JPH0132948B2 - - Google Patents
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- JPH0132948B2 JPH0132948B2 JP57076678A JP7667882A JPH0132948B2 JP H0132948 B2 JPH0132948 B2 JP H0132948B2 JP 57076678 A JP57076678 A JP 57076678A JP 7667882 A JP7667882 A JP 7667882A JP H0132948 B2 JPH0132948 B2 JP H0132948B2
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- G—PHYSICS
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S436/81—Tube, bottle, or dipstick
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- Pathology (AREA)
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は抗原または抗体と酵素または酵素阻害
もしくは活性化用物質とを場を分離して固定した
固定化物と、それを用いて抗原を酵素免疫法によ
つて測定する方法に関するものである。
もしくは活性化用物質とを場を分離して固定した
固定化物と、それを用いて抗原を酵素免疫法によ
つて測定する方法に関するものである。
抗原の測定方法には種々の方法が知られている
が、酵素免疫法が特異性および鋭敏性にすぐれ、
かつ操作および装置が比較的簡便であるところか
ら多用されている。そして、この酵素免疫法にお
ける操作性をより簡便にしあるいは鋭敏性を高め
るための改良研究が種々行なわれている。
が、酵素免疫法が特異性および鋭敏性にすぐれ、
かつ操作および装置が比較的簡便であるところか
ら多用されている。そして、この酵素免疫法にお
ける操作性をより簡便にしあるいは鋭敏性を高め
るための改良研究が種々行なわれている。
本発明者らもこの酵素免疫法を改良すべく種々
検討の結果、抗原または抗体と酵素または酵素阻
害もしくは活性化物質を場を分離して固定した固
定化物固定化物を用いて抗原と抗体の反応と酵素
と酵素阻害もしくは活性化物質との反応を競争さ
せる全く新規な方法を案出し、この方法を用いれ
ば抗原を簡便にかつ鋭敏性高く測定しうることを
見出して、これに基いて本発明を完成するに至つ
た。
検討の結果、抗原または抗体と酵素または酵素阻
害もしくは活性化物質を場を分離して固定した固
定化物固定化物を用いて抗原と抗体の反応と酵素
と酵素阻害もしくは活性化物質との反応を競争さ
せる全く新規な方法を案出し、この方法を用いれ
ば抗原を簡便にかつ鋭敏性高く測定しうることを
見出して、これに基いて本発明を完成するに至つ
た。
以下、本発明の内容を詳細に説明する。
まず、本発明の固定化物は、抗原または抗体
と、酵素または酵素阻害もしくは活性化物質とが
担体に各々の固定相が分離されて固定されている
ものである。
と、酵素または酵素阻害もしくは活性化物質とが
担体に各々の固定相が分離されて固定されている
ものである。
抗原の種類は限定されるものではなく、使用目
的に応じて適宜選択すればよい。抗原にはハプテ
ンおよび２抗体法で用いる場合の第１抗体も含ま
れる。
的に応じて適宜選択すればよい。抗原にはハプテ
ンおよび２抗体法で用いる場合の第１抗体も含ま
れる。
抗原の例としては、各種内分泌腺に由来するホ
ルモン、血清中の免疫グロブリン、アルブミン、
フエリチンなどの蛋白質、各種免疫複合体、HB
抗原等の病原体、補体、ジゴキシンの如き薬物、
サイクリツクヌクレオチド類、α―フエトプロテ
イン、癌胎児性抗原等の各種臓器あるいは血中、
尿中に存在する抗原を挙げることができる。
ルモン、血清中の免疫グロブリン、アルブミン、
フエリチンなどの蛋白質、各種免疫複合体、HB
抗原等の病原体、補体、ジゴキシンの如き薬物、
サイクリツクヌクレオチド類、α―フエトプロテ
イン、癌胎児性抗原等の各種臓器あるいは血中、
尿中に存在する抗原を挙げることができる。
酵素と酵素阻害もしくは活性化物質はお互いに
反応し合うものである。これらの種類も特に限定
されるものではなく、α―アミラーゼとアミラー
ゼインヒビター、β―ガラクトシダーゼとイソフ
ラボノイド、エステラーゼとエステラスチンなど
を例として挙げることができる。
反応し合うものである。これらの種類も特に限定
されるものではなく、α―アミラーゼとアミラー
ゼインヒビター、β―ガラクトシダーゼとイソフ
ラボノイド、エステラーゼとエステラスチンなど
を例として挙げることができる。
本発明の固定化物は抗原または抗体と酵素また
は酵素阻害もしくは活性化物質とが固定されてい
るのであるから、抗原と酵素、抗原と酵素阻害も
しくは活性化物質、抗体と酵素、および抗体と酵
素阻害もしくは活性化物質の４種の組合せがある
ことになる。
は酵素阻害もしくは活性化物質とが固定されてい
るのであるから、抗原と酵素、抗原と酵素阻害も
しくは活性化物質、抗体と酵素、および抗体と酵
素阻害もしくは活性化物質の４種の組合せがある
ことになる。
このような固定化物は抗原または抗体の固定相
と酵素または酵素阻害もしくは活性化物質の固定
相とが分離されているところに特徴がある。この
相分離とは、後述する抗原または抗体と酵素また
は酵素阻害もしくは活性化物質との結合物が一方
の相において反応して結合した場合にもう一方の
相と更に反応しない程度に両相が互いに分離され
ていることをいう。但し、両相の境界域において
