JPH03175984A - 微生物により製造したｎ―アシル―ｌ―プロリン―アシラーゼ、その取得方法、ｌ―プロリン、ｌ―ピペコリン酸、ｌ―チアゾリジン―４―カルボン酸およびｌ―チアゾリジン―２―カルボン酸の取得方法、ならびにｎ―アセチル―ｌ―プロリン、ｎ―プロピオニル―ｌ―プロリンおよびｎ―ブチリル―ｌ―プロリンの製造方法 - Google Patents
微生物により製造したｎ―アシル―ｌ―プロリン―アシラーゼ、その取得方法、ｌ―プロリン、ｌ―ピペコリン酸、ｌ―チアゾリジン―４―カルボン酸およびｌ―チアゾリジン―２―カルボン酸の取得方法、ならびにｎ―アセチル―ｌ―プロリン、ｎ―プロピオニル―ｌ―プロリンおよびｎ―ブチリル―ｌ―プロリンの製造方法Info
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- JPH03175984A JPH03175984A JP2234656A JP23465690A JPH03175984A JP H03175984 A JPH03175984 A JP H03175984A JP 2234656 A JP2234656 A JP 2234656A JP 23465690 A JP23465690 A JP 23465690A JP H03175984 A JPH03175984 A JP H03175984A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野１
本発明は、次のような反応：
を接触する今まで記載されていない酵素に関する。
この新規酵素は熱安定性であり、かつ特に良好な反応（
ただしＲ１−Ｈ，Ｘ−ＣＨ，Ｒ２−Ｈｉ Ｒ１−ＣＱ、
Ｘ−ＣＨ，Ｒ２−Ｈ； Ｒ１−Ｉ（、Ｘ−Ｒ２−３、
Ｒ１冨ｃＱ、ｘ−Ｒ２玉Ｓ、Ｒ，−Ｈ，Ｘ−ＣＨ，Ｒ２
請Ｈ，Ｙ■Ｓ；Ｒ，−ＣＱ、 Ｘ−０８％Ｒ２−Ｈ，Ｙ
−Ｓ）が生じる。
ただしＲ１−Ｈ，Ｘ−ＣＨ，Ｒ２−Ｈｉ Ｒ１−ＣＱ、
Ｘ−ＣＨ，Ｒ２−Ｈ； Ｒ１−Ｉ（、Ｘ−Ｒ２−３、
Ｒ１冨ｃＱ、ｘ−Ｒ２玉Ｓ、Ｒ，−Ｈ，Ｘ−ＣＨ，Ｒ２
請Ｈ，Ｙ■Ｓ；Ｒ，−ＣＱ、 Ｘ−０８％Ｒ２−Ｈ，Ｙ
−Ｓ）が生じる。
［従来の技術］
Ｂｉｏｃｈｉ＋ｎ１ｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
Ａｃｔａ、７４４（１９８３）。
Ａｃｔａ、７４４（１９８３）。
１８０−１８８． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉ
ｃａｉ Ｐｒｅｓｓ から既にプソイドモナス株から
のフロリンアシラーゼ（Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−ア
ミド−ヒドロラーゼ）は公知である。しかしこの文献に
記載された酵素は５０℃の温度で既に極めて急速に失活
してしまう。しかし工業的利用のために、高い安定性を
有する酵素が必要である。反応操作のためには、高めた
温度で作業することが特に有利であり、この温度が基質
の反応速度および溶解性を本質的に高める。本発明によ
る酵素は本質的に熱安定性である。
ｃａｉ Ｐｒｅｓｓ から既にプソイドモナス株から
のフロリンアシラーゼ（Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−ア
ミド−ヒドロラーゼ）は公知である。しかしこの文献に
記載された酵素は５０℃の温度で既に極めて急速に失活
してしまう。しかし工業的利用のために、高い安定性を
有する酵素が必要である。反応操作のためには、高めた
温度で作業することが特に有利であり、この温度が基質
の反応速度および溶解性を本質的に高める。本発明によ
る酵素は本質的に熱安定性である。
［発明の構成］
本発明による酵素は次の特性により特徴づけられる。
ｌ）反応性：
Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンのアセチル基を分割し、そ
の際、最終生成物として酢酸およびＬ−プロリンが生じ
、酢酸およびＬ−プロリンを縮合し、その際、最終生成
物としてＮ−アセチル−Ｌ−プロリンおよび水が生じる
；２）基質特異性： Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ
−プロリン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−プロリン、Ｎ−プロピ
オニル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ブチリル−Ｌ−プロリン、
Ｎ−バレリル−Ｌ−プロリン、Ｎ−カプロイル−Ｌ−プ
ロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、
Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン
酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−２−カル
ボン酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−ピペコリン酸、Ｎ−
ベンジルオキシカルボニル−グリシル−Ｌ−プロリン、
グリシル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン
、Ｎ−１０ロアセチル−Ｌ−メチオニンおよびＮ−クロ
ロアセチル−Ｌ−バリンを加水分解する３）最適ｐＨ値
： 最適ｐＨ値は６．８±０．５である； ４）ｐＨ安定性： ２２℃で３週間にわたりｐＨ７，０〜１０．０の範囲内
で良好な安定性を示す； ５）最適温度： 最適温度は、ｐＨ値７．５で６５℃である；６）温度安
定性ニ ア０℃で、ｐｆ（７，５で３０分間インキユベートシた
後に、活性度損失は検出されないニア）阻害剤および活
性化剤の影響： 特に１．１０−フェナントロリン、２−メルカプトエタ
ノール、４−クロロメルクリベンゾエート、４−ヒドロ
キシメルクリベンゾエートＨｇ２＋ Ｃｕ２＋
Ｆ ｅ２＋ Ｆ ｅ３＋Ｓｎ” Ｚｎ２” Ｐ
Ｏ４３＋が阻害作用しアボ酵素に関してＣｏ２＋および
Ｚｎ２＋が活性化作用する； ８）分子量： 分子量は３８００００±４００００ダルトンである： ９）サブユニット： 分子はそれぞれ４５０００±５０００ダルトンを有する
８個の同じ大きさのサブユニットからなる； １０）ＫＭ値： 基質のＮ−アセチル−Ｌ−プロリンに対するＫＭ値は５
ｍＭ（３０℃、０．１Ｍ！−リスーＨＣａ緩衝液、ｐＨ
７，０）である。
の際、最終生成物として酢酸およびＬ−プロリンが生じ
、酢酸およびＬ−プロリンを縮合し、その際、最終生成
物としてＮ−アセチル−Ｌ−プロリンおよび水が生じる
；２）基質特異性： Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ
−プロリン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−プロリン、Ｎ−プロピ
オニル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ブチリル−Ｌ−プロリン、
Ｎ−バレリル−Ｌ−プロリン、Ｎ−カプロイル−Ｌ−プ
ロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、
Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン
酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−２−カル
ボン酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−ピペコリン酸、Ｎ−
ベンジルオキシカルボニル−グリシル−Ｌ−プロリン、
グリシル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン
、Ｎ−１０ロアセチル−Ｌ−メチオニンおよびＮ−クロ
ロアセチル−Ｌ−バリンを加水分解する３）最適ｐＨ値
： 最適ｐＨ値は６．８±０．５である； ４）ｐＨ安定性： ２２℃で３週間にわたりｐＨ７，０〜１０．０の範囲内
で良好な安定性を示す； ５）最適温度： 最適温度は、ｐＨ値７．５で６５℃である；６）温度安
定性ニ ア０℃で、ｐｆ（７，５で３０分間インキユベートシた
後に、活性度損失は検出されないニア）阻害剤および活
性化剤の影響： 特に１．１０−フェナントロリン、２−メルカプトエタ
ノール、４−クロロメルクリベンゾエート、４−ヒドロ
キシメルクリベンゾエートＨｇ２＋ Ｃｕ２＋
Ｆ ｅ２＋ Ｆ ｅ３＋Ｓｎ” Ｚｎ２” Ｐ
Ｏ４３＋が阻害作用しアボ酵素に関してＣｏ２＋および
Ｚｎ２＋が活性化作用する； ８）分子量： 分子量は３８００００±４００００ダルトンである： ９）サブユニット： 分子はそれぞれ４５０００±５０００ダルトンを有する
８個の同じ大きさのサブユニットからなる； １０）ＫＭ値： 基質のＮ−アセチル−Ｌ−プロリンに対するＫＭ値は５
ｍＭ（３０℃、０．１Ｍ！−リスーＨＣａ緩衝液、ｐＨ
７，０）である。
本発明によるＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼは
、コマモナス テストステロニ菌株（Ｃｏｍａｍｏｎａ
ｓｕ ｔａｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ） Ｄ Ｓ Ｍ ５４
１６またはアルカリゲネス デニトリフィカンス菌株（
Ａｌｋａｌｉｇｅｎｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）
Ｄ Ｓ Ｍ ５４１７を用いて得ることができる。こ
の双方の菌株は、西ドイツ国ブラウンシュバイク（Ｂｒ
ａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）在のＤｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａ
ｎｒｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｌｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（
Ｄ Ｓ Ｍ ）に寄託されている。
、コマモナス テストステロニ菌株（Ｃｏｍａｍｏｎａ
ｓｕ ｔａｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ） Ｄ Ｓ Ｍ ５４
１６またはアルカリゲネス デニトリフィカンス菌株（
Ａｌｋａｌｉｇｅｎｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）
Ｄ Ｓ Ｍ ５４１７を用いて得ることができる。こ
の双方の菌株は、西ドイツ国ブラウンシュバイク（Ｂｒ
ａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）在のＤｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａ
ｎｒｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｌｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（
Ｄ Ｓ Ｍ ）に寄託されている。
次の特性は、菌株ＤＳＭ５４１６がコマモナス テスト
ステロニ種に属することを示す。
ステロニ種に属することを示す。
この菌株は、Ｉｉｏ、５〜０．７μ胃、長さ１．５〜３
．０μ胸で、ダラム陰性で、１本以上の極性の鞭毛によ
り運動する桿状の形で増殖し、芽胞を形成しない。この
細胞は３％のＫＯＨで溶解する。アミノペプチダーゼ（
Ｃｅｒｎｙ）反応、オキシダーゼ反応、カタラーゼ反応
およびフェニルアラニンデアミナーゼ反応は陽性であり
、レクチナーゼ反応およびウレアーゼ反応は陰性である
。この増殖は個性好気性であり、ｐＨ５゜６でＭａｃ−
Ｃｏｎｋｅｙ寒天およびＳｉｍｍｏｎｓ−ＣｉＬｒａｔ
寒天において陽性であり、３７℃８よび４１℃でＳＳ寒
天およびＣｅｔｒｉｍＬｄ寒天では陰性である。
．０μ胸で、ダラム陰性で、１本以上の極性の鞭毛によ
り運動する桿状の形で増殖し、芽胞を形成しない。この
細胞は３％のＫＯＨで溶解する。アミノペプチダーゼ（
Ｃｅｒｎｙ）反応、オキシダーゼ反応、カタラーゼ反応
およびフェニルアラニンデアミナーゼ反応は陽性であり
、レクチナーゼ反応およびウレアーゼ反応は陰性である
。この増殖は個性好気性であり、ｐＨ５゜６でＭａｃ−
Ｃｏｎｋｅｙ寒天およびＳｉｍｍｏｎｓ−ＣｉＬｒａｔ
寒天において陽性であり、３７℃８よび４１℃でＳＳ寒
天およびＣｅｔｒｉｍＬｄ寒天では陰性である。
色素形成、０ＮＰＣ反応、ＡＤＨ反応および■Ｐ反応は
陰性である。硝酸還元は陽性であり、脱窒素作用は陰性
である。でんぷん、ゼラチン、カゼイン、Ｄ Ｎ Ａ
ｓ Ｔｗｅｅｎ ８０およびエスクリン（Ｘ５ｃｕｌｉ
ｎ）を加水分解しない。増殖のためにビタミンが必要で
、チロシン分解は陽性である。次の基質は増殖のために
炭素源およびエネルギー源として使用したニゲルコン酸
