JPH024717A - アンチトロンビン−３製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−ＩＩ
Ｉを含有し、ウィルスが不活化され、夾雑物質を実質的
に含まないアンチトロンビン−■製剤に関する。

［従来の技術］ アンチトロンビン−■は血漿中に存在するα２グロブリ
ンに属する糖蛋白質の一種で、その分子量は６５，００
０〜６８．０００であり、プロテアーゼ阻害活性を有し
、トロンビンの凝固活性を強く阻害する。

また、トロンビンに対する阻害作用のみならず、その他
の凝固因子、例えば、活性化Ｘ因子、活性化■因子など
に対する阻害作用をも有している。

その他、プラスミンやトリプシンに対する阻害作用のあ
ることも報告されている。

これらの阻害作用は、一般にヘパリンの共存下でより速
やかに進行することが知られている。

このような薬理作用を有するアンチトロンビン−■は、
凝固異常亢進の補正、具体的には汎発性血管異常症（Ｄ
ＩＣ）を目的として用いら２れるものである。

［発明が解決しようとする課題］ ところで、アンチトロンビン−■の精製工程において、
パイロジエン又は夾雑蛋白の混在が危惧されており、そ
の除去方法が種々検討されている。

また、血漿蛋白成分に混在する可能性のある肝炎ウィル
ス等を不活化するために行う６０℃、１０時間の液状加
熱処理により生成する熱変性蛋白の存在も新たな問題と
なりつつある。最近、この熱変性蛋白を除去する方法と
して、固定化ヘパリンを用いて再処理する方法が提案さ
れている（特開昭６３−２３８９６号公報）。しかし、
この方法はパイロジエンの除去等にはあまり有効でない
ことが判明している。

そこで本発明者らはこれらの事情に鑑み、種々研究を重
ねた結果、ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−ＩＩ
Ｉを含有し、ウィルスが不活化され、夾雑物質を実質的
に含まないアンチトロンビン−■製剤を調製できること
を見出し、本発明を完成した。

［課題を解決するための手段］ 本発明のアンチトロンビン−■製剤は、以下の性質を有
する。

■ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−ＩＩＩを含有
する。

■ウィルスは不活化されている。

■夾雑物質を実質的に含まない。

夾雑物質としては、パイロジエン、熱変性蛋白、アンチ
トロンビン−■以外の血漿蛋白（例えば、セルロプラス
ミン、トランスフェリン、アルブミン、ハプトグロビン
、α２−マクログロブリン、α１−アンチトリブシン、
ＩｇＡＳ　ＩｇＧなど）等が挙げられる。

■アンチトロンビンー■の比活性は６〜７単位／ｍｇ蛋
白程度である。

本発明のアンチトロンビン−■製剤は、具体的には、以
下のようにアンチトロンビン−■含有水溶液を疎水性基
をリガンドとする不溶性担体を用いるクロマト処理によ
り精製されたアンチトロンビン−ＩＩＩを用いて調製さ
れる。

原料として使用されるアンチトロンビン−■は、ヒト由
来のもので、医薬として使用できる程度に精製されたも
のであれば特に制限されるものではなく、例えば、ヒト
の全血、血漿、血清または凝固した血液から圧搾された
血清等から精製することができる。上記アンチトロンビ
ン−ＩＩＩを調製するための出発原料としては、例えば
、血漿、コーンの冷エタノール法で得られる画分■、Ｉ
Ｖ−１、ＩＶ−４またはＩＶ−１＋ＩＶ−４、クエン酸
含有血漿から血液凝固節■囚子を回収した後の残渣画分
等が使用される。アンチトロンビン−■の精製法として
は、例えば、特開昭４８−３５０１７号公報、特公昭５
９−７６９３号公報に開示の方法が例示される。

アンチトロンビン−■含有水溶液の蛋白濃度としては、
０．１〜１０（ν／Ｖ）％程度が例示される。

また、アンチトロンビン−■含有水溶液は、疎水性クロ
マト処理に付す前に加熱処理（５０〜７０℃、５〜３０
時間程度）を行っておくことが好ましい。

上記精製に使用される疎水性基をリガンドとする不溶性
担体は以下のようなものである。

疎水性基としては、アルキル基（炭素数１〜１０程度、
好ましくは３〜５程度）、置換基を有していてもよいフ
ェニル基等が挙げられる。

不溶性担体としては、セルロース、アガロース、デキス
トラン、ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体、ポリ
ビニル系、ポリスチレン系等が挙げられる。

