JPS6029687B2 - ヒト胎盤由来血液凝固第１０３因子の濃縮液の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト胎盤由来血液凝固第Ｘ皿因子濃縮液の製
造方法に関する。

近年止血血栓機構との関連における創傷治癒機転の一端
として、フィプリ／ーゲンーフィブリン系の不溶性フィ
ブリン形成に関与している血液凝固Ｘ皿因子の作用が注
目されてきた。

先天性血液凝固第Ｘｍ因子欠損症で観察される出血と創
傷治癒遅延という異常症状は、血液凝固第Ｘｍ因子の基
質となるフィブＩＪンのｙ（ガンマ−）鎖間の架橋形成
（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇクロスリンキング）不全
により起こることが知られている。

。そしてまた、フイブリンのｙ（ガンマ‐）鎖間の架橋
形成（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）のみならず、Ｑ（
アルファ）鎖間のクロスリンキングの有する生物学的意
義についても関心が向けられるようになった。すなわち
、前者は、ｙ（ガンマ‐）鎖が化学的安定性を通して尿
素に不溶性にするのに対して、後者はフィブリンの物理
的・機械的強固さを規制するのではないかと考えられる
ようになった。さらにまた、フィブリンーゲン精製時な
らびに抗血友病因子精製時などに終始つきまとう爽雑物
としてしか、これまで把握されていなかったコールド
インソリユフル グロブリン（ｃｏｌｄｉｎｓｏｌｕｂ
ｌｅｇｏｂｕｌｉｎ）がフイブリン以外に血液凝固第Ｘ
囚因子の基質となり得て、生物学的にきわめて重要な役
割を演じているらしいことがわかってきた。創傷治癒の
初期には、フィブリンのＱ（アルファ）鎖間のクロスリ
ンキングが、単にフィブリン間のみならず、コールドィ
ンソリュフル グロブリンとの間においても進行する、
という形で、創傷治癒初期相が血液凝固第Ｘ瓜因子に依
存しているのではないかと考えられている。文献：■
ピサノ Ｊ．Ｊ．（Ｐｉｓａｎｏ，Ｊ．Ｊ）、アナルズ
オプ ザ ニユーヨークアカデミー オプ サイエン
ス（Ａぷｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、２０２，
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雌ｇｈ，Ｒ．Ｐ．）、ザシツクス テイーンスインター
ナショナルコングレス オブ ヘマトロジイ（Ｔｈｅ１
６ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａＩＣｏｎ凶．Ｈｅｍａ
ｔｏｌ．）、Ｋｙｏｔｏ，１９７６■ モツシヤ− Ｄ
．Ｆ．（Ｍｏｓｈｅｒ，Ｄ．Ｆ）、ジヤーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、２５０，６６１４（１９７５）以上のことから
、血液凝固第Ｘｍ因子製剤は臨床適用において、先天性
ないし後天性血液凝固第Ｘｍ因子欠損症及び減少症はも
ちろんのこと、広く一般外科手術後の創傷治癒促進に対
して効を奏することは明らかである。

血液凝固第Ｘ囚因子の製造原料としては、価格、収量、
既製品の製造との関連性などから、人胎盤を用いること
が優れている（特開昭５３−５９０１８号）。

特開昭５３一５９０１８号では、アルブミン製剤および
ｙーグロブリン製剤など既製品の製造との関連問題を解
決した血液凝固第Ｘｍ因子の製造法を種々検討した結果
、胎盤から硫安分画法を主体にしたアルブミン及びｙ−
グロブリンを製造する工程の、粗−グロブリン画分に血
液凝固第Ｘｍ因子が濃縮されてくることを見し、出し、
これをもとに血液凝固第Ｘ皿因子の製造法の組み立て、
さらに血液製剤に共通の問題である肝炎ウイルスの不活
化処理工程を組み込んだ製法を示した。

特開昭５３−５９０１８号の製法は、硫安分画法により
粗グロブリン画分及び粗アルブミン画分を除いたたのち
、血液凝固第Ｘ町因子を得るまでの工程が長く、したが
ってそのために時として発熱性物質の混入がみられこと
があった。

この問題について種々研究を重ねた結果、粗グロブリン
画分についてポリアルキレングリコールによる沈澱分画
を採用することにより、工程が短縮され、それがために
発熱性物質の混入も認められなくなり、、収量の向上も
さらにはかることが出来ることが分った。そして製品の
純度、安定性などについては、特開昭５３−５９０１８
号で得られるものとの間に差は認められなかった。以上
の結果より本発明は完成した。本発明によりヒト胎盤よ
り得られた粗グロブリン画分より、ｐＨ６−９において
、分子量２，０００〜２０，０００を有するアルキレン
オキサイド重合体または共重合体の濃度４一９％（Ｗ／
Ｖ）において沈澱する画分を除去し、次いで前記重合体
又は共重合体の濃度２０〜３０％（Ｗ／Ｖ）において沈
澱する函分を集めることを特徴とするヒト胎盤由来血液
凝固第Ｘｍ因子の濃縮液の製造方法が提供される。