塩、グルセリン、ピルビン酸塩、Ｌ−乳酸塩、リンゴ酸
塩、アジピン酸塩、レブリン酸塩、ムカート、Ｄ−酒石
酸塩、セバシン酸塩、２−ケトグルタル酸塩、酢酸塩、
プロピオン酸塩、酪酸塩、Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン、
Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシンＬ−アスパラギン酸塩、ノ
ルロイシンおよびγ−アミノブチレート。増殖させない
ためにはアラビノース、グルコース、フルクトース、ラ
クトース、マルトース、マンノース、サッカロース、キ
シロース、マンニット、２−ケトグルコン酸塩、Ｎ−ア
セチルグルコースアミン、カプロン酸塩、クエン酸塩、
グリコール酸塩、マロン酸塩、フェニルアセテート、Ｌ
−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−セリンおよびＬ−
トリプトファンを使用する。
陰性である。硝酸還元は陽性であり、脱窒素作用は陰性
である。でんぷん、ゼラチン、カゼイン、Ｄ Ｎ Ａ
ｓ Ｔｗｅｅｎ ８０およびエスクリン（Ｘ５ｃｕｌｉ
ｎ）を加水分解しない。増殖のためにビタミンが必要で
、チロシン分解は陽性である。次の基質は増殖のために
炭素源およびエネルギー源として使用したニゲルコン酸
塩、グルセリン、ピルビン酸塩、Ｌ−乳酸塩、リンゴ酸
塩、アジピン酸塩、レブリン酸塩、ムカート、Ｄ−酒石
酸塩、セバシン酸塩、２−ケトグルタル酸塩、酢酸塩、
プロピオン酸塩、酪酸塩、Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン、
Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシンＬ−アスパラギン酸塩、ノ
ルロイシンおよびγ−アミノブチレート。増殖させない
ためにはアラビノース、グルコース、フルクトース、ラ
クトース、マルトース、マンノース、サッカロース、キ
シロース、マンニット、２−ケトグルコン酸塩、Ｎ−ア
セチルグルコースアミン、カプロン酸塩、クエン酸塩、
グリコール酸塩、マロン酸塩、フェニルアセテート、Ｌ
−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−セリンおよびＬ−
トリプトファンを使用する。
次の特性は、菌株ＤＳＭ５４１７がアルカリゲネス デ
ニトリフィカンス種に属することを示す。
ニトリフィカンス種に属することを示す。
この菌株は、輻０．５〜０．６μ講、長さ１．０〜２．
０μｍで、ダラム陰性で、周鞭毛により運動する桿状の
形で増殖し、芽胞を形成しない。
０μｍで、ダラム陰性で、周鞭毛により運動する桿状の
形で増殖し、芽胞を形成しない。
この細胞は３％のＫＯＨで溶解する。アミノペプチダー
ゼ（Ｃｅｒｎｙ）反応、オキシダーゼ反応カタラーゼ反
応は陽性であり、フェニルアラニンデアミナーゼ反応、
レクチナーゼ反応およびウレアーゼ反応は陰性である。
ゼ（Ｃｅｒｎｙ）反応、オキシダーゼ反応カタラーゼ反
応は陽性であり、フェニルアラニンデアミナーゼ反応、
レクチナーゼ反応およびウレアーゼ反応は陰性である。
この増殖は好気性であり、ｐＨ５，６で、３６℃でＭａ
ｃ−Ｃｏｎｋｅｙ寒天、ＳＳ寒天およびＳｉｍｍｏｎｓ
−Ｃｉｔｒａｔ寒天において陽性であり、４１℃でおよ
びＣｅｔｒｔｍｉｄ寒天では陰性である。色素形成、０
ＮＰＧ反応、ＡＤＨ反応およびｖＰ反応は陰性である。
ｃ−Ｃｏｎｋｅｙ寒天、ＳＳ寒天およびＳｉｍｍｏｎｓ
−Ｃｉｔｒａｔ寒天において陽性であり、４１℃でおよ
びＣｅｔｒｔｍｉｄ寒天では陰性である。色素形成、０
ＮＰＧ反応、ＡＤＨ反応およびｖＰ反応は陰性である。
硝酸還元および脱窒素作用は陽性である。貯蔵物質とし
てポリ−β−ヒドロキシ酪酸（Ｐ ＨＢ）を生成する。
てポリ−β−ヒドロキシ酪酸（Ｐ ＨＢ）を生成する。
でんぷん、 ゼラチン、 カゼイン、 ＤＮＡ 、
Ｔｖｅｅｎ ８０およびエスクリン（Ｘｓｃｕｌｉｎ）
を加水分解しない。チロシン分解は陽性である。
Ｔｖｅｅｎ ８０およびエスクリン（Ｘｓｃｕｌｉｎ）
を加水分解しない。チロシン分解は陽性である。
次の基質は増殖のために炭素源およびエネルギー源とし
て使用した：酢酸塩、アジピン酸塩、カプロン酸塩、ク
エン酸塩、Ｌ〜乳酸塩、リンゴ酸塩、プロピオン酸塩、
フェニルアセテートアゼライン酸塩、グルコン酸塩、Ｎ
−アセチルグルコースアミン、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロ
リン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アスパラギン酸塩およびＬ−
グルタミン酸塩。増殖させないためには、アラビノース
、グルコース、フルクトースマンノース、マルトース、
キシロース、マンニット、２−ケトグルコン酸塩、グリ
コ−／Ｌ４塩、レブリン酸塩、マロン酸塩、シュウ酸塩
、メソ−酒石酸塩、イタコン酸塩、ピメリン酸塩セバシ
ン酸塩、スペリン酸塩、Ｌ−アラニン、およびＬ−セリ
ンを使用する。
て使用した：酢酸塩、アジピン酸塩、カプロン酸塩、ク
エン酸塩、Ｌ〜乳酸塩、リンゴ酸塩、プロピオン酸塩、
フェニルアセテートアゼライン酸塩、グルコン酸塩、Ｎ
−アセチルグルコースアミン、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロ
リン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アスパラギン酸塩およびＬ−
グルタミン酸塩。増殖させないためには、アラビノース
、グルコース、フルクトースマンノース、マルトース、
キシロース、マンニット、２−ケトグルコン酸塩、グリ
コ−／Ｌ４塩、レブリン酸塩、マロン酸塩、シュウ酸塩
、メソ−酒石酸塩、イタコン酸塩、ピメリン酸塩セバシ
ン酸塩、スペリン酸塩、Ｌ−アラニン、およびＬ−セリ
ンを使用する。
微生物は、−８０℃で凍結することによるかまたは一１
９６℃で液体窒素中で、凍結乾燥培養として保存する。
９６℃で液体窒素中で、凍結乾燥培養として保存する。
作業培養は、斜面培地小管 （Ｓｃｈｒａｇａｇａｒ−
Ｒ５ｈｒｃｈｅｎ、西ドイツ国、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、
Ｍｅｒｃｋ社のカゼインペプトンーダイズ粉末ペプト
ン−寒天）で管理した。
Ｒ５ｈｒｃｈｅｎ、西ドイツ国、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、
Ｍｅｒｃｋ社のカゼインペプトンーダイズ粉末ペプト
ン−寒天）で管理した。
本発明によるＮ−アシル−プロリン−アシラーゼを得る
ために、炭素および窒素の供給源、誘導物質としての鉱
物塩およびＮ−アシル−Ｌ−プロリンを含有し、コマモ
ナス テストステロニＤＳＭ５４１６を使用する場合、
付加的に、たとえば酵母抽出物として複合体の形ビタミ
ン源を含有する水性培養基中のコマモナス テストステ
ロニＤＳＭ５４１６またはアルカリゲネス デニトリフ
ィカンスＤＳＭ５４１７を、出発ｐＨ値６．０〜８．０
で温度２５℃〜３５℃で好気的に培養し、細胞物質を分
離し、酵素を細胞から単離する。
ために、炭素および窒素の供給源、誘導物質としての鉱
物塩およびＮ−アシル−Ｌ−プロリンを含有し、コマモ
ナス テストステロニＤＳＭ５４１６を使用する場合、
付加的に、たとえば酵母抽出物として複合体の形ビタミ
ン源を含有する水性培養基中のコマモナス テストステ
ロニＤＳＭ５４１６またはアルカリゲネス デニトリフ
ィカンスＤＳＭ５４１７を、出発ｐＨ値６．０〜８．０
で温度２５℃〜３５℃で好気的に培養し、細胞物質を分
離し、酵素を細胞から単離する。
酵素は、たとえばコマモナス テストステロニＤＳＭ５
４１６またはアルカリゲネス デニトリフィカンスＤＳ
Ｍ５４１７を公知方法で、所望のサイズのバイオリアク
ター中で培養するようにして大量に得ることができる。
４１６またはアルカリゲネス デニトリフィカンスＤＳ
Ｍ５４１７を公知方法で、所望のサイズのバイオリアク
ター中で培養するようにして大量に得ることができる。
必要な培養にとって次のことが重要である：良好な通気
（好気性生物）； 培養基の出発ｐＨ値６．０〜８．０； 酵素の誘導のため、培養基中のＮ−アセチル−Ｌ−プロ
リンの存在（０，０６〜０．１重量％）： ビタミンの存在（たとえば酵母抽出物として複合体の形
で）； この酵素は、細胞を溶解した後、酵素精製の公知方法の
組合せにより得ることができる。この酵素は、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−プロリン、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−プロリ
ン、Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−プロリンのからＬ−プロリ
ンを取得すために使用する。さらに、この酵素はＮ〜ル
アセチルＬ−プロリン、Ｎ−プロピオニル−Ｌ−プロリ
ンおよびＮ−ブチリル−Ｌ−プロリンをＬ−プロリンか
ら製造するために使用することができる。
（好気性生物）； 培養基の出発ｐＨ値６．０〜８．０； 酵素の誘導のため、培養基中のＮ−アセチル−Ｌ−プロ
リンの存在（０，０６〜０．１重量％）： ビタミンの存在（たとえば酵母抽出物として複合体の形
で）； この酵素は、細胞を溶解した後、酵素精製の公知方法の
組合せにより得ることができる。この酵素は、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−プロリン、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−プロリ
ン、Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−プロリンのからＬ−プロリ
ンを取得すために使用する。さらに、この酵素はＮ〜ル
アセチルＬ−プロリン、Ｎ−プロピオニル−Ｌ−プロリ
ンおよびＮ−ブチリル−Ｌ−プロリンをＬ−プロリンか
ら製造するために使用することができる。
［実施例１
本発明を、次に実施例により詳説した。
例１：Ｎ−アシルーＬ−プロリンーアシラーゼの製造者
の追跡 ３土壌試料およびｌ浄化加工試料を０．９％（ｖ／ｖ）
のＮａＣｌ２と共に懸濁させ、この懸濁液１ ｍＱもし
くは希釈していない浄化加工試料１ｍＱを液体培養基（
増菌培養基）５０＋ｉＱに植え込んだ。この液体培養基
は次の組成を有していたＮ−アセチル−Ｌ−プロリン
５ｇ 酵母抽出物 ０．１ｇＫ２ＨＰＯ４２
ｇ ＮａＣＱ １ ｇＭｇＳＯ４
・７Ｈ２００、ｈ ＣａＣＱ２・２Ｈ２００−１９ 微量元素溶液 １ＩＩＩ２Ｈ２０（脱
塩水） 全量１ａｐ Ｈ値
５．６もしくｌｉ７
．４微量元素溶液は次の組成を有していた：ＦｅＣ（２
３・６Ｈ２０２５０＋ａ ＺｎＣＱ２
７５ｍｇＨ３ＢＯ３３０＋ｍ５ ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２０２０＋＋＋ｇ ＭｎＣＱ２・４Ｈ２０２０ｍ９ ＣｏＣ１２２・６Ｈ２０１４ｍｇ （ＮＨ４）６ＭＯ７０２４・４Ｈ２０１０ＩＩＩ９Ｏ，
ＯＩＮ ＨＣｌ２ 全量１００ｍ１２ｐ
Ｈ値 〜１．７ 増菌培養基５０ｍｆｆを５００ｍｎのエルレンマイヤー
フラスコ［接合部（Ａｕｆｓａｔｚ）および側部の４ｙ
Ｉの差し込みＱ （５ｃｈｉｋａｎｅ）を備えている］
に装入し、オートクレーブにかけた。微量元素溶液は無
菌濾過し、それぞれのフラスコに冷却後に装入した。こ
のフラスコを前記したように植え込み３０℃で好気性に
ラウンドシエイヵーで２００ｒｐｍで３０間インキュベ
ートした。
の追跡 ３土壌試料およびｌ浄化加工試料を０．９％（ｖ／ｖ）
のＮａＣｌ２と共に懸濁させ、この懸濁液１ ｍＱもし
くは希釈していない浄化加工試料１ｍＱを液体培養基（
増菌培養基）５０＋ｉＱに植え込んだ。この液体培養基
は次の組成を有していたＮ−アセチル−Ｌ−プロリン
５ｇ 酵母抽出物 ０．１ｇＫ２ＨＰＯ４２
ｇ ＮａＣＱ １ ｇＭｇＳＯ４
・７Ｈ２００、ｈ ＣａＣＱ２・２Ｈ２００−１９ 微量元素溶液 １ＩＩＩ２Ｈ２０（脱
塩水） 全量１ａｐ Ｈ値
５．６もしくｌｉ７
．４微量元素溶液は次の組成を有していた：ＦｅＣ（２
３・６Ｈ２０２５０＋ａ ＺｎＣＱ２
７５ｍｇＨ３ＢＯ３３０＋ｍ５ ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２０２０＋＋＋ｇ ＭｎＣＱ２・４Ｈ２０２０ｍ９ ＣｏＣ１２２・６Ｈ２０１４ｍｇ （ＮＨ４）６ＭＯ７０２４・４Ｈ２０１０ＩＩＩ９Ｏ，
ＯＩＮ ＨＣｌ２ 全量１００ｍ１２ｐ
Ｈ値 〜１．７ 増菌培養基５０ｍｆｆを５００ｍｎのエルレンマイヤー
フラスコ［接合部（Ａｕｆｓａｔｚ）および側部の４ｙ
Ｉの差し込みＱ （５ｃｈｉｋａｎｅ）を備えている］
に装入し、オートクレーブにかけた。微量元素溶液は無
菌濾過し、それぞれのフラスコに冷却後に装入した。こ
のフラスコを前記したように植え込み３０℃で好気性に
ラウンドシエイヵーで２００ｒｐｍで３０間インキュベ
ートした。
厚く覆った成分を無菌の０．９％（ｗ／ｖ）のＮａＣＱ
溶液で通常の方法で希釈し、寒天プレート（１，２％の