疎水性基をリガンドとする不溶性担体としては、アルキ
ル型セファロース（例えば、オクチル型セファロース等
）、フェニル型セファロース、アルキル型ポリビニル（
例えば、ブチル型ポリビニル等）等が市販されており、
これら以外のものについても市販品と同様な方法または
これに準する方法によって容易に製造することができる
。

上記不溶性担体を用いる精製工程は、一般にアンチトロ
ンビン−■含有水溶液を、疎水性基をリガンドとする不
溶性担体に接触させることにより行われるが、その方法
としてはカラム法、バッチ法の何れにて行ってもよい。

接触条件は、ｐＨ６〜９程度、塩濃度１〜５Ｍ程度が例
示される。このような条件を具備する溶媒としては、３
Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７，５）　、２Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７゜５）等が例示される。

上記の精製方法を具体的に説明すると、バッチ法にて行
う場合、上記条件に調整したアンチトロンビン−■含有
水溶液を、同じ条件で平衡化した当該疎水性クロマト用
担体に接触させる。その条件としては、該担体１１！に
対して該水溶液１〜１００１！を用い、２〜２０℃で３
０分〜２時間程度混和させる方法が挙げられる。その後
に遠心分離にて上澄を回収する。

カラム法にて行う場合、上記条件に調整したアンチトロ
ンビン−■含有水溶液を、同じ条件で平衡化され且つカ
ラム充填された当該疎水性クロマト用担体にて展開し、
非吸着画分を回収する。

好ましくは、上記で得られた非吸着画分を、さらに陰イ
オン交換体で処理し吸着画分を回収する工程に付して精
製するのがよい。

陰イオン交換体としては、ＤＥＡＥ系（例えば、ＤＥＡ
Ｅ−アガロース、ＤＥＡＥ−デキストラン、ＤＥＡＥ−
セルロースなど）、ＱＡＥ系（例えば、ＱＡＥ−アガロ
ース、ＱＡＥ−デキストランなど）等が挙げられる。

接触条件はｐＨ６〜８程度、塩濃度０．０１〜０．１Ｍ
程度が例示され、このような条件を具備する溶媒として
は、０．０５’Ｍ塩化ナトリウム含有０．０１Ｍクエン
酸緩衝液（ｐＨ７）等が挙げられる。

また溶出条件はｐＨ６〜８程度、塩濃度０．　１〜０．
３Ｍ程度が例示され、このような条件を具備する溶媒と
しては、０．１７Ｍ塩化ナトリウム含有０．０１Ｍクエ
ン酸緩衝液（ｐＨ７）等が挙げられる。

その方法としてはカラム法、バッチ法のいずれで行って
もよい。

バッチ法にて行う場合、上記接触条件に調製したアンチ
トロンビン−■含有水溶液を、同じ条件で平衡化した当
該陰イオン交換体に接触させる。

その条件としては、該交換体１　ｙｌに対して該水溶液
１〜１００１１を用い、２〜２０℃で３０分〜２時間程
度混和した後に遠心分離して、該交換体を回収する。さ
らに、該交換体に上記溶出用溶媒を添加する。混和条件
は接触時と同じであるが、遠心分離して上澄を回収する
。

一方、カラム法にて行う場合、上記の接触条件に調製し
たアンチトロンビン−■含有水溶液を、同じ条件で平衡
化され、且つカラムに充填された当該陰イオン交換体に
通し、非吸着画分を廃棄する。必要に応じてカラムを洗
浄した後、溶出用溶媒を流して溶出画分を回収する。

こうして得られたアンチトロンビン−■は、必要に応じ
てさらに精製した後、製剤化される。製剤としては、水
溶液、懸濁剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、これら製剤
化は、医薬上許容される添加剤（希釈剤、等張化剤、界
面活性剤等）を適宜混合し、製剤上の常套手段により行
うことができる。また、該製剤は静注、皮下注射等の注
射剤として用いられ、凍結乾燥製剤は用時に注射用蒸留
水等に溶解して用いられる。

［発明の効果コ 本発明の製剤によれば、アンチトロンビン−■含有水溶
液に含まれるパイロジエン、夾雑蛋白、加熱処理により
生成した熱変性蛋白等が効果的に除去された精製アンチ
トロンビン−ＩＩＩを含有するので、安全性に優れたア
ンチトロンビン−■製剤を提供することができる。