本発明を以下に詳細に説明する。

本発明において用いられるヒト胎盤に由釆する粗グロブ
リン画分は、例えば袴開昭５３一５９１０８号の開示の
方法により得られた胎盤抽出溶液例えば生理的食塩水に
て細切胎盤を抽出した溶液から、爽雑するムコィド蛋白
を遠心除去し、更にはｐＨ５一７、温度１一ｌｙｏにお
いて硫安を２０〜３０％に飽和することにより沈澱する
組織蛋白を除去し、次いで得られる上清から更に硫安飽
和度をあげその４５−５５％飽和においてｐＨ６一８に
おいて沈澱する画分を上情の粗ァルブミン画分から分離
して得られる。

粗グロブリン画分は、本発明の方法によるアレキレンオ
キサイド重合体又は共重合体による分画にかけられるこ
とにより、その中のｙーグロブリン画分、ヘモグロビン
画分及び血液凝固第Ｘ山因子を多量に含む画分に分画さ
れる。

すなわち、上記沈澱物として得られる粗グロブリン画分
は、好ましくはＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸塩）
などの二価金属キレート剤を含む、ｐＨ６−９、好まし
くは７．５の緩衝溶液に溶解し、その溶液に分子量２，
０００〜２０，０００の、ポリオキシェチレン、ポリオ
キシプロピレン及びポリオェキシェチレン−ポリオキシ
プロピレン共重合体（ブルロニツク、ポリオール）のよ
うなアルキレンオキサィド重合体又は共重合体（以下ポ
リオールという）の単独または混合物を添加する。

先ずポリオールを濃度４一９％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは
７％（Ｗ／Ｖ）になるように添加し溶解させ、生ずる沈
澱（ｙーグロブリン画分）を遠心分離により除去し、上
清に再びポリオールを添加して終濃度を２０−３０％（
Ｗ／Ｖ）、好ましくは２５％（Ｗ／Ｖ）とする。生じた
沈澱を上清（ヘモグロビン画分）から分離し集めること
により血液凝固第Ｘｍ因子の画分を得る。かくして得ら
れた所望の濃縮画分は、これを公知の方法に従い透析し
、除菌炉過し、凍結乾燥することにより製剤とすること
ができる。

しかしこの画分は上記製剤化の前に、存在することのあ
る肝炎ウイルスを不活化するための加熱処理を施こすこ
とが好ましい。

不活化の方法は、特開昭５３−５９０１８号に記載と同
じであり、安定剤として中性アミノ酸、単糖類、糠アル
コール類の単独又は混合物の濃度１０−２０％（Ｗ／Ｖ
）の存在において、前記画分のｐＨ６一９の緩衝溶液を
５５一６５００において９−１１時間加熱することによ
り行われる。この際生ずる加熱不安定物質は、加熱され
た水溶液を冷後ＤＥＡＥーセフアデックスのような陰イ
オン交換体によるクロマトグラフィーまたはブロック電
気泳動法にかけて除去する。次いで上記の公知の方法に
従って製剤化する。本発明の方法で、血液凝固第Ｘｍ因
子濃縮液製剤としたとき、新鮮な正常人皿嬢１の‘中に
含まれる第Ｘｍ因子活性量を１単位とすれば、２５０単
位／４の‘の活性を有するものが得られた。

本発明によるときは、胎盤からアルブミン、ｙ−グロブ
リン製造を妨げることなく、これらを製造する際の副産
物を利用でき、且つ医療用として有用な肝炎ウイルス不
活化のための加熱処理を施すことができ、さらに工程が
短縮されたことから発熱性物質の混入を防止することが
でき、安全、且つ安定な濃縮第Ｘｍ因子製剤を収率よく
製し得る効果がある。本発明の方法で製した濃縮第Ｘ山
因子製剤と、特開昭５３一５９０１８号で製したそれと
の間には、純度、安定性については差は認められない。

次にいくつかの実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。

なお本発明はこれらの実施例に示されるポリオールの種
類並びに加熱処理後の精製法に限定されるものではない
。実施例 １ ヒトの胎盤を生理的食塩水をもって抽出した抽出液８０
０夕（胎盤約８４の固、約５１０ｋｇ）を遠心分離し、
ｐＨを５．０に調整し生ずる沈澱を遠心分離し、上清を
ｐＨ６としてこれに硫安を２５％飽和になるまで加え、
生ずる沈澱を遠心分離により除去、上清に更に硫安をｐ
Ｈ７において５０％飽和させることにより粗グロブリン
画分を沈澱させて遠心分離により集めた。