寒天を有する増菌培養基、ｐＨ値：５．６）上に平板培
養した。寒天プレートを５８間３０℃でインキュベート
し、良好に発育したコロニーを個別化し、あわせて４回
から５回同じ培養基上に植え込んだ。
溶液で通常の方法で希釈し、寒天プレート（１，２％の
寒天を有する増菌培養基、ｐＨ値：５．６）上に平板培
養した。寒天プレートを５８間３０℃でインキュベート
し、良好に発育したコロニーを個別化し、あわせて４回
から５回同じ培養基上に植え込んだ。
コロニー形態および顕微鏡画像により単一に生じた系統
を、次に液体培養基（接合部および側部の４ｍの差し込
み口を備えた５００ｍｇのエルレンマイヤーフラスコ）
ｌｏＯｍ（２中で、３０℃で円形振盪機で２００ｒｐｍ
で増殖させた。
を、次に液体培養基（接合部および側部の４ｍの差し込
み口を備えた５００ｍｇのエルレンマイヤーフラスコ）
ｌｏＯｍ（２中で、３０℃で円形振盪機で２００ｒｐｍ
で増殖させた。
この培養基は次の組成を有していた：
Ｎ−アセチルーＬ−プロリン ４ｇ
（ＮＨ４）２Ｓ０４ ２ｇ
酵母抽出物 ｌ。
酵母抽出物 ｌ。
Ｋ２ＨＰＯ４２ｇ
ＭｇＳＯ４・７ｔ１２０ ０．３ｇ
Ｃａ（Ｊ２・２Ｈ２００，１９ ＮａＣＱ ｌ ｇ微量元素
溶液 １ｍＱＨ２０（脱塩水）
全量１ＱｐＨ値 ７．０ ２４〜４８時間後に細胞を含む培養基を遠心分離（１５
分、冷却遠心分離機中４５００９）ｌ。
Ｃａ（Ｊ２・２Ｈ２００，１９ ＮａＣＱ ｌ ｇ微量元素
溶液 １ｍＱＨ２０（脱塩水）
全量１ＱｐＨ値 ７．０ ２４〜４８時間後に細胞を含む培養基を遠心分離（１５
分、冷却遠心分離機中４５００９）ｌ。
この細胞を０．９％（ｖ／ｖ）のＮａＣｌ２溶液で２回
洗浄し、０．１Ｍのトリス−ＨＣＱ緩衝液（ｐＨ値７−
０）１．０ｍ１２で再懸濁させた。
洗浄し、０．１Ｍのトリス−ＨＣＱ緩衝液（ｐＨ値７−
０）１．０ｍ１２で再懸濁させた。
この懸濁液の微生物は超音波処理（ＳｏｎｉｆｉｅｒＣ
ｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ Ｂ−３０Ｂｒａｎｓｏｎ
５ｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃ０１社、Ｄａｎｂｕｒｙ
、Ｃｏｍｍｅｃｔｉｃｔ、ＵＳＡ）により溶かした（２
分間パルス処理、相応して１分間の純粋な音波処理時間
）。細胞断片および不溶解の細胞を冷却遠心分離機で３
０分間５℃で４００００Ｇで遠心分離した。澄んだ上澄
液（粗製抽出液）を酵素テストで使用した。酵素の活性
度の測定のための標準反応成分は次の組成を示す二０．
１Ｍのトリス−ＨＣ１２−＠ 養液中の３０ｍＭのＮ
−アセ チル−トープロリン（ｐＨ値ニア、０に調節）
ｌ−９ｍ１２０．１Ｍのトリス−Ｈ
ＣＱ−緩 養液（ｐＨ値： ７．０ ）
１．９５ｍ（２粗製抽出液
０．０５講ａこの反応を粗製抽出液の添加により開始
し、反応バッチを通常３Ｑ０ｃで１０分間インキュベー
トした。インキュベート時間および粗製抽出液量は、酵
素反応および後続するプロリン検出の直線領域を越えな
いように測った。
ｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ Ｂ−３０Ｂｒａｎｓｏｎ
５ｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃ０１社、Ｄａｎｂｕｒｙ
、Ｃｏｍｍｅｃｔｉｃｔ、ＵＳＡ）により溶かした（２
分間パルス処理、相応して１分間の純粋な音波処理時間
）。細胞断片および不溶解の細胞を冷却遠心分離機で３
０分間５℃で４００００Ｇで遠心分離した。澄んだ上澄
液（粗製抽出液）を酵素テストで使用した。酵素の活性
度の測定のための標準反応成分は次の組成を示す二０．
１Ｍのトリス−ＨＣ１２−＠ 養液中の３０ｍＭのＮ
−アセ チル−トープロリン（ｐＨ値ニア、０に調節）
ｌ−９ｍ１２０．１Ｍのトリス−Ｈ
ＣＱ−緩 養液（ｐＨ値： ７．０ ）
１．９５ｍ（２粗製抽出液
０．０５講ａこの反応を粗製抽出液の添加により開始
し、反応バッチを通常３Ｑ０ｃで１０分間インキュベー
トした。インキュベート時間および粗製抽出液量は、酵
素反応および後続するプロリン検出の直線領域を越えな
いように測った。
反応生成物のＬ−プロリンの検出はニンヒドリン検出に
より行った（ Ｙａｒｏｎおよび旧ｙｎａｒ 。
より行った（ Ｙａｒｏｎおよび旧ｙｎａｒ 。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏ
ｍｍｕｎ、 ３２（４）、 ６５８−６６３（１９６８
））。
ｍｍｕｎ、 ３２（４）、 ６５８−６６３（１９６８
））。
酵素テスト物質５０μαを１００％の酢酸ｉ。
２５ｍ（中にピペットで取り、それにより酵素反応を停
止させた。引続き０．１Ｍのトリス−ＨＣＱ−緩衝液（
ｐＨ値： ７．０） ０．４５ｍｆｆおよびニンヒドリ
ン試薬にンヒドリン３ｇを加熱しながら１００％の酢酸
６０ｙｒＱと６Ｍリン酸４Ｑｍ（２とからなる混合物に
溶かした）１−２５ｍ（！を添加した。ニンヒドリン試
薬を毎日新たに添加した。
止させた。引続き０．１Ｍのトリス−ＨＣＱ−緩衝液（
ｐＨ値： ７．０） ０．４５ｍｆｆおよびニンヒドリ
ン試薬にンヒドリン３ｇを加熱しながら１００％の酢酸
６０ｙｒＱと６Ｍリン酸４Ｑｍ（２とからなる混合物に
溶かした）１−２５ｍ（！を添加した。ニンヒドリン試
薬を毎日新たに添加した。
試料ガラス容器を螺嵌蓋でゆるく閉め、１０００Ｃで３
０分間インキユベートシ、引続き水浴で冷却した。
０分間インキユベートシ、引続き水浴で冷却した。
酵素による加水分解により遊離したＬ−プロリンは、ニ
ンヒドリンで１００℃で黄色の色素を形成し、この吸光
は分光分析装置で４８０ｎｏｌで、１バツチに対して粗
製抽出物なしで測定した。試料５０μＱ当りの５〜１０
０ ｎｍｏＱの範囲のＬ−プロリンの検量直線に基づき
生じたＬ−プロリンの膚度を測定した。酵素活性度は国
際単位で表し、その際、１単位（Ｕ）は、１分当り放出
したＬ−プロリン１μｍｏＱの量に相当する。
ンヒドリンで１００℃で黄色の色素を形成し、この吸光
は分光分析装置で４８０ｎｏｌで、１バツチに対して粗
製抽出物なしで測定した。試料５０μＱ当りの５〜１０
０ ｎｍｏＱの範囲のＬ−プロリンの検量直線に基づき
生じたＬ−プロリンの膚度を測定した。酵素活性度は国
際単位で表し、その際、１単位（Ｕ）は、１分当り放出
したＬ−プロリン１μｍｏＱの量に相当する。
タンパク質測定は、米国、イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒ
ｄ在、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ社のタン
パク質測定キットを用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ａｎａ
ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２＋２４８−２５４ （１９７
６）Ｊ：より実施した。
ｄ在、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ社のタン
パク質測定キットを用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ａｎａ
ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２＋２４８−２５４ （１９７
６）Ｊ：より実施した。
表１ニスクリーニングした多様な細菌株によるＮ−アシ
ル−Ｌ−プロリンの生成 菌株 比活性 （Ｕ／ｍｇ） Ｂ−ＡＩ（ＤＳＭ５４１７） ０．６４Ｂ−Ａ２
０．３４ Ｂ−Ａ３ ０．５５ Ｂ−Ｂ Ｏ，５９Ｂ −Ｋ （Ｄ
ＳＭ ５４１６） ２．９８Ｂ−Ｌ
Ｏ，１９Ｂ−Ｍ Ｏ
，０９Ｓｕｂ ４ ０．４２Ｓｕｂ
５ ０．１６表１に示したように、菌
株Ｂ−には前記したテスト方法において特に最も高い活
性度を示し、従って酵素の製造に使用した。菌株Ｂ−に
およびＢ−Ａｔは、西ドイツ国ブラウンシュバイク（Ｂ
ｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）在のＤｅｕＬｓｃｈｅｎ Ｓ
ａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ Ｍｉｋｌｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ
ｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｄ
ＳＭ）により、コマモナス テストステロニＣｏｍａｍ
ｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉおよびアルカリゲ
ネス デニトリフィカンス Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｄｅｎｉＬｒｉｆ １ｅａｎｓとして確認された。
ル−Ｌ−プロリンの生成 菌株 比活性 （Ｕ／ｍｇ） Ｂ−ＡＩ（ＤＳＭ５４１７） ０．６４Ｂ−Ａ２
０．３４ Ｂ−Ａ３ ０．５５ Ｂ−Ｂ Ｏ，５９Ｂ −Ｋ （Ｄ
ＳＭ ５４１６） ２．９８Ｂ−Ｌ
Ｏ，１９Ｂ−Ｍ Ｏ
，０９Ｓｕｂ ４ ０．４２Ｓｕｂ
５ ０．１６表１に示したように、菌
株Ｂ−には前記したテスト方法において特に最も高い活
性度を示し、従って酵素の製造に使用した。菌株Ｂ−に
およびＢ−Ａｔは、西ドイツ国ブラウンシュバイク（Ｂ
ｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）在のＤｅｕＬｓｃｈｅｎ Ｓ
ａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ Ｍｉｋｌｏｏｒｇａｎｉｓｍｅ
ｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｄ
ＳＭ）により、コマモナス テストステロニＣｏｍａｍ
ｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉおよびアルカリゲ
ネス デニトリフィカンス Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｄｅｎｉＬｒｉｆ １ｅａｎｓとして確認された。
例２：コマモナス テストステロニ ＤＳＭ５４１６の
増殖およびアシラーゼ形成 ａ）多様な炭素源上の増殖およびアシラーゼ形成 コマモナス テストステロニ ＤＳＭ ５４１６をｆ
ｌＩＩに記載したように培養基中で増殖させ、細胞を超
音波により溶かし、Ｎ−アシル−Ｌ−プロリンの比活性
度を測定した。４９／１２の濃度を有する培養基の炭素
源を変え、増殖およびアシラーゼ形成に関する影響を測
定した。
増殖およびアシラーゼ形成 ａ）多様な炭素源上の増殖およびアシラーゼ形成 コマモナス テストステロニ ＤＳＭ ５４１６をｆ
ｌＩＩに記載したように培養基中で増殖させ、細胞を超
音波により溶かし、Ｎ−アシル−Ｌ−プロリンの比活性
度を測定した。４９／１２の濃度を有する培養基の炭素
源を変え、増殖およびアシラーゼ形成に関する影響を測
定した。
表２＝異なる炭素源のＮ−アシル−Ｌ−プａリン−アシ
ラーゼの増殖および比活性への影響 Ｃ源＊ 増殖 比活性 （０Ｄｓｏｏ） （Ｕ ／ ｍｇ）Ｎ−γセチ
に−Ｌ−ｈｌリン ６．０ ２．
２６アセテート ２．３
＜０−０１プロピオネート １
．９ ＜０．０１ブチレー）
１．８ ＜０．０１
ビルベー） ２．４
＜０．０１ラクテート ３
．０ ＜０．０１マレニー）
３．４ ＜０．０１グ
リセリン １．１
＜０．０１Ｌ−アスバルテー） ２．０
＜０．０１Ｌ−ロイシン
２．６ ＜０．０１Ｌ−プロリ
ン ３．９ ＜０．０
１＊ アラビノース、グルコース、フラクトースラクト
ース、マルトース、マンノース、サッカロース、キシロ
ース、シトレート、フェニルアセテート、Ｌ−アルギン
ニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−セリンおよびＬ−トリプト
ファンに関しては増殖せず 表２から見られるように、Ｎ−アシル−Ｌ−アシラーゼ
は、コマモナス テストステロニＤＳＭ ５４１６に
よる、炭素源としてＮ−アセチル−Ｌ−プロリンを用い
た増殖の際にのみ形成される。その他の炭素源を用いた
増殖の際には酵素活性は検出されなかった。
ラーゼの増殖および比活性への影響 Ｃ源＊ 増殖 比活性 （０Ｄｓｏｏ） （Ｕ ／ ｍｇ）Ｎ−γセチ
に−Ｌ−ｈｌリン ６．０ ２．
２６アセテート ２．３
＜０−０１プロピオネート １
．９ ＜０．０１ブチレー）
１．８ ＜０．０１
ビルベー） ２．４
＜０．０１ラクテート ３
．０ ＜０．０１マレニー）
３．４ ＜０．０１グ
リセリン １．１
＜０．０１Ｌ−アスバルテー） ２．０
＜０．０１Ｌ−ロイシン
２．６ ＜０．０１Ｌ−プロリ
ン ３．９ ＜０．０
１＊ アラビノース、グルコース、フラクトースラクト
ース、マルトース、マンノース、サッカロース、キシロ
ース、シトレート、フェニルアセテート、Ｌ−アルギン
ニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−セリンおよびＬ−トリプト
