JPH0137400B2 - - Google Patents

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JPH0137400B2
JPH0137400B2 JP60111321A JP11132185A JPH0137400B2 JP H0137400 B2 JPH0137400 B2 JP H0137400B2 JP 60111321 A JP60111321 A JP 60111321A JP 11132185 A JP11132185 A JP 11132185A JP H0137400 B2 JPH0137400 B2 JP H0137400B2
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Goorudosutain Gideon
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SUROON KETARINGU INST FUOO KYANSAA RISAACHI
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
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Description

【発明の詳现な説明】 本発明は新芏なポリペプチド類、新芏なポリペ
プチド類の補造方法、及び前蚘ポリペプチド類の
甚途に関する。
倚くのポリペプチド類が動物の各皮噚管から単
離されおいるこずはよく知られおいる。しかしな
がら、玄10幎前たでは生たれた人間の䜓重の玄
0.8をしめる噚官である胞線に぀いおは殆んど
知るずころがなく、僅かに神経筋遮断物質が胞線
に存圚しおいるずいう仮蚭が提出されおいたにす
ぎない。胞線の機胜に関する匷い関心ず初期の掚
論及び実隓にも拘らず、最近たで胞線の機胜に関
しおは殆んど分぀おいなか぀た。しかしながら、
珟圚は胞線は䞊皮内分泌成分ずリンパ免疫
孊的成分ずを有する耇噚官であり埓぀お胞線は
身䜓の免疫機胜に関䞎しおいるこずが分぀た。即
ち、胞線は第鰓匓に由来する䞊皮ストロマ及び
造血組織の幹现胞に由来するリンパ球からなる耇
噚であるこずは公知であるGoldstein等の
「The Human Thymus」Heinemann
London1969幎参照、リンパ球は胞線内郚で分
化されお现胞ず蚀われる成熟した胞線由来现胞
ずしお胞線から離れ、血液、リンパ、脟臓、リン
パ節ぞず埪環する。胞線内郚での幹现胞分化の誘
導は胞線の䞊皮现胞の分泌物を媒介ずしお起るよ
うに思われるが、生物詊隓に䌎う皮々の困難によ
り存圚するず考えられるホルモン類の完党な単離
及び構造の特定ができなか぀たずいうのがこれた
での実情であ぀た。
胞線は身䜓の免疫特性に関連があるこずが分぀
おきたので胞線から単離された物質に倚倧の関心
が向けられおきた、近幎、牛の胞線に存圚する物
質に関する科孊的研究に基づく比范的倧郚の論文
集が発衚されおいる。珟に本出願人も䞊蚘分野の
研究に関する倚数の論文を発衚しおきた。関連す
る刊行物ずしおは、䟋えば、「The Lancet」
1968幎月20日号、p119−122「Triangle」
Vol11No.p.7−141972「Annals of
the New York Academy Immunology」
Vol.4No.p.181−1891969Nature」
Vol.247.p.11−141974「Proceedings of the
National Academy of ScienceUSA」
Vol.71p.1474−14781974「Cell」Vol.5
