JPH0151997B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、赤血球からスーパーオキシドジスム
ターゼ（以下SOダーゼと略記する）を単離する
新規な方法に関する。更に詳しくは、赤血球の溶
血液から加熱により、ヘモグロビンおよびSOダ
ーゼに親和性の蛋白を効率的に沈澱除去し、高純
度のSOダーゼを単離する方法に関する。 SOダーゼは超酸化物イオンO₂ ^-の不均化反応
2O₂ ^-＋2H⁺→O₂＋H₂O₂を触媒する酵素であり、
広く動植物に存在し、生物の生体反応から生じた
活性酸素が細胞毒として仂くの対しその除去機能
を果すものである。 一方赤血球のSOダーゼは高等動物原料より精
製されるオルゴテインと名付けられる金属キレー
ト蛋白群に属する。解明の進んでいる牛赤血球の
SOダーゼは分子量31200各アミノ酸数151個ずつ
の等しいサブユニツト２個よりなり、立体的には
αラセン構造が少なく、円筒形β構造が大部分を
占めるため、変性に強いとされている。キレート
金属として、１モル中銅、亜鉛各２ｇ原子を含
み、等電点はPH5.5附近を示す。無毒性で生体内
に投与されたとき、免疫的に異物として認識され
難く、注射可能な蛋白質であり、薬理作用として
は、自己免疫疾患に生ずる炎症などに効果を有
し、近年変形性関節症、慢性リウマチ、放射線療
法の重篤な副作用の治療剤として開発が進められ
ている。 従来、赤血球のオルゴテインすなわちSOダー
ゼを単離する方法はいくつか知られているが、い
ずれも精製収率、製品純度の点で不満足なもので
あり、更に実用上極めて有利な貯蔵原料の使用が
困難である等、種々の欠点を有していた。 すなわち特公昭53−31206には、銅、亜鉛、コ
バルト、マンガン、マグネシウム等の２価金属塩
の存在下に赤血球溶血液を熱処理し、ヘモグロビ
ンと炭酸脱水酵素を沈澱除去し、オルゴテインを
単離する方法を開示しているが、本法において
は、比較的高温長時間の加熱にも、かかわらず不
純蛋白の沈澱分離が不充分であり、加熱処理後の
上澄液には沈澱し切れないヘモグロビンの赤色が
残り、その後の精製工程で、SOダーゼ活性を低
下させる原因となつている。また凍結血球など貯
蔵原料を使用した場合は、更にSOダーゼの分離
精製が困難になる。 特公昭45−39832では、赤血球溶血液を、有機
塩素化合物で処理し、その錯化合物としてヘモグ
ロビンを除き、オルゴテインを単離する方法が開
示されているが、本法は錯化合物に可成りのSO
ダーゼが帯同されてしまい、上澄液中のSOダー
ゼ収量は、20％以上低下している。 またJ.B.C.244，6051では、同じく有機塩素化
合物を使用して、SOダーゼを単離しているが、
初回抽出段階において原料中SOダーゼ活性の少
くとも20％以上の損失が見られる。 更にこれら有機塩素化合物処理法は、有機溶媒
を多量に使用するので、経済性、作業性の面で実
用上問題が多く、また凍結乾燥血球を原料とした
場合は、上澄液が、真赤に着色するほど、ヘモグ
ロビン等不純蛋白が、SOダーゼフランクシヨン
に帯同して液相に残り、以後の精製処理は不可能
に近い。 特開昭49−50195では、原料血球を加熱処理後、
上澄液に蛋白分解酵素処理を施し、過後カラム
クロマトグラフイー、ゲル過などで精製する方
法を発表している。本法には酵素処理工程が作業
上繁雑であること、および老化血球や凍結血球を
原料とした場合、不純蛋白がSOダーゼと強く結
合し、酵素分離し難く、SOダーゼの純化が困難
である等の問題点がある。 特公昭53−22137では、血球の溶血液中のSOダ
ーゼを、直接弱塩基性イオン交換樹脂に吸着さ
せ、分離している。しかし本法は、原料蛋白中
0.3〜0.5％程度の目的蛋白を他の不要蛋白から分
離する方法としては、経済的に可成り不利であ
り、また大量処理に不適である。 以上詳説したごとく従来法はいずれも実用上多
くの欠点を有し、満足すべきものではない。 本発明者は種々研究の結果、SOダーゼの純化
