JPH03994B2

JPH03994B2 -

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Publication number: JPH03994B2
Application number: JP57135886A
Authority: JP
Inventors: Kunitsugu Inoe
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1982-08-04
Filing date: 1982-08-04
Publication date: 1991-01-09
Also published as: JPS5925682A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は動物組織、赤血球もしくは、酵母から
銅（Cu）、亜鉛（Zn）−スーパーオキサイド・デ
イスムターゼ（Superoxide Dismutase；
EC.1.15.1.1、以下SODと略記する）の単離・精
製方法に関し、更に詳しくは、動物組織、赤血
球、もしくは酵母から、種々の方法により、かな
りの程度にまで精製されたCu，Zn−SODを含有
する画分から、不純物を効率的に除去し高純度の
Cu，Zn−SODを単離精製する方法に関する。

SODは酸素分子が一電子還元をうけて生じる
スーパーオキサイド・アニオン・ラジカル（以下
O₂−と略記する）の不均化反応、すなわちO₂−
＋O₂−＋2H⁺→O₂＋H₂O₂を触媒す酵素であつ
て、広く生物界に存在することが知られており、
1969年以降、この活性を有する酵素は多数単離さ
れて来た。その活性部位にCuおよびZnをもつ
Cu，Zn−SODは真核生物の細胞質中にみいださ
れる。このような各種の真核生物由来のCu，Zn
−SODは、そのアミノ酸配列において高い相同
性を示し（シー・ピーターセン（（C.Petersen））
ら、カールスベルグ・レス・コンミユン
（（Carlsberg Res.Commun））第42巻、391〜395
頁、1977年）、相互に関連する物理化学的物性を
有する（エイ・イー・ジー・キヤス（（A.E.G.
Cass））ら、カールスベルグ・レス・コンミユン
（（Carlsberg Res.Commun.））第43巻、439〜449
頁、1978年）二量体分子であることが知られてい
る。別の種類のSODは、活性部位に鉄もしくは
マンガンを含むものであり、このものは原核生物
および真核生物のミトコンドリアにみいだされ
る。この種類ではアミノ酸組成およびＮ末端アミ
ノ酸配列に高い相同性を示す。

しかし、Cu，Zn−SODとFeもしくはMn−
SODの間には有意の相同性は存在しない。

前述の如く、SODは生物の生体内反応から生
じたO₂−をすみやかに除去することにより、O₂
−自体、およびO₂−から派生する各種の活性酸
素種による細胞毒性を低減させると考えられてい
る。すなわちO₂−は組織の各種炎症過程に関与
することおよびリウマチ性関節炎をおこすもとに
なることがいわれており、SODをこれらの治療
に用いることが提案され、炎症およびリウマチ性
関節炎に対する治療効果は試験により確認されて
いるからである（エイツチ・マーバーガー（（H.
Marberger））ら、インタル・ジエイ・ウロル・
ネフロル（（Intl.J.Urol.Nephrol.））第６巻、61
〜74頁、1974年；エム・ワルラベンス（（M.
Walravens））、ジエイ・デツカー（（J.
Dequeker））、カレント・テラピ・レス
（（Current Therap.Res））第20巻、62〜69頁、
1976年）。従つて、従来より工業的規模で高収量
のSODの回収方法、精製方法の研究開発が行な
われている。

