JPS6067857A - 活性蛋白等固定化物及びそれを用いた抗原，抗体の測定方法 - Google Patents
活性蛋白等固定化物及びそれを用いた抗原，抗体の測定方法Info
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- JPS6067857A JPS6067857A JP17635683A JP17635683A JPS6067857A JP S6067857 A JPS6067857 A JP S6067857A JP 17635683 A JP17635683 A JP 17635683A JP 17635683 A JP17635683 A JP 17635683A JP S6067857 A JPS6067857 A JP S6067857A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
くは活性化物質とを場を分離して固定した固定化物と、
それを用いて抗原及び抗体を酵素免疫法によって測定す
る方法に関するものである。
それを用いて抗原及び抗体を酵素免疫法によって測定す
る方法に関するものである。
抗原及び抗体の測定方法には種々の方法が知られている
が、酵素免疫法が特異性及び鋭敏性にすぐれ、かつ操作
及び装置が比較的簡便であるところから多用されている
。そして、この酵素免疫法における操作性をより簡便に
しあるいは鋭敏性を高めるだめの改良研究が種々行なわ
れている。
が、酵素免疫法が特異性及び鋭敏性にすぐれ、かつ操作
及び装置が比較的簡便であるところから多用されている
。そして、この酵素免疫法における操作性をより簡便に
しあるいは鋭敏性を高めるだめの改良研究が種々行なわ
れている。
本発明者らもこの酵素免疫法を改良すべく種々検討の結
果、抗原又は抗体と酵素又は酵素阻害もしくは活性化物
質を場を分離して固定した固定化物、及びこの固定化物
を用いて抗原と抗体の反応と酵素と酵素阻害もしくは活
性化物質との反応を競争させる全く新規な方法を案出し
、この方法を用いれば抗原及び抗体を簡便にかつ鋭敏性
高く測定しうることを見出して、これに基いて本発明を
完成するに至った。
果、抗原又は抗体と酵素又は酵素阻害もしくは活性化物
質を場を分離して固定した固定化物、及びこの固定化物
を用いて抗原と抗体の反応と酵素と酵素阻害もしくは活
性化物質との反応を競争させる全く新規な方法を案出し
、この方法を用いれば抗原及び抗体を簡便にかつ鋭敏性
高く測定しうることを見出して、これに基いて本発明を
完成するに至った。
以下、本発明の内容を詳細に説明する。
まず、本発明の固定化物は、抗原又は抗体と、酵素又は
酵素阻害もしくは活性化物質とが担体に各々の固定相が
分離されて固定されているものである。
酵素阻害もしくは活性化物質とが担体に各々の固定相が
分離されて固定されているものである。
抗原及び抗体の種類は限定されるものではなく、使用目
的に応じて適宜選択すればよい。抗原にはハプテン及び
２抗体法で用いる場合の第１抗体も含まれ、抗体にはＦ
（ａｂっ２ ’ ＋ Ｆａｂ’ ＋ Ｆａｂのよう々フ
ラグメント及び第１抗体に対する第２抗体も含まれる。
的に応じて適宜選択すればよい。抗原にはハプテン及び
２抗体法で用いる場合の第１抗体も含まれ、抗体にはＦ
（ａｂっ２ ’ ＋ Ｆａｂ’ ＋ Ｆａｂのよう々フ
ラグメント及び第１抗体に対する第２抗体も含まれる。
また、本発明を２抗体法を用いて実施する場合、全ての
抗原、第１抗体、第２抗体の組合せも本発明の抗原及び
抗体に含まれる。
抗原、第１抗体、第２抗体の組合せも本発明の抗原及び
抗体に含まれる。
抗原及び抗体の例としては、各種内分泌腺に由来スルホ
ルモン、血清中の免疫グロブリン、アルブミン、フエＩ
Ｊチンなどの蛋白質、各種免疫複合体、ＨＢ抗原等の病
原体、補体、ノコ゛ギンンのような薬物、サイクリック
ヌクレオチド類、α−フェトプロティン、癌胎児性抗原
等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原及び抗
体を挙げることができる。
ルモン、血清中の免疫グロブリン、アルブミン、フエＩ
Ｊチンなどの蛋白質、各種免疫複合体、ＨＢ抗原等の病
原体、補体、ノコ゛ギンンのような薬物、サイクリック
ヌクレオチド類、α−フェトプロティン、癌胎児性抗原
等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原及び抗
体を挙げることができる。
酵素と酵素阻害もしくは活性化物質はお互いに反応し合
うものである。これらの種類も特に限定されるものでは
なく、α−アミラーゼとアミラーゼインヒビター、β−
ガラクトシダーセ◆とイソンラ？ノイド、エステラーゼ
とベスタチンなどを例として挙げることができる。
うものである。これらの種類も特に限定されるものでは
なく、α−アミラーゼとアミラーゼインヒビター、β−
ガラクトシダーセ◆とイソンラ？ノイド、エステラーゼ
とベスタチンなどを例として挙げることができる。
本発明の固定化物は抗原又は抗体と酵素又は酵素阻害も
しくは活性化物質とが固定されているのであるから、抗
原と酵素、抗原と酵素阻害もしくは活性化物質、抗体と
酵素、及び抗体と抗素阻害もしくは活性化物質の４種の
組合せがあることになる。
しくは活性化物質とが固定されているのであるから、抗
原と酵素、抗原と酵素阻害もしくは活性化物質、抗体と
酵素、及び抗体と抗素阻害もしくは活性化物質の４種の
組合せがあることになる。
このような固定化物は抗原又は抗体の固定相と酵素又は
酵素阻害もしくは活性化物質の固定相とが分離されてい
るところに特徴がある。この相分離とは、後述する抗原
又は抗体と酵素又は酵素阻害もしくは活性化物質との結
合物が一方の相において反応して結合した場合にもう一
方の相と更に反応しない程度に両相が互いに分離されて
いることをいう。但し、両相の境界域において両相と反
応する結合物があってもその比率が固定化物の用途との
関係において問題にならない程度であればよいことはい
うまでもない。
酵素阻害もしくは活性化物質の固定相とが分離されてい
るところに特徴がある。この相分離とは、後述する抗原
又は抗体と酵素又は酵素阻害もしくは活性化物質との結
合物が一方の相において反応して結合した場合にもう一
方の相と更に反応しない程度に両相が互いに分離されて
いることをいう。但し、両相の境界域において両相と反
応する結合物があってもその比率が固定化物の用途との
関係において問題にならない程度であればよいことはい
うまでもない。
具体的には、担体に用いた重合体の場を分けて抗原等と
酵素等を固定したものとが抗原等を固定した重合体と酵
素等を固定した重合体を貼合せたものなどを例として挙
げることができる。また、担体がある程度大きな粒子、
例えば直径３閣以上の粒子であるような場合には全体の
面積に対して接触面積が問題になら々くなるので、抗原
等と酵素等をこのような大きさの別々の粒子に固定した
ものであってもよい。他の例としては、一方を管に固定
し、もう一方を粒子に固定したような場合を挙げること
ができる。
酵素等を固定したものとが抗原等を固定した重合体と酵
素等を固定した重合体を貼合せたものなどを例として挙
げることができる。また、担体がある程度大きな粒子、
例えば直径３閣以上の粒子であるような場合には全体の
面積に対して接触面積が問題になら々くなるので、抗原
等と酵素等をこのような大きさの別々の粒子に固定した
ものであってもよい。他の例としては、一方を管に固定
し、もう一方を粒子に固定したような場合を挙げること
ができる。
固定化物の製法としては、重合体の場を分けて固定した