両相と反応する結合物があつてもその比率が固定
化物の用途との関係において問題にならない程度
であればよいことはいうまでもない。
と酵素または酵素阻害もしくは活性化物質の固定
相とが分離されているところに特徴がある。この
相分離とは、後述する抗原または抗体と酵素また
は酵素阻害もしくは活性化物質との結合物が一方
の相において反応して結合した場合にもう一方の
相と更に反応しない程度に両相が互いに分離され
ていることをいう。但し、両相の境界域において
両相と反応する結合物があつてもその比率が固定
化物の用途との関係において問題にならない程度
であればよいことはいうまでもない。
具体的には、担体に用いた重合体の場を分けて
抗原等と酵素等を固定したものとか抗原等を固定
した重合体と酵素等を固定した重合体を貼合せた
ものなどを例として挙げることができる。
抗原等と酵素等を固定したものとか抗原等を固定
した重合体と酵素等を固定した重合体を貼合せた
ものなどを例として挙げることができる。
固定化物の製法としては、重合体の場を分けて
固定したものの場合には、例えば官能基を異にし
たブロツク共重合体とかグラフト共重合体を形成
して官能基の差異を利用して抗原等と酵素等を別
別に固定すればよい。官能基は、―NH2、―
COOH、―CHO、―OH、―SHなど通常のもの
でよい。これらの重合体を構成成分とするブロツ
ク共重合体、グラフト共重合体は公知の方法によ
つて製造すればよい。一方、固定されるものが酵
素阻害物質などで、固定してから共重合体を形成
しても活性が失なわれないような場合には、そう
することによつて官能基が異ならなくともよい場
合がある。
固定したものの場合には、例えば官能基を異にし
たブロツク共重合体とかグラフト共重合体を形成
して官能基の差異を利用して抗原等と酵素等を別
別に固定すればよい。官能基は、―NH2、―
COOH、―CHO、―OH、―SHなど通常のもの
でよい。これらの重合体を構成成分とするブロツ
ク共重合体、グラフト共重合体は公知の方法によ
つて製造すればよい。一方、固定されるものが酵
素阻害物質などで、固定してから共重合体を形成
しても活性が失なわれないような場合には、そう
することによつて官能基が異ならなくともよい場
合がある。
重合体を貼合わせる場合には予め貼合わせてか
ら固定化してもよく、その逆でもよい。貼合せは
融着であつてもよく接着であつてもよい。
ら固定化してもよく、その逆でもよい。貼合せは
融着であつてもよく接着であつてもよい。
このような担体の外形は特に限定されるもので
はなく、例えば、球形、円盤形、長方形、円管形
などでよい。
はなく、例えば、球形、円盤形、長方形、円管形
などでよい。
抗原、抗体、酵素、および酵素阻害もしくは活
性化物質の固定化方法は公知の方法に準じて行な
えばよい。抗体、酵素、および抗原、酵素阻害も
しくは活性化物質のうち蛋白質のものについて
は、ジアゾ法、ペプチド結合法、アルキル化法等
の共有結合法、イオン結合法、物理的吸着法など
の酵素等の活性蛋白を担体に固定する公知の方法
に準じて行なえばよく、蛋白質以外のものも抗原
等と担体等の官能基等を考慮して固定化方法を適
宜選択すればよい。この固定化されている抗原に
は、例えば担体に共有結合されている抗原に第１
抗体を抗原抗体反応させ、これにさらに第２抗体
を反応させるような場合の抗原と第１抗体との反
応物も含む。
性化物質の固定化方法は公知の方法に準じて行な
えばよい。抗体、酵素、および抗原、酵素阻害も
しくは活性化物質のうち蛋白質のものについて
は、ジアゾ法、ペプチド結合法、アルキル化法等
の共有結合法、イオン結合法、物理的吸着法など
の酵素等の活性蛋白を担体に固定する公知の方法
に準じて行なえばよく、蛋白質以外のものも抗原
等と担体等の官能基等を考慮して固定化方法を適
宜選択すればよい。この固定化されている抗原に
は、例えば担体に共有結合されている抗原に第１
抗体を抗原抗体反応させ、これにさらに第２抗体
を反応させるような場合の抗原と第１抗体との反
応物も含む。
この固定化物を用いて抗原を測定する場合に
は、固定相の一方には測定対象たる抗原と反応す
る抗体またはこの抗体と反応する抗原を固定す
る。
は、固定相の一方には測定対象たる抗原と反応す
る抗体またはこの抗体と反応する抗原を固定す
る。
そして、該固定化物に固定された抗原または抗
体と反応する抗体または抗原と該固定化物に固定
された酵素または酵素阻害もしくは活性化物質と
反応する酵素阻害もしくは活性化物質または酵素
とを結合した結合物と、測定対象たる抗原とを、
該固定化物と水溶液中で共存せしめて抗原と抗体
の反応と酵素と酵素阻害もしくは活性化物質の反
応とを競争反応させ、その後酵素活性又は酵素阻
害もしくは活性化物質の活性を測定することによ
つて抗原を測定するのである。
体と反応する抗体または抗原と該固定化物に固定
された酵素または酵素阻害もしくは活性化物質と
反応する酵素阻害もしくは活性化物質または酵素
とを結合した結合物と、測定対象たる抗原とを、
該固定化物と水溶液中で共存せしめて抗原と抗体
の反応と酵素と酵素阻害もしくは活性化物質の反
応とを競争反応させ、その後酵素活性又は酵素阻
害もしくは活性化物質の活性を測定することによ
つて抗原を測定するのである。
ここに測定対象たる抗原とは本発明法における
測定対象であることはいうまでもなく、例えば２
抗体法においては測定の目的物である抗原と第１
抗体との結合物が測定対象たる抗原になる。
測定対象であることはいうまでもなく、例えば２
抗体法においては測定の目的物である抗原と第１
抗体との結合物が測定対象たる抗原になる。
結合物の組合せは抗原と酵素、抗原と酵素阻害
もしくは活性化物質、抗体と酵素、および抗体と
酵素阻害もしくは活性化物質の４通りあるわけで
あるが、この結合物は前記固定化物の両固定相と