得られた粗グロブリン画分３．５ｋ９を、０．００小１
のＥＤＴＡを含むＰＨ７．５の０．０弧リン酸塩緩衝液
１００どに溶解させた。

この溶液にプルロニック（ポリオェキシェチレンとボリ
オキシプロピレンの共重合体：平均分子量１５，０００
）７．０ｋ９を加え溶解させる。一夜静遣して生じた沈
澱（グロブリンの精製に供用できる）を遠心分離して除
く。得られた上清に再びプルロニックを添加して終濃度
２５％（Ｗ／Ｖ）とする。一夜静暦後分離した沈澱を上
記緩衝に溶かし、６０ｏ○、１畑時間加熱処理、ＤＥＡ
Ｅ−セファデックスィオン交換クロマトグラフィー、透
析、除菌炉過、分注を経て凍結乾燥する。新鮮な正常人
血賂１地中に含まれる血液凝固第Ｘｍ因子活性量を１単
位として２２０万単位、蛋白として１８７ｇを得た。実
施例 ２ 実施例１で用いたプルロニックの代り‘こ平均分子量８
，０００のポリオキシプロピレン４．０ｋ９を用いて先
ずグロブリンを除去したのち、再びポリオキシプロピレ
ンを添加して終濃度２０％（Ｗ／Ｖ）とした以外は同様
に処理した。

その結果、濃縮第Ｘ皿因子１８０万単位、蛋白として１
５１ｇを得た。実施例 ３実施例１で用いたプルロニッ
クの代りにボリオキシェチレン（平均分子量１２，００
０）９．０ｋ９を用いて先ずグロブリンを除去したのち
、再びポリオキシェチレンを添加して綾濃度３０％（Ｗ
／Ｖ）とした以外は、同様に処理した。

その結果、濃縮第Ｘｍ因子１６５万単位、蛋白として１
３巡を得た。実施例 ４実施例１を繰り返した。

但し、再びプルロニックを添加し、一夜静贋後分離した
め澱の緩衝液を、６０℃、１０時間加熱処理、ＱＡＥ−
セフアデックスィオン変換クロマトグラフィーにかけ、
濃縮し、透析し、ｐＨ７．５の０．００９ＭＥＤＴＡ含
有の０．０９Ｍリン酸塩緩衝液で予かじめ平衡化したセ
フアデックスＧ−２００カラムでゲル炉過し、この分画
処理で蛋白での吸収は２蜂性を示し、第Ｘｍ因子の活性
は２番目の吸収の後半部に存在し、血液型物質は１番目
の吸収部に存在するので、第Ｘｍ因子活性部位のみを回
収し、除菌炉過、分注を経て凍結乾燥し、２２０万単位
、蛋白として１８雌の第Ｘｍ因子を得た。実施例 ５ 実施例４のセフアデツクスＧ２００カラムを用いるゲル
炉週の代りに、ｐＨ３．５〜５．０とし第Ｘｍ因子を沈
澱として回収し、これを０．０９Ｍのリン酸塩に溶解す
る以外、実施例４を繰り返し２２０万単位、蛋白として
１７酸の第Ｘｍ因子を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒト胎盤より得られた粗グロブリン画分より、ｐＨ
   ６−９において、分子量２，０００〜２０，０００を有
   するアルキレンオキサイド重合体または共重合体の濃度
   ４−９％（Ｗ／Ｖ）において沈澱する画分を除去し、次
   いで前記重合体又は共重合体の濃度２０〜３０％（Ｗ／
   Ｖ）において沈澱する画分を集めることを特徴とするヒ
   ト胎盤由来血液凝固第XIII因子の濃縮液の製造方法。 ２ 粗グロブリン画分が、胎盤の塩化ナトリウムによる
   抽出溶液より組織蛋白を除去し、次いで硫安の飽和４５
   −５５％において沈澱させた画分である特許請求の範囲
   第１項による方法。 ３ アルキレンオキサイド重合体又は共重合体がポリエ
   チレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド、又はエ
   チレンオキサイド−プロピレンオキサイド共重合体であ
   る特許請求の範囲第１項による方法。 ４ 除去される沈澱がアルキレンオキサイド重合体また
   は共重合体の濃度７％（Ｗ／Ｖ）におけるものであり、
   集められる沈澱画分２５％（Ｗ／Ｖ）におけるものであ
   る特許請求の範囲の第１項による方法。 ５ 沈澱生成が二価金属キレート剤の存在において行な
   われる特許請求の範囲第１項による方法。 ６ ヒト胎盤より得られた粗グロブリン画分より、ｐＨ
   ６−９において、分子量２，０００−２０，０００を有
   するアルキレンオキサイド重合体または共重合体の濃度
   ４−９％（Ｗ／Ｖ）において沈澱する画分を除去し、次
   いで前記重合体又は共重合体の濃度２０−３０％（Ｗ／
   Ｖ）において沈澱する画分を集め、この画分を中性アミ
   ノ酸、単糖類、糖アルコール又はそれらの２以上の混和
   物の１０−２０％（Ｗ／Ｖ）の濃度において水性媒質中
   ５５−６５℃において９−１１時間加熱処理を施すこと
   により肝炎ウイルス不活化処理を行なうことを特徴とす
   るヒト胎盤由来血液凝固第XIII因子の濃縮液の製造方法
   。