ものの場合には、例えば官能基を異にしたブロック共重
合体とがグラフト共重合体を形成して官能基の差異を利
用して抗原等と酵素等を態別に固定すればよい。官能基
は、−ＮＨ２，−ＣＯＯＴ（。
ものの場合には、例えば官能基を異にしたブロック共重
合体とがグラフト共重合体を形成して官能基の差異を利
用して抗原等と酵素等を態別に固定すればよい。官能基
は、−ＮＨ２，−ＣＯＯＴ（。
−ＣＨｏ 、 −ＯＨ、−８Ｈなど通常のものでよい。
これらの重合体を構成成分とするグａ７り共重合体、グ
ラフト共重合体は公知の方法傾よって製造すればよい。
ラフト共重合体は公知の方法傾よって製造すればよい。
一方、固定されるものが酵素阻害物質などで、固定して
から共重合体を形成しても活性が失なわれないような場
合には、そうすることによって官能基が異ならなくとも
よい場合がある。
から共重合体を形成しても活性が失なわれないような場
合には、そうすることによって官能基が異ならなくとも
よい場合がある。
重合体を貼合わせる場合には予め貼合わせてから固定化
してもよく、その逆でもよい。貼合せは融着であっても
よく接着であってもよい。
してもよく、その逆でもよい。貼合せは融着であっても
よく接着であってもよい。
このような担体の外形は特に限定されるものではなく、
例えば、球形、円盤形、長方形、円管形などでよい。
例えば、球形、円盤形、長方形、円管形などでよい。
抗原、抗体、酵素、及び酵素阻害もしくは活性化物質の
固定化方法は公知の方法に準じて行々えばよい。抗体、
酵素、及び抗原、酵素阻害もしくは活性化物質のうち蛋
白質のものについては、ノアゾ法、被プチド結合法、ア
ルキル 結合法、イオン結合法、物理的吸着法などの酵素等の活
性蛋白を担体に固定する公知の方法に準じて行なえばよ
く、蛋白質以外のものも抗原等と担体等の官能基等を考
慮して固定化方法を適宜選択すればよい。この固定化さ
れている抗原には、例えば担体に共有結合されている抗
原に第１抗体を抗原抗体反応させ、これにさらに第２抗
体を反応させるような場合の抗原と第１抗体との反応物
も含む。
固定化方法は公知の方法に準じて行々えばよい。抗体、
酵素、及び抗原、酵素阻害もしくは活性化物質のうち蛋
白質のものについては、ノアゾ法、被プチド結合法、ア
ルキル 結合法、イオン結合法、物理的吸着法などの酵素等の活
性蛋白を担体に固定する公知の方法に準じて行なえばよ
く、蛋白質以外のものも抗原等と担体等の官能基等を考
慮して固定化方法を適宜選択すればよい。この固定化さ
れている抗原には、例えば担体に共有結合されている抗
原に第１抗体を抗原抗体反応させ、これにさらに第２抗
体を反応させるような場合の抗原と第１抗体との反応物
も含む。
この固定化物を用いて抗原を測定する場合には、固定相
の一方には測定対象たる抗原と反応する抗体又はこの抗
体と反応する抗原を固定し、抗体を測定する場合には、
固定相の一方に測定対象たる抗体と反応する抗原又はこ
の抗原と反応する抗体を固定する。
の一方には測定対象たる抗原と反応する抗体又はこの抗
体と反応する抗原を固定し、抗体を測定する場合には、
固定相の一方に測定対象たる抗体と反応する抗原又はこ
の抗原と反応する抗体を固定する。
そして、該固定化物に固定された抗原又は抗体と反応す
る抗体又は抗原と該固定化物に固定された酵素又は酵素
阻害もしくは活性化物質と反応する酵素阻害もしくは活
性化物質又は酵素とを結合した結合物と、測定対象たる
抗原又は抗体とを、該固定化物とを水溶液中で共存せし
めて抗原と抗体の反応と酵素と酵素阻害もしくは活性化
物質の反応とを競争反応させ、その後酵素活性又は酵素
阻害もしくは活性化物質の活性を測定することによって
抗原又は抗体を測定するのである。
る抗体又は抗原と該固定化物に固定された酵素又は酵素
阻害もしくは活性化物質と反応する酵素阻害もしくは活
性化物質又は酵素とを結合した結合物と、測定対象たる
抗原又は抗体とを、該固定化物とを水溶液中で共存せし
めて抗原と抗体の反応と酵素と酵素阻害もしくは活性化
物質の反応とを競争反応させ、その後酵素活性又は酵素
阻害もしくは活性化物質の活性を測定することによって
抗原又は抗体を測定するのである。
ここに測定対象たる抗原あるいは抗体とは本発明法にお
ける測定対象であることはいうまでもなく、例えば２抗
体法においては測定の目的物である抗原と第１抗体との
結合物が測定対象たる抗原になる。
ける測定対象であることはいうまでもなく、例えば２抗
体法においては測定の目的物である抗原と第１抗体との
結合物が測定対象たる抗原になる。
結合物の組合せは抗原と酵素、抗原と酵素阻害もしくは
活性化物質、抗体と酵素、及び抗体と酵素阻害もしくは
活性化物質の４通りあるわけであるが、この結合物は前
記固定化物の両固定相と反応するものでなければならな
いから、この組合せは固定化物に応じて自動的に定まる
。結合物の製法としては要は結合物が両方の活性を発揮
しうれば足シ、例えば結合させる双方がいずれも蛋白質
である場合には、酵素等の活性蛋白を固定する架橋法あ
るいはにフ０チド結合法などを活用できる。
活性化物質、抗体と酵素、及び抗体と酵素阻害もしくは
活性化物質の４通りあるわけであるが、この結合物は前
記固定化物の両固定相と反応するものでなければならな
いから、この組合せは固定化物に応じて自動的に定まる
。結合物の製法としては要は結合物が両方の活性を発揮
しうれば足シ、例えば結合させる双方がいずれも蛋白質
である場合には、酵素等の活性蛋白を固定する架橋法あ
るいはにフ０チド結合法などを活用できる。
結合する一方又は双方が蛋白質でない場合にはそれぞれ
の官能基を考慮して結合方法を適宜選択すればよい。
の官能基を考慮して結合方法を適宜選択すればよい。
本発明の測定方法の原理を、抗原と酵素阻害物質を固定
した固定化物と、酵素と抗体の結合物を用いて抗原を測
定する場合を例として説明すると、まず、測定される抗
原がないときには一般に抗原−抗体間の結合力が酵素−
酵素阻害もしくは活性化物質間の結合力より強いとζろ
がら、結合物は固定化抗原に結合し酵素阻害物質の固定
化物には結合しない。次に１測定される抗原が存在する
ときには結合物の抗体が測定対象抗原と固定化抗原との
間で競争反応し、測定対象抗原と結合した結合物はさら
に酵素部分が固定化物の酵素阻害物質と反応してそこに
結合する。そしてこの結合量だけ酵素活性が低下するか
ら予め遊離の抗原量と酵素活性の低下量の関係をめてお
けば、酵素活性の低下量を測定することによって測定対
象抗原量を知ることができる。
した固定化物と、酵素と抗体の結合物を用いて抗原を測
定する場合を例として説明すると、まず、測定される抗
原がないときには一般に抗原−抗体間の結合力が酵素−
酵素阻害もしくは活性化物質間の結合力より強いとζろ
がら、結合物は固定化抗原に結合し酵素阻害物質の固定
化物には結合しない。次に１測定される抗原が存在する
ときには結合物の抗体が測定対象抗原と固定化抗原との
間で競争反応し、測定対象抗原と結合した結合物はさら
に酵素部分が固定化物の酵素阻害物質と反応してそこに
結合する。そしてこの結合量だけ酵素活性が低下するか
ら予め遊離の抗原量と酵素活性の低下量の関係をめてお
けば、酵素活性の低下量を測定することによって測定対
象抗原量を知ることができる。
測定方法としては、要は水溶液中において固定化物と結
合物と測定対象たる抗原又は抗体の三者を共存させれば
よく添加順序は問わない。この共存は一方の反応中の全
時間待なわれている場合に限らず、一時的であってもよ
い。例えば、抗原及びそれと酵素との結合物を抗体固定
化チー−プで反応させたのち釦酵素インヒビター固定化
ビーズを投入して余剰の結合物をスカベンジするよう々