反応するものでなければならないから、この組合
せは固定化物に応じて自動的に定まる。結合物の
製法としては要は結合物が両方の活性を発揮しう
れば足り、例えば結合させる双方がいずれも蛋白
質である場合には、酵素等の活性蛋白を固定する
架橋法あるいはペプチド結合法などを活用でき
る。結合する一方または双方が蛋白質でない場合
にはそれぞれの官能基を考慮して結合方法を適宜
選択すればよい。
もしくは活性化物質、抗体と酵素、および抗体と
酵素阻害もしくは活性化物質の４通りあるわけで
あるが、この結合物は前記固定化物の両固定相と
反応するものでなければならないから、この組合
せは固定化物に応じて自動的に定まる。結合物の
製法としては要は結合物が両方の活性を発揮しう
れば足り、例えば結合させる双方がいずれも蛋白
質である場合には、酵素等の活性蛋白を固定する
架橋法あるいはペプチド結合法などを活用でき
る。結合する一方または双方が蛋白質でない場合
にはそれぞれの官能基を考慮して結合方法を適宜
選択すればよい。
本発明の測定方法の原理を、抗原と酵素阻害物
質を固定した固定化物と、酵素と抗体の結合物を
用いて抗原を測定する場合を例として説明する
と、まず、測定される抗原がないときには一般に
抗原―抗体間の結合力が酵素―酵素阻害もしくは
活性化物質間の結合力より強いところから、結合
物は固定化抗原に結合し酵素阻害物質の固定化物
には結合しない。次に、測定される抗原が存在す
るときは結合物の抗体が測定対象抗原と固定化抗
原との間で競争反応し、測定対象抗原と結合した
結合物はさらに酵素部分が固定化物の酵素阻害物
質と反応してそこに結合する。そしてこの結合量
だけ酵素活性が低下するから予め遊離の抗原量と
酵素活性の低下量の関係を求めておけば、酵素活
性の低下量を測定することによつて測定対象抗原
量を知ることができる。
質を固定した固定化物と、酵素と抗体の結合物を
用いて抗原を測定する場合を例として説明する
と、まず、測定される抗原がないときには一般に
抗原―抗体間の結合力が酵素―酵素阻害もしくは
活性化物質間の結合力より強いところから、結合
物は固定化抗原に結合し酵素阻害物質の固定化物
には結合しない。次に、測定される抗原が存在す
るときは結合物の抗体が測定対象抗原と固定化抗
原との間で競争反応し、測定対象抗原と結合した
結合物はさらに酵素部分が固定化物の酵素阻害物
質と反応してそこに結合する。そしてこの結合量
だけ酵素活性が低下するから予め遊離の抗原量と
酵素活性の低下量の関係を求めておけば、酵素活
性の低下量を測定することによつて測定対象抗原
量を知ることができる。
測定方法としては、要は水溶液中において固定
化物と結合物と測定対象たる抗原の三者を共存さ
せればよく添加順序は問わない。この共存は一方
の反応中の全時間行なわれている場合に限らず、
一時的であつてもよい。水溶液は抗原―抗体反応
および酵素―酵素阻害もしくは活性化物質反応が
反応しやすいPHにするのがよくそのためにリン酸
緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝
液を用いるのがよい。PHは抗原および抗体と酵素
および酵素阻害もしくは活性化物質によつて異な
るが通例PH５〜８程度がよい。温度も抗原および
抗体と酵素および酵素阻害もしくは活性化物質に
よつて異なるが通例は15〜45℃程度である。
化物と結合物と測定対象たる抗原の三者を共存さ
せればよく添加順序は問わない。この共存は一方
の反応中の全時間行なわれている場合に限らず、
一時的であつてもよい。水溶液は抗原―抗体反応
および酵素―酵素阻害もしくは活性化物質反応が
反応しやすいPHにするのがよくそのためにリン酸
緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝
液を用いるのがよい。PHは抗原および抗体と酵素
および酵素阻害もしくは活性化物質によつて異な
るが通例PH５〜８程度がよい。温度も抗原および
抗体と酵素および酵素阻害もしくは活性化物質に
よつて異なるが通例は15〜45℃程度である。
反応後は固定化物または水溶液の酵素活性また
は酵素阻害もしくは活性化物質の活性を測定す
る。測定方法は測定対象たる酵素あるいは酵素阻
害もしくは活性化物質の活性を測定する公知の方
法によればよく、例えば酵素活性を測定する場合
にも使用する酵素と基質の組合せにより、比色
法、蛍光法、フオトンカウンター等を用いた発光
法など種々の測定方法を利用することができる。
は酵素阻害もしくは活性化物質の活性を測定す
る。測定方法は測定対象たる酵素あるいは酵素阻
害もしくは活性化物質の活性を測定する公知の方
法によればよく、例えば酵素活性を測定する場合
にも使用する酵素と基質の組合せにより、比色
法、蛍光法、フオトンカウンター等を用いた発光
法など種々の測定方法を利用することができる。
本発明の測定方法は抗原の種類を問わず広く測
定しうるものであり、従来の各種酵素免疫法のう
ちの代表的な方法であるサンドイツチ法において
は操作が煩雑であるという難点があり、ホモジニ
アス法においては感度が不充分であるという難点
があつたところを本発明の方法によつて、操作を
簡単にしかつ感度を高めて、両者の問題点を一挙
に解決したのである。この本発明の方法は抗原ま
たは抗体と酵素または酵素阻害もしくは活性化物
質をいずれも固定し、しかも両者の固定相を分離
するという特殊な技法によつて達成したものであ
り、この相分離によつて一方の固定相に結合した
抗原または抗体と酵素または酵素阻害もしくは活
性化物質との結合がさらにもう一方の固定相に結
合する可能性を排除し、そのことによつて反応操
作が１回であるにもかかわらず高感度を達成する
ことができたのである。
定しうるものであり、従来の各種酵素免疫法のう
ちの代表的な方法であるサンドイツチ法において