ファンに関しては増殖せず 表２から見られるように、Ｎ−アシル−Ｌ−アシラーゼ
は、コマモナス テストステロニＤＳＭ ５４１６に
よる、炭素源としてＮ−アセチル−Ｌ−プロリンを用い
た増殖の際にのみ形成される。その他の炭素源を用いた
増殖の際には酵素活性は検出されなかった。
ｂ）異なる出発ｐＨ値における増殖およびアシラーゼ形
成 例１に記載したと同様であるが、Ｎ−アセチル−Ｌ−プ
ロリン２ ｇ／ Ｑを有する培養基において、ｐＨ値を
６．０〜８．０の範囲で、段階的に０．５単位づつ変化
させた。１７．５時間のインキュベート時間の後に、培
養基のｐ Ｈ値、６００ｎｍでの光学密度の測定による
増殖、Ｎ−アシル〜Ｌ−プロリンーアシラーゼの比活性
度を測定した。
成 例１に記載したと同様であるが、Ｎ−アセチル−Ｌ−プ
ロリン２ ｇ／ Ｑを有する培養基において、ｐＨ値を
６．０〜８．０の範囲で、段階的に０．５単位づつ変化
させた。１７．５時間のインキュベート時間の後に、培
養基のｐ Ｈ値、６００ｎｍでの光学密度の測定による
増殖、Ｎ−アシル〜Ｌ−プロリンーアシラーゼの比活性
度を測定した。
表３：増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラー
ゼの形成の培養基のｐＨ値によるの依存性 出発ｐＨ最終ｐＨ増殖 比活性 （０Ｄａｏｏ） （Ｕ ／ ｍｇ）６．０ ８
．００ ３．５５ １．５２６．５ ８．
０５ ３．７８ １．３１７．０ ８．０
０ ３．８０ １．３６７．５ ８．０６
３．５３ １．３４８．０ ８．００
３．８８ ０．５８表３は、最終ｐＨ値および
増殖が培養基の出発ｐＨ値により影響されないことを示
す。６゜０〜７．５のｐＨ範囲内において、アシラーゼ
の比活性度は本質的に影響されず、ｐ Ｈ８，０で酵素
活性度のほぼ３分のｌが達成されるにすぎない。
ゼの形成の培養基のｐＨ値によるの依存性 出発ｐＨ最終ｐＨ増殖 比活性 （０Ｄａｏｏ） （Ｕ ／ ｍｇ）６．０ ８
．００ ３．５５ １．５２６．５ ８．
０５ ３．７８ １．３１７．０ ８．０
０ ３．８０ １．３６７．５ ８．０６
３．５３ １．３４８．０ ８．００
３．８８ ０．５８表３は、最終ｐＨ値および
増殖が培養基の出発ｐＨ値により影響されないことを示
す。６゜０〜７．５のｐＨ範囲内において、アシラーゼ
の比活性度は本質的に影響されず、ｐ Ｈ８，０で酵素
活性度のほぼ３分のｌが達成されるにすぎない。
Ｃ）多様なＮ−アセチル−Ｌ−プロリン濃度での増殖お
よびアシラーゼ形成 例１に記載したと同様の培養基中でＮ−アセチル−Ｌ−
プロリン濃度は１ｇ／＋２〜５ｇ／Ｑの範囲内で段階的
に１ｇ１Ｑづつ変化させた。２４時間インキュベート時
間の後に増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラ
ーゼの比活性度を測定した。
よびアシラーゼ形成 例１に記載したと同様の培養基中でＮ−アセチル−Ｌ−
プロリン濃度は１ｇ／＋２〜５ｇ／Ｑの範囲内で段階的
に１ｇ１Ｑづつ変化させた。２４時間インキュベート時
間の後に増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラ
ーゼの比活性度を測定した。
表４＝増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラー
ゼの形成培養基のＮ−アセチル−Ｌ−プロリン濃度によ
る依存性 Ｎ−アセチル−Ｌ−グｄりン 増殖（ｇ／
＋２） （００６００）なし
０．３９ １ １．９５２
３．１６３
４．３２４ ５．４
２５ ５．６８比活性 （Ｕ ／ ｍｇ） ｎ、ｂ。
ゼの形成培養基のＮ−アセチル−Ｌ−プロリン濃度によ
る依存性 Ｎ−アセチル−Ｌ−グｄりン 増殖（ｇ／
＋２） （００６００）なし
０．３９ １ １．９５２
３．１６３
４．３２４ ５．４
２５ ５．６８比活性 （Ｕ ／ ｍｇ） ｎ、ｂ。
１．３３
１．３６
１．７７
１．８４
０．９４
表４は、
達成した細胞密度がＮ−アセチル−
Ｌ−プロリンの使用量に依存することを示す。
Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンなしではわずかな増殖が見
られたにすぎず、これは培養基中にある酵母抽出物に起
因する。Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン濃度が増加すると
共に、アシラーゼの比活性度は上昇し、Ｎ−アセチル−
Ｌ−プロリン４ｇ／Ｑで最適値を達成する。
られたにすぎず、これは培養基中にある酵母抽出物に起
因する。Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン濃度が増加すると
共に、アシラーゼの比活性度は上昇し、Ｎ−アセチル−
Ｌ−プロリン４ｇ／Ｑで最適値を達成する。
ｄ）多様な（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度での増殖およびアシ
ラーゼ形成 例１に記載したと同様な培養基中で、（Ｎ Ｈ４）２Ｓ
０４濃度を１ｇ／１２〜５ｇ／１２の範囲で段階的に１
ｇ／Ｑづつ変化させる。２３時間のインキュベート時間
の後に、増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラ
ーゼの形成を測定した。
ラーゼ形成 例１に記載したと同様な培養基中で、（Ｎ Ｈ４）２Ｓ
０４濃度を１ｇ／１２〜５ｇ／１２の範囲で段階的に１
ｇ／Ｑづつ変化させる。２３時間のインキュベート時間
の後に、増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラ
ーゼの形成を測定した。
表５＝増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリンアシラーゼ
の形成の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度による依存性 （Ｎ Ｈ４） ２Ｓ ０４ 増殖 比活性（ｇ
／ １２） （０Ｄｓｏｏ） （Ｕ ／
ｍｇ）なし ４．８２ ０．３８１
５．２４ １．７１２ ５．
６７ １．９１３ ５．４７
１．５３４ ５．４４ １．５９５
５．４７ １．３２表５は、２９／Ｑ
の（ＮＨ４）２Ｓ０４濃度での増殖およびアシラーゼの
形成が最適であることを示した。（ＮＨ４）２５０４は
明らかにアシラーゼの形成を促進する、それというのも
（ＮＨ４）２５０４なしではアシラーゼの比活性が最適
値の２０％にすぎず、一方達戒しＩ；細胞密度は本質的
に減少していないためである。この場合培養基中に存在
する酵母抽出物およびＮ−アセチルーＬ−プロリンから
遊離したＬ−プロリンは、細胞の増殖のための窒素源と
して役立つ。
の形成の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度による依存性 （Ｎ Ｈ４） ２Ｓ ０４ 増殖 比活性（ｇ
／ １２） （０Ｄｓｏｏ） （Ｕ ／
ｍｇ）なし ４．８２ ０．３８１
５．２４ １．７１２ ５．
６７ １．９１３ ５．４７
１．５３４ ５．４４ １．５９５
５．４７ １．３２表５は、２９／Ｑ
の（ＮＨ４）２Ｓ０４濃度での増殖およびアシラーゼの
形成が最適であることを示した。（ＮＨ４）２５０４は
明らかにアシラーゼの形成を促進する、それというのも
（ＮＨ４）２５０４なしではアシラーゼの比活性が最適
値の２０％にすぎず、一方達戒しＩ；細胞密度は本質的
に減少していないためである。この場合培養基中に存在
する酵母抽出物およびＮ−アセチルーＬ−プロリンから
遊離したＬ−プロリンは、細胞の増殖のための窒素源と
して役立つ。
ｅ）多様な酵母抽出物濃度での増殖およびアシラーゼ形
成 例１に記載したと同様の培養基中で、酵母抽出濃度を１
ｇ／Ｑ〜５ｇ／１２の範囲で段階的に１ｇ／Ｑづつ変化
させた。２４時間のインキュベート時間の後に、増殖お
よびＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの比活性を
測定した。
成 例１に記載したと同様の培養基中で、酵母抽出濃度を１
ｇ／Ｑ〜５ｇ／１２の範囲で段階的に１ｇ／Ｑづつ変化
させた。２４時間のインキュベート時間の後に、増殖お
よびＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの比活性を
測定した。
表６＝酵母抽出物濃度による増殖およびＮ−アシル−Ｌ
−プロリン−アシラーゼ形成の依存性 酵母抽出物 増殖 比活性（ｇ／ Ｑ”）
（ＯＤｓｏｏ） （Ｕ ／ ｍｇ’
）なし ０．０２ ｎ、ｂ。
−プロリン−アシラーゼ形成の依存性 酵母抽出物 増殖 比活性（ｇ／ Ｑ”）
（ＯＤｓｏｏ） （Ｕ ／ ｍｇ’
）なし ０．０２ ｎ、ｂ。
１ ６−１１ ２．１４２
７．０３ １．３０３
７．５５ １．３０４ ８．０５
１．２６５ ８．８２
１．４６ｎ、ｂ、 測定せず 表６は、アシラーゼの形成が酵母抽出物濃度ｌ ｇ／
Ｑで最適であり、一方で遠戚した細胞密度は酵母抽出物
濃度の増加と共に上昇することを示す。酵母抽出物なし
で細胞は増殖せず、このことは菌株の複合増殖培養基の
必要性を示す。
７．０３ １．３０３
７．５５ １．３０４ ８．０５
１．２６５ ８．８２
１．４６ｎ、ｂ、 測定せず 表６は、アシラーゼの形成が酵母抽出物濃度ｌ ｇ／
Ｑで最適であり、一方で遠戚した細胞密度は酵母抽出物
濃度の増加と共に上昇することを示す。酵母抽出物なし
で細胞は増殖せず、このことは菌株の複合増殖培養基の
必要性を示す。
ｆ）培養基中に酢酸塩およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン
を同時に提供した場合の増殖およびアシラーゼ形成 例１に記載したと同様の培養基中でＮ−アセチル−Ｌ−
プロリン濃度を０．２〜１．０９／＋２に減少させ、付
加的に酢酸Ｎａ４ｇ／（２を使用した。３４時間インキ
ュベートした後に増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン
−アシラーゼの比活性度を測定した。
を同時に提供した場合の増殖およびアシラーゼ形成 例１に記載したと同様の培養基中でＮ−アセチル−Ｌ−
プロリン濃度を０．２〜１．０９／＋２に減少させ、付
加的に酢酸Ｎａ４ｇ／（２を使用した。３４時間インキ
ュベートした後に増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン
−アシラーゼの比活性度を測定した。
表７：酢酸ＮａおよびＮ−アセチル−Ｌ−プロリンの同
時供給における増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン−
アシラーゼの誘導Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン
増殖 比活性なし ２．
３５ ０．２ ２．２７ ０・４ ２．９０ ０．６ ２．７５ ０．８ ３．０４ ＜０．０１ ０．５３ ０．７９ １．４１ １．７０ 表７はアシラーゼがＮ−アセチル−Ｌ−プロリンの存在
でのみ形成されるが、同時に酢酸塩によっても減少しな
い。このことは炭素源として酢酸塩およびＮ−アセチル
−Ｌ−プロリン濃度時に提供することにより、十分に大
量のバイオマスを得ることができ、その際、アシラーゼ
の形成を十分に誘導するためには、誘導物質０．６ｇＩ
Ｑで十分である。
時供給における増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン−
アシラーゼの誘導Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン
増殖 比活性なし ２．
３５ ０．２ ２．２７ ０・４ ２．９０ ０．６ ２．７５ ０．８ ３．０４ ＜０．０１ ０．５３ ０．７９ １．４１ １．７０ 表７はアシラーゼがＮ−アセチル−Ｌ−プロリンの存在
でのみ形成されるが、同時に酢酸塩によっても減少しな
い。このことは炭素源として酢酸塩およびＮ−アセチル
−Ｌ−プロリン濃度時に提供することにより、十分に大
量のバイオマスを得ることができ、その際、アシラーゼ
の形成を十分に誘導するためには、誘導物質０．６ｇＩ
Ｑで十分である。
ｇ）後期指数増殖期において、培養基へのＮ−アセチル
−Ｌ−プロリンの添加の場合の増殖およびアシラーゼ形
成 前記ｆ）に記載したように行った。誘導物質のＮ−アセ
チル−Ｌ−プロリンは、１２時間のインキュベート時間
の後の後期指数増殖期においてようやく培養基に添加さ
れた。その後、培養基を更に２４時間インキュベートし
、増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの
活性を測定した。
−Ｌ−プロリンの添加の場合の増殖およびアシラーゼ形
成 前記ｆ）に記載したように行った。誘導物質のＮ−アセ
チル−Ｌ−プロリンは、１２時間のインキュベート時間
の後の後期指数増殖期においてようやく培養基に添加さ
れた。その後、培養基を更に２４時間インキュベートし
、増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの
活性を測定した。
表８＝後期指数増殖期におけるＮ−アセチル−Ｌ−プロ