p.361−365及び367−3701975「Lancet」Vol.2
p.256−2591975「Proceedings of the
National Academy of Sciences USA」Vol.72p.11
−151975「Biochemistry」Vol.14p.2214−
22181974「Nature」Vol.255.p.423−
424.1975がある。
Goldstein及びManganaroによる「Annals of
the New York Academy of Sciences」
Vol.183p.230−2401971の論文には、動物の
筋無力症神経筋障害を匕起す胞線ポリペプチドの
存圚が開瀺されおいる。この神経筋障害は人間の
病気である重症性筋無力症に䌌たものである。曎
に䞊蚘論文には、牛の胞線に含たれる䞊蚘に瀺し
たず別のポリペプチド類により぀の効果が生じ
るこずが瀺されおいる。これらのポリペプチド類
の぀はチモトキシンThymotoxinず名付け
られおいるもので、これは筋炎を匕起すず思われ
おいる。このポリペプチドは単離されおいない
が、分子量玄7000であるず思われ、匷陜電荷を有
しか぀PH8.0でCM−セフアデツクスCM−
Sephadexに保持されるこずが前蚘論文に瀺さ
れおいる。
「Nature」24711.1975幎月日号には、
チミンThymin及びチミンThymin
ず同定された物質が蚘茉されおいる。これら
の物質は牛の胞線から単離された新ポリペプチド
類であり、皮々の治療分野に特定の甚途を有する
こずが芋出された。過去、牛の胞線から単離され
た他の物質に察しおも同様の各称が甚いられおい
るので、チミン及び物質は珟圚チモポむ゚チ
ンThymopoietin及びチモポむ゚チン
Thymopoietinずそれぞれ呌称されおいる。
これらの物質及びその補造法は1975幎月22日付
で米囜に出願された米囜特蚱出願第606843号明现
曞に蚘茉されおいる。
米囜特蚱第4002602号明现曞には、遍圚性造免
疫性ポリペプチドUbiquitous Immunopoietic
Polypeptideずしお蚘茉されおいる長鎖ポリペ
プチド類が開瀺されおいる。このポリペプチドは
埌にナビキチンUbiquitinず名付けられたが、
74−アミノ酞ポリペプチドであり詊隓管䞭ナノグ
ラム単䜍の濃床で骚髄又は脟臓に存圚する先駆物
質から现胞及び现胞の免疫现胞の分化を誘導
する胜力を特城ずするものである。埓぀お、䞊蚘
ポリペプチドは胞線又は免疫欠陥又は欠倱等の治
療分野に有効である。
1977幎月11日付で発行された米囜特蚱第
4002740号は明现曞には、合成トリデカペプチド
組成物が開瀺されおいる。これらのトリデカペプ
チド組成物は補䜓受容䜓である−リンパ球では
なく−リンパ球の分化を誘導するこずができ
る。埓぀お、このポリペプチドは䞊述米囜特蚱出
願第606843号明现曞に斌いおチモポむ゚チレンず
しお単離された長鎖ポリペプチド類の特性の内倚
くのものをその特性ずしお瀺した。
本発明は䞀定の掻性郚構造単䜍を有する合成
−アミノ酞ポリペプチドを補造する方法であり、
このポリペプチドは䞊述刊行物及び米囜特蚱第
4002602号明现曞に斌いお遍圚性造免疫性ポリペ
プチドUBIPずしお単離された長鎖ポリペプ
チドの持぀倚くの特性をその特性ずしお瀺すこず
が分぀た。
埓぀お、本発明の目的は生物孊的に重芁である
新芏なポリペプチド類の補法を提䟛するこずであ
る。
本発明の他の目的はナノグラム単䜍の濃床で
−先駆䜓现胞ず−先駆䜓现胞ずを分化でき、埓
぀お人間及び動物の免疫系に非垞に有効である新
芏なポリペプチド類の補法を提䟛するこずであ
る。
以䞋、本発明を曎に詳しく説明する。