は操作が煩雑であるという難点があり、ホモジニ
アス法においては感度が不充分であるという難点
があつたところを本発明の方法によつて、操作を
簡単にしかつ感度を高めて、両者の問題点を一挙
に解決したのである。この本発明の方法は抗原ま
たは抗体と酵素または酵素阻害もしくは活性化物
質をいずれも固定し、しかも両者の固定相を分離
するという特殊な技法によつて達成したものであ
り、この相分離によつて一方の固定相に結合した
抗原または抗体と酵素または酵素阻害もしくは活
性化物質との結合がさらにもう一方の固定相に結
合する可能性を排除し、そのことによつて反応操
作が１回であるにもかかわらず高感度を達成する
ことができたのである。
以下、実施例を示す。
実施例 １
(1) 酵素標識抗体の調製
ブタ肝臓より調製したβ―Ｄ―ガラクトシダ
ーゼを公知のマレイミド架橋法により、抗体と
結合させる。山羊抗ヒトフエリチン抗体のIgG
分画20mgを１mlの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液
PH4.5に溶解し0.4mgペプシンを加えて37℃16時
間酵素消化を行う。PHを8.0に合せたのちにセ
フアデツクスＧ―150カラムにより0.1M硼酸ナ
トリウム緩衝液PH8.0で溶出し、Ｆ（ab′）2を得
る。これを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液PH5.0中
で20μモルの２―メルカプトエチルアミンと37
℃で90分反応させ、セフアデツクスＧ―25カラ
ムにて過剰試薬を除去する。得られたFab′を
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液PH5.0の条件下、1.0
mlのＮ，N′―ｏ―フエニレンダイマレイミド
飽和溶液を加え30℃で20分間反応を行つたの
ち、セフアデツクスＧ―25カラムにてマレイミ
ド―Fab′を集める。これに硫安懸濁状態のβ
―Ｄ―ガラクトシダーゼを20μ加え30℃で20
分反応させ、中和したのちに0.1％ウシ血清ア
ルブミン（BSA）―1mM MgCl2―0.1M
NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液PH
7.0で平衡化したセフアローズ6Bカラムで精製
する。
ーゼを公知のマレイミド架橋法により、抗体と
結合させる。山羊抗ヒトフエリチン抗体のIgG
分画20mgを１mlの0.1M酢酸ナトリウム緩衝液
PH4.5に溶解し0.4mgペプシンを加えて37℃16時
間酵素消化を行う。PHを8.0に合せたのちにセ
フアデツクスＧ―150カラムにより0.1M硼酸ナ
トリウム緩衝液PH8.0で溶出し、Ｆ（ab′）2を得
る。これを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液PH5.0中
で20μモルの２―メルカプトエチルアミンと37
℃で90分反応させ、セフアデツクスＧ―25カラ
ムにて過剰試薬を除去する。得られたFab′を
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液PH5.0の条件下、1.0
mlのＮ，N′―ｏ―フエニレンダイマレイミド
飽和溶液を加え30℃で20分間反応を行つたの
ち、セフアデツクスＧ―25カラムにてマレイミ
ド―Fab′を集める。これに硫安懸濁状態のβ
―Ｄ―ガラクトシダーゼを20μ加え30℃で20
分反応させ、中和したのちに0.1％ウシ血清ア
ルブミン（BSA）―1mM MgCl2―0.1M
NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液PH
7.0で平衡化したセフアローズ6Bカラムで精製
する。
(2) 相分離担体の製造
平均分子量500000ダルトンのデキストラン
（フアーマシア社製）10ｇを80％エタノールを
含む0.1N NaOH50mlに溶解し、徐々にモノク
ロル酢酸ナトリウム0.6ｇを添加して30℃で５
時間反応させてカルボキシメチル基を導入す
る。反応終了後、この一部を10mMホウ酸緩衝
液PH6.0に対して透析し、3N HClで24時間処
理してアミノ基を遊離させたナイロン製球形ビ
ーズ（直径６mm）100個に加え水溶性カルボジ
イミド（以後WSCと略す）を加えて４℃で６
時間反応させてナイロンのアミノ基の一部にデ
キストランを導る。上記緩衝液で２回洗浄操作
を行つたビーズに、10mMホウ酸緩衝液PH5.5
に溶解したβ―ガラクトシダーゼの阻害剤であ
るフエニルアセトアルドキシムのアミノ誘導体
に無水コハク酸を反応させた化合物を１mg/ml
の濃度で加え、WSCとともに30℃で18時間反
応を行つてナイロンの残りのアミノ基とカツプ
リングを行なう。このナイロン―ビーズに
0.02M過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加え４℃で
30分反応させたのちにエチレングリコールを
0.04Mになるように加え室温で１時間反応させ
る。反応液を除去したのちに50mM炭酸ナトリ
ウム緩衝液PH8.5に溶解したフエリチン（10μ
ｇ／ml）を加え、室温で４時間反応させる。１
mg水素化硼素ナトリウムを加え１晩放置後0.5
％BSAを含む同緩衝液で２回洗浄ののち、
20mMリン酸ナトリウム緩衝液PH7.5中に保存
する。
（フアーマシア社製）10ｇを80％エタノールを
含む0.1N NaOH50mlに溶解し、徐々にモノク
ロル酢酸ナトリウム0.6ｇを添加して30℃で５
時間反応させてカルボキシメチル基を導入す
る。反応終了後、この一部を10mMホウ酸緩衝
液PH6.0に対して透析し、3N HClで24時間処
理してアミノ基を遊離させたナイロン製球形ビ
