の
発熱性物質試験法によった。その結果を第１表に示す。

第１表 上記第１表に示されるように、疎水性クロマト処理によ
り合計温度が低下し、パイロジエンが十分に除去されて
いることが判明した。

（２）夾雑蛋白の除去 （ω比活性 実施例１に準じて疎水性クロマト処理を行い、その前後
のアンチトロンビン−■含有画分中の総蛋白量及びアン
チトロンビン−■活性を測定し、比活性を算出した。総
蛋白量は２８０ｎＩｌｌの吸光度により測定した。また
、アンチトロンビン−■活性（ＡＴ−ＩＩＩ活性）はト
ロンビンと試料とを２８℃で５分間反応させ、これにフ
ィブリンを加えた時に凝固時間がどの程度延長されるか
を測定し、予め作製しておいた検量線よりその力価を算
出したものである。但し、１単位は正常人血漿Ｉ　Ｉｆ
中に含まれるアンチトロンビン−■量に相当する。

得られた結果を第２表に示す。

第２表 第２表に示されるように、疎水性クロマト処理により、
ＡＴ−ＩＩＩ活性及び比活性の上昇が認められ、特に比
活性は４．９（単位／　ｍｇ蛋白）から６゜４（単位／
　ｍｇ蛋白）となった。

山）夾雑血漿蛋白の除去 実施例１に準じて疎水性クロマト処理を行い、その前後
のアンチトロンビン−■含有画分中に夾雑する血漿蛋白
の有無をオフタロニー法により調べた。その結果を第３
表に示す。

第３表 （Ｃ）ゲル濾過 実施例１に準じて疎水性クロマト処理を行い、その゛前
後のアンチトロンビン−■含有画分をゲル濾過にかけ、
その溶出パターンを比較した。その結果を第１図に示す
。なお、ゲル濾過の条件は次のとおりである。

担　体：　ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ−ＸＬ　（東ソー
社゛製） 溶出液：０，２Ｍ塩化ナトリウム含有０，１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６，８） ′検出性：２８０ｒｖの吸光度 第１図に示されるように、処理前の両分は二峰性を示す
。このうち、高分子画分は加熱処理前の溶出パターンか
らみて、熱変性蛋白に基づくものと考えられる。疎水性
クロマト処理によりこの高分子画分は消失し、−峰性と
なることが判明した。

実験例２ アンチトロンビン−ＩＩＩの凍結乾燥製剤を注射用蒸溜
水に溶解し、５匹のマウスに４０．０００単位／ｋｇ゛
　相当量を尾静脈より投与して７日間観察を続けたが、
なんら異常は認められなかった。また、同じ溶解液を家
兎に５．０００単位／　ｋｇ投与して２４時間観察した
が、体温の異常は認められなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、疎水性クロマト処理の前後でのアンチトロン
ビン−■含有画分のゲル濾過溶出パターンを示す。 特許出願人　　株式会社　ミドリ十字 第１図 処　　理　　前　　　　　　　　処　　理　　後保持時
間（分）　　保持時間（分） 手　　続　　補　　正　　書（自発） 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １　事件の表示 昭和６３年　特　許願第１０５７８３号２　発明の名称 アンチトロンビン−ＩＩＩの精製方法 ３　補正をする者 （平成元年２月１３日住居表示変更） 名称　　株式会社　ミトリ十字 代表者須山忠和 ５　補正命令の日付（自発） ６　補正により増加する請求項の数 なし ８　補正の内容 （１）　　明細書第９頁第１５行の 「つづ」を「ずつ」に訂正する。 （２同書第１３頁第１５行の ｒ４０．０００Ｊをｒ４．０００　Ｊに訂正する。 以上

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）アンチトロンビン−III含有水溶液を、疎水性基
   をリガンドとする不溶性担体に接触させ、その未吸着画
   分を回収することを特徴とするアンチトロンビン−III
   の精製方法。
2. （２）接触条件が、ｐＨ６〜９、塩濃度１〜５Ｍである
   請求項（１）記載のアンチトロンビン−IIIの精製方法
   。
3. （３）疎水性基がアルキル基である請求項（１）記載の
   アンチトロンビン−IIIの精製方法。
4. （４）アンチトロンビン−IIIが加熱処理されたもので
   ある請求項（１）記載のアンチトロンビン−IIIの精製
   方法。