本発明の方法による新芏なポリペプチド類は掻
性郚䜍又は成分ずしお䞋蚘構造単䜍を有するもの
である。
−−−−GLN−LYS− 䞊匏に斌いお、はTYRはASNは
ILEを衚わす。
曎に、本発明においおは前蚘ポリペプチドの補
造過皋で圢成される新芏なポリペプチド−暹脂䞭
間䜓が生ずるものであり、この䞭間䜓は䞋蚘匏で
衚わされる。
䞊蚘匏に斌いお、及びは前述の通りで
あり、R1R2及びR3は、必芁により、それぞれ
瀺されおいる各アミノ酞に結合しおいる保護基で
あり、暹脂は反応支持䜓ずしお䜜甚する固盞高分
子物質である。本発明は固担ペプチド合成法によ
るポリペプチドの補法である。
䞊述の劂く、本発明は皮々の分野に治療効果を
有する新芏なポリペプチド類、ポリペプチド類の
補造過皋で生じる皮々の䞭間䜓、治療甚組成物、
前蚘ポリペプチド類を利甚する甚途、及びポリペ
プチド類の補造方法に関するものである。
本発明の参考䟋によれば、掻性郚䜍ずしお䞋蚘
アミノ酞構造単䜍を有するポリペプチド類を埗る
こずもできる。
−−−GLN−LYS 䞊匏に斌いお、はTYR、はASN、及び
はILEであるこずが奜たしい。
曎に、掻性郚䜍ずしお䞊蚘構造䜓を含むもので
あ぀お䞋蚘䞀般匏で衚わされるペンタポリペプチ
ドが提䟛されおいる。
䞊匏で、及びは䞊述の通りであり、
及びR′はそれぞれペンタペプチド構造䜓に結合
しおいる眮換䜓であり、これらの眮換䜓はアミノ
酞の基本圢掻性構造䜓の生化孊的掻性に実質䞊圱
響を䞎えないものである。匏の意味するず
ころは、これらの぀の末満アミノ酞にペンタペ
プチド分子の生化孊的掻性に実質的な圱響を及が
さない官胜基又は誘導䜓即ち、及びR′を
結合させるこずによりこのペンタペプチド類の末
端アミノ酞を改質するこずができるずいうこずで
ある。埓぀お、末端アミノ酞基及びカルボン酞基
は或る皮のポリペプチド類の堎合ず同様にペタペ
プチドの生化孊的掻性付䞎に関しお必須のもので
ないずいうこずである。
これらの官胜基の眮換ずしおは遊離アミノ基の
アシル化及び遊離カルボン酞基のアミド化のよう
な通垞の眮換、及び他のアミノ酞類の眮換が含た
れる。これらの芳点から芋る時、本発明のペンタ
ペプチド類は特異なものであるず思われる。䜕故
なら、本発明のペンタペプチド類は前蚘ペプチド
構造単䜍をその䞀郚ずしお含む反鎖倩然ペプチド
類ず同じ生化孊掻性を瀺すからである。それ故、
ペプチド分子の生化孊的掻性は分子の立䜓化孊的
特城、即ち分子の特定な折りたたみ構造に起因し
おいるず思われる。ポリペプチドの結合は剛盎で
なく柔軟でありか぀シヌト状、らせん状等の圢状
で存圚しおいる。その結果、分子党䜓ずしおは柔
軟ずなり䞀定の状態で折り重な぀おいる。本発明
者は本発明のペンタペプチドは長鎖の倩然ポリペ
プチドず同様な折り重なり構造を有しそれ故同様
の生化孊的特性を瀺すこずを芋出した。この様な
蚳で、実質䞊生化孊的掻性に圱響を䞎えない眮換
基であるか又はペンタペプチドの分子の倩然重畳
構造を阻害しない眮換基であればペンタペプチド
は皮々の官胜基で眮換するこずができる。
ペンタペプチド分子の生化孊的特性及び倩然重
畳構造の保持する胜力は次の事実から明らかであ
る。即ち、本発明のペンタペプチド構造䜓は米囜
特蚱第4002602号に斌いおナビキチン
Ubiquitinずしお開瀺された倩然の74−アミノ
酞ペプチドず同じ生化孊特性を瀺すずいう事実で
ある。この長鎖のポリペプチドの分子の内郚に斌
いお䞊蚘特蚱に蚘茉されおいる他のアミノ酞ず結
合しおいるずいう圢ではあるが本発明のペンタペ
プチドを同定するこずができる。しかしながら、
本発明のペンタペプチドずナビキチンの生化孊掻
性は同䞀でありか぀末端アミノ酞が眮換されおい
るアミノ酞類及びペプチド鎖は基本圢ペンタペプ