場合も本発明に含捷れる。
合物と測定対象たる抗原又は抗体の三者を共存させれば
よく添加順序は問わない。この共存は一方の反応中の全
時間待なわれている場合に限らず、一時的であってもよ
い。例えば、抗原及びそれと酵素との結合物を抗体固定
化チー−プで反応させたのち釦酵素インヒビター固定化
ビーズを投入して余剰の結合物をスカベンジするよう々
場合も本発明に含捷れる。
水溶液は抗原−抗体反応及び抗素−酵素阻害もしくは活
性化物質反応が反応しやすいＰＨにするのがよくそのた
めにリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液などの
緩衝液を用いるのがよい。ＰＨは抗原及び抗体と酵素及
び酵素阻害もしくは活性化物質によって異なるが通例Ｐ
Ｈ５〜８程度がよい。
性化物質反応が反応しやすいＰＨにするのがよくそのた
めにリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液などの
緩衝液を用いるのがよい。ＰＨは抗原及び抗体と酵素及
び酵素阻害もしくは活性化物質によって異なるが通例Ｐ
Ｈ５〜８程度がよい。
温度も抗原及び抗体と酵素及び酵素阻害もしくは活性化
物質によって異なるが通例は１５〜４５℃程度である。
物質によって異なるが通例は１５〜４５℃程度である。
反応後は固定化物又は水溶液の酵素活性又は酵素阻害も
しくは活性化物質の活性を測定する。測定方法は測定対
象たる酵素あるいは酵素阻害もしくは活性化物質の活性
を測定する公知の方法によればよく、例えば酵素活性を
測定する場合にも使用する酵素と基質の組合せによシ、
比色法、螢光法、フォトンカウンター等を用いた発光法
など種々の測定方法を利用することができる。
しくは活性化物質の活性を測定する。測定方法は測定対
象たる酵素あるいは酵素阻害もしくは活性化物質の活性
を測定する公知の方法によればよく、例えば酵素活性を
測定する場合にも使用する酵素と基質の組合せによシ、
比色法、螢光法、フォトンカウンター等を用いた発光法
など種々の測定方法を利用することができる。
本発明の測定方法は抗原、抗体の種類を問わず広ぐ測定
しうるものであり、従来の各種酵素免疫法のうちの代表
的な方法であるサンドインチ法においては操作が煩雑で
塾るという難点があり、ボモジニアス法においては感度
が不充分であるという難点があったところを本発明の方
法によって、操作を簡単にしかつ感度を高めて、両者の
問題点を一挙に解決したのである。この本発明の方法は
抗原又は抗体と酵素又は酵素阻害もしくは活性化物質を
いずれも固定し、しかも両者の固定相を分離するという
特殊外技法によって達成したものであり、との相分離に
よって一方の固定相に結合した抗原まだは抗体と酵素ま
たは酵素阻害もしくは活性化物質との結合物がさらにも
う一方の固定相に結合する可能性を排除し、そのことに
よって反応操作が１回であるにもかかわらず高感度を達
成することができたのである。
しうるものであり、従来の各種酵素免疫法のうちの代表
的な方法であるサンドインチ法においては操作が煩雑で
塾るという難点があり、ボモジニアス法においては感度
が不充分であるという難点があったところを本発明の方
法によって、操作を簡単にしかつ感度を高めて、両者の
問題点を一挙に解決したのである。この本発明の方法は
抗原又は抗体と酵素又は酵素阻害もしくは活性化物質を
いずれも固定し、しかも両者の固定相を分離するという
特殊外技法によって達成したものであり、との相分離に
よって一方の固定相に結合した抗原まだは抗体と酵素ま
たは酵素阻害もしくは活性化物質との結合物がさらにも
う一方の固定相に結合する可能性を排除し、そのことに
よって反応操作が１回であるにもかかわらず高感度を達
成することができたのである。
以下、実施例を示す。
実施例１
（１）相分離担体の調製
平均分子量５０００００ダルトンのデキストラン（ファ
ーマシア社製）１ｏｆを８０％エタノールを含む０．
Ｉ Ｎ ＮａＯＨ５０ｍｌＪに溶解し、徐々にモノクロ
ル酢酸ナトリウム０．６ ｙ−を添加して３０℃で５時
間反応させてカルボキシメチル基を４人させる。
ーマシア社製）１ｏｆを８０％エタノールを含む０．
Ｉ Ｎ ＮａＯＨ５０ｍｌＪに溶解し、徐々にモノクロ
ル酢酸ナトリウム０．６ ｙ−を添加して３０℃で５時
間反応させてカルボキシメチル基を４人させる。
反応終了後、この一部を１０ｍＭホウ酸緩衝液ｐＨ６，
０に対して透析し、３’ Ｎ ＨＣｔで２４時間処理し
てアミン基を遊離させたナイロン製球形ビー、ｅ（直径
６ ｒｒｒｍ ） １００個に加え水容性カルボジイミ
ド（以後ＷＳＣと略す）を加えて４℃で６時間反応させ
てナイロンのアミン基の一部にデキストランを導入する
。上記緩衝液で２回洗浄操作を行ったビーズに、１０ｍ
Ｍホウ酸緩衝液ＰＨ５，５に溶解したβ−ガラクト７ダ
ーゼの阻害剤であるフェニルアセトアルドキシムのアミ
ン誘導体に無水コハク酸を反応させた化合物を１ ｍ１
７Ｍの濃度で加え、ＷＳｃとともに３０℃で１８時間反
応を行ってナイロンの残シのアミン基と力、プリングを
行なう。このナイロン−ピーズに０．０２ Ｍ過ヨウ素
酸ナトリウム溶液を加え４℃で３０分反応させたのちに
エチレングリコールを０．０４ Ｍになるように加え室
温で１時間反鼠愼ぜスーＭ問妨冬伶ホ１売箇乞ＷζＡ
−ｕ炭酸す） ＩＪウム緩衝液ｐＨ８，５に溶解したフ
ェリチン（１０μｆｄｎｌ ）を加え、室温で４時間反
応させる。
０に対して透析し、３’ Ｎ ＨＣｔで２４時間処理し
てアミン基を遊離させたナイロン製球形ビー、ｅ（直径
６ ｒｒｒｍ ） １００個に加え水容性カルボジイミ
ド（以後ＷＳＣと略す）を加えて４℃で６時間反応させ
てナイロンのアミン基の一部にデキストランを導入する
。上記緩衝液で２回洗浄操作を行ったビーズに、１０ｍ
Ｍホウ酸緩衝液ＰＨ５，５に溶解したβ−ガラクト７ダ
ーゼの阻害剤であるフェニルアセトアルドキシムのアミ
ン誘導体に無水コハク酸を反応させた化合物を１ ｍ１
７Ｍの濃度で加え、ＷＳｃとともに３０℃で１８時間反
応を行ってナイロンの残シのアミン基と力、プリングを
行なう。このナイロン−ピーズに０．０２ Ｍ過ヨウ素
酸ナトリウム溶液を加え４℃で３０分反応させたのちに
エチレングリコールを０．０４ Ｍになるように加え室
温で１時間反鼠愼ぜスーＭ問妨冬伶ホ１売箇乞ＷζＡ
−ｕ炭酸す） ＩＪウム緩衝液ｐＨ８，５に溶解したフ
ェリチン（１０μｆｄｎｌ ）を加え、室温で４時間反
応させる。
］、 ｍ！水素化硼素す） ＩＪウムを加え１晩放置後
０５％ ＢＳＡを含む同緩衝液で２回洗浄ののち、２０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，５中に保存する。
０５％ ＢＳＡを含む同緩衝液で２回洗浄ののち、２０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，５中に保存する。
（２）酵素標識抗体の調製
ブタ肝臓より調製したβ−Ｄ−がラクトシダーゼを公知
のマレイミド架橋法にょシ、抗体と結合させる。
のマレイミド架橋法にょシ、抗体と結合させる。
山羊抗ヒトフェリチン抗体のＩｇＧ分画２ｏｒｎｇを１
ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ＰＨ４，５に溶
解しＱ、 ４． ｒｑ−ｅデンンを加えて３７℃１６時
間酵素消化を行う。ＰＴ（を８． Ｏに合せたのちにセ
ファデックスＧ−１５０カラムによす０．１ Ｍ硼酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ８，０で溶出し、Ｆ （ａ ｂ’