ーズ（直径６mm）100個に加え水溶性カルボジ
イミド（以後WSCと略す）を加えて４℃で６
時間反応させてナイロンのアミノ基の一部にデ
キストランを導る。上記緩衝液で２回洗浄操作
を行つたビーズに、10mMホウ酸緩衝液PH5.5
に溶解したβ―ガラクトシダーゼの阻害剤であ
るフエニルアセトアルドキシムのアミノ誘導体
に無水コハク酸を反応させた化合物を１mg/ml
の濃度で加え、WSCとともに30℃で18時間反
応を行つてナイロンの残りのアミノ基とカツプ
リングを行なう。このナイロン―ビーズに
0.02M過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加え４℃で
30分反応させたのちにエチレングリコールを
0.04Mになるように加え室温で１時間反応させ
る。反応液を除去したのちに50mM炭酸ナトリ
ウム緩衝液PH8.5に溶解したフエリチン（10μ
ｇ／ml）を加え、室温で４時間反応させる。１
mg水素化硼素ナトリウムを加え１晩放置後0.5
％BSAを含む同緩衝液で２回洗浄ののち、
20mMリン酸ナトリウム緩衝液PH7.5中に保存
する。
(3) フエリチン抗原の測定法
(2)で調製した相分離担体ナイロンビーズを１
個試験管にとり、0.4mlの0.1Mリン酸緩衝液PH
7.0を加える。これにフエリチン標準液または
血清希釈液を50μ加え続いて希釈した酵素標
識抗体を50μ加えて37℃で１時間反応させ
る。基質である0.005Mp―ニトロフエニル―β
―Ｄ―ガラクトピラノシドを0.5mlそのまま加
え、15分間37℃で反応したのちに、2.0mlの
0.4Mグリシン―NaOH緩衝液（PH10.5）で反
応を止め、400nmの吸光度を測定する。
個試験管にとり、0.4mlの0.1Mリン酸緩衝液PH
7.0を加える。これにフエリチン標準液または
血清希釈液を50μ加え続いて希釈した酵素標
識抗体を50μ加えて37℃で１時間反応させ
る。基質である0.005Mp―ニトロフエニル―β
―Ｄ―ガラクトピラノシドを0.5mlそのまま加
え、15分間37℃で反応したのちに、2.0mlの
0.4Mグリシン―NaOH緩衝液（PH10.5）で反
応を止め、400nmの吸光度を測定する。
このようにして測定した結果、測定すべきフ
エリチン量の増加に対応して阻害率が増加し
て、フエリチン量25〜500μｇ/mlの検体の測定
範囲において第１回に示すような良好な標準曲
線が得られた。また血清においても上記濃度範
囲において測定が可能であつた。
エリチン量の増加に対応して阻害率が増加し
て、フエリチン量25〜500μｇ/mlの検体の測定
範囲において第１回に示すような良好な標準曲
線が得られた。また血清においても上記濃度範
囲において測定が可能であつた。
実施例 ２
(1) 担体の製造
陽イオン交換樹脂（アンバーライトIRC―
50）0.5ｇと陰イオン交換樹脂（アンバーライ
トIR―45）0.6ｇを各々細かくすりつぶし、
別々に約１cm2のポリスチレン基板上に均一にの
せ400Kg/cm2の圧力をかけて定着させる。この陽
イオン交換樹脂プレートをジオキサンにつけ、
0.1MのＮ―ヒドロキシスクシンイミドおよび
Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミドを
加え室温で90分間振とうを加えながら反応させ
る。少量のメタノールで洗浄後0.1M NaHCO3
溶液で希釈したβ2―マイクログロブリン溶液を
2.5ml加えて４℃で24時間反応させ、0.05Mト
リス緩衝液（PH8.0）で洗浄後β2―マイクログ
ロブリン固定化担体を得る。陰イオン交換樹脂
プレートは、ラツト肝より精製したアミノペプ
チダーゼＢ（10mg/ml）を含む50mMホウ酸ナト
リウム緩衝液PH6.0の中でWSCを加えて室温で
２時間反応させ、同緩衝液で洗浄後、標素不溶
化担体を得る。
50）0.5ｇと陰イオン交換樹脂（アンバーライ
トIR―45）0.6ｇを各々細かくすりつぶし、
別々に約１cm2のポリスチレン基板上に均一にの
せ400Kg/cm2の圧力をかけて定着させる。この陽
イオン交換樹脂プレートをジオキサンにつけ、
0.1MのＮ―ヒドロキシスクシンイミドおよび
Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミドを
加え室温で90分間振とうを加えながら反応させ
る。少量のメタノールで洗浄後0.1M NaHCO3
溶液で希釈したβ2―マイクログロブリン溶液を
2.5ml加えて４℃で24時間反応させ、0.05Mト
リス緩衝液（PH8.0）で洗浄後β2―マイクログ
ロブリン固定化担体を得る。陰イオン交換樹脂
プレートは、ラツト肝より精製したアミノペプ
チダーゼＢ（10mg/ml）を含む50mMホウ酸ナト
リウム緩衝液PH6.0の中でWSCを加えて室温で
２時間反応させ、同緩衝液で洗浄後、標素不溶
化担体を得る。
(2) 標識担体の調製
放線菌から単離したアミノペプチダーゼＢの
阻害物質であるベスタチンのＮ―ヒドロキシス
クシンイミドエステル（0.02mg/ml）の0.1M
NaHCO3溶液に山羊抗ヒトβ2―マイクログロ
ブリンIgG分画10mgを加え室温で２時間反応し
た後にセフアデツクスＧ―25カラムにより精製
して阻害物質・標識抗体を得る。
阻害物質であるベスタチンのＮ―ヒドロキシス
クシンイミドエステル（0.02mg/ml）の0.1M
NaHCO3溶液に山羊抗ヒトβ2―マイクログロ
ブリンIgG分画10mgを加え室温で２時間反応し
た後にセフアデツクスＧ―25カラムにより精製
して阻害物質・標識抗体を得る。
(3) β2―マイクログロブリンの測定
β2―マイクログロブリン固定化担体を試験管
にとり、阻害物質標識抗体を含む50mMリン酸
ナトリウム緩衝液PH7.2を0.4mlとβ2―マイクロ