を妨げているものは赤血球溶血液中に含まれ、ヘ
モグロビンおよびSOダーゼと複合体を作り易い
或る種の蛋白（変性における挙動から血球膜に由
来する脂質蛋白と推定される。以下これを「親和
性蛋白」と記す。）の分離困難性にあること、更
にこの親和性蛋白が１価無機中性塩および遷移金
属塩の共存下に、２〜３段加熱を行うことによ
り、容易にかつ、完全にSOダーゼと分離沈澱せ
しめ得ることを知り本発明を完成した。 親和性蛋白は、元来SOダーゼと親和性を有す
るが、原料赤血球の予備処理、たとえば凍結、凍
結乾燥、有機溶媒処理等で、温和な変性を受け、
更に加熱工程が加わることによりヘモグロビンも
しくはその色素部分およびSOダーゼに対し、よ
り強固な複合体を作る。この現象は血球の老化に
よつても生ずる。従来凍結血球、凍結乾燥血球、
保存血球等の工業的に有利な貯蔵原料からSOダ
ーゼの分離精製が困難であつたのは、これら親和
性蛋白とSOダーゼの強固な複合体の存在が原因
と考えられる。 本発明の目的は、従来看過されていた親和性蛋
白の効果的な除去を可能ならしめ、簡易かつ経済
的にSOダーゼを単離する新規な方法を提供する
ことにある。 また、本発明の他の目的は、新鮮原料のみなら
ず実用上有利な貯蔵原料から随時、随意の量の
SOダーゼを新鮮原料と同等の収率で製造し得る
新規な方法を提供することにある。 本発明は赤血球の溶血液にアルカリ金属塩およ
び少量の銅、コバルトまたはマンガンの塩の存在
下に加熱し、生成する変性ヘモグロビンを主とす
る不純蛋白の沈澱を除去する第１工程と、その上
澄液になお溶存する不純蛋白を沈澱せしむるに充
分な量の遷移金属塩を追添し、再度加熱し、生成
した沈澱を除去する第２工程よりなつている。好
ましくは第１工程と第２工程の間に、第１工程と
同程度の少量の銅、コバルトまたはマンガンの塩
を添加し、加熱し、沈澱を除去し、または除去し
ない工程をもう一段挿入すれば、SOダーゼの精
製効率は更に向上する。 本発明の構成要件をその作用面から説明すると
アルカリ金属塩の、不純蛋白とSOダーゼの隔離
作用と少量添加する銅、コバルトまたはマンガン
の塩の不純蛋白変性促進作用の組合せのもとで加
熱して、親和性蛋白が有するヘモグロビンもしく
はその色素部分及びSOダーゼに対する結合性を
低下せしめる一方、SOダーゼ以外の蛋白に対す
る銅、コバルトまたはマンガンの付加作用によ
り、熱変性と凝集沈澱作用を促進せしめ、SOダ
ーゼを高純度、高収率で取得する方法であり、さ
らに重要な構成の一つは、低濃度、次いで高濃度
の銅、コバルトまたはマンガンの塩の存在下で加
熱工程を２段階に行うことで、第１工程では大部
分のヘモグロビンと一部親和性蛋白の変性沈澱が
進行するが、本工程で、銅、コバルトまたはマン
ガン濃度を増大させると（たとえば10倍以上に増
加させると）SOダーゼ収率が低下する。（比較例
第２表Ｂ参照）−たん第１工程の沈澱を除去した
後、第２工程として、ヘモグロビン等大部分の不
純蛋白が除去された上澄液中の残存蛋白に対し充
分な銅、コバルトまたはマンガンの塩を添加、再
度加熱すると、第１工程での不純蛋白変性が補完
されなお残存していた少量のヘモグロビンや親和
性蛋白などに銅、コバルトまたはマンガンイオン
を充分飽和付加させることができ、従つて不要蛋
白をほゞ完全に凝集沈澱させることができる。第
２工程加熱終了後のPHは、5.5〜6.5となり、SOダ
ーゼは変性沈澱せず上澄液に残る。 本発明で使用する赤血球としては、新鮮血球の
みならず、長期間保存老化した血球や凍結保存、
凍結乾燥した血球であつても原料として有効に使
用し得る。また赤血球は血漿部分を洗滌除去した
ものが好ましいが血漿部分が多少共存するもの
も、原料として使用し得る。 赤血球を溶血せしめ、加熱時生成した沈澱の撹
拌や分離を容易ならしめるため、第１工程におい
て赤血球容積に対し、１〜４倍容、好ましくは２
〜３倍容の水を添加する。 第１工程で添加するアルカリ金属塩としては、
塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、
硝酸リチウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、
臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化リチウム、
等が好適である。 これらアルカリ金属塩の濃度は、通常0.1モル
以上飽和以下で、親和性蛋白のSOダーゼおよび
ヘモグロビンに対する結合力を抑制する効果を有
するが、特に0.3モル〜1.0モルの範囲が好まし
い。 本発明においては、更に、銅、コバルト、マン
ガンの塩が使用しうる。特に銅と１価の強酸の塩
すなわち塩化銅、硝酸銅、等が好適である。特に
銅塩が不純蛋白に対する変性、凝集沈澱作用の選
択性と、第２工程における不純蛋白の凝集反応終
末点の確認容易性の面で優れている。 銅、コバルトまたはマンガンの塩濃度は、第１
工程では銅塩は１〜２×10^-4モルコバルト、マン
ガンの塩は１〜２×10^-3モルで充分であるが、第
２工程では加熱後上澄液が濁らなくなるまで、な
いし溶存する不純蛋白に飽和付加するまで比較的
多量に加える。銅塩の場合は、加熱後その青色が
上澄液に僅かに残る点を添加量の目安とすればよ
い。 加熱条件は第１、第２工程とも60℃〜75℃、10
分〜60分程度が用いられるが、好ましくは第１工
程においては65℃〜70℃、25分〜40分、第２工程
においてはやゝ低温度短時間でよく60℃〜68℃、
15分〜30分の範囲が用いられる。 本発明において加熱処理時PHは特に調整する必
要はないが、加熱後のPHは5.5〜6.5の範囲となつ
ている。 既述のごとく、第１工程終了後の上澄液に10^-4
〜10^-3モルの銅、コバルトまたはマンガンの塩を
添加し、60℃〜70℃10分程度の加熱処理を行い生
成した沈澱を除去した後、第２工程にかけるなら
ばSOダーゼの単離精製度は更に向上する。 第２工程終了後の上澄液は、常法により脱イオ
ン水または緩衝液に対し、透析を行い、残存する
アルカリ金属塩および銅、コバルトまたはマンガ
ンの塩を除去、要すれば更にDEAEセルローズカ
ラムクロスト分離、ゲル過、再透析等の高度精
製操作をへてSOダーゼ製品を得る。 以下本発明の効果および具体的内容を、比較例
および実施例により説明する。なおSOダーゼ力
価の測定はMcCordとFridovichの方法、
JBC244，6049（1969）に準じて行つた。また原料
血液の採血にはすべて抗凝固剤としてクエン酸ソ
ーダを用いた。 従来法である特公昭53−31206に開示されたオ
ルゴテインの精製法と本発明の主たる構成上の差
異は、アルカリ金属塩の存否と、第２工程の存否
にある。実験例によりそれぞれの構成の差異に基
づくSOダーゼ収量および純度を比較する。 比較例１ （アルカリ金属塩の効果） 牛赤血球150mlに相当する凍結乾燥品52.5ｇに、
塩化第２銅20mg、水500mlを加え、塩化ナトリウ
ム15ｇ（最終濃度0.5モル）を添加又は不添加の
条件で、70℃60分加熱して生ずる沈澱を除去した
後、更に塩化第二銅230mgを添加、65℃20分加熱、
沈澱を除去した後、上澄液を透析後凍結乾燥し
た。ただし、アルカリ金属塩無添加の場合は、第
２工程において不純蛋白の沈澱析出が不充分であ
り液は赤褐色を呈し、その後の精製が不可能と
なるので、第２工程の液に更に塩化第２銅220
mgを加え、苛性ソーダでPH5.6に調整後加熱し、
PH5.8の無色の上澄液を得、力価を測定した。得
られた標品のSOダーゼ活性は第１表のごとく、
アルカリ金属塩の添加により大巾に上昇してい
る。

【表】 比較例２ （第２工程付加の効果） 同一原料、
同一条件で第１工程の加熱処理を行つた液を異つ
た条件（第２工程の省略を含む）で第２次処理を
行い、液を透析後凍結乾燥し、比較した。 第１次処理：原料牛赤血球凍結乾燥物52.5ｇ