）２ を得る。これを０、１ Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ５，０中で２０μモルの２−メルカプトエチルアミ
ンと３７℃で９０分反応させ、セファデックスＧ−２５
カラムにて過剰試薬を除去する。得られたＦａｔ）’を
０．１ Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５，０の条件下、
１．０ ｍｌ （Ｄ Ｎ、Ｎ’−〇−フェニレンダイマ
レイミド飽和溶液を加え３０℃で２０分間反応を行った
のち、セファデックスＧ−２５カラムにてマレイミド−
Ｆａｂ′を集める。これに硫安懸濁状態のβ−Ｄ−ガラ
クトンダーゼを２０μを加え３０℃で２０分反応させ、
中和したのちに０．１チウシ血清アルブミン（ＢＳＡ
） −１ｍ１ｌｌｉ ＭｇＣｌ２−０．１ Ｍ ＮａＣ
１を含む１０ ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ７，
０で平衡化したセファローズ６Ｂカラムで精製する。
ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ＰＨ４，５に溶
解しＱ、 ４． ｒｑ−ｅデンンを加えて３７℃１６時
間酵素消化を行う。ＰＴ（を８． Ｏに合せたのちにセ
ファデックスＧ−１５０カラムによす０．１ Ｍ硼酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ８，０で溶出し、Ｆ （ａ ｂ’
）２ を得る。これを０、１ Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ５，０中で２０μモルの２−メルカプトエチルアミ
ンと３７℃で９０分反応させ、セファデックスＧ−２５
カラムにて過剰試薬を除去する。得られたＦａｔ）’を
０．１ Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５，０の条件下、
１．０ ｍｌ （Ｄ Ｎ、Ｎ’−〇−フェニレンダイマ
レイミド飽和溶液を加え３０℃で２０分間反応を行った
のち、セファデックスＧ−２５カラムにてマレイミド−
Ｆａｂ′を集める。これに硫安懸濁状態のβ−Ｄ−ガラ
クトンダーゼを２０μを加え３０℃で２０分反応させ、
中和したのちに０．１チウシ血清アルブミン（ＢＳＡ
） −１ｍ１ｌｌｉ ＭｇＣｌ２−０．１ Ｍ ＮａＣ
１を含む１０ ｍＭリン酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ７，
０で平衡化したセファローズ６Ｂカラムで精製する。
（３） フェリチン抗原の測定法
（１）で調製した相分離担体ナイロンビーズを１個試験
管にと’）、ｏ４ｍｅの０．１． Ｍ ！Ｊン酸緩衝液
ＰＨ７０を加える。これにフェリチン標準液または血清
希釈液を５０μＬ加え続いて希釈した酵素標識抗体を５
０μを加えて３７℃で１時間反応させる。基質である０
、 ００５ Ｍ ｐ−二トロフェニルーβ−り一ガラク
トピラノンドをＱ、 ５ ｍｌそのまま加え、１５分間
３７℃で反応したのちに、２．０ｍｌの０．４Ｍグリシ
ン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，５）で反応を止め、４
００ ｎｍの吸光度を測定する。
管にと’）、ｏ４ｍｅの０．１． Ｍ ！Ｊン酸緩衝液
ＰＨ７０を加える。これにフェリチン標準液または血清
希釈液を５０μＬ加え続いて希釈した酵素標識抗体を５
０μを加えて３７℃で１時間反応させる。基質である０
、 ００５ Ｍ ｐ−二トロフェニルーβ−り一ガラク
トピラノンドをＱ、 ５ ｍｌそのまま加え、１５分間
３７℃で反応したのちに、２．０ｍｌの０．４Ｍグリシ
ン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，５）で反応を止め、４
００ ｎｍの吸光度を測定する。
このようにして測定１７た結果、測定すべきフェリチン
量の増加に対応して阻害率が増加して、フェリチン量２
５〜５００μｆ／ｍｌの検体の測定範囲において第１図
に示すような良好な標準曲線が得られた。また血清にお
いても上記濃度範囲において測定が可能であった。
量の増加に対応して阻害率が増加して、フェリチン量２
５〜５００μｆ／ｍｌの検体の測定範囲において第１図
に示すような良好な標準曲線が得られた。また血清にお
いても上記濃度範囲において測定が可能であった。
実施例２
（１）担体の製造
陽イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＣ−５０）０、
５ ｙ−と陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−４
５）０．６！ｉＩ−を各々細かくすりつぶし、別々に約
１ｄのポリスチレン基板上に均一にのせ４００に９／ａ
ｒｔ？の圧力をかけて定着させる。この陽イオン交換樹
脂プレートをジオキサンにつけ、０．１ ＭのＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドおよびＮ、Ｎ’−シンクロヘキシ
ルカルデジイミドを加え室温で９０分間振とうを加えな
がら反応させる。少量のメタノールで洗浄後０．１ Ｍ
ＮａＨＣＯ３溶液で希釈したβ２−マイクログロブリ
ン溶液を２．５ ｍｌ加えて４℃で２４時間反応させ、
０．０５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ８，０）で洗浄後β２−
マイクログロブリン固定化担体を得る。陰イオン交換樹
脂プレートは、ラット肝よシ精製したアミノペプチダー
ゼＢ （１０ｍｆＪ／ｆｎｌ ） ヲ含む５０ ｍＭホ
ウ酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ６，０の中でＷＳＣを加え
て室温で２時間反応させ、同緩衝液で洗浄後、酵素不溶
化担体を得る。
５ ｙ−と陰イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ−４
５）０．６！ｉＩ−を各々細かくすりつぶし、別々に約
１ｄのポリスチレン基板上に均一にのせ４００に９／ａ
ｒｔ？の圧力をかけて定着させる。この陽イオン交換樹
脂プレートをジオキサンにつけ、０．１ ＭのＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドおよびＮ、Ｎ’−シンクロヘキシ
ルカルデジイミドを加え室温で９０分間振とうを加えな
がら反応させる。少量のメタノールで洗浄後０．１ Ｍ
ＮａＨＣＯ３溶液で希釈したβ２−マイクログロブリ
ン溶液を２．５ ｍｌ加えて４℃で２４時間反応させ、
０．０５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ８，０）で洗浄後β２−
マイクログロブリン固定化担体を得る。陰イオン交換樹
脂プレートは、ラット肝よシ精製したアミノペプチダー
ゼＢ （１０ｍｆＪ／ｆｎｌ ） ヲ含む５０ ｍＭホ
ウ酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ６，０の中でＷＳＣを加え
て室温で２時間反応させ、同緩衝液で洗浄後、酵素不溶
化担体を得る。
（２）標識担体の調製
放線菌から単離したアミノ被ブチダーゼＢの阻害物質で
あるベスタチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミＰエステ
ル（０，０２ｍ？ＡＩ ）の０．１． Ｍ ＮａＨＣＯ
３溶液に山羊抗ヒトβ２−マイクログロブリンＩｇＧ分