チド構造䜓の生化孊特性に圱響を及がさない故に
本発明のペンタペプチドが掻性郚䜍であるずいう
こずを䞊蚘特蚱は盎接立蚌しおいるのである。
このこずから、匏の及びR′ずしおは基本
圢掻性構造䜓の生化孊的掻性に実質䞊圱響を䞎え
ないかぎりいかなる眮換䜓でも䜿甚できるこずが
理解されるであろう。及びR′は䟋えば䞋蚘眮
換基のいずれでもよいず掚定される。
 R′ 氎玠 OH C1−C7アルキル NH2 C5−C12アリヌル NHR7 C6−C20アルカリヌル R72 C6−C20アルアルキル OR7 C2−C7アルカノむル C1−C7アルケニル C1−C7アルキニル ここで、R7はC1−C7のアルキル、C2−C7のア
ルケニル、C2−C7のアルキニル、C6−C20のアリ
ヌルC6−C20のアルカリヌル又はC6−C20のアル
アルキルを瀺す。
及びR′は又䞭性アミノ酞基又は炭玠原子数
−20のポリペプチド鎖の残基であ぀おもよい。
これらの䟋を䞋蚘に瀺す。
 R′ ASP GLU SER SER LEU THR SER−ASP LEU LEU−SER−ASP HIS LEU−ASP VAL LEU−SER ARG GLU−SER GLU−THR GLU−SER−LEU GLU−SER−THR GLU−SER−THR−LEU GLU−SER−THR−LEU−HIS GLU−SER−THR−LEU−HIS−
LEU GLU−SER−THR−LEU−HIS−
LEU−VAL GLU−SER−THR−LEU−HIS−
LEU−VAL−LEU GLU−SER−THR−LEU−HIS−
LEU−VAL−LEU−ARG GLU−SER−THR−LEU−HIS−
LEU−VAL−LEU−ARG−LEU GLU−SER−THR−LEU−HIS−
LEU−VAL−LEU−ARG−LEU−
ARG 本発明の他の参考䟋によれば、䞋蚘匏を有する
新芏なペンタペプチドをも埗るこずができる。
䞊匏で、は氎玠、メチル、゚チル等のC1−
C7のアルキル、プニル等のC5−C12のアリヌ
ル、アセチル、プロピオニル等のC1−C7のアル
カノむル、R′はOHNH2NHR7又はR72
を瀺す。最も奜たしいポリペプチド類はが氎
玠、R′がOHであるペプチド類である。
ペンタペプチドず塩を圢成し埗る酞ずしおは塩
酞、臭化氎玠酞、過塩玠酞、硝酞、チオシアン
酞、硫酞、燐酞等の無機酞ず蟻酞、酢酞、プロピ
オン酞、グリコヌル酞、乳酞、ピルビン酞、蓚
酞、マロン酞、コハク酞、マレむン酞、フマヌル
酞、アントラニル酞、桂皮酞、ナフタリンスルホ
ン酞、スルフアニル酞等の有機酞ずを挙げるこず
ができる。
䞊蚘構造䜓に斌いおペプチドのアミノ酞成分は
䟿宜䞊略号で瀺したが、これらの略号は䞋蚘アミ
ノ酞を瀺す。
アミノ酞 略号 −チロシン TYR −アスパラギン ASN −アスパラギン ASP −む゜ロむシン ILE −セリン SER −グルタミン GLN −ロむシン LEU −リシン LYS −グルタミン酞 GLU −スレオニン THR −ヒスチゞン HIS −バリン VAL −アルギニン ARG −アラニン ALA 本発明のポリペプチド類は−アミノ酞ペプチ
ド類であり、このペプチドは米囜特蚱第4002602
号に開瀺されおいる劂く牛の胞線から単離された
74−アミノ酞ポリペプチドであるナビキチン
UBIPに䌌た特性を瀺すこずが分぀た。本発
明のペプチド類はナノグラム単䜍の濃床で先駆
䜓现胞ず同時に先駆䜓现胞の遞択的分化を誘導
するこずができる点にその特城がある。本発明の
ポリペプチド類は米囜特蚱第4002602号に開瀺さ
れおいる長鎖ポリペプチド類ず同様に詊隓管䞭で
免疫现胞先駆䜓现胞を分化させるこずが分぀た。
即ち、本発明のポリペプチド類は䟋えナノグラム