赤血球のCu，Zn−SODは、高等動物原料より
精製されるオルゴテイン（Orgotein）（インター
ナシヨナル・ノンプロプリエタリー・ネイム・フ
オア・フアルマシユーテイカル・サブスタンシス
（（International Nonproprietary Name for
Pharmaceutical Substauces））；国際的一般名
称）と名付けられる金属キレート蛋白質群に属し
（ジエイ・エイ・エム・エイ（（J.A.M.A.））第
208巻、第８号、1399頁、1969年５月26日）、以前
より種々の純度で単離され次の名称をもつ蛋白質
と等しい。すなわち、ヘモクプレイン
（Hemocuprein）（テイ・マン（（T.Mann））、デ
イ・ケイリン（（D.Keilin））、プロク・ロイ・ソ
ク・シリーズ・ビー・ビオル・サイ（（Proc.
Roy.Soc.Ser.B.Biol.Sci））第126巻、303頁、
1939年）、エリスロクプレイン
（Erythrocuprein）（エイツチ・マルコビツツ
（（Ｈ・Markowitz））ら、ジエイ・ビオル・ケム
（（Ｊ・Biol.Chem））第234巻、40頁、1959年；ジ
エイ・アール・キンメル（（Ｊ・Ｒ・Kimmel））
ら、ジエイ・ビオル・ケム（（Ｊ・Biol.Chem））
第234巻、46頁、1959年）、セレブロクプレイン
（Cerebrocuprein）（エイツチ・ポーター（（H.
Porter））、ジエイ・フオルヒ（（J.Folch））、ジエ
イ・ニユーロケム（（J.Neurochem））第１巻、
260頁、1959年）およびヘパトクプレイン
（Hepatocuperin）（テイ・マン（（T.Mann））、
デイ・ケイリン（（Ｄ・Keilin））、プロク・ロ
イ・ソク・シリーズ・ビー・ビオル・サイ
（（Proc.Roy.Soc.Ser.B.Biol.Sci.））第126巻、303
頁、1939年；エム・エス・モハメド（（M.S.
Mohamed））、デイ・エム・グリーンベルグ
（（D.M.Greenberg））、ジエイ・ゲン・フイジオ
ル（（J.Gen.Physiol））第37巻、433頁、1953年）。

このうち、蛋白質化学的および酵素化学的な解
明の進んでいるSODは、ウシ赤血球のCu，Zn−
SODであり、完全なアミノ酸配列およびＸ線結
晶解析による立体構造もすでに知られている。即
ち、分子量は32000であり、アミノ酸数151個より
なる均等なサブユニツトの個からなり、立体構造
的にはα−ヘリツクス構造が少なく、円筒型β−
構造が大部分を占めるため、変性に強いといわれ
ている。キレート金属として１モル中に、Cuと
Znをそれぞれ２ｇ原子ずつ含有し、等電点は、
PH4.9ないし5.5付近を示す。無毒性で生体内に投
与されたとき、免疫的に異物として認識され難
く、注射可能な蛋白質であり、薬理作用として
は、自己免疫性疾患において生じる炎症などに効
果を有し、近年、変形性関節炎、慢性リウマチ、
放射線療法の重篤な副作用治療剤および防止剤と
して開発がすすめられている（ダブリユー・エイ
ツチ・バニスター（（W.H.Bannister））、ジエ
イ・ヴイ・バニスター（（J.V.Bannister））編、
バイオロジカル・アンド・クリニカル・アスペク
ツ・オブ・スーパーオキサイド・アンド・スーパ
ーオキサイド・デイスムターゼ（（Biological
and Clinical Aspects of Superoxide and
Superoxide Dismutase））1980年、エルセビア
（（Elsevier））社）。

ところで、従来Cu，Zn−SODを分離する方法
はいくつか知られている。例えばウシおよび他の
高等動物からのCu，Zn−SODは、たとえば器官
および組織、特に肝臓から冷緩衝液で細切組織を
抽出することにより、もしくは血液から赤血球の
溶血により得られる水溶性蛋白質溶液からCu，
Zn−SODを分離することにより回収されている。
また酵母からのCu，Zn−SODは、水と混和しな
い有機溶媒、たとえばエーテルの添加により自己
消化させることにて得られる水溶性蛋白質溶液か
ら、Cu，Zn−SODを分離することにより回収さ
れている。分離は、たとえば有機溶媒もしくは硫
酸アンモニウムにより、任意には２価金属の存在
下で加熱することにより熱不安定性蛋白質の変性
とあわせて分別沈澱することにより、もしくは
DEAE基、もしくはカルボキシメチル基（以下
CM基と略記する）を有するイオン交換樹脂のク
ロマトグラフイーにより行われる。一般に低分子
物質は透析およびゲル過法による精製により除
去される。