画１０ ｒｎｙを加え室温で２時間反応した後にセファ
デックスＧ−２５カラムによシ精製して阻害物質・標識
抗体を得る。
あるベスタチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミＰエステ
ル（０，０２ｍ？ＡＩ ）の０．１． Ｍ ＮａＨＣＯ
３溶液に山羊抗ヒトβ２−マイクログロブリンＩｇＧ分
画１０ ｒｎｙを加え室温で２時間反応した後にセファ
デックスＧ−２５カラムによシ精製して阻害物質・標識
抗体を得る。
（３） β２−マイクログロブリンの測定β２−マイク
ログロブリン固定化担体を試験管にとり、阻害物質標識
抗体を含む５０ ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７
，２を０．４ ｍｌとβ２−マイクログロブリン標準溶
液又は血清検体希釈液０．１− ｍｌを加え、３７℃で
１時間反応させる。これに酵素不溶化担体を加え３７℃
３０分反応させる。これに基質であるＬ−アルギニン−
β−ナフチルアミド溶液をＱ、 ５ ｍｌ加え３７℃で
３０分間反応させる。この後ガーネット試薬１．０ｍｌ
を加え室温で１５分間放置後５２５ｎｍの吸光度を測定
する。このようにして測定した結果、その阻害の程度と
、加えた抗原量について第２図に示すような良好な標準
曲線が得られた。
ログロブリン固定化担体を試験管にとり、阻害物質標識
抗体を含む５０ ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７
，２を０．４ ｍｌとβ２−マイクログロブリン標準溶
液又は血清検体希釈液０．１− ｍｌを加え、３７℃で
１時間反応させる。これに酵素不溶化担体を加え３７℃
３０分反応させる。これに基質であるＬ−アルギニン−
β−ナフチルアミド溶液をＱ、 ５ ｍｌ加え３７℃で
３０分間反応させる。この後ガーネット試薬１．０ｍｌ
を加え室温で１５分間放置後５２５ｎｍの吸光度を測定
する。このようにして測定した結果、その阻害の程度と
、加えた抗原量について第２図に示すような良好な標準
曲線が得られた。
実施例３
（１）相分離担体の調製
小麦粉より分離した分子量約２４０００の蛋白性アミラ
ーゼインヒビター２（ｌグを５ ｍＭ ＢＤＴＡを含む
０．１． Ｍ ＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，５に溶解し、こ
れに９ｍμ６のＳ−アセチルメルカ７’）コハク酸無水
物のツメチルスルホキシド溶液１００μｔを加えて３７
℃で１時間加温した。続いて、ｐＨ７，５の１Ｍヒドロ
キシルアミン溶液１１０μｔを加えて３７℃で３０分間
反応させた。この反応液をセファデックスＧ−２５のカ
ラムに流して１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む０、１ Ｍ ！
Ｊン酸緩衝液ｐＨ６，５でグルＥ過し、未反応のＳ−ア
セチルメルカグトコハク酸を除去してＳＨ化アミラーゼ
インヒビターを得た。
ーゼインヒビター２（ｌグを５ ｍＭ ＢＤＴＡを含む
０．１． Ｍ ＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，５に溶解し、こ
れに９ｍμ６のＳ−アセチルメルカ７’）コハク酸無水
物のツメチルスルホキシド溶液１００μｔを加えて３７
℃で１時間加温した。続いて、ｐＨ７，５の１Ｍヒドロ
キシルアミン溶液１１０μｔを加えて３７℃で３０分間
反応させた。この反応液をセファデックスＧ−２５のカ
ラムに流して１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む０、１ Ｍ ！
Ｊン酸緩衝液ｐＨ６，５でグルＥ過し、未反応のＳ−ア
セチルメルカグトコハク酸を除去してＳＨ化アミラーゼ
インヒビターを得た。
一方、直径４論のナイロン製球形ビーズを３Ｎ塩酸中に
２４時間浸してアミノ基を遊離させた。
２４時間浸してアミノ基を遊離させた。
このビーズ°を水洗後０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液ｐＨ
６，３に浸し、１／１０容量の２ ｍｇ、、ｆｎｌのＣ
Ｉ−ＴＭＳジオキサン溶液を加えて室温にて３時間反応
させた。ビーズを取出して０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液
ｐＨ６，３で２回洗浄し、これに前記のＳＨ化テアミラ
ーゼインヒビター溶液加えて４℃で一夜反応させた。こ
のビーズを上記緩衝液で洗浄してから１％ＢＳＡを含む
５０ ｍＭＭリン酸緩衝液１７．０中に４℃にて保存し
、これをアミラーゼインヒビター固定化ビーズとした。
６，３に浸し、１／１０容量の２ ｍｇ、、ｆｎｌのＣ
Ｉ−ＴＭＳジオキサン溶液を加えて室温にて３時間反応
させた。ビーズを取出して０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液
ｐＨ６，３で２回洗浄し、これに前記のＳＨ化テアミラ
ーゼインヒビター溶液加えて４℃で一夜反応させた。こ
のビーズを上記緩衝液で洗浄してから１％ＢＳＡを含む
５０ ｍＭＭリン酸緩衝液１７．０中に４℃にて保存し
、これをアミラーゼインヒビター固定化ビーズとした。
直径３６■のポリスチレン製球形ビーズを水洗後、２０
ｍＭ リン酸緩衝液ｐｉ４７．５に溶解した山羊抗ヒ
トＡＦＰ特異ＩｇＧ（ＯＤ２８ｏ−０１）に浸し、４℃
で２日間物理吸着させた。これを２０ ｍＭ ’）ン酸
緩衝液ｐＨ７，５で十分に洗浄してからｌ ％ ＢＳＡ
及び０１４Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝
液ｐＨ７，５中に４℃にて保存し、抗体固定化ビーズと
（２）酵素標識抗原の調製 ブタ膵臓由来のα−アミラーゼ５■ヲ５ｍＭＥＤＴＡを
含む０．１ＭＭリン酸緩衝液１７．５に溶かし、これに
９ψｌのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物のジメ
チルスルホキシドｉ液ｌｏｏμｍ ヲ加えて３７℃で３
０分間反応させた。この反応液をセファデックスＧ−２
５のカラムに流して１ｍＭＥＤＴＡを含むＱ、 Ｉ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液ｐＨ６，５でデル濾過し、未反応のＳ
−アセチルメルカプトコハク酸ヲ除去した。こうして得
られたＳＨ化α−アミラーゼを１ψｌまで濃縮した。
ｍＭ リン酸緩衝液ｐｉ４７．５に溶解した山羊抗ヒ
トＡＦＰ特異ＩｇＧ（ＯＤ２８ｏ−０１）に浸し、４℃
で２日間物理吸着させた。これを２０ ｍＭ ’）ン酸
緩衝液ｐＨ７，５で十分に洗浄してからｌ ％ ＢＳＡ
及び０１４Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝
液ｐＨ７，５中に４℃にて保存し、抗体固定化ビーズと
（２）酵素標識抗原の調製 ブタ膵臓由来のα−アミラーゼ５■ヲ５ｍＭＥＤＴＡを
含む０．１ＭＭリン酸緩衝液１７．５に溶かし、これに
９ψｌのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物のジメ
チルスルホキシドｉ液ｌｏｏμｍ ヲ加えて３７℃で３
０分間反応させた。この反応液をセファデックスＧ−２
５のカラムに流して１ｍＭＥＤＴＡを含むＱ、 Ｉ Ｍ
ＩＪン酸緩衝液ｐＨ６，５でデル濾過し、未反応のＳ
−アセチルメルカプトコハク酸ヲ除去した。こうして得
られたＳＨ化α−アミラーゼを１ψｌまで濃縮した。
一方、ヒト腹水由来のα−フエトグロティン（ＡＦＰ量