リンの添加の際の増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン
−アシラーゼの誘導Ｎ−１セチル−Ｌ−プロリン
増殖 比活性（ｇ／ Ｑ）
（ＯＤ６００） （Ｕ ／ ｍ９
）なし １．９２ ＜０．０１０．２
２．２２ ０．
５００．４ ２．２８
０．６３０．６ ２．７６
０．９６０．８
２．．９５ ０．６７１．０
２．８８ １．０８表７
および表８の比較は、アシラーゼ形成を十分に誘導する
ために、酢酸含有培養基中でＮ−アセチル−Ｌ−プロリ
ン０．６９／１２で十分であることを示している。この
場合、誘導物質は接種の前に、すでに培養基に添加して
おくのが有利である。
リンの添加の際の増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリン
−アシラーゼの誘導Ｎ−１セチル−Ｌ−プロリン
増殖 比活性（ｇ／ Ｑ）
（ＯＤ６００） （Ｕ ／ ｍ９
）なし １．９２ ＜０．０１０．２
２．２２ ０．
５００．４ ２．２８
０．６３０．６ ２．７６
０．９６０．８
２．．９５ ０．６７１．０
２．８８ １．０８表７
および表８の比較は、アシラーゼ形成を十分に誘導する
ために、酢酸含有培養基中でＮ−アセチル−Ｌ−プロリ
ン０．６９／１２で十分であることを示している。この
場合、誘導物質は接種の前に、すでに培養基に添加して
おくのが有利である。
ｈ）培養基中に酢酸Ｎａおよび多様なＮ−アセチル−ア
ミノ酸およびＮ−クロａアセチル−アミノ酸の同時供給
の際の増殖およびアシラーゼ形成 前記ｆ）に記載したように、行った。Ｎ−アセチル−Ｌ
−プロリンの代わりに、多様なＮ−アセチル−アミノ酸
およびＮ−クロロアセチル−アミノ酸を濃度１ｇ／Ｑで
培養基に添加した。
ミノ酸およびＮ−クロａアセチル−アミノ酸の同時供給
の際の増殖およびアシラーゼ形成 前記ｆ）に記載したように、行った。Ｎ−アセチル−Ｌ
−プロリンの代わりに、多様なＮ−アセチル−アミノ酸
およびＮ−クロロアセチル−アミノ酸を濃度１ｇ／Ｑで
培養基に添加した。
２４時間のインキュベート時間の後に増殖およびＮ−ア
シル−し−プａリン−アシラーゼの比活性を測定した。
シル−し−プａリン−アシラーゼの比活性を測定した。
表９
：増殖およびアシラーゼ形成に関スるＮ−アセチル−ア
ミノ酸およびＮ−クロロアセチル−アミノ酸の影響 誘導物質 増殖 比活性 （０Ｄｓｏｏ） （Ｕ ／ １１９）なし
２．６０ ＜ ０．０１Ａｃ−Ｌ−Ａｌ
ａ ２−２８ ＜ ０．０１Ａｃ−
Ｌ−Ｐｒｏ ３．４６ １．３４Ｃ
ＣＡｃ−Ｌ−Ｍｅｔ ２−１９ ＜
０．０１Ｃ＋２Ａｃ−Ｌ−Ｖａｌ ２．５０
＜ ０．０１ＣＱＡｃ−Ｌ−Ｌｅｕ
２．６５ ＜ ０．０ＩＣ（ｌＡｃ−Ｌ−Ｐｈ
ｅ ２−８９ ＜ ０．０１ＣＱＡｃ
−Ｌ−Ｔｙｒ ２．７６ ＜ ０．０
１表９かられかるように、テストしたＮ−アセチル−ア
ミノ酸およびＮ−クロロアセチル−アミノ酸の中で、も
っばらＮ−アセチル−Ｌ−プロリンだけがアシラーゼ形
成を誘導した。
ミノ酸およびＮ−クロロアセチル−アミノ酸の影響 誘導物質 増殖 比活性 （０Ｄｓｏｏ） （Ｕ ／ １１９）なし
２．６０ ＜ ０．０１Ａｃ−Ｌ−Ａｌ
ａ ２−２８ ＜ ０．０１Ａｃ−
Ｌ−Ｐｒｏ ３．４６ １．３４Ｃ
ＣＡｃ−Ｌ−Ｍｅｔ ２−１９ ＜
０．０１Ｃ＋２Ａｃ−Ｌ−Ｖａｌ ２．５０
＜ ０．０１ＣＱＡｃ−Ｌ−Ｌｅｕ
２．６５ ＜ ０．０ＩＣ（ｌＡｃ−Ｌ−Ｐｈ
ｅ ２−８９ ＜ ０．０１ＣＱＡｃ
−Ｌ−Ｔｙｒ ２．７６ ＜ ０．０
１表９かられかるように、テストしたＮ−アセチル−ア
ミノ酸およびＮ−クロロアセチル−アミノ酸の中で、も
っばらＮ−アセチル−Ｌ−プロリンだけがアシラーゼ形
成を誘導した。
例３：Ｎ−アセチルーＬ−プロリンの精製ａ）コマモナ
ス テストステロニ ＤＳＭ ５４１６の培養および
粗製抽出物の取得 コマモナステストステａ二ＤＳＭ５４１６を傾斜寒天（
西ドイツ国Ｄａｒｍｓｔａｄｔ在、ＩＪｅｒｋ ＡＧ社
のカゼインペプトン−大豆粉末ペプトン−寒天）上で培
養し、傾斜寒天試験管Ｉｍ当り、無菌の０，９％（ｗ／
ｖ）のＮａＣＱ溶液４．５＋＋＋Ｑで懸濁させた。こう
して得られた細胞懸濁液を、４個のエルレンマイヤーフ
ラスコＣ２０，４（ｍの差し込み口を有する）用の接種
物として用いこのフラスコは、例１に記載したと同様に
それぞれ接種培養基５０Ｑｍｆｆを有していた。このエ
ルレンマイヤーフラスコを２１時間ラウンドシェイカー
で３０℃でｌｏｏｒｐｍでインキュベートし、細胞を例
１に記載したと同様に収穫し、洗浄し、ｐ Ｈ７，０の
Ｏ，１Ｍ１−リスーＨＣＱ緩衝液３（１＋Ｑ中に再懸濁
させ、超音波で溶かし ｔこ 。
ス テストステロニ ＤＳＭ ５４１６の培養および
粗製抽出物の取得 コマモナステストステａ二ＤＳＭ５４１６を傾斜寒天（
西ドイツ国Ｄａｒｍｓｔａｄｔ在、ＩＪｅｒｋ ＡＧ社
のカゼインペプトン−大豆粉末ペプトン−寒天）上で培
養し、傾斜寒天試験管Ｉｍ当り、無菌の０，９％（ｗ／
ｖ）のＮａＣＱ溶液４．５＋＋＋Ｑで懸濁させた。こう
して得られた細胞懸濁液を、４個のエルレンマイヤーフ
ラスコＣ２０，４（ｍの差し込み口を有する）用の接種
物として用いこのフラスコは、例１に記載したと同様に
それぞれ接種培養基５０Ｑｍｆｆを有していた。このエ
ルレンマイヤーフラスコを２１時間ラウンドシェイカー
で３０℃でｌｏｏｒｐｍでインキュベートし、細胞を例
１に記載したと同様に収穫し、洗浄し、ｐ Ｈ７，０の
Ｏ，１Ｍ１−リスーＨＣＱ緩衝液３（１＋Ｑ中に再懸濁
させ、超音波で溶かし ｔこ 。
ｂ）７０℃−加熱沈澱
細胞を含んでいない粗製抽出物（３８，５ｍｆｆ）を３
０分間に、水浴で７０℃の温度でインキュベートした。
０分間に、水浴で７０℃の温度でインキュベートした。
この時間の後に沈澱したタンパク質を遠心分離（４００
００Ｇで５℃で３０分間）により分離した。
００Ｇで５℃で３０分間）により分離した。
Ｃ）濾過による濃縮
７０℃の加熱沈澱の残分（３４，５ｍ！２）を、撹拌セ
ル（米国、デンバー在Ｗ、Ｒ，Ｇｒａｃｅ Ｃｏ、社。
ル（米国、デンバー在Ｗ、Ｒ，Ｇｒａｃｅ Ｃｏ、社。
Ａｍ１ｃｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎのモデル８０５０）中
で、４バールの圧力で、窒素下で、排除限界ｉｏｏ。
で、４バールの圧力で、窒素下で、排除限界ｉｏｏ。
００ダルトン（ＹＭ １００）の平面膜を通して濾過
によりａ縮した。
によりａ縮した。
ｄ ） Ｍｏｎｏ Ｑでの高速プロティン液体クロマト
グラフィー（ＦＰＬＣ） 濾過の保持物（４，５ｍ４）を、０．５Ｘ５ｃ＋ｎのＭ
ｏｎｏ Ｑ−カラム（スウェーデン国、Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ／ＬＫＢ社、 Ｕｐｐｓａ ｌａ）に装入し、ｌ
ｒｔｒＱ１分の流れでクロマトグラフィーにかけた。
グラフィー（ＦＰＬＣ） 濾過の保持物（４，５ｍ４）を、０．５Ｘ５ｃ＋ｎのＭ
ｏｎｏ Ｑ−カラム（スウェーデン国、Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ／ＬＫＢ社、 Ｕｐｐｓａ ｌａ）に装入し、ｌ
ｒｔｒＱ１分の流れでクロマトグラフィーにかけた。
アニオン交換体よ、試料供給の前に、ｐ Ｈ７，０の０
．１Ｍ）リスーＨＣＱ緩衝液で平衡化させた。ｐＨ７゜
Ｏの０．１Ｍ１−リス−ＨＣＱ緩衝液中で、０−０゜４
Ｍに直線的に上昇するＮａＣＱの勾配液で溶離した。酵
素の溶離は、０．２〜０．２５ＭのＮａＣＱで行った。
．１Ｍ）リスーＨＣＱ緩衝液で平衡化させた。ｐＨ７゜
Ｏの０．１Ｍ１−リス−ＨＣＱ緩衝液中で、０−０゜４
Ｍに直線的に上昇するＮａＣＱの勾配液で溶離した。酵
素の溶離は、０．２〜０．２５ＭのＮａＣＱで行った。
１工程当り０．２ｍＱの試料容量で、合計１４工程行っ
た。活性フラクションを合わせ、−２０℃で凍結させた
。
た。活性フラクションを合わせ、−２０℃で凍結させた
。
この後精製の結果を表１０に示した。
表１０：Ｎ−アシルーＬ−プロリンーアシラーゼの精製
経路 容量 総プロティン 総活性度 （ｍの （■） （Ｕ） 粗製抽出物 ３８．５ ４７２．０ ７５４．
７７０℃−加慈沈ｌ ３４．５ ８６
．６ ６１８．０濃縮 ４．５
５６．２ ５８５．６（Ａ叫ｃｏｎ−１けセル ＹＭ−１００１，１００ＯＯＯＤ） ＦＰＬＣ−ＩＪｏｎｏ Ｑ ２７．５ 比活性 （Ｕ／■） １．６０ ７．１４ １０．４２ ８５．１６ ３７４．７ ４．４ 精製工程 濃縮度 （＠） ４．５ ６．５ ５３．２ 例４：ｐＨ値による反応速度の依存性 アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの存在で、化合物の
Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンから酢酸を加水分解により
分離する反応速度は、反応混合物のｐＨ値に依存して決
められる。テストバッチは次の組成を有していた： 下記のＯ，１Ｍ緩衝液中のＮ−アセチル−Ｌ−プロリン
ｌｏｍＭ ２．９５ｍ！アシラーゼ
０．０５璃αアシラーゼ添加による
反応の開始の前に、基質緩衝液混合物のｐＨ値を、０．
１Ｍの酢酸／ＮａＯＨ緩衝液において４．０〜５，０の
範囲内で、Ｏ，１Ｍのクエン酸／ Ｎ ａ ＯＨ緩衝液
において５．０〜６．０の範囲内で、０．１Ｍのに２Ｈ
Ｐ ０４／ Ｋ Ｈ４Ｆ Ｏ４緩衝液において６．０〜
７．５の範囲内で、０．１Ｍトリス−ＨＣＱ緩衝液にお
いて６．２〜９．０の範囲内で、および１．０ＭのＮ
ａ２ｃＯ３／Ｎ ａ ＨＣＯ３緩衝液において９．０−
１０．０の範囲内で、２Ｎ ＮａＯＨの添加により、
所望のｐＨ値に調節した。３００Ｃで１０分間の反応時
間の後に、酵素活性を、出け１ノーｒ−プロ１１ン小二
ソＰビ１↑ン論宏ｌ−ｔり測定した。
経路 容量 総プロティン 総活性度 （ｍの （■） （Ｕ） 粗製抽出物 ３８．５ ４７２．０ ７５４．
７７０℃−加慈沈ｌ ３４．５ ８６
．６ ６１８．０濃縮 ４．５
５６．２ ５８５．６（Ａ叫ｃｏｎ−１けセル ＹＭ−１００１，１００ＯＯＯＤ） ＦＰＬＣ−ＩＪｏｎｏ Ｑ ２７．５ 比活性 （Ｕ／■） １．６０ ７．１４ １０．４２ ８５．１６ ３７４．７ ４．４ 精製工程 濃縮度 （＠） ４．５ ６．５ ５３．２ 例４：ｐＨ値による反応速度の依存性 アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの存在で、化合物の
Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンから酢酸を加水分解により
分離する反応速度は、反応混合物のｐＨ値に依存して決
められる。テストバッチは次の組成を有していた： 下記のＯ，１Ｍ緩衝液中のＮ−アセチル−Ｌ−プロリン
ｌｏｍＭ ２．９５ｍ！アシラーゼ
０．０５璃αアシラーゼ添加による
反応の開始の前に、基質緩衝液混合物のｐＨ値を、０．
１Ｍの酢酸／ＮａＯＨ緩衝液において４．０〜５，０の
範囲内で、Ｏ，１Ｍのクエン酸／ Ｎ ａ ＯＨ緩衝液
において５．０〜６．０の範囲内で、０．１Ｍのに２Ｈ
Ｐ ０４／ Ｋ Ｈ４Ｆ Ｏ４緩衝液において６．０〜
７．５の範囲内で、０．１Ｍトリス−ＨＣＱ緩衝液にお
いて６．２〜９．０の範囲内で、および１．０ＭのＮ
ａ２ｃＯ３／Ｎ ａ ＨＣＯ３緩衝液において９．０−
１０．０の範囲内で、２Ｎ ＮａＯＨの添加により、
所望のｐＨ値に調節した。３００Ｃで１０分間の反応時
間の後に、酵素活性を、出け１ノーｒ−プロ１１ン小二
ソＰビ１↑ン論宏ｌ−ｔり測定した。
トリス−ＨＣＱ緩衝液においての反応速度の最適値は、
６．２〜７．２のｐＨ範囲であり、リン酸カリウム緩衝
液においての最適ｐＨ（ｉｉＬは、〉７．５の範囲であ
るが、反応速度はトリス−ＨＣＱ緩衝液と比較して１５
％より少ない。リン酸塩は酵素を阻害した。
６．２〜７．２のｐＨ範囲であり、リン酸カリウム緩衝
液においての最適ｐＨ（ｉｉＬは、〉７．５の範囲であ
るが、反応速度はトリス−ＨＣＱ緩衝液と比較して１５
％より少ない。リン酸塩は酵素を阻害した。
例５：最適反応温度
ｐＨ７，５の０．１Ｍトリス−ＨＣＱ緩衝液中の１０ｍ
ＭＮ−アセチル−Ｌ−プロリン２．９５ｎ＋Ｑを有する
反応バッチを、２２〜８５℃の温度で１０分間にあらか
じめ温度調節し、次いで反応をアシラーゼ０−０５ｍ１
２を添加することで開始しｔ；。５分間の反応時間の後
、酵素活性を生じたＬ−プロリンのニンヒドリン検出で
測定し ｔこ 。
ＭＮ−アセチル−Ｌ−プロリン２．９５ｎ＋Ｑを有する
反応バッチを、２２〜８５℃の温度で１０分間にあらか
じめ温度調節し、次いで反応をアシラーゼ０−０５ｍ１
２を添加することで開始しｔ；。５分間の反応時間の後
、酵素活性を生じたＬ−プロリンのニンヒドリン検出で
測定し ｔこ 。
最大反応速度は６５℃で遠戚され、３０℃の標準温度に
よるよりもファクター２，３だけ高かった。
よるよりもファクター２，３だけ高かった。
例６：Ｎ−アシル−Ｌ−ブロリンーアシラーゼの安定性
ａ）ｐＨ安定性
Ｎ−アシル−Ｌ−プロリンーアシラーゼのｐＨ安定性は
４．２〜１０．４のｐｌ−１範期で試験した。ＦＰＬＣ
／Ｍｏｎｏ Ｑで精製した酵素を、異なるｐＨ値を有
する０、１Ｍの異なる緩衝液で１０倍に希釈し、３週間
２２℃で貯蔵した。異なる時間で試料（０，２ｍ１２）