たとえば、特公昭53−31206号には、Cu、Zn、
Co、Mn、Mg等の２価金属塩の存在下に赤血球
溶血液を加熱し、ヘモグロビンとカーボニツクア
ンハイドラーゼとを沈澱除去し、Cu，Zn−SOD
を単離する方法を開示している。また、特公昭45
−39832号では、赤血球溶血液を有機塩素化合物
で処理し、ヘモグロビンを除き、Cu，Zn−SOD
を単離する方法が開示されている。また、ジエ
イ・エム・マツコード（J.M.McCord）、アイ・
フリドビツチ（I.Frido vich）（ジエイ・ビオ
ル・ケム（（J.Biol.Chem.））第244巻、6049〜
6055頁、1969年）は、同じく有機塩素系化合物を
使用して、ヘモグロビンを沈澱除去したのち、
Cu，Zn−SODを単離精製している。また、特開
昭49−50195号では、原料血液を加熱処理後、上
澄液に蛋白質加水分解酵素処理を施し、過後カ
ラムクロマトグラフイー、ゲル過などで、Cu，
Zn−SODを精製する方法を提示している。さら
に、特公昭53−22137号では、赤血球の溶血液を
直接、弱塩基性イオン交換樹脂で処理し、Cu，
Zn−SODをゲルに吸着させ単離する方法を提示
している。しかしながら、これらの方法によつて
えられるCu，Zn−SOD画分は蛋白質化学的に純
粋なCu，Zn−SODを与えるものではなく、純粋
なCu，Zn−SODを得るためには、更に別の精製
手段、たとえばイオン交換クロマトグラフイーに
よる精製工程を加えなければならないという問題
がある。

かなりの程度にまで精製されたCu，Zn−SOD
画分からの純粋なCu，Zn−SODを得るためのイ
オン交換クロマトグラフイーによる精製に関して
も、既にいつくかの方法が示されている。ジエ
イ・エム・マツコード（J.M.McCord）、アイ・
フリドビツチ（I.Fridovich）は、ジエイ・ビオ
ル・ケム（J.Biol.Chem）（第244巻、6049〜6055
頁、1969年）において2.5mmole／りん酸カリ
ウム緩衝液（PH7.4）で平衡化させたDEAE−セ
ルロースを充填したカラムにCu，Zn−SODを吸
着させたのち、りん酸カリウム緩衝液の濃度をPH
7.4に保持したまま、0.2mole／まで上昇させる
ことによる濃度勾配溶出法にてCu，Zn−SODを
特異的に溶出させ精製する方法を報告している。

しかしこの論文においても、イオン交換クロマ
トグラフイーで純化されたとされる「純粋なCu，
Zn−SOD」の紫外吸収スペクトルには、280nm
近傍に大きい肩があらわれており、吸収極大であ
る260nmでの吸光度A₂₆₀と280nmでの吸光度A₂₈₀
の比、A₂₆₀／A₂₈₀は1.29であり、Cu，Zn−SOD
とこれに随伴する微少の蛋白質が共存しており、
更に精製する必要があることを示している。

また、この方法の他の１つの問題点は、操作の
再現性あるいは安定性が悪いことである。すなわ
ち、通常のイオン交換樹脂に適用することは困難
である。

また特開昭46−548号、特開昭50−69215号およ
び特公昭56−19876号では、実質的に純粋なCu，
Zn−SODが含有する不純蛋白質（以下随伴蛋白
質と称す）を除去する方法において、イオン強度
10mmole／以下、PH5.5〜８の緩衝液中に溶解
した不純蛋白質を含むCu，Zn−SOD溶液を、弱
塩基性イオン交換樹脂のカラム上に通じ、
100mmole／にまで高められたイオン強度とPH
約5.5〜８を有する緩衝液によつて、前記カラム
から選択的にCu，Zn−SODを溶出する方法を開
示している。しかし本方法もその使用ゲルと操作
条件が特定され、前記と同様に再現性および安定
性に問題がある。