） １ ｍｆをＰＨ６，３の０．１ Ｍリン酸緩衝液１
ｍｌに溶かし、これに２予ゲの４−マレイミド９−メ
チル／クロヘキサン−１−カルぎ／酸すクシンイミドエ
ステル（ＣＦＩＭＳ ）のソオキサン溶液１００μｔを
加えて室温にて１時間反応させた。この溶液をセフアゾ
、クスＧ−２５カラム（，１ｃｒａ Ｘ ４０ ｃＴＬ
）に流して１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ６，５でグル濾過して未反応のＣＨＭＳを除き
、４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン
酸トＡＦＰとの結合物（Ｃ脂化ＡＦＰ ）を得た。この
結合物の溶液を１ ｍｌに濃縮し、ＳＨ化α−アミラー
ゼを加えて４℃で一夜放置して反応させた。この反応液
をセフアクリルｓ −２００（１ｍＸ １．２０ｃｍ）
でダル濾過し、ＡＦＰ−アミラーゼ結合物を得た。
） １ ｍｆをＰＨ６，３の０．１ Ｍリン酸緩衝液１
ｍｌに溶かし、これに２予ゲの４−マレイミド９−メ
チル／クロヘキサン−１−カルぎ／酸すクシンイミドエ
ステル（ＣＦＩＭＳ ）のソオキサン溶液１００μｔを
加えて室温にて１時間反応させた。この溶液をセフアゾ
、クスＧ−２５カラム（，１ｃｒａ Ｘ ４０ ｃＴＬ
）に流して１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ６，５でグル濾過して未反応のＣＨＭＳを除き
、４−マレイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン
酸トＡＦＰとの結合物（Ｃ脂化ＡＦＰ ）を得た。この
結合物の溶液を１ ｍｌに濃縮し、ＳＨ化α−アミラー
ゼを加えて４℃で一夜放置して反応させた。この反応液
をセフアクリルｓ −２００（１ｍＸ １．２０ｃｍ）
でダル濾過し、ＡＦＰ−アミラーゼ結合物を得た。
（３） ＡＦＰの測定
試験管にアミラーゼインヒビター固定化ビーズと抗体固
定化ビーズ各１個を入れ、５０ ｍＭ ト！Ｊス緩衝液
−０，１４Ｍ ＮａＣ１−０，２Ｍ ＢＳＡｐＨ７，８
を８００μを加えた。
定化ビーズ各１個を入れ、５０ ｍＭ ト！Ｊス緩衝液
−０，１４Ｍ ＮａＣ１−０，２Ｍ ＢＳＡｐＨ７，８
を８００μを加えた。
これに８００ ｎｇ、Ｉｎｌよりの４ｎ希釈列のＡＦＰ
溶液各１００μＬを加え、次いで、ＡＦＰ−アミラーゼ
結合物を１００μｔづつ加えて室温で１時間半放置した
。
溶液各１００μＬを加え、次いで、ＡＦＰ−アミラーゼ
結合物を１００μｔづつ加えて室温で１時間半放置した
。
この各試験管に酵素基質液としてオートパックα−アミ
ラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）をｌ ｍｌづつ
加え、１０分後の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定
してＡＦＰ量とアミラーゼ活性との関係をめた。
ラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）をｌ ｍｌづつ
加え、１０分後の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定
してＡＦＰ量とアミラーゼ活性との関係をめた。
得られた結果を頷３図に示＋。
次に、各種ヒト血清の５倍希釈液１ｏｏμｔづつを用い
て上記と同様に測定を行ない、第１図を検量線としてＡ
ＦＰの濃度を測定した。
て上記と同様に測定を行ない、第１図を検量線としてＡ
ＦＰの濃度を測定した。
一方、これと並行して従来法であるラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ ）を用いて、同じヒト血清のＡＦｐ ９度
を測定した。
イ（ＲＩＡ ）を用いて、同じヒト血清のＡＦｐ ９度
を測定した。
得られた結果を下表に示す。
ＡＦＰ濃度
血清 本発明法 従来法
Ａ ５０ ｎｇ７ｆｎｌ！ ４．３．２ ｎｇ／ｆｎｌ
！Ｂ １８０ １９５．９ Ｃ４３０４０４，３ Ｄ ７１０ ７５０．０ 実施例４ （１） 相分離担体の調製 担体固相・はポリスチレンを基板として、公知のポリマ
ーブレンド法に従って作成した。ボＩＪ −Ｌ−システ
ィン及びポリーＬ−リジン各１０ｍｇをジメチルスルホ
キシＰ −、Ｔ−千ｌ！、岨へ泊鏝１−゛ｈｈ−・ホリ
スチレンポリマー基板上に塗布して減圧下で溶媒を除去
した。その際、これらの各プリマーは凝集エネルギーが
異なるため、アミノ基層とＳＴ（基層との間でミクロ相
分離が形成された。ＳＨ基含量をジチオピリドン法で、
そして、アミン基含量をニンヒドリン法でそれぞれ測定
したところ、ＳＨ基とアミノ基の比率はほぼ１：１であ
った。
！Ｂ １８０ １９５．９ Ｃ４３０４０４，３ Ｄ ７１０ ７５０．０ 実施例４ （１） 相分離担体の調製 担体固相・はポリスチレンを基板として、公知のポリマ
ーブレンド法に従って作成した。ボＩＪ −Ｌ−システ
ィン及びポリーＬ−リジン各１０ｍｇをジメチルスルホ
キシＰ −、Ｔ−千ｌ！、岨へ泊鏝１−゛ｈｈ−・ホリ
スチレンポリマー基板上に塗布して減圧下で溶媒を除去
した。その際、これらの各プリマーは凝集エネルギーが
異なるため、アミノ基層とＳＴ（基層との間でミクロ相
分離が形成された。ＳＨ基含量をジチオピリドン法で、
そして、アミン基含量をニンヒドリン法でそれぞれ測定
したところ、ＳＨ基とアミノ基の比率はほぼ１：１であ
った。
この目？リスチレン基板を０８ｃｍ角に裁断して担体固
相として用いた。
相として用いた。
ブロモ酢酸７ｏｍｇとＮ−ヒドロキシサンシンイミド１
１５ ｍｙをジオキサン４ ｍｌに溶かし、これにノシ
クロヘキシルカルボ゛ノイミドｔ１５ｍｙを加えて室温
で９０分間反応させた。生じたジシクロヘキシル尿素を
濾過して除き、得られた泥液に０１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ７，５を加えて２５ｍ１にした。この液に上
記固相を加えて４℃で６０分間反応させ、０１ＭＮａＣ
ｔで洗浄してブロモアセトアミド担体を得た。この担体
を０． ＯＩ Ｍピリドキサール−５′−リン酸と０．
１ＭＤＬ−バリンを含む０、１ Ｍリン酸カリウム緩衝
液ｐＨ５，Ｑに浸し、暗室に室温で７２時間放置した。
１５ ｍｙをジオキサン４ ｍｌに溶かし、これにノシ
クロヘキシルカルボ゛ノイミドｔ１５ｍｙを加えて室温
で９０分間反応させた。生じたジシクロヘキシル尿素を
濾過して除き、得られた泥液に０１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ７，５を加えて２５ｍ１にした。この液に上
記固相を加えて４℃で６０分間反応させ、０１ＭＮａＣ
ｔで洗浄してブロモアセトアミド担体を得た。この担体
を０． ＯＩ Ｍピリドキサール−５′−リン酸と０．
１ＭＤＬ−バリンを含む０、１ Ｍリン酸カリウム緩衝
液ｐＨ５，Ｑに浸し、暗室に室温で７２時間放置した。
続いて、０．１ Ｍ ＩＪン酸カリウム緩衝液ｐＨ９，
０及びｐＨ５，５で洗浄し、ＰＨ７０に戻して、ピリド
キサール−５′−リン酸固定化担体を得だ。
０及びｐＨ５，５で洗浄し、ＰＨ７０に戻して、ピリド
キサール−５′−リン酸固定化担体を得だ。
山羊抗ヒトＩｇＧ特異ＩｇＧ （α−ｈＩｇＧ）５■を
ＰＨ６，３の０．１Ｍリン酸緩衝液］−ｍｌに溶解し、
２ｍｇ７４ｎｌのＣＨＭＳのジオキサン溶液１００μｔ
を加えて室温で１時間反応させた。反応液をセファデッ
クスＧ−２５のカラムに流して１． ｍＭ Ｉｉ；ＤＴ
Ａを含む０、１ Ｍ リン酸緩衝液ＰＨ６，５でケ゛ル