グロブリン標準溶液又は血清検体希釈液0.1ml
を加え、37℃で１時間反応させる。これに酵素
不溶化担体を加え37℃30分反応させる。これに
基質であるＬ―アルギニン―β―ナフチルアミ
ド溶液を0.5ml加え37℃で30分間反応させる。
この後ガーネツト試薬1.0mlを加え室温で15分
間放置後525nmの吸光度を測定する。このよう
にして測定した結果、その阻害の程度と、加え
た抗原量について第２図に示すような良好な標
準曲線が得られた。
にとり、阻害物質標識抗体を含む50mMリン酸
ナトリウム緩衝液PH7.2を0.4mlとβ2―マイクロ
グロブリン標準溶液又は血清検体希釈液0.1ml
を加え、37℃で１時間反応させる。これに酵素
不溶化担体を加え37℃30分反応させる。これに
基質であるＬ―アルギニン―β―ナフチルアミ
ド溶液を0.5ml加え37℃で30分間反応させる。
この後ガーネツト試薬1.0mlを加え室温で15分
間放置後525nmの吸光度を測定する。このよう
にして測定した結果、その阻害の程度と、加え
た抗原量について第２図に示すような良好な標
準曲線が得られた。
第１図はフエリチンの濃度と酵素活性との関係
を示すものであり、第２図はβ2―マイクログロブ
リンの濃度と酵素活性との関係を示すものであ
る。
を示すものであり、第２図はβ2―マイクログロブ
リンの濃度と酵素活性との関係を示すものであ
る。
Claims (1)
- １ 測定対象たる抗原と反応する抗体またはこの
抗体と反応する抗原と、酵素または酵素阻害もし
くは活性化物質とを担体に各々の固定相を分離し
て一体に固定した固定化物と、該固定化物に固定
された抗体または抗原と反応する抗原または抗体
と該固定化物に固定された酵素または酵素阻害も
しくは活性化物質と反応する酵素阻害もしくは活
性化物質または酵素とを結合した結合物と、測定
対象たる抗原とを水溶液中で共存せしめ、その後
該固定化物または水溶液の酵素活性または酵素阻
害もしくは活性化物質の活性を測定することを特
徴とする抗原の測定方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57076678A JPS58209994A (ja) | 1982-05-10 | 1982-05-10 | 活性蛋白等固定化物を用いた抗原の測定方法 |
| US06/491,661 US4582792A (en) | 1982-05-10 | 1983-05-05 | Immunoassay method using two immobilized biologically active substances |
| EP83302591A EP0094777B1 (en) | 1982-05-10 | 1983-05-09 | Biologically active composition and immunoassay using the same |
| DE8383302591T DE3370378D1 (en) | 1982-05-10 | 1983-05-09 | Biologically active composition and immunoassay using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57076678A JPS58209994A (ja) | 1982-05-10 | 1982-05-10 | 活性蛋白等固定化物を用いた抗原の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58209994A JPS58209994A (ja) | 1983-12-07 |
| JPH0132948B2 true JPH0132948B2 (ja) | 1989-07-11 |
Family
ID=13612085
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57076678A Granted JPS58209994A (ja) | 1982-05-10 | 1982-05-10 | 活性蛋白等固定化物を用いた抗原の測定方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4582792A (ja) |
| EP (1) | EP0094777B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58209994A (ja) |
| DE (1) | DE3370378D1 (ja) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59202064A (ja) * | 1983-04-30 | 1984-11-15 | Fujirebio Inc | 抗原決定基具有物質を測定する方法 |
| US4560648A (en) * | 1983-09-23 | 1985-12-24 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Homogeneous enzyme immunoassay for ferritin |
| JPS6067857A (ja) * | 1983-09-26 | 1985-04-18 | Fujirebio Inc | 活性蛋白等固定化物及びそれを用いた抗原，抗体の測定方法 |
| US4668620A (en) * | 1984-02-22 | 1987-05-26 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Reducing background interference activity in enzyme-label immunoassays |