［実施例］ 本発明をより詳細に説明するため実施例を挙げて説明す
るが、本発明はこれらによってなんら限定されるもので
はない。

実施例１ コーンの冷アルコール分画法で得られた画分■−１のペ
ースト１０ｋｇを生理食塩水１００ｊ７に懸濁し、硫酸
バリウムを５　（Ｗ／Ｖ）％になるように加え、室温で
３０分間攪拌し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸
バリウムに吸着させて除去した。

この上澄液をｐＨ６，５に調整し、ポリエチレングリコ
ール９４，０００を１３（ν／Ｖ）％になるように加え
、生じた沈澱を遠心分離して除き、さらにポリエチレン
グリコール＃　４．０００を３０　（Ｗ／Ｖ）％になる
ように加え、生じた沈澱を遠心分離して回収した。この
沈澱を冷生理食塩水約２０ｇに溶解し、予め生理食塩水
で調整されたヘパリンセファ０−スのカラムに注入し、
アンチトロンビン−ＩＩＩをカラムに吸着させた。この
カラムを０．４Ｍの塩化ナトリウム溶液で洗浄して不純
蛋白を除いた後、２．０Ｍの塩化ナトリウム溶液をカラ
ムに流して溶出してくる部分を回収した。

このアンチトロンビン−■の水溶液にクエン酸ナトリウ
ムを０．６Ｍの濃度に加え、ｐＨ７，８に調整した後、
６０℃で１０時間の加熱処理を施した後、塩化ナトリウ
ム（最終濃度３Ｍ）及びクエン酸ナトリウム（最終濃度
２０ｍＭ）を添加し、ｐＨ７，５に調整した。一方、３
Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７，５）で平衡化したブチル型ポリビニル系担
体（ブチル−トヨパール６５０、東洋曹達■製）にアン
チトロンビン−■含有水溶液を接触させたのちに上記緩
衝液で展開し、未吸着画分を回収した。

続いて、０．９％塩化ナトリウム溶液に対して一夜透析
を行いつつ濃縮してアンチトロンビン−■の１　（Ｗ／
Ｖ）％水溶液を得、必要に応じて、濾過又は遠心分離を
行って澄明な液とした。

このアンチトロンビン−■の１　（Ｗ／Ｖ）％水溶液に
マンニトール２　（Ｗ／Ｖ）％とクエン酸ナトリウム０
．２　（Ｗ／Ｖ）％を加え、塩化ナトリウムが０．５％
になるように少量の冷蒸留水希釈し、ＩＮの水酸化ナト
リウムでｐＨ７，６に調整した後、滅菌したミリポアフ
ィルタ−で除菌濾過し、５００単位つづ分注し、凍結乾
燥を行って乾燥製剤とした。

実施例２ 画分ＩＶ−１ペーストの代わりに、画分■−１＋ＩＶ−
４を用いる以外は全て実施例１に準じて処理を行い、実
施例１と同様なアンチトロンビン−■製剤を得た。

実施例３ 両分ＩＶ−１ペーストの代わりに、クエン酸含有血漿を
低温で処理して血液凝固第■因子を回収した後の残渣画
分を用いる以外は全て実施例１に準じて処理を行い、実
施例１と同様なアンチトロンビン−■製剤を得た。

実施例４ 実施例１と同様にして疎水性クロマト処理を行った後、
ＤＥＡＥ−デキストラン処理を施した。

即ち、実施例１で得られた疎水性クロマト処理アンチト
ロンビン−■含有水溶液を、塩化ナトリウム０．０５Ｍ
、クエン酸ナトリウム０．０１Ｍ。

ｐＨ７となるように調製した後、０．０５Ｍ塩化ナトリ
ウム含有０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化
したＤＥＡＥ−デキストラン（ＤＥＡＥ−セファデック
スＡ−５０、ファルマシア社製）に通した。さらに同じ
溶媒でカラムを洗浄した後、０．１７Ｍ塩化ナトリウム
含有０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７）で溶出し、溶
出画分を回収した。以下、実施例１に準じて製剤化処理
を行いアンチトロンビン−■製剤を調製した。

実施例５ 実施例４で得られたアンチトロンビン−■乾燥粉末　　
　　　　　　　　　　５００単位塩化ナトリウム　　　
　　　　　　　５０ｍｇクエン酸ナトリウム　　　　　
　　　５２ｍｇ上記処方の製剤を、用時、注射用蒸留水
２０１！に溶解して、静注又は点滴静注する。なお、１
単位は、正常人血漿１１１！に含まれるアンチトロンビ
ン−■量に相当する。