を取り出し、その酵素活性を、次の組成の反応バッチ中
で測定した： ｐＨ７，５の０゜ＩＭ）リスーＨＣ１２緩衝液中の１０
ｍＭＮ−アセチル−Ｌ−プロリン ２．８ｒｘＱ アシラーゼ（１：１０に希釈）０．２ｒＲＩ２表１から
明らかなように、酵素はクエン酸により急速に失活し、
ｐＨ７，４および１Ｏ０４のトリス−ＨＣＱ緩衝液およ
びＮａ炭酸塩緩衝液中であまり活性度の損失は確認でき
なかつｔ；。
４．２〜１０．４のｐｌ−１範期で試験した。ＦＰＬＣ
／Ｍｏｎｏ Ｑで精製した酵素を、異なるｐＨ値を有
する０、１Ｍの異なる緩衝液で１０倍に希釈し、３週間
２２℃で貯蔵した。異なる時間で試料（０，２ｍ１２）
を取り出し、その酵素活性を、次の組成の反応バッチ中
で測定した： ｐＨ７，５の０゜ＩＭ）リスーＨＣ１２緩衝液中の１０
ｍＭＮ−アセチル−Ｌ−プロリン ２．８ｒｘＱ アシラーゼ（１：１０に希釈）０．２ｒＲＩ２表１から
明らかなように、酵素はクエン酸により急速に失活し、
ｐＨ７，４および１Ｏ０４のトリス−ＨＣＱ緩衝液およ
びＮａ炭酸塩緩衝液中であまり活性度の損失は確認でき
なかつｔ；。
Ｎａ−酢酸塩
ｐＨ４，２
ｐＨ４，６
ｐＨ５，２
Ｎａ−クエン酸塩
ｐ Ｈ５，０
ｐ Ｈ５，５
ｐ Ｈ６，０
に−リン酸塩
ｐＨ６，０
ｐＨ６，５
ｐＨ７，０
ｐＨ７，５
トリス−ＨＣＱ
ｐＨ７，４
ｐＨ８，０
ｐＨ８，５
ｐ Ｈ９，０
Ｎａ−炭酸塩
ｐＨ８，７
ｐＨ９，３
ｐＨ９，９
９３ｌｏｔ ９８ ６５ ３８ｂ）
熱安定性 ｐＨ７，５の０．１Ｍトリス−ＨＣＩ２緩衝液に溶かし
たアシラーゼを、３０分間２０〜８５℃の温度でインキ
ュベートした。次いで酵素活性度を３０℃で次の組成の
反応バッチ中で測定しｔこ ： ｐ Ｈ７，５のＯ，１Ｍトリス−ＨＣＱ緩衝液中の１０
ｍＭＮ−アセチル−Ｌ−プロリン２．９５＋ｌＩＱ アシラーゼ ０．０５ｍＱ７０℃で
３０分間インキュベートした後、酵素の活性損失は検出
できず、しかし高めた温度で酵素は急速に失・活した。
熱安定性 ｐＨ７，５の０．１Ｍトリス−ＨＣＩ２緩衝液に溶かし
たアシラーゼを、３０分間２０〜８５℃の温度でインキ
ュベートした。次いで酵素活性度を３０℃で次の組成の
反応バッチ中で測定しｔこ ： ｐ Ｈ７，５のＯ，１Ｍトリス−ＨＣＱ緩衝液中の１０
ｍＭＮ−アセチル−Ｌ−プロリン２．９５＋ｌＩＱ アシラーゼ ０．０５ｍＱ７０℃で
３０分間インキュベートした後、酵素の活性損失は検出
できず、しかし高めた温度で酵素は急速に失・活した。
例７：阻害物質および活性化物質の影響Ｎ−アセチル−
Ｌ−プロリンの加水分解的分割の反応速度に関する、異
なる化学的試薬ならびに金属カチオンおよびアニオンの
影響は、３Ｑ ′Ｏで次の組成の反応バッチ中で測定し
た：ｐ Ｈ７，０の０．１Ｍトリス−ＨＣＱ緩衝液中の
３０ｍＭＮ−アセチル−Ｌ−プロリン １．０ｍ＋２ 前記緩衝液中の３もしくは３０ｍＭの阻害物質１、Ｑｍ
Ｑ ｐＨ７，ＯのＯ，１Ｍ）リスーＨＣ１２緩衝液０．９５
＋＋＋Ｑ アシラーゼ ０．０５＋ｎ１２ａ
）異なる化学的試薬の影響 表１２から、１．１０−フェナントロリン２−メルカプ
トエタノール、４−クロロメルクリベンゾエートおよび
４−ヒドロキシメルクリベンゾエートはアシラーゼを明
らかに阻害することがわかった。基質の添加によって反
応を開始する前に、酵素を１０分間３０ ’Ｏで作用物
質と共に前インキュベートしｔ；。
Ｌ−プロリンの加水分解的分割の反応速度に関する、異
なる化学的試薬ならびに金属カチオンおよびアニオンの
影響は、３Ｑ ′Ｏで次の組成の反応バッチ中で測定し
た：ｐ Ｈ７，０の０．１Ｍトリス−ＨＣＱ緩衝液中の
３０ｍＭＮ−アセチル−Ｌ−プロリン １．０ｍ＋２ 前記緩衝液中の３もしくは３０ｍＭの阻害物質１、Ｑｍ
Ｑ ｐＨ７，ＯのＯ，１Ｍ）リスーＨＣ１２緩衝液０．９５
＋＋＋Ｑ アシラーゼ ０．０５＋ｎ１２ａ
）異なる化学的試薬の影響 表１２から、１．１０−フェナントロリン２−メルカプ
トエタノール、４−クロロメルクリベンゾエートおよび
４−ヒドロキシメルクリベンゾエートはアシラーゼを明
らかに阻害することがわかった。基質の添加によって反
応を開始する前に、酵素を１０分間３０ ’Ｏで作用物
質と共に前インキュベートしｔ；。
表１２：アシラーゼ活性に関する異なる化学的試薬の影
響ＥＤＴＡ Ｎａ−クヱン蔭直 ２．２−ビピリジン １．１０−フェナントロリン ジチオテレイトール グルタチオン ２−メルカプ）エタノール ４−クロロメルクリベンゾエート ４−ヒｐｏｔシメルクリベンゾエート ヨーＦア七トアミＦ ヨードＴ七テート セミカルバジド ＭＳＦ ！２９ ｏｔ ｂ）異なる金属カチオンの影響 表１３から、天然の酵素を、テストした金属カチオンに
より活性化したものはなかったことが示された。Ｃｄ２
＋ Ｃｕ２＋ Ｆｅ２＋ Ｆｅ３＋Ｈｇ ２ ＋ ５
ｎ ２＋およびＺｎ２＋が阻害作用した。基質の添加
により反応を開始する前に、酵素を３０ ’Ｏで１０分
間作用物質と共に前インキュベートした。
響ＥＤＴＡ Ｎａ−クヱン蔭直 ２．２−ビピリジン １．１０−フェナントロリン ジチオテレイトール グルタチオン ２−メルカプ）エタノール ４−クロロメルクリベンゾエート ４−ヒｐｏｔシメルクリベンゾエート ヨーＦア七トアミＦ ヨードＴ七テート セミカルバジド ＭＳＦ ！２９ ｏｔ ｂ）異なる金属カチオンの影響 表１３から、天然の酵素を、テストした金属カチオンに
より活性化したものはなかったことが示された。Ｃｄ２
＋ Ｃｕ２＋ Ｆｅ２＋ Ｆｅ３＋Ｈｇ ２ ＋ ５
ｎ ２＋およびＺｎ２＋が阻害作用した。基質の添加
により反応を開始する前に、酵素を３０ ’Ｏで１０分
間作用物質と共に前インキュベートした。
表１３：アシラーゼ活性に関する異なるカチオンの影響
ａＣ１２２ ａＣＱ２ ｄＣＩ２２ ｏＣＱ２ ｕＳＯ４ ｅＳＯ４ ｅＣＱ３ ｇＣＩ２２ ｇＣＱ２ ｎＣｆｆ２ （ＮＯ３） ２ ｎＣｌ２２ ｒＣＩ２２ ｎＳＯ４ ｎ、ｂ。
ａＣ１２２ ａＣＱ２ ｄＣＩ２２ ｏＣＱ２ ｕＳＯ４ ｅＳＯ４ ｅＣＱ３ ｇＣＩ２２ ｇＣＱ２ ｎＣｆｆ２ （ＮＯ３） ２ ｎＣｌ２２ ｒＣＩ２２ ｎＳＯ４ ｎ、ｂ。
ｎ、ｂ。
覆ＩＪ足でさす
Ｃ）異なるアニオンの影響
表１４から、アシラーゼがリン酸塩により著しく阻害さ
れ、炭酸塩および窒素化物により弱く阻害されることが
示された。リン酸塩の阻害機構は非競争的であった。基
質の添加により反応を開始する前に、酵素を３０℃で１
０分間作用物質とともに前インキュベートしｔ；。アニ
オンの濃度はそれぞれｌｏｍＭである。
れ、炭酸塩および窒素化物により弱く阻害されることが
示された。リン酸塩の阻害機構は非競争的であった。基
質の添加により反応を開始する前に、酵素を３０℃で１
０分間作用物質とともに前インキュベートしｔ；。アニ
オンの濃度はそれぞれｌｏｍＭである。
表１４：アシラーゼ活性度に関する異なるアニオンの影
響 作用物質 なし ａＣＱ ａ２ＣＯ３ ＮａＨ２ＰＯ４ ａ２ＳＯ４ ａＮＯ２ ＮＯ３ 活性度（％） 、ｄ）１．１０−フェナントロリンにより失活したアシ
ラーゼ（アボ酵素）に関する異なるカチオンの影響 ＦＰＬＣ／Ｍｏｎｏ Ｑ精製した酵素を、１１０−フ
ェナントロリンの存在で４℃で２４時間インキュベート
しｔ；。引続き酵素とキレート形成剤の１．１０−フェ
ナントロリンを、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｍ （Ｐ
Ｄ−１０，Ｐｈａｒｍａｃｔａ社／ＬＫＢ、 Ｕｐｐｓ
ａｌａ、スエーデン国）のゲル濾過により分離した。酵
素含有フラクションを合わせ活性度を異なるカチオンの
不在でまたは存在で測定した。
響 作用物質 なし ａＣＱ ａ２ＣＯ３ ＮａＨ２ＰＯ４ ａ２ＳＯ４ ａＮＯ２ ＮＯ３ 活性度（％） 、ｄ）１．１０−フェナントロリンにより失活したアシ
ラーゼ（アボ酵素）に関する異なるカチオンの影響 ＦＰＬＣ／Ｍｏｎｏ Ｑ精製した酵素を、１１０−フ
ェナントロリンの存在で４℃で２４時間インキュベート
しｔ；。引続き酵素とキレート形成剤の１．１０−フェ
ナントロリンを、５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｍ （Ｐ
Ｄ−１０，Ｐｈａｒｍａｃｔａ社／ＬＫＢ、 Ｕｐｐｓ
ａｌａ、スエーデン国）のゲル濾過により分離した。酵
素含有フラクションを合わせ活性度を異なるカチオンの
不在でまたは存在で測定した。
表１５から、ｌ、１０−フェナントロリンにより失活し
たアシラーゼ（アボ酵素）が、Ｃ０２＋およびＺｎ２＋
により、最初の活性度の８０％ないし５４％まで再活性
することが示された。
たアシラーゼ（アボ酵素）が、Ｃ０２＋およびＺｎ２＋
により、最初の活性度の８０％ないし５４％まで再活性
することが示された。
ｂ）に記載したように、Ｃｕ ” Ｆ ｅ ” Ｆ
ｅ３＋、Ｈｇ２＋およびＳｎ２＋は阻害した。これは
Ｎ−アシル−Ｌ−プロリンーアシラーゼがコバルトまＩ
；は亜鉛依存性の金属酵素であることを意味する。
ｅ３＋、Ｈｇ２＋およびＳｎ２＋は阻害した。これは
Ｎ−アシル−Ｌ−プロリンーアシラーゼがコバルトまＩ
；は亜鉛依存性の金属酵素であることを意味する。
表１５： １．１０−フェナントロリンＩこより失活し
たアシラーゼに関する異なるカチオンの影響 （ゲル濾過前） 失活した酵素 （ゲル濾過後） なし ＢａＣ（！２ ａＣｆ２２ ｄＣＱ２ ｏＣＱ２ ｕＳＯ４ ｅＳＯ４ ｅＣＱ３ ｇＣＱ２ ｇＣＱ２ ｎＣ１２２ Ｎｉ （ＮＯ３） ２ ｎＣＱ２ ｒＣＱ２ ｎＳＯ４ 例８：分子量および下位単位の数および大きさの測定 天然の酵素の分子量は５ｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＨＲ＝
１０／３０のゲル濾過により測定した。ＦＰＬＣシステ
ム（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ社／ ＬＫＢ、 Ｕｐｐｓａ
ｌａ、スエーデン国）が結合したカラム（１，ＯＸ ３
０ｃＩｌ＋）を流動速度０．３ｒＩＩＱ１分で運転し、
その際、ＦＰＬＣ／Ｍｏｎｏ Ｑで精製した酵素０．
２＋ｍＱを試料として使用した。標準タンパク質として
アプロチニン、キモトリプシノゲンＡ１アルドラーゼカ
タラーゼおよび７エリチンを使用した。Ｎ−アシル−Ｌ
−プロリン−アシラーゼの分子量は３８００００±４０
０００ダルトンであったナトリウムドデシルスルフェー
ト（ＳＤＳ）の存在でのゲル電気泳動により酵素の下位
単位の数および大きさを測定した。下位単位の分子量は
４５０００土５０００ダルトンである。これはＮ−アシ
ル−Ｌ−プロリン−アシラーゼが間１ニー＊：きざの３
個の下位単位から潅戊されていることを意味する。検量
線に対して、ホスホリラーゼｂ（ウサギの筋肉）、アル
ブミン（ウシ血清）、オバルブミンにワトリの卵白）、
カルボアンヒドラーゼ（ウシ赤血球）およびトリプシン
阻害剤（大豆）を使用した。
たアシラーゼに関する異なるカチオンの影響 （ゲル濾過前） 失活した酵素 （ゲル濾過後） なし ＢａＣ（！２ ａＣｆ２２ ｄＣＱ２ ｏＣＱ２ ｕＳＯ４ ｅＳＯ４ ｅＣＱ３ ｇＣＱ２ ｇＣＱ２ ｎＣ１２２ Ｎｉ （ＮＯ３） ２ ｎＣＱ２ ｒＣＱ２ ｎＳＯ４ 例８：分子量および下位単位の数および大きさの測定 天然の酵素の分子量は５ｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＨＲ＝
１０／３０のゲル濾過により測定した。ＦＰＬＣシステ
ム（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ社／ ＬＫＢ、 Ｕｐｐｓａ
ｌａ、スエーデン国）が結合したカラム（１，ＯＸ ３
０ｃＩｌ＋）を流動速度０．３ｒＩＩＱ１分で運転し、
その際、ＦＰＬＣ／Ｍｏｎｏ Ｑで精製した酵素０．
２＋ｍＱを試料として使用した。標準タンパク質として
アプロチニン、キモトリプシノゲンＡ１アルドラーゼカ
タラーゼおよび７エリチンを使用した。Ｎ−アシル−Ｌ
−プロリン−アシラーゼの分子量は３８００００±４０
０００ダルトンであったナトリウムドデシルスルフェー
ト（ＳＤＳ）の存在でのゲル電気泳動により酵素の下位
単位の数および大きさを測定した。下位単位の分子量は
４５０００土５０００ダルトンである。これはＮ−アシ
ル−Ｌ−プロリン−アシラーゼが間１ニー＊：きざの３
個の下位単位から潅戊されていることを意味する。検量
線に対して、ホスホリラーゼｂ（ウサギの筋肉）、アル
ブミン（ウシ血清）、オバルブミンにワトリの卵白）、
カルボアンヒドラーゼ（ウシ赤血球）およびトリプシン
阻害剤（大豆）を使用した。
例９ニアシラーゼ活性度の基質濃度への依存性Ｎ−アシ
ル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの存在下での化合物Ｎ＝
アセチル−Ｌ−プロリンからの酢酸の加水分解的分割の
反応速度の依存性を、次の組成の反応バッチで測定した
：ｐＨ７，０の０．ＩＭのトリス−ＨＣＱ緩衝液中のＮ
−アセチル−Ｌ−プロリン １．０ｍＱｐＨ７，０のＯ
，１Ｍのトリス−ＨＣｆ２緩衝液１．９５ｍ１２ アシラーゼ ０．０！５ｍＱ反応温
度は３０℃で、インキュベー［９間は１０分であった。
ル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの存在下での化合物Ｎ＝
アセチル−Ｌ−プロリンからの酢酸の加水分解的分割の