ア過を行ない、未反応ノＣＩ−］１１Ｍ５を除イテＣＨ
Ｍ化α−ｈＩｇＧ ヲ得た。
ＰＨ６，３の０．１Ｍリン酸緩衝液］−ｍｌに溶解し、
２ｍｇ７４ｎｌのＣＨＭＳのジオキサン溶液１００μｔ
を加えて室温で１時間反応させた。反応液をセファデッ
クスＧ−２５のカラムに流して１． ｍＭ Ｉｉ；ＤＴ
Ａを含む０、１ Ｍ リン酸緩衝液ＰＨ６，５でケ゛ル
ア過を行ない、未反応ノＣＩ−］１１Ｍ５を除イテＣＨ
Ｍ化α−ｈＩｇＧ ヲ得た。
コノＣＨＭ 化α−ｈ１ｇＧを上記のピリドキサール−
５７−リン酸固定化担体に加えて４℃で３日間反応させ
、その後、５％ＢＳＡを含む０．０５ Ｍリン酸−０，
１４Ｍ ＮａＣｔ緩衝液を加えて４℃で一夜放置し、相
分離担体とした。
５７−リン酸固定化担体に加えて４℃で３日間反応させ
、その後、５％ＢＳＡを含む０．０５ Ｍリン酸−０，
１４Ｍ ＮａＣｔ緩衝液を加えて４℃で一夜放置し、相
分離担体とした。
（２）酵素標識抗原の調製
ヒトＩｇＧ （ｈＩｇＧ） ５７ｎｐを５ ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含むＰＨ７５の０．１ Ｍ ！Ｉン酸緩衝液に溶
かし、これに９ｍｇ７ｆｎｌのＳ−アセチルメルヵノト
コハク酸無水物のジメチルスルホキシド溶液１ｏｏμｔ
を加えて３７℃で１時間加温した。続いて、ｐＨ７，５
の１Ｍヒドロキシルアミン溶液１１０μｔを加えて３７
℃で３０分間放置して反応させた。この反応液をセファ
デックスＧ−２５のカラムに流して１ ｍＭ ＥＤＴＡ
を含むｐＨ６，５の０．１ Ｍ リン酸緩衝液でグル濾
過して未反応のＳ−アセチルメル力グトコハク［除去し
、流出液を１ｍｌ′！、で濃縮してＳＨ化ｈＩｇＧを得
だ。
ＴＡを含むＰＨ７５の０．１ Ｍ ！Ｉン酸緩衝液に溶
かし、これに９ｍｇ７ｆｎｌのＳ−アセチルメルヵノト
コハク酸無水物のジメチルスルホキシド溶液１ｏｏμｔ
を加えて３７℃で１時間加温した。続いて、ｐＨ７，５
の１Ｍヒドロキシルアミン溶液１１０μｔを加えて３７
℃で３０分間放置して反応させた。この反応液をセファ
デックスＧ−２５のカラムに流して１ ｍＭ ＥＤＴＡ
を含むｐＨ６，５の０．１ Ｍ リン酸緩衝液でグル濾
過して未反応のＳ−アセチルメル力グトコハク［除去し
、流出液を１ｍｌ′！、で濃縮してＳＨ化ｈＩｇＧを得
だ。
一方、４ ｍｇの、Ｇ６ＰＤＨをｐＨ６，３の０．１Ｍ
リン酸緩衝液１ ｍｌに溶かし、これに２ ｍｇ７ｒｎ
ｉのＣＨＭＳのジオへサン溶液１００μｔを加えて室温
にて１時間放置した。この溶液をセファデックスＧ−２
５のカラムに流して］ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＱ、 Ｉ
Ｍ ＩＪン酸緩衝液ｐＨ６，５でケ゛ル濾過して未反
応のＣ）ＥＭＳを除去した。
リン酸緩衝液１ ｍｌに溶かし、これに２ ｍｇ７ｒｎ
ｉのＣＨＭＳのジオへサン溶液１００μｔを加えて室温
にて１時間放置した。この溶液をセファデックスＧ−２
５のカラムに流して］ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＱ、 Ｉ
Ｍ ＩＪン酸緩衝液ｐＨ６，５でケ゛ル濾過して未反
応のＣ）ＥＭＳを除去した。
こうして得られたＣＨＭ化Ｇ６ＰＤＨに上記のＳＨ化ｈ
ＩｇＧを加え、４℃で一夜放置して反応させた。この反
応液を十フアクリルＳ−３００カラムでグル濾過し、Ｇ
６ＰＤＨ結合ｈＩｇＨを得た。
ＩｇＧを加え、４℃で一夜放置して反応させた。この反
応液を十フアクリルＳ−３００カラムでグル濾過し、Ｇ
６ＰＤＨ結合ｈＩｇＨを得た。
（３） ヒトＩｇＧの定数
試験管に各種濃度のヒトＩｇＧ溶液各５０μｔを入れ、
上記の酵素標識抗原溶液４５０μｔを加え、前記の相分
離担体をさらに加えて室温で１時間反応させた。続いて
、０．０１％水素化ホウ素ナトリウム水溶液を各５０μ
Ｌづつ加え、室温で２０分間反応させた。相分離担体を
取シ出し、生理食塩水で洗浄後側の試験管に移して、Ｇ
６ＰＤＩ（の基質液として０．１ Ｍグリシルグリシン
緩衝液ｐＨ８，５，２０ｍＭＭｇ ｃｔ２．０．５ ｍ
Ｍ Ｇ６Ｐ及び０．５ ｍＭ ＮＡＤＰを含む溶液１、
Ｑ ｍｅを加えた。１０分後の波長３４０ ｎｍにお
ける吸光度を測定したところ、第４図に示すような結果
が得られた。
上記の酵素標識抗原溶液４５０μｔを加え、前記の相分
離担体をさらに加えて室温で１時間反応させた。続いて
、０．０１％水素化ホウ素ナトリウム水溶液を各５０μ
Ｌづつ加え、室温で２０分間反応させた。相分離担体を
取シ出し、生理食塩水で洗浄後側の試験管に移して、Ｇ
６ＰＤＩ（の基質液として０．１ Ｍグリシルグリシン
緩衝液ｐＨ８，５，２０ｍＭＭｇ ｃｔ２．０．５ ｍ
Ｍ Ｇ６Ｐ及び０．５ ｍＭ ＮＡＤＰを含む溶液１、
Ｑ ｍｅを加えた。１０分後の波長３４０ ｎｍにお
ける吸光度を測定したところ、第４図に示すような結果
が得られた。
実施例５
（１）相分離担体の調製
ブタ膵臓由来のα−マミラーゼと山羊抗ヒトＩｇＥ特異
ＩｇＧ （α−ＩｇＥ ）を各々３０ ｍＭクエン酸ナ
トリウム−０，３Ｍ ＮａＣ１緩衝液ｐＨ７，０Ｋ Ｏ
Ｄ２８０−〇、４になるように溶解した。この各溶液を
浸した各Ｆ紙をいずれもニトロセルロースメンブランフ
ィルタ−（東洋Ｆ紙（株）製、１．５Ｘ１５ｃｒｒＬ）
に重ねて４℃で２日間放置し、α−アミラーゼとα−Ｉ
ｇＥを別々にメングランフィルターに吸着すせた。この
各メンブランフィルタ−を５％ＢＳＡ 及）ＪＯ，１４
Ｍ ＮａＣ１を含む０．１ ’Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，
５溶液に浸し、４℃で一夜放置後、０．１．４ Ｍ Ｎ
ａＣ１を含む５０ ｍＭ ’）ン酸緩衝液ｐＨ７，５で
洗浄し、４℃で真空乾燥した。各メングランフィルター
ヲ０．５ ＸＯ，７５ｃｒｒＬの大きさに裁断し、この
二重のフィルターを吸着面を表にして０．５ Ｘ ５
Ｘ ０．０５ ｃｍのトリアセテートフィルム基板の端
の両面にビニル系接着剤で接着し、相分離担体スティッ
クとして使用した。
ＩｇＧ （α−ＩｇＥ ）を各々３０ ｍＭクエン酸ナ
トリウム−０，３Ｍ ＮａＣ１緩衝液ｐＨ７，０Ｋ Ｏ
Ｄ２８０−〇、４になるように溶解した。この各溶液を
浸した各Ｆ紙をいずれもニトロセルロースメンブランフ
ィルタ−（東洋Ｆ紙（株）製、１．５Ｘ１５ｃｒｒＬ）
に重ねて４℃で２日間放置し、α−アミラーゼとα−Ｉ
ｇＥを別々にメングランフィルターに吸着すせた。この
各メンブランフィルタ−を５％ＢＳＡ 及）ＪＯ，１４
Ｍ ＮａＣ１を含む０．１ ’Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，
５溶液に浸し、４℃で一夜放置後、０．１．４ Ｍ Ｎ
ａＣ１を含む５０ ｍＭ ’）ン酸緩衝液ｐＨ７，５で
洗浄し、４℃で真空乾燥した。各メングランフィルター
ヲ０．５ ＸＯ，７５ｃｒｒＬの大きさに裁断し、この
二重のフィルターを吸着面を表にして０．５ Ｘ ５
Ｘ ０．０５ ｃｍのトリアセテートフィルム基板の端
の両面にビニル系接着剤で接着し、相分離担体スティッ
クとして使用した。
（２）阻害剤標識抗原の調製
ミエローマ患者血清から精製したヒトＩｇＥを実施例３
のＡＦＰと同様にしてＣＨＭ化し、これに実施例３と同
様にして調整したＳＨ化アミラーゼインヒビターを加え
てＩｇＥ−アミラーゼインヒビター結合物を生成させた
。この反応液をセファクリルＳ−３００カラム（２ｘ１
００ｃＩｎ’）でケ゛ル濾過して上記結合物の分画を得
た。
のＡＦＰと同様にしてＣＨＭ化し、これに実施例３と同
様にして調整したＳＨ化アミラーゼインヒビターを加え