| FR2562252B1 (fr) * | 1984-03-27 | 1988-01-22 | Inst Nat Sante Rech Med | Procede de dosage immunoenzymatique sans etape de separation et reactifs et necessaires pour sa mise en oeuvre |
| US4868106A (en) * | 1985-10-17 | 1989-09-19 | Konishiroku Photo Industry Co., Ltd. | Analytical element and method for determining a component in a test sample |
| US5501949A (en) * | 1985-12-10 | 1996-03-26 | Murex Diagnostics Corporation | Particle bound binding component immunoassay |
| US5236826A (en) * | 1985-12-10 | 1993-08-17 | Murex Corporation | Immunoassay for the detection or quantitation of an analyte |
| EP0248892A1 (en) * | 1985-12-10 | 1987-12-16 | Murex Corporation | Particle-bound binding component immunoassay |
| JPS6345562A (ja) * | 1986-04-22 | 1988-02-26 | Konica Corp | 免疫学的分析素子 |
| US5763262A (en) * | 1986-09-18 | 1998-06-09 | Quidel Corporation | Immunodiagnostic device |
| US20010023075A1 (en) * | 1992-04-03 | 2001-09-20 | Siu-Yin Wong | A immunodiagnositc device having a dessicant incorporated therein |
| AU610095B2 (en) * | 1986-11-19 | 1991-05-16 | Genetic Systems Corporation | Membrane affinity concentration immunoassay |
| CA1304682C (en) * | 1986-11-19 | 1992-07-07 | Nobuo Monji | Membrane affinity concentration immunoassay |
| US5206136A (en) * | 1986-11-19 | 1993-04-27 | Genetic Systems Corporation | Rapid membrane affinity concentration assays |
| US5206178A (en) * | 1986-11-19 | 1993-04-27 | Genetic Systems Corporation | Membrane affinity concentration immunoassay |
| JP2599192B2 (ja) * | 1987-04-29 | 1997-04-09 | セルテク セラピューティクスリミティド | 結合アッセイ装置 |
| US5641639A (en) * | 1987-04-29 | 1997-06-24 | Celltech Therapeutics Limited | Binding assay device |
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| EP0328106A3 (en) * | 1988-02-09 | 1990-12-19 | Konica Corporation | Method of assaying substance and immunoassay element |
| US5104793A (en) * | 1988-02-16 | 1992-04-14 | Boehringer Mannheim Corporation | Method for determining an analyte in a liquid sample using a zoned test device and an inhibitor for a label used in said method |
| CA2038059C (en) * | 1990-03-13 | 1997-05-20 | Norio Hagi | Process for producing a carrier for immunoassay |
| US5279937A (en) * | 1992-04-30 | 1994-01-18 | Detechnology Canada | Use of macroglobulins to improve the signal-to-background ratio in affinity binding assays |
| US5354692A (en) * | 1992-09-08 | 1994-10-11 | Pacific Biotech, Inc. | Analyte detection device including a hydrophobic barrier for improved fluid flow |