さらに、特開昭56−35983号、特開昭56−35984
号および特開昭56−148287号等には、Cu，Zn−
SODおよび随伴蛋白質を共に含む水溶液からCu，
Zn−SODを分離するにあたつて、まず陽イオン
交換クロマトグラフイーをPH4.7〜5.5で行つて
Cu，Zn−SOD活性画分を得たのち、このものを
さらに陰イオン交換クロマトグラフイーに供する
２段法に関するものが開示されているが、これは
操作性、安定性等の問題がある。

以上詳述した如く、従来のCu，Zn−SODを均
一にまで純化するための方法は要するに
10mmole／以下のイオン強度下、PH5.5〜８の
りん酸緩衝液を用いてCu，Zn−SODを弱塩基性
イオン交換樹脂に吸着させたのち、イオン強度の
上昇により溶出させるものであるが、これらの方
法は実質的には、極めて再現性の悪い方法であ
り、また、使用ゲルへのCu，Zn−SODの吸着、
PH調整、緩衝液の種類、樹脂の再生等に問題があ
る他、更にこれら従来の方法では、Cu，Zn−
SODが完全に均一にまで純化・精製されるとは
いえないという問題がある。

本発明者はこれら従来の問題点を改善すべく鋭
意研究の結果、Cu，Zn−SODを随伴して存在す
る不純蛋白質から効率よく、かつ簡便に、再現性
よく単離・精製しうる方法を発明するに至つた。
すなわち本発明においては前記した随伴蛋白質を
含有するCu，Zn−SOD水溶液からCu，Zn−
SODを単離する方法において、陰イオン交換樹
脂を用いてCu，Zn−SODを効率よく吸着させる
ために、酸成分が塩酸である陽イオン性緩衝液で
あつて、PHを5.5〜11好ましくは７〜10、更に好
ましくは８〜10に保ち、緩衝液のイオン強度は十
分な緩衝作用をもつ程度で、かつ、ゲルが再生利
用できる程度、即ち10〜50mmole／の範囲で
イオン交換クロマトグラフイーを行うことで良好
なCu，Zn−SODの単離が得られることを見出し
たものである。

本発明方法ではCu，Zn−SODを陰イオン交換
ゲルへ吸着させるときの緩衝液のPH、種類、イオ
ン濃度等を前述の如き範囲に特定したが、これは
その再現性、安定性、操作性を考えたときに特定
されたもので、このうちのいずれかの範囲をはず
すと、本発明の効果は達成されない。

即ち、Cu，Zn−SODの等電点はPH4.9〜5.5に
あり、このCu，Zn−SODを効果的に吸着せしめ
るためには、この点からアルカリ側が好ましく、
又そのとき使用する緩衝液については十分な緩衝
能を維持し、かつ、使用陰イオン交換ゲルの活性
化、再生化等に問題のない範囲でなければならな
いからである。

また本発明で使用される陰イオン交換ゲルとし
ては、十分にCu，Zn−SODを吸着−溶出すもの
がよく、陰イオン交換樹脂としては、ジエチルア
ミノエチル（DEAE）基、トリエチルアミノエチ
ル（TEAE）基もしくはジエチル−（２−ヒドロ
キシプロピル）−アミノエチル（QAE）基で置換
したセルロースゲル；DEAE基もしくはQAE基
で置換した架橋結合デキストランゲル；DEAE基
で置換した架橋結合アガロースゲル；DEAE基で
置換したＮ−トリス−（ヒドロキシメチル）−メチ
ルアクリルアミドゲル；もしくはDEAE基で置換
した親水性ポリビニール系樹脂が用いられ、好ま
しくはQAE基で置換したセルロースゲルもしく
は架橋結合デキストランゲルもしくはDEAE基で
置換したＮ−トリス−（ヒドロキシメチル）−メチ
ルアクリルアミドゲルもしくは、親水性ポリビニ
ール系樹脂が適当である。更に緩衝液としては酸
成分が塩酸である陽イオン性緩衝液が用いられ、
好ましくは、イミダゾール・塩酸、２：４：６−
トリメチルピリジン・塩酸、トリエタノールアミ
ン・塩酸、Ｎ−エチルモルフオリン・塩酸、トリ
ス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン・塩酸、
２−アミノ−２−メチル−１：３−プロパンジオ
ール・塩酸、ジエタノールアミン・塩酸、四ほう
酸ナトリウム・塩酸、ジメチルグリシンナトリウ
ム・塩酸もしくは塩化アンモニウム・アンモニア
のいずれかである。