てＩｇＥ−アミラーゼインヒビター結合物を生成させた
。この反応液をセファクリルＳ−３００カラム（２ｘ１
００ｃＩｎ’）でケ゛ル濾過して上記結合物の分画を得
た。
試験管に各種濃度のヒ） ＩｇＥ溶液溶液各戸０μｔり
、上記Ｉ’ｇＥ−アミラニゼインヒビター結合物の５０
ｍＭリン酸緩衝液−〇、 ｉ ４ Ｍ ＮａＣ１−２％
ＢＳＡ溶液４５０μｔを加え、次いで、相分離担体ス
ティックを加えて室温で１時間反応させた。別の試験管
に酵素基質液としてオート・ぐツクα−アミラーゼ（ペ
ーリンガーマンハイム社ｆｆ ） ヲ各１ ｍｌ 分注
し７、反応後の相分離担体スティックとこの試験管に移
して反応させ、１０分後の波長４０５ｎｍにおける吸光
度を測定してＩｇＥ屏とアミラーゼ活性との関係をめた
。
、上記Ｉ’ｇＥ−アミラニゼインヒビター結合物の５０
ｍＭリン酸緩衝液−〇、 ｉ ４ Ｍ ＮａＣ１−２％
ＢＳＡ溶液４５０μｔを加え、次いで、相分離担体ス
ティックを加えて室温で１時間反応させた。別の試験管
に酵素基質液としてオート・ぐツクα−アミラーゼ（ペ
ーリンガーマンハイム社ｆｆ ） ヲ各１ ｍｌ 分注
し７、反応後の相分離担体スティックとこの試験管に移
して反応させ、１０分後の波長４０５ｎｍにおける吸光
度を測定してＩｇＥ屏とアミラーゼ活性との関係をめた
。
得られた結果を第５図に示す。
第１図〜第５図はいずれも本発明の方法で測定して得ら
れた各種抗原あるいは抗体の濃度と酵素活性との関係を
示すものである。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人 弁理士 １） 中 政 浩 第１図 フェリチン（７ｕ９／ｆｆ１ｌ） 第２図 β、−マイクログｂヅリン （７ｕ９／ｄｌ） 第３図 ベーフェトブロティ〉 （ｎ９／ｍｌ） 第４図 第５図 Ｉ ｔｏ ＋００ ＋０００ Ｉ９ Ｅ （Ｌｌ／ ｍｌ ＞
れた各種抗原あるいは抗体の濃度と酵素活性との関係を
示すものである。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人 弁理士 １） 中 政 浩 第１図 フェリチン（７ｕ９／ｆｆ１ｌ） 第２図 β、−マイクログｂヅリン （７ｕ９／ｄｌ） 第３図 ベーフェトブロティ〉 （ｎ９／ｍｌ） 第４図 第５図 Ｉ ｔｏ ＋００ ＋０００ Ｉ９ Ｅ （Ｌｌ／ ｍｌ ＞
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 抗原又は抗体と、酵素又は酵素阻害もしくは活性化
物質とが、担体に各々の固定相が分離されて固定されて
いる、抗原又は抗体と酵素又は酵素阻害もしくは活性化
物質の固定化物 ２ 下記の方法よりなる抗原又は抗体の測定方法 （１）測定対象たる抗原と反応する抗体又はこの抗体と
反応する抗原と、酵素又は酵素阻害もしくは活性化物質
とを担体に各々の固定相を分離して固定した固定化物と
、該固定化物に固定された抗体又は抗原と反応する抗原
又は抗体と該固定化物に固定された酵素又は酵素阻害も
しくは活性化物質と反応する酵素阻害もしくは活性化物
質又は酵素とを結合した結合物と、測定対象たる抗原と
を水浴液中で共存せしめ、その後該固定化物又は水溶液
の酵素活性又は酵素阻害もしくは活性化物質の活性を測
定することを特徴とする抗原の測定力・法 （２）測定対象たる抗体と反応する抗原又はこの抗原と
反応する抗体と、酵素又は酵素阻害もしくは活性化物質
とを担体に各々の固定相を分離して固定した固定化物と
、該固定化物に固定された抗原又は抗体と反応する抗体
又は抗原と該固定化物に固定された酵素又は酵素阻害も
しくは活性化物質と反応する酵素阻害もしくは活性化物
質又は酵素とを結合した結合物と、測定対象たる抗体と
を水溶液中で共存せしめ、その後該固定化物又は水溶液
の酵素活性又は酵素阻害もしくは活性化物質の活性を測
定することを特徴とする抗体の測定方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17635683A JPS6067857A (ja) | 1983-09-26 | 1983-09-26 | 活性蛋白等固定化物及びそれを用いた抗原，抗体の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17635683A JPS6067857A (ja) | 1983-09-26 | 1983-09-26 | 活性蛋白等固定化物及びそれを用いた抗原，抗体の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6067857A true JPS6067857A (ja) | 1985-04-18 |
Family
ID=16012173
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17635683A Pending JPS6067857A (ja) | 1983-09-26 | 1983-09-26 | 活性蛋白等固定化物及びそれを用いた抗原，抗体の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6067857A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6345562A (ja) * | 1986-04-22 | 1988-02-26 | Konica Corp | 免疫学的分析素子 |
| WO1999060401A1 (en) * | 1998-05-15 | 1999-11-25 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Immunoassay reagents and immunoassay method |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58209994A (ja) * | 1982-05-10 | 1983-12-07 | Fujirebio Inc | 活性蛋白等固定化物を用いた抗原の測定方法 |
-
1983
- 1983-09-26 JP JP17635683A patent/JPS6067857A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58209994A (ja) * | 1982-05-10 | 1983-12-07 | Fujirebio Inc | 活性蛋白等固定化物を用いた抗原の測定方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6345562A (ja) * | 1986-04-22 | 1988-02-26 | Konica Corp | 免疫学的分析素子 |
| WO1999060401A1 (en) * | 1998-05-15 | 1999-11-25 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Immunoassay reagents and immunoassay method |
| AU751938B2 (en) * | 1998-05-15 | 2002-08-29 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Immunoassay reagents and immunoassay method |
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