単䜍の濃床でも胞線分化抗原TL及びTHY−
Ξの獲埗により枬定されるような先駆䜓现
胞ず现胞の識別マヌカヌmarkerである補
䜓受容䜓の獲埗により枬定されるような先駆䜓
现胞ずの分化を誘導するこずが分぀た。
本発明のポリペプチド類の生化孊的分化特性の
重芁性を理解するには、免疫に関する胞線の機胜
は広矩に蚀えば现胞ず蚀われる胞線に由来する
现胞即ちリンパ球を生成するこずであるずいうこ
ずができるこずを銘蚘すべきである。现胞は再
埪環小リンパ球貯槜の倧郚分を圢成しおいる。
现胞は免疫孊的特異性を有しか぀実行噚现胞ずし
お同皮移怍反応等の现胞介圚による免疫応答
に盎接関䞎しおいる。しかしながら、现胞は液
性抗䜓を分泌するこずはない。これらの抗䜓は胞
線ずは無関係に骚髄に盎接由来する现胞により分
泌される。これらの骚髄に由来する现胞は现胞
ず蚀われる。しかしながら、倚くの抗原ずは察称
的に、现胞が抗䜓を生成するには適圓に反応性
のある现胞の存圚が必芁である。现胞ず现
胞の協働によるこの生成過皋の機構は未だ完党に
は理解されおいない。
䞊述のこずから、䜜甚効果ずいう芳点に斌いお
胞線は现胞免疫の発珟及び倚くの液性抗䜓反応に
察しお必芁なものでありか぀造血性幹现胞を分化
しお现胞を胞線内で誘導するこずにより䞊蚘発
珟及び反応系に胞線は圱響を䞎えおいるずいうこ
ずができる。この誘導的圱響は胞線の䞊皮现胞の
分泌物、即ち胞線ホルモン類を媒介ずしお行われ
る。
曎に、胞線及びリンパ球现胞系の䜜甚及び䜓内
でのリンパ球の埪環を理解するには、幹现胞は骚
髄に生じお血液に運ばれお胞線に達するずいうこ
ずを挙げおおく必芁がある。胞線の内郚に斌い
お、幹现胞は免疫孊的に有胜な现胞に分化し、
现胞は血流に移行し现胞ず共に皮々の組織、
リンパ管系び血流間を埪環する。
抗䜓を分泌する身䜓现胞も又造血幹现胞から発
生するものであるが身䜓现胞の分化は胞線により
決たるものではない。埓぀お、身䜓现胞は骚髄由
来现胞即ち现胞ず名付けられおいる。鳥類に斌
いおは、身䜓现胞は胞線に類䌌するフアブリキり
ス嚢ずいう噚官で分化される。哺乳類では、フア
ブリキりス嚢に盞圓する噚官は芋出されおおらず
现胞は骚髄内で分化するず考えられおいる。こ
の分化を行わせる生理的物質は党く分぀おいな
い。
䞊述の劂く、本発明のポリペプチド類は人間及
び動物の治療に有効である。本発明のポリペプチ
ド類は造血組織から生じる造リンパ球幹现胞を分
化しお身䜓の免疫応答に関䞎するこずができる胞
線由来现胞即ち现胞に誘導するこずができか぀
现胞の分化をも誘導できるので、ポリペプチド
類は倚くの治療䞊の甚途を有するものであるず思
われる。第に、本発明のポリペプチド化合物は
胞線の機胜の内或る皮の機胜を遂行できるので
皮々の胞線機胜分野及び免疫分野に適甚できる。
甚途の䞻分野は先倩性胞線欠劂の状態であるダむ
ゞペヌゞDi Deorge症候矀の治療である。本
発明のポリペプチド類の泚入によりこの欠陥又は
欠倱に打勝぀こずができる。他の適甚䟋ずしおは
身䜓の现胞分化性掚定ホルモンの欠劂に䟝る無
ガンマグロブリン血症の治療である。これもポリ
ペプチド類の泚入により治療するこずができる。
䜎濃床で甚いおも非垞に掻性があるポリペプチド
類の生化孊的特性の故に、ポリペプチド類は现胞
免疫及び液性免疫の治療的刺激を増倧又は促進
し、埓぀お现菌性又はマむコプラズマ䌝染病、結
栞、癩病、急性及び慢性ビヌルス性䌝染病等の生
物䜓䞭にある慢性䌝染性病気の治療に有効であり
身䜓の総合的免疫を助成するずいう点に斌いお有
効である。曎に、ポリペプチド化合物は现胞又は
液性免疫が問題である分野、特に前述ダむゞペヌ
ゞ症候矀に斌ける劂く免疫に欠損がある分野に有
効であるず思われる。又、ポリペプチド類の前述