陰イオン交換樹脂に吸着されたCu，Zn−SOD
を選択的に溶出させるために用いる緩衝液は、イ
オン強度が0.2mmole／以上であるか、又は緩
衝液のPHが５以下であるものを用いる。さらに陰
イオン交換クロマトグラフイーは０〜30℃で行う
のが望ましい。

これは、Cu，Zn−SODの使用する陰イオン交
換ゲルへの吸着−溶離又は該ゲルの再生−活性化
のために、出来るだけ一価イオンの使用が好まし
いためで、これ以外の緩衝液では、本発明の如き
操作性、安定性、再現性のすぐれた効果は得られ
ない。

溶出のときの緩衝液の条件としては、Cu，Zn
−SODの等電点がPH4.9〜5.5にあるので、このよ
うな条件下で行なえばよい。また操作温度も、０
℃未満では試料、溶液の凍結、塩の析出等がおこ
り、30℃を越えると試料の腐敗、ゲルの劣化、ゲ
ルへの吸着性の低下等がおこる。

本発明の方法により得られるCu，Zn−SOD標
品はポリアクリルアミドゲル電気泳動により単一
であり、ドデシル硫酸ナトリウム存在下の電気泳
動法により分子量16000を与えた。さらに、沈澱
平衡法による超遠心分析により分子量は32000で
あり、原子吸光分析により１分子中にCuとZnを
それぞれ２ｇ原子づつ含むことがわかつた。標品
重量１mg当りの活性は3500単位であつた。

次に本発明を実施例により更に説明するが、こ
れら実施例のみに本発明は限定されるものではな
い。

実施例１新鮮なウシ血液10に凝固防止液としてACD
液150mlを加え、遠心分離により充填赤血球を分
離した。この充填赤血球に、10の生理食塩水を
加え、撹拌ののち、遠心分離により洗浄した。こ
うして得られる充填赤血球約５に同量の蒸留水
を加えて溶血させ、溶血液約10にし、この溶血
液の総SOD活性を前述したジエイ・エム・マツ
コード（J.M.McCord）とアイ・フリドビツチ
（I.Fridovich）（ジエイ・ビオル・ケム（（J.Biol.
Chem））第244巻、6049〜6055頁、1969年）の方
法に従つて測定した結果、4.0×10⁶単位であつ
た。

このジエイ・エム・マツコード（J.M.
McCord）とアイ・フリドビツチ（I.Fridovich）
の方法に従い (1) エタノール−クロロホルム処理によるヘモグ
ロビンの除去、 (2) K₂HPO₄によるエタノール層と水層の分離、 (3) アセトン分画によるエタノール層からのCu，
Zn−SODの沈澱の操作を行い得られた沈澱は
淡緑色を呈しており、これに少量の蒸留水に溶
解させ、不溶物を紙で別して得られる液
を「溶液(A)」と呼ぶ。このときの総SOD活性
は、2.1×10⁶単位であつた。「溶液(A)」をイオ
ン強度25mmole／トリスー（ヒドロキシメ
チル）−アミノメタン・塩酸緩衝液（PH8.2）に
透析して得られる透析液を「溶液(B)」と呼ぶ。
イオン強度25mmole／トリス−（ヒドロキシ
メチル）−アミノメタン・塩酸緩衝液（PH8.2）
に平衡化した「QAE−Sephade×Ａ−50」ゲ
ル（Pharmacia社製；商品名）を充填したカ
ラムに前記「溶液(B)」を流入させ、Cu，Zn−
SODを吸着させた。このゲルクロマトグラム
およびSOD活性280nmと680nmの吸光度の測
定結果を図１に示した。また「溶液(B)」の紫外
部吸収スペクトル及び電気泳動図を第２図に示
した。