反応速度の依存性を、次の組成の反応バッチで測定した
：ｐＨ７，０の０．ＩＭのトリス−ＨＣＱ緩衝液中のＮ
−アセチル−Ｌ−プロリン １．０ｍＱｐＨ７，０のＯ
，１Ｍのトリス−ＨＣｆ２緩衝液１．９５ｍ１２ アシラーゼ ０．０！５ｍＱ反応温
度は３０℃で、インキュベー［９間は１０分であった。
反応バッチのＮ−アセチル−Ｌ−プロリン濃度は１〜５
０ｍＭの範囲で変えた。Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンの
ＫＭ−値は前記の条件下で５ｍＭであった。
０ｍＭの範囲で変えた。Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンの
ＫＭ−値は前記の条件下で５ｍＭであった。
例１Ｏ二Ｎ−アシルーＬ−プロリン−アシラーゼの基質
特異性 ａ）異なるＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸もしくはＮ−クロ
ロアセチル−Ｌ−アミノ酸の加水分解アシラーゼの活性
は、異なるＮ−アセチル−Ｌ−アミノ酸もしくはＮ−ク
ロロアセチル−Ｌ−アミノ酸とともに次の組成の反応バ
ッチ中で測定した： ２０ｍＭのＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸もしくはＮ−クロ
ロアセチル−Ｌ−アミノ酸 ！、０肩Ｑ ｐ Ｈ７，０のトリス−ＨＣＱ緩？＃液０．９５＋＋＋
Ｑ アシラーゼ Ｑ、Ｑ５ｍ１２反応温
度は３０℃で、インキュベート時間は１５分〜２４時間
であった。それぞれ反応バッチ０．２ｒｎＱに異なる時
間に１０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸０．２ｍ（ｌを
添加し、変性タンパク質を卓上遠心機中で１１１０００
ｒｐで１０分間遠心分離した。上澄み液を、２５％（ｖ
／ｖ）の２．２−チオジェタノールおよび０．１％のフ
ェノール１：５もしくはｌ：５０を有するｐＨ２，２の
０．１ＭのＮａ−シトレート緩衝液で希釈した。遊離し
たアミノ酸をアミノ酸分析機（Ｌ Ｃ５００１、Ｂｉｏ
ｔｒｏｎｉｃ社、Ｍａｉｎｔａｌ、Ｆ ＲＧ）により定
量的に測定した。表１６において＊で示した基質および
相応する生成物はＨＰ ＬＣにより定量分析した。
特異性 ａ）異なるＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸もしくはＮ−クロ
ロアセチル−Ｌ−アミノ酸の加水分解アシラーゼの活性
は、異なるＮ−アセチル−Ｌ−アミノ酸もしくはＮ−ク
ロロアセチル−Ｌ−アミノ酸とともに次の組成の反応バ
ッチ中で測定した： ２０ｍＭのＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸もしくはＮ−クロ
ロアセチル−Ｌ−アミノ酸 ！、０肩Ｑ ｐ Ｈ７，０のトリス−ＨＣＱ緩？＃液０．９５＋＋＋
Ｑ アシラーゼ Ｑ、Ｑ５ｍ１２反応温
度は３０℃で、インキュベート時間は１５分〜２４時間
であった。それぞれ反応バッチ０．２ｒｎＱに異なる時
間に１０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸０．２ｍ（ｌを
添加し、変性タンパク質を卓上遠心機中で１１１０００
ｒｐで１０分間遠心分離した。上澄み液を、２５％（ｖ
／ｖ）の２．２−チオジェタノールおよび０．１％のフ
ェノール１：５もしくはｌ：５０を有するｐＨ２，２の
０．１ＭのＮａ−シトレート緩衝液で希釈した。遊離し
たアミノ酸をアミノ酸分析機（Ｌ Ｃ５００１、Ｂｉｏ
ｔｒｏｎｉｃ社、Ｍａｉｎｔａｌ、Ｆ ＲＧ）により定
量的に測定した。表１６において＊で示した基質および
相応する生成物はＨＰ ＬＣにより定量分析した。
比活性の測定のために、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンを
用いた加水分解率は比較可能な反応条件下で同様に１０
０％に定めた。
用いた加水分解率は比較可能な反応条件下で同様に１０
０％に定めた。
表１６から明らかなように、Ｎ−アセチルおよびＮ−Ｚ
ロロアセチルーＬ−プロリン、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ
−チアゾリジン−４−カルボン酸ならびにＮ−クロロア
セチル−Ｄ、Ｌチアゾリジン−２−カルボン酸は有利に
加水分解した。その他に、Ｎ−クロロアセチル−ＤＬ−
ピペコリン酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−メチオニン、
Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−バリンならびにＮ−アセチル
−アラニンも、明らかに遅い反応速度で反応した。
ロロアセチルーＬ−プロリン、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ
−チアゾリジン−４−カルボン酸ならびにＮ−クロロア
セチル−Ｄ、Ｌチアゾリジン−２−カルボン酸は有利に
加水分解した。その他に、Ｎ−クロロアセチル−ＤＬ−
ピペコリン酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−メチオニン、
Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−バリンならびにＮ−アセチル
−アラニンも、明らかに遅い反応速度で反応した。
表１６：多様なＮ−アセチル−およびＮ−クロロアセチ
ル−アミノＡｃ−Ｌ−Ａｌａ Ａｃ−Ｌ−Ｖａｌ Ａｃ−Ｄ、Ｌ−３ｅｒ Ａｃ−Ｌ−Ｃｙｓ Ａｃ−Ｌ−Ｔｙｒ ＣＩ２Ａｃ−Ｌ−Ｐｒ。
ル−アミノＡｃ−Ｌ−Ａｌａ Ａｃ−Ｌ−Ｖａｌ Ａｃ−Ｄ、Ｌ−３ｅｒ Ａｃ−Ｌ−Ｃｙｓ Ａｃ−Ｌ−Ｔｙｒ ＣＩ２Ａｃ−Ｌ−Ｐｒ。
ＣＱＡｃ−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸Ｃｌ２Ａ
ｃ−Ｄ、Ｌ−チアゾリジン−２−カルボン酸＊＋Ｃｌ２
Ａｃ−Ｄ、Ｌ−ピペコリン酸＊＋Ａｃ−Ｌ−７ゼチジン
ー２−カル４ン酸ネＣＱＡｃ−Ｌ−インドリン−２−カ
ルボン酸＊Ｃｆ２Ａｃ−Ｌ−Ｍｅｔ ＣＩ２Ａｃ−Ｌ−Ｖａｌ ＣＩ２Ａｃ−Ｌ−Ｌｅｕ Ｃｆ２Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ ＣＩ２Ａｃ−Ｌ−Ｔｙｒ Ｃ（２Ａｃ−Ｌ−１１ｅ ９．３ ０．２ ０．２ １７．１ １４．１ １．９ １．０ １．０ ０．５ ｂ）異なるプロリン誘導体の加水分解 アシラーゼの活性をａ）に記載したと同様に多様なプロ
リン誘導体を用いて測定した。
ｃ−Ｄ、Ｌ−チアゾリジン−２−カルボン酸＊＋Ｃｌ２
Ａｃ−Ｄ、Ｌ−ピペコリン酸＊＋Ａｃ−Ｌ−７ゼチジン
ー２−カル４ン酸ネＣＱＡｃ−Ｌ−インドリン−２−カ
ルボン酸＊Ｃｆ２Ａｃ−Ｌ−Ｍｅｔ ＣＩ２Ａｃ−Ｌ−Ｖａｌ ＣＩ２Ａｃ−Ｌ−Ｌｅｕ Ｃｆ２Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ ＣＩ２Ａｃ−Ｌ−Ｔｙｒ Ｃ（２Ａｃ−Ｌ−１１ｅ ９．３ ０．２ ０．２ １７．１ １４．１ １．９ １．０ １．０ ０．５ ｂ）異なるプロリン誘導体の加水分解 アシラーゼの活性をａ）に記載したと同様に多様なプロ
リン誘導体を用いて測定した。
比活性の測定のために、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンを
用いた加水分解率は比較可能な反応条件下で同様に１０
０％に定めｔ；。
用いた加水分解率は比較可能な反応条件下で同様に１０
０％に定めｔ；。
表１７から明らかなように、このアシラーゼはＬ−特異
的であった。それというのもＮ−アセチル−Ｄ−プロリ
ンは加水分解されなかったためである。この酵素は、基
質結合のため明らかに遊離カルボキシル基が必要である
。それというのもＮ−アセチル−し−プロリンアミドお
よびＮ−アセチル−Ｌ−プロリンメチルエステルは加水
分解されなかったためである。Ｎ−クロロアセチル−Ｌ
−プロリンは、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンよりも３．
６＠たけ早く加水分解した。ｌ／３から１／２０だけの
加水分解率は、Ｎ−ホルミル−Ｌ〜プロリン、Ｎ−プロ
ピオオニル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ブチリル−Ｌプロリン
、Ｎ−バレリル−Ｌ−プロリン、Ｎ−カブロリルーＬ−
グσリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｎ
−ベンジルオキシカルボニル−グリシル＝Ｌ−プロリン
およびグリシル−Ｌ−プロリンで得られた。
的であった。それというのもＮ−アセチル−Ｄ−プロリ
ンは加水分解されなかったためである。この酵素は、基
質結合のため明らかに遊離カルボキシル基が必要である
。それというのもＮ−アセチル−し−プロリンアミドお
よびＮ−アセチル−Ｌ−プロリンメチルエステルは加水
分解されなかったためである。Ｎ−クロロアセチル−Ｌ
−プロリンは、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンよりも３．
６＠たけ早く加水分解した。ｌ／３から１／２０だけの
加水分解率は、Ｎ−ホルミル−Ｌ〜プロリン、Ｎ−プロ
ピオオニル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ブチリル−Ｌプロリン
、Ｎ−バレリル−Ｌ−プロリン、Ｎ−カブロリルーＬ−
グσリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｎ
−ベンジルオキシカルボニル−グリシル＝Ｌ−プロリン
およびグリシル−Ｌ−プロリンで得られた。
表１７：多様なプロリン誘導体に対するＮアシル−Ｌ−
プロリン Ａｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨ ＣＲＡｃ−Ｌ−Ｐｒｏ −０Ｈ Ａｃ−Ｌ−Ｐ ｒ ｏ−ＮＨ２ Ａｃ −Ｌ−Ｐ １ ｏ −ＯＭｅ Ａｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−（４−ＯＨ）−ＯＨＡｃ−Ｌ−Ａｌ
ａ−Ｌ−Ｐｒｏ−〇Ｈ ホルミルーＬ−Ｐｒｏ’−ＯＨ プロピオニル＝Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ ブチリル−Ｌ−Ｐｒｏ −ＯＨ バレリル−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ カブロリル−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ ２−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ ２−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨ ２−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ２ Ｚ−Ｌ−Ｐ ｒ ｏ−Ｌ−Ａ Ｉ ａ−○１１Ｚ−Ｇｌ
ｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ Ｈ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ −０Ｈ Ｈ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ２ 例１１：Ｎ−アシルーＬ−プロリン−アシラーゼによる
Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−プロリンの加水分解の立体特異
性 Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−
プロリンおよびＮ−アセチル−Ｄ−プロリンの加水分解
は次の組成の反応バッチ中で実施し ｔこ ： ｐＨ７，０のＯ，１Ｍ１−リスーＨＣ０緩衝液中の２０
ｍＭ基質 １．０Ｉ＋１Ｉ２ｐＨ
７，０の０１１Ｍトリス−ＨＣＩ２Ｃα緩衝液中ｍＱ アシラーゼ ０．０５ｍ１２この
反応バッチを３０℃で２時間１ンキユベートシ、次いで
生じたＬ−プロリンの量を、例１Ｏに記載したように、
アミノ酸分析により測定した表ｉ８は、Ｎ−アシル−Ｌ
−プロリン−アシラーゼが、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリ
ンを加水分解したが、Ｎ−アセチル−Ｄ−プロリンを加
水分解しなかつｔ；ことを示した。
プロリン Ａｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨ ＣＲＡｃ−Ｌ−Ｐｒｏ −０Ｈ Ａｃ−Ｌ−Ｐ ｒ ｏ−ＮＨ２ Ａｃ −Ｌ−Ｐ １ ｏ −ＯＭｅ Ａｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−（４−ＯＨ）−ＯＨＡｃ−Ｌ−Ａｌ