実験例１ （１）パイロジエンの除去 、実施例１に準じて、疎水性クロマト処理を行い、その
前後のアンチトロンビン−■含有画分中のパイロジエン
を調べる試験を２回行った（各々第１サンプル及び第２
サンプルと称する）。なお、試験方法は日本薬局方収載
の発熱性物質試験法によった。その結果を第１表に示す
。

第１表 め作製しておいた検量線よりその力価を算出したもので
ある。但し、１単位は正常人血漿１１！中に含まれるア
ンチトロンビン−■ｔに相当する。得られた結果を第２
表に示す。

処理により合計温度が低下し、パイロジエンが実質的に
除去されていることが判明した。

（２）夾雑蛋白の除去 （ａｌ比活性 実施例１に準じて疎水性クロマト処理を行い、その前後
のアンチトロンビン−■含有画分中の総蛋白量及びアン
チトロンビン−■活性を測定し、比活性を算出した。総
蛋白量はケルプール法により測定した。また、アンチト
ロンビン−■活性（ＡＴ−ＩＩＩ活性）はトロンビンと
試料とを２８℃で５分間反応させ、これにフィブリンを
加えた時に凝固時間がどの程度延長されるかを測定し、
子弟２表に示されるように、疎水性クロマト処理により
、ＡＴ−ＩＩＩ活性及び比活性の上昇が認められ、特に
比活性は４．９（単位／　ｍｇ蛋白）から６．４（単位
／　ａ＋ｇ蛋白）となった。

山）夾雑血漿蛋白の除去 実施例１に準じて疎水性クロマト処理を行い、その前後
のアンチトロンビン−■含有画分中に夾雑する血漿蛋白
の有無をオフタロニー法により調べた。その結果を第３
表に示す。

（以下余白） 第３表 実施例１に準じて疎水性クロマト処理を行い、その前後
のアンチトロンビン−■含有画分をゲル濾過にかけ、そ
の溶出パターンを比較した。その結果を第１図に示す。

なお、ゲル濾過の条件は次のとおりである。

担　体：ＴＳＫゲルＧ　３０００　Ｓ　Ｗ　−Ｘ　Ｌ　
（東ソー社製） 溶出液：０．２Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６，８） 検出法：２８００Ｉの吸光度 第１図に示されるように、処理前の両分は二峰性を示す
。このうち、高分子画分は加熱処理前の溶出パターンか
らみて、熱変性蛋白に基づくものと考えられる。疎水性
クロマト処理によりこの高分子画分は消失し、−時性と
なることが判明した。

曲夾雑血漿蛋白の除去 実施例４に準じて疎水性クロマト処理及び陰イオン交換
体処理を行って得られたアンチトロンビン−■含有画分
と、上記疎水性クロマト処理前のアンチトロンビン−■
含有水溶液について、夾雑血漿蛋白の有無をオフタロニ
ー法により調べた。

蛋白濃度１００　ｌｌ１ｇ／　１１で実施した。その結
果を第４表に示す。

（以下余白） 実験例２ 実施例１で得られたアンチトロンとンー■凍結乾燥製剤
を注射用蒸溜水に溶解し、５匹のマウスに４０，０００
単位／　ｋｇ相当量を尾静脈より投与して７日間観察を
続けたが、なんら異常は認められなかった。また、同じ
溶解液を家兎に５，０００単位／　ｋｇ投与して２４時
間観察したが、体温の異常は認められなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、疎水性クロマト処理の前後でのアンチトロン
ビン−■含有画分のゲル濾過溶出パターンを示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−IIIを含
   有し、ウィルスが不活化され、夾雑物質として少なくと
   もパイロジェン及び不活化処理により生成した熱変性蛋
   白を実質的に含まないアンチトロンビン−III製剤。
2. （２）夾雑物質としてパイロジェン、熱変性蛋白及びア
   ンチトロンビン−III以外の血漿蛋白を実質的に含まな
   い請求項（１）記載のアンチトロンビン−III製剤。
3. （３）夾雑物質としてパイロジェン、熱変性蛋白、アル
   ブミン、ハプトグロビン、α２−マクログロブリン、α
   １−アンチトリブシン及び ＩｇＡを実質的に含まない請求項（１）記載のアンチト
   ロンビン−III製剤。
4. （４）アンチトロンビン−III含有水溶液を疎水性基を
   リガンドとする不溶性担体に接触させ、その未吸着画分
   を回収して得られた精製アンチトロンビン−IIIを含有
   する請求項（１）記載のアンチトロンビン−III製剤。