上端から約2.5cmの厚さに淡緑色のバンドが
あらわれ、さらに続けて同じ緩衝液約１をカ
ラムに流入させ、ゲルに吸着しない蛋白質を洗
浄除去した。次いでイオン強度25mmole／
のトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタ
ン・塩酸緩衝液（PH8.2）においてNaClがゼロ
から1mole／まで変化する直線濃度勾配によ
り、前記吸着されているCu，Zn−SODを溶出
した。流速は、約10ml／hr、室温下にて操作し
た。NaCl濃度勾配をかけはじめてから、すぐ
にカラムからの溶出液の管口をフラクシヨンコ
レクターにつなぎ、１フラクシヨンあたり100
滴（4.6ml）で分画した。それぞれのフラクシ
ヨンは、280nmと680nmの吸光度を測定した。
同時に、SOD活性も記録した。SOD活性はフ
ラクシヨン数41〜65に溶出していた。この結果
を第１図に示した。それぞれのフラクシヨンの
紫外部吸収スペクトル（240〜400nm）を自記
分光光度計を記録した上で、260nmでの吸光度
A₂₆₀と28nmでの吸光度A₂₈₀の比は、A₂₆₀／
A₂₈₀が1.50以上であるフラクシヨン数47〜52を
集めた。このプールした溶液を「溶液(C)」と呼
び、紫外部吸収スペクトル及び電気泳動図を第
３図に示した。これを蒸留水に対して透析のの
ち凍結乾燥した。得られた標品の重量は400mg、
総SOD活性は、1.4×10⁶単位乾燥重量１mg当り
の比活性は3500単位であり、電気泳動的には単
一バンドであつた。

実施例２実施例１において得られる「溶液(A)」をイオン
強度20mmole／のジエタノールアミン・塩酸
緩衝液（PH9.0）に対して透析して得られる「溶
液(B)′」とし、これを前記同じ緩衝液で平衡化し
た「DEAE−Toyopearl650M」（東洋曹達工業(株)
製：商品名）を充填したカラムに流入させ、同じ
緩衝液で十分洗浄後、0.2mmole／ NaClを含
むイオン強度20mmole／のジエタノールアミ
ン・塩酸緩衝液（PH9.0）で段階的（ステツプワ
イズ）溶出を行つた。実施例１と同様に分取し、
A₂₆₀／A₂₈₀＞1.50であつたフラクシヨン（フラク
シヨン数39〜46）を集め、蒸留水に対して透析
後、凍結乾燥によりCu，Zn−SOD390mgを得た。
総SOD活性は、1.37×10⁶単位であり、電気泳動
的には単一のバンドを与えた。

実施例３実施例１で用いた緩衝液をイオン強度
30mmole／の塩化アンモニウム・アンモニア
緩衝液（PH10.5）に変更し、陰イオン交換ゲルと
して「DEAE−トリスアクリルＭ」（LKB社製：
商品名）を用いた以外は同様にして、Cu，Zn−
SODを吸着させたのち、同緩衝液においてNaCl
が０（ゼロ）から1mole／まで変化する直線的
濃度勾配で溶出させた。活性画分のプールから
405mgの凍結乾燥標品を得た。総SOD活性は、
1.42×10⁶単位であり、このものの電気泳動パタ
ーンは単一であつた。

実施例４新鮮な牛肝臓５Kgを、10mmole／、Mn²⁺を
含有する25mmole／トリス−グリシン緩衝液
（PH7.5）10と水冷下に混合した。次いでトルエ
ンを250ml添加し、遠心分離により、上澄液10
を集め、この上澄液に12.5の冷アセトンを加
え、沈澱形成させ遠心分離により沈澱をあつめて
前記と同じ10mmole／Mn²⁺含有25mmole／
トリス−グリシン緩衝液（PH7.5）に懸濁させた。