（赤血球150ml相当）を水500mlに溶解、塩化ナト
リウム15ｇ、塩化第２銅15mgを加え、70℃で１時
間加熱した。 第２次処理： 条件Ａ：第２工程省略、第１工程の赤褐色の
液を、透析後、凍結乾燥した。 条件Ｂ：第１次処理の反応液を過せず、冷後
塩化第２銅1.9ｇを添加し、PH5.6として65゜20分加
熱、冷後過、得られた無色の液520mlを透析、
凍結乾燥した。 条件Ｃ：第一工程の液に60℃で塩化第２銅
215mgを加え65℃に昇温して15分間加熱冷後過
して得た微青色の液500mlを透析、凍結乾燥し
た。 それぞれの実験条件で、得られた標品の性状は
第２表のとおりであり、第２工程を省略すると、
本発明方法に比し、純度が大巾に低下することが
明らかである。

【表】 実施例 １ 新鮮な牛血液600mlより得た赤血球255ｇに、塩
化ナトリウム25ｇ、塩化第二銅25mg、水600mlを
混合し、68℃で30分間加熱した。冷却後沈澱を
過し液に塩化第二銅25mgを加え、60℃で10分加
温した後、更に塩化銅を加え、65゜に昇温する。
上澄液が濁らず充分青色が認められるまで380mg
添加した。その間65゜20分間加熱したこととなる。
冷却後沈澱を過し、脱イオン水に48時間透析後
過、次に0.0025モルPH7.4の燐酸カリウム緩衝
液に一夜透析平衡化した。この液を過し、液
850ml、SOダーゼ力価109080単位を得た。 あらかじめ前記緩衝液で平衡化したDE52（ワツ
トマン社製DEAEセルローズ登録商標）カラム
（1.9×11.5cm）に、上記の液を吸着させた後、同
じ緩衝液の0.0025モルから0.075モルまで計400ml
で勾配溶出を行つた。SOダーゼ活性部分を集め、
透析後、凍結乾燥した。凍結乾燥重量43.0mgSO
ダーゼ力価96850単位であつた。 実施例 ２ ２年間、−20℃に貯蔵した牛の凍結血球417ｇに
臭化ナトリウム55ｇ、塩化第二銅30mg、水650ml
を加え68℃で25分加熱、冷却後過洗滌し、液
に塩化第二銅20mgを加え60℃で15分加熱した。更
に塩化第二銅600mlを加え、65℃15分加熱、冷却
後過し、液1080mlを得た。 これを透析、過、凍結乾燥し、重量285mgSO
ダーゼ力価206400単位を得た。これをPH7.4，
0.0025モルの燐酸カリウムム緩衝液10mlに溶解
し、同一緩衝液で平衡化したDE52カラム（1.9×
16cm）に吸着させ、0.0025モルから0.075モルま
で、同一緩衝液500mlで勾配溶出を行つた。SOダ
ーゼ活性部分を集め、透析後凍結乾燥し、重量
72.5mg、SOダーゼ活性179100単位であつた。 実施例 ３ ACD抗凝固液採血後、30日を経過した人保存
血より得た赤血球315ｇに塩化カリウム30ｇ、塩
化第二銅25mg、水550mlを加えた後、68℃30分加
熱、冷却後過した。液に50℃で塩化第二銅
300mgを加え、68℃に昇温し20分間加熱、冷却後
澄明な淡青色の液920mlを得た。脱イオン水で
透析後、SOダーゼ力価を測定し、63600単位であ
つた。 実施例 ４ 種々の原料、１価無機中性塩、遷移金属塩を用
い、実施例４と同様の手法でSOダーゼ標品を得
た。処理条件および標品のSOダーゼ力価は第３
表のとおり、

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 赤血球の溶血液から加熱により不要蛋白を沈
   澱除去して、スーパーオキシドジスムターゼ
   （Superoxide Dismutase）を単離する方法にお
   いて、赤血球溶血液をアルカリ金属の塩および
   銅、コバルト、またはマンガンの塩の存在下に加
   熱して生ずる沈澱を除去する第１工程と、その上
   澄液に第１工程と同量以上の銅、コバルト、また
   はマンガンの塩を添加し、加熱して生じた沈澱を
   除去する第２工程とを、組み合せることを特徴と
   するスーパーオキシドジスムターゼの単離方法。