ａ−Ｌ−Ｐｒｏ−〇Ｈ ホルミルーＬ−Ｐｒｏ’−ＯＨ プロピオニル＝Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ ブチリル−Ｌ−Ｐｒｏ −ＯＨ バレリル−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ カブロリル−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ ２−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ ２−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨ ２−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ２ Ｚ−Ｌ−Ｐ ｒ ｏ−Ｌ−Ａ Ｉ ａ−○１１Ｚ−Ｇｌ
ｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ Ｈ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ −０Ｈ Ｈ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＮＨ２ 例１１：Ｎ−アシルーＬ−プロリン−アシラーゼによる
Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−プロリンの加水分解の立体特異
性 Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−
プロリンおよびＮ−アセチル−Ｄ−プロリンの加水分解
は次の組成の反応バッチ中で実施し ｔこ ： ｐＨ７，０のＯ，１Ｍ１−リスーＨＣ０緩衝液中の２０
ｍＭ基質 １．０Ｉ＋１Ｉ２ｐＨ
７，０の０１１Ｍトリス−ＨＣＩ２Ｃα緩衝液中ｍＱ アシラーゼ ０．０５ｍ１２この
反応バッチを３０℃で２時間１ンキユベートシ、次いで
生じたＬ−プロリンの量を、例１Ｏに記載したように、
アミノ酸分析により測定した表ｉ８は、Ｎ−アシル−Ｌ
−プロリン−アシラーゼが、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリ
ンを加水分解したが、Ｎ−アセチル−Ｄ−プロリンを加
水分解しなかつｔ；ことを示した。
表１８
二Ｎ−アンルーＬ
プロリン−アシラーゼ
の立体特異性
基質 濃度 Ｌ−プロリン（ａｒｓｏ
ｎ／ ｍＱ） （ｍｍｏにｔ／ ｍ４ＱＮ−アセチル
−し一プロリン １０ ．
１０．２５Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−プロリン
１０ ４．８２Ｎ−アセチル−Ｄ−
プロリン １．０ ＜０
．０１例１２：Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−プロ
ピオニル−Ｌ−プロリンおよびＮ−ブチリル−Ｌ−プロ
リンの合皮 逆反応の、酢酸とＬ−プロリンとからのＮ−アセチル−
Ｌ−プロリンの合皮を、次の組成の反応バッチ中で行っ
た： ｐＨ７，０の０．ＩＭｌ−リス−ＨＣα緩衝液中のＩＭ
酢酸ナトリウム＋５Ｍ Ｌ−プロリン ｍＱ アシラーゼ（ＦＰＬＣ−精製） ｌ、ｍｆ２こ
の反応バッチを３０℃でインキュベートしｔ；。異なる
時間で試料を取り出し、一定量の１０％（Ｗ／ｖ）トリ
クロロ酢酸を添加し、変性したタンパク質を１ｌ１００
ｏｒｐで１０分間卓上遠心機で遠心分離した。残分を、
相応する希釈度により溶離剤でＨＰＣＬにより分析した
。
ｎ／ ｍＱ） （ｍｍｏにｔ／ ｍ４ＱＮ−アセチル
−し一プロリン １０ ．
１０．２５Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−プロリン
１０ ４．８２Ｎ−アセチル−Ｄ−
プロリン １．０ ＜０
．０１例１２：Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−プロ
ピオニル−Ｌ−プロリンおよびＮ−ブチリル−Ｌ−プロ
リンの合皮 逆反応の、酢酸とＬ−プロリンとからのＮ−アセチル−
Ｌ−プロリンの合皮を、次の組成の反応バッチ中で行っ
た： ｐＨ７，０の０．ＩＭｌ−リス−ＨＣα緩衝液中のＩＭ
酢酸ナトリウム＋５Ｍ Ｌ−プロリン ｍＱ アシラーゼ（ＦＰＬＣ−精製） ｌ、ｍｆ２こ
の反応バッチを３０℃でインキュベートしｔ；。異なる
時間で試料を取り出し、一定量の１０％（Ｗ／ｖ）トリ
クロロ酢酸を添加し、変性したタンパク質を１ｌ１００
ｏｒｐで１０分間卓上遠心機で遠心分離した。残分を、
相応する希釈度により溶離剤でＨＰＣＬにより分析した
。
７日間のインキュベート時間の後で、反応バッチのＮ−
アセチル−Ｌ−プロリン濃度は０．２＋＋１Ｏｆ２／Ｑ
で、使用しＩ；酢酸ナトリウムの量に対して４０％の収
率に相当した。酵素を含まない対照バッチはＮ−アセナ
ル−Ｌ−プロリンを含有していなかった。
アセチル−Ｌ−プロリン濃度は０．２＋＋１Ｏｆ２／Ｑ
で、使用しＩ；酢酸ナトリウムの量に対して４０％の収
率に相当した。酵素を含まない対照バッチはＮ−アセナ
ル−Ｌ−プロリンを含有していなかった。
Ｎ−プロピオニル−し−プロリンおよびＮ−ブチリル−
Ｌ−プロリンも同様に、ＮａプロピオネートもしくはＮ
ａブチレートとＬ−プロリンとから脅威することができ
た。Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−プロリン、Ｎ−７エニルアセ
チルー およびＮ−７エニルブロピオニルーＬ−プロリンの安息
香酸ナトリウム、フェニル酢酸ナトリウムもしくはフェ
ニルプロピオン酸ナトリウム（それぞれ反応バッチ中０
．０５Ｍ） と、 ゾロリ ン とからの合或は成功しなかった。
Ｌ−プロリンも同様に、ＮａプロピオネートもしくはＮ
ａブチレートとＬ−プロリンとから脅威することができ
た。Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−プロリン、Ｎ−７エニルアセ
チルー およびＮ−７エニルブロピオニルーＬ−プロリンの安息
香酸ナトリウム、フェニル酢酸ナトリウムもしくはフェ
ニルプロピオン酸ナトリウム（それぞれ反応バッチ中０
．０５Ｍ） と、 ゾロリ ン とからの合或は成功しなかった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、微生物により製造したＮ−アシル−Ｌ−プロリン−
アシラーゼにおいて、次の特性： １）反応性： Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンのアセチル基 を分割し、その際、最終生成物として酢酸およびＬ−プ
ロリンが生じ、酢酸およびＬ−プロリンを縮合し、その
際、最終生成物としてＮ−アセチル−Ｌ−プロリンおよ
び水が生じる； ２）基質特異性： Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ
−プロリン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−プロリン、Ｎ−プロピ
オニル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ブチリル−Ｌ−プロリン、
Ｎ−バレリル−Ｌ−プロリン、Ｎ−カプロイル−Ｌ−プ
ロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、
Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン
酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−２−カル
ボン酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−ピペコリン酸、Ｎ−
ベンジルオキシカルボニル−グリシル−Ｌ−プロリン、
グリシル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン
、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−メチオニンおよびＮ−クロ
ロアセチル−Ｌ−バリンを加水分解する； ３）最適ｐＨ値： 最適ｐＨ値は６．８±０．５である； ４）ｐＨ安定性： ２２℃で３週間にわたりｐＨ７．０〜１０．０の範囲内
で良好な安定性を示す； ５）最適温度： 最適温度は、ｐＨ値７．５で６５℃である ６）温度安定性： ７０℃で、ｐＨ７．５で３０分間インキュベートした後
に、活性度損失は検出されない７）阻害剤および活性化
剤の影響： 特に１，１０−フェナントロリン、２−メルカプトエタ
ノール、４−クロロメルクリベンゾエート、４−ヒドロ
キシメルクリベンゾエート、Ｈｇ＾２＾＋、Ｃｕ＾２＾
＋、Ｆｅ＾２＾＋、Ｆｅ＾３＾＋、Ｓｎ＾２＾＋、Ｚｎ
＾２＾＋、ＰＯ＿４＾３＾＋が阻害作用し、アボ酵素に
関してＣｏ＾２＾＋およびＺｎ＾２＾＋が活性化作用す
る； ８）分子量： 分子量は３８００００±４００００ダルトンである； ９）サブユニット： 分子はそれぞれ４５０００±５０００ダルトンを有する
８個の同じ大きさのサブユニットからなる； １０）Ｋ＿Ｍ値： 基質のＮ−アセチル−Ｌ−プロリンに対するＫ＿Ｍ値は
５ｍＭ（３０℃、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ
７．０）である； を有することを特徴とする微生物により製造したＮ−ア
シル−Ｌ−プロリン−アシラーゼ２、炭素および窒素の
供給源、誘導物質としての鉱物塩およびＮ−アシル−Ｌ
−プロリンを含有し、コマモナス テストステロニＤＳ
Ｍ５４１６を使用する場合、付加的に、たとえば酵母抽
出物として複合体の形ビタミン源を含有する水性培養基
中のコマモナス テストステロニＤＳＭ５４１６または
アルカリゲネス デニトリフィカンスＤＳＭ５４１７を
出発ｐＨ値６．０〜８．０で温度２５℃〜３５℃で好気
的に培養し、細胞物質を分離し、酵素を細胞から単離す
ることを特徴とする請求項１記載のＮ−アシル−Ｌ−プ
ロリン−アシラーゼの製造方法。 ３、請求項１記載のＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラ
ーゼを使用して、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ク
ロロアセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−プロ
リン、Ｎ−プロピオニル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ブチリル
−Ｌ−プロリン、Ｎ−バレリル−Ｌ−プロリン、Ｎ−カ
プロイル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−プロ
リン、Ｎ−クロロアセチル−Ｄ，Ｌ−プロリン、Ｎ−ホ
ルミル−Ｄ，Ｌ−プロリン、Ｎ−プロピオニル−Ｄ，Ｌ
−プロリン、Ｎ−ブチリル−Ｄ，Ｌ−プロリン、Ｎ−バ
レリル−Ｄ，Ｌ−プロリンまたはＮ−カプロイル−Ｄ，
Ｌ−プロリンからＬ−プロリンならびに Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸、Ｎ−クロロアセチル
−Ｌ−ピペコリン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ピペコリ
ン酸またはＮ−クロロアセチル−Ｄ，Ｌ−ピペコリン酸
からＬ−ピペコリン酸ならびに Ｎ−アセチル−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸、Ｎ
−クロロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸
、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン
酸またはＮ−クロロアセチル−Ｄ，Ｌ−チアゾリジン−
４−カルボン酸からチアゾリジン−４−カルボン酸なら
びに Ｎ−アセチル−Ｌ−チアゾリジン−２−カルボン酸、Ｎ
−クロロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−２−カルボン酸
、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チアゾリジン−２−カルボン
酸またはＮ−クロロアセチル−Ｄ，Ｌ−チアゾリジン−
２−カルボン酸からチアゾリジン−２−カルボン酸を取
得する方法およびＬ−プロリンおよびそれぞれのカルボ
ン酸からＮ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−プロピオニ
ル−Ｌ−プロリンおよびＮ−ブチリル−Ｌ−プロリンを
製造する方法。
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| DE3929570.2 | 1989-09-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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