撹拌ののち、遠心して得られる上澄液を加熱
後、遠心分離により上澄液を得た。この上澄液に
45％になるように硫酸アンモニウムを加え、沈澱
を除去し、さらに65％になる様に硫酸アンモニウ
ムを加え沈澱物を集めた。この沈澱物を
30mmole／２−アミノ−２−メチル−１：３
−プロパンジオール・塩酸緩衝液（PH9.0）に溶
解させ同緩衝液に対して透析して得られる透析液
を「溶液Ｄ」とする。この「溶液Ｄ」は若干の随
伴蛋白質を含む大略純粋なCu，Zn−SOD溶液で
あり、このものに含まれる総SOD活性は、1.75×
10⁶単位であつた。この「溶液Ｄ」をイオン強度
30mmole／の２−アミノ−２−メチル−１：
３プロパンジオール・塩酸（PH9.0）にて平衡化
させ、４℃で「Selectacel−QAE」（Brown社
製：商品名）を充填したカラムに流し込み、同じ
緩衝液で十分ゲルを洗浄したのち、0.2mole／
NaClを含有する同緩衝液を実施例２と同様に
流しこみ、吸着しているCu，Zn−SODを溶出さ
せた。A₂₆₀／A₂₈₀が1.50以上であるSOD活性フラ
クシヨンをプールして、蒸留水に対して十分透析
したのち、凍結乾燥を行い、340mgの凍結乾燥標
品を得た。総SOD活性は1.20×10⁶単位で、電気
泳動的に単一であつた。

実施例５実施例４で得られた「溶液Ｄ」を、イオン強度
10mmole／のイミダゾール・塩酸緩衝液（PH
7.0）に透析後、同緩衝液で平衡化した
「Servacel TEAE−23」（Serva社製：商品名）
及び「DEAE B10−GEL Ａ」（Bio−Rad社製：
商品名）を充填したカラムに流し、実施例４と同
様にして、溶出させ電気的泳動的に単一な凍結乾
燥標品をそれぞれ345mg得た。

実施例６酵母ケーキを５：３容量比のエタノール−クロ
ロホルム混合物と同量混合し、25℃で撹拌し、次
いでその混合物を遠心分離して得られた上澄液の
SOD活性は酵母10Kgから出発したとき1.42×10⁷
単位であつた。この上澄液に300ｇ／の割合で
K₂HPO₄の固形を加え混合、静置後、上層部を分
離した。この塩析有機相は遠心分離により不溶物
を除去後上澄液に冷アセトンを0.75容量加え、生
じたアセトン沈澱物を遠心分離によりあつめ、こ
のアセトン沈澱物を少量（約200ml）のイオン強
度10mmole／のトリエタノールアミン・塩酸
緩衝液（PH7.8）に溶解し、同緩衝液で平衡化し
た「DEAE−Sephadex Ａ−50」（Pharmacia社
製：商品名）を充填したカラムに流入させ、Cu，
Zn−SODを吸着させ、同緩衝液において０から
1mole／までのNaClによる直線濃度勾配によ
り溶出させ、実施例１と同様の方法で活性画分を
凍結乾燥品を得た。総SOD活性は、6.02×10⁶単
位で、電気泳動的に単一であつた。

実施例７実施例６で得られたアセトン沈澱物をイオン強
度50mmole／の５：５−ジエチルバルビツー
ル酸ナトリウム塩酸緩衝液（PH9.5）に溶解し、
イオン交換クロマトグラフイー操作を30℃で同緩
衝液に変更し、イオン交換樹脂として「DEAE−
Toyopeorl 650M」（東洋曹達工業(株)製；商品名）
及び「Cellex QAE」（Bio−Rad社製：商品名）
を用いた以外は実施例６と同様の方法で活性画分
をあつめた。電気泳動的に単一なCu，Zn−SOD
凍結乾燥標品178mgが得られた。