| DE69331597T2 (de) * | 1992-11-25 | 2002-09-12 | Chisso Corp., Osaka | Methoden und Verwendung von poly-L-lysine als Enzymschutzmittel |
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| US5565326A (en) * | 1994-05-31 | 1996-10-15 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Separation-free specific binding assays using anti-inhibitor antibodies |
| AU751938B2 (en) * | 1998-05-15 | 2002-08-29 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Immunoassay reagents and immunoassay method |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4225575A (en) * | 1978-05-15 | 1980-09-30 | Ventrex Laboratories, Inc. | Method and apparatus for performing in vitro clinical diagnostic tests using a solid phase assay system |
| US4294817A (en) * | 1977-11-25 | 1981-10-13 | International Diagnostic Technology, Inc. | Method of fluoro immunoassay |
| AU531777B2 (en) * | 1978-04-05 | 1983-09-08 | Syva Co. | Label/solid conjugate immunoassay system |
| GB2045431B (en) * | 1979-02-26 | 1983-04-20 | Technicon Instr | Immunoassay utilising two particulate reagents |
| DE2918342A1 (de) * | 1979-05-07 | 1980-11-20 | Behringwerke Ag | Latex-reagenz |
| US4378344A (en) * | 1979-09-28 | 1983-03-29 | Ventrex Laboratories, Inc. | Method and apparatus for performing multiple, simultaneous in vitro diagnostic tests using a solid phase system |
| US4299916A (en) * | 1979-12-26 | 1981-11-10 | Syva Company | Preferential signal production on a surface in immunoassays |
| DE3267499D1 (en) * | 1981-03-18 | 1986-01-02 | Fujirebio Kk | Support material for use in serological testing and process for the production thereof |
| JPS5818167A (ja) * | 1981-07-24 | 1983-02-02 | Fuji Photo Film Co Ltd | 分析フイルム及びこれを用いる分析方法 |
| US4459361A (en) * | 1982-06-04 | 1984-07-10 | Angenics, Inc. | Ligand assay with one or two particulate reagents and filter |
| US4435504A (en) * | 1982-07-15 | 1984-03-06 | Syva Company | Immunochromatographic assay with support having bound "MIP" and second enzyme |
-
1982
- 1982-05-10 JP JP57076678A patent/JPS58209994A/ja active Granted
-
1983
- 1983-05-05 US US06/491,661 patent/US4582792A/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-05-09 EP EP83302591A patent/EP0094777B1/en not_active Expired
- 1983-05-09 DE DE8383302591T patent/DE3370378D1/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0094777B1 (en) | 1987-03-18 |
| US4582792A (en) | 1986-04-15 |
| JPS58209994A (ja) | 1983-12-07 |
| DE3370378D1 (en) | 1987-04-23 |
| EP0094777A1 (en) | 1983-11-23 |
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