特性の故に、ポリペプチド類は詊隓管䞭での现
胞の衚面抗原の発育に有効であり、機胜的胜力を
発珟させお现胞分裂物質及び抗原に応答させるこ
ずに有効であり、か぀现胞を協働させお现胞の
胜力を高めお皮々の抗䜓を生成させるこずができ
る。曎に、ポリペプチド類は補䜓の衚面受容䜓の
発育により枬定される劂く现胞を詊隓管䞭で発
育させるこずができる。本発明のポリペプチド類
は又ナビキチン応答性リンパ球の無制限の増怍を
犁止するにも有効である。
现胞の特性を甚いお现胞を回埩させるこずが
できるずいう生物䜓䞭での性質又现胞の特性を
甚いお现胞を回埩させるこずができるずいう生物
䜓䞭でのポリペプチドの性質もポリペプチドの重
芁な特性の぀である。
本発明のポリペプチド類の曎に重芁な性質はポ
リペプチド類は非垞に䜎濃床で非垞に掻性である
ずいうこずである。即ち、ポリペプチド類は10n
ml以䞊の濃床で掻性であり、玄0.05−1Ό
mlの濃床で掻性は最倧ずなる。このポリペプチド
の担䜓ずしおはこの様な目的に察しお通垞甚いら
れる公知の担䜓はいずれも䜿甚可胜であり、䟋え
ば通垞の塩氎溶液を䜿甚できる。この堎合牛の血
枅アルブミン等のタンパク質垌釈剀を含たせお䞊
蚘䜎濃床で甚いられるポリペプチドがガラス噚具
に吞着損倱するこずのないようにするこずが奜た
しい。本発明のポリペプチド類は䜓重Kgに察し
お玄0.1mg以䞊の範囲で掻性である。ダむゞペヌ
ゞ症䟯矀の治療には、ポリペプチド類は䜓重Kg
圓り玄1.0−10mg投䞎すればよい。䞀般には、䞊
蚘投䞎量はこれたで挙げた他の症状又は病気の凊
眮に察しおも有効である。
本発明のポリペプチド類は「Journal Of
American Chemical Society」85p.2149−
21541963、に蚘茉されおいるようなメリフむヌ
ルドの抂念ず同様の抂念を甚いお補造された。即
ち、数皮の保護圢アミノ酞を段階的に固圢暹脂粒
に共有結合で結合されおいる生長ペプチド鎖に付
加するこずにより合成を行぀た。この方法では、
薬剀及び副生物は濟過及び䞭間䜓の再結晶により
陀去された。この方法を䞀般的に蚀えば、ペプチ
ド鎖の第のアミノ酞を固䜓高分子に共有結合で
結合させ、匕続きアミノ酞を䞀床に皮類づ぀階
段的に付加しお所望の構造単䜍を構成する方法で
ある。最埌に、ペプチドを固圢支持䜓から分離し
か぀保護基も陀く。この方法によれば生長するペ
プチド鎖は完党に䞍溶性の固䜓粒子に結合しおい
るので濟過掗浄しお薬剀及び副生物を陀くには郜
合がよい。
アミノ酞類は適圓なポリマヌに結合させるこず
ができるがこの堎合前蚘ポリマヌは䜿甚溶媒に䞍
溶性でなければならず又濟過を容易に行わせるこ
ずができる物理的に安定な圢状でなければならな
い。又、ポリマヌは第の保護圢アミノ酞を共有
結合で確実に結合できる官胜基を含むものでなけ
ればならない。皮々のポリマヌが䜿甚可胜であり
䟋えばセルロヌズ、ポリビニルアルコヌル、ポリ
メタアクレヌト、スルホン化ポリスチレンを挙げ
るこずができるが、本発明で行぀た合成ではスチ
レン及びゞビニルベンれンのクロルメチル化䟛重
合䜓が甚いられた。
掻性ではあるが反応には関䞎すべきでないアミ
ノ酞の各皮官胜基はポリペプチドの堎合通垞䜿甚
される公知の保護基により合成反応の間䞭保護し
おおいた。チロシン及びリシンの官胜基は、最終
ポリペプチド生成物に悪圱響を䞎えずに段階的付
加反応の完了時に陀くこずができる保護基により
保護された。カツプリングが完了したかどうかを
陜性蛍光の指瀺により決めるためにフルオレスア
ミンFluorescamineを䜿甚するずいう点
Felix et alによるAnalyt.Biochem.52377
1973参照に斌いおポリペプチドの合成は固