実施例８実施例１において得られる「溶液(A)」をイオン
強度10mmole／の５：５−ジエチルバルビツ
ール酸ナトリウム・塩酸緩衝液（PH5.8）に対し
て透析して得られる「溶液（B″）」を同緩衝で平
衡化した「DEAE−Sepharose CL−6B」
（Pharmacia製：商品名）に流入してCu，Zn−
SODを吸着し、その後は実施例１と同様に操作
して電気泳動的に単一の凍結乾燥標品372mgを得
た。

実施例９実施例２において、DEAE−Toyopearl 650M
に吸着したSODを選択的に溶出させるに際し、
0.2mole／ NaClを含有するイオン強度
20mmole／のジエタノールアミン・塩酸緩衝
液（PH9.0）の代りにイオン強度20mmole／の
酢酸ナトリウム緩衝液（PH4.5）を用いた以外は、
同様に行なつた。得られたクロマトグラムは実施
例２で得られたものと同じであり、活性フラクシ
ヨンから、電気泳動的に均一なCu，Zn−SODの
凍結乾燥標品390mgを得た。

比較例１実施例１において緩衝液をイオン強度
25mmole／のりん酸緩衝液（PH8.1）に変更し、
「DEAE−Toyopearl650M」（東洋曹達工業(株)
製：商品名）及び「DEAE−Sephadex Ａ−50」
（Pharmacia社製：商品名）及び「DEAE−セル
ロースDE−32」（Watman社製：商品名）の各イ
オン交換樹脂を用いて行なつた以外は同様に行な
つたが、いずれもCu，Zn−SODは吸着せず、カ
ラム外へ流出してしまつた。

比較例２実施例１と同じ操作をイオン強度5mmole／
のりん酸緩衝液（PH7.8）にておこなつた。その
結果、全SOD活性のうち95％は試料透析液の流
入時または、緩衝液による洗浄時にカラム外へ流
出してしまつた。一方、残りの５％のものの活性
は0.2mole／リン酸緩衝液（PH7.8）をカラムに
流すことにより溶出して来た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１におけるクロマトグラムで
ある。−−○・−−はSOD活性（単位／ml）−・−
は、A₂₈₀、−×−はA₆₈₀、−は、NaCl濃度
（mole／）を示す。第２図は実施例１における
「溶液(B)」の紫外部吸収スペクトルおよび電気泳
動図を、また、第３図は実施例１における「溶液
(C)」の紫外部吸収スペクトルと電気泳動図を示
す。

Claims

【特許請求の範囲】１ Cu，Zn−スーパーオキサイド・デイスムタ
ーゼ及び随伴する蛋白質を共に含む水溶液中から
Cu，Zn−スーパーオキサイド・デイスムターゼ
を陰イオン交換樹脂を用いたイオン交換クロマト
グルフイーにより単離精製する方法において、PH
が5.5〜11でイオン強度が10〜50mmole／であ
り、その酸成分が塩酸である陽イオン性緩衝液中
でCu，Zn−スーパーオキサイド・デイスムター
ゼを陰イオン交換樹脂に吸着させ、次いで吸着したCu，Zn−スーパーオキサイ
ド・デイスムターゼをイオン強度が0.2mole／
以上であるか、又はPHが５以下である緩衝液を用
いて溶出させることを特徴とする方法。２陰イオン交換樹脂が、ジエチルアミノエチル
（DEAE）基、トリエチルアミノエチル（TEAE）
基、もしくはジエチル−（２−ヒドロキシプロピ
ル）−アミノエチル（QEA）基で置換したセルロ
ース；DEAE基もしくはQAE基で置換した架橋
結合デキストラン；DEAE基で置換した架橋結合
アガロース；DEAE基で置換したＮ−トリス−
（ヒドロキシメチル）−メチルアクリルアミド；も
しくは、DEAE基で置換した親水性ポリビニルア
ルコール系樹脂である特許請求の範囲第１項記載
の方法。３陰イオン交換クロマトグラフイーを０〜30℃
にて行なう特許請求の範囲第１項又は第２項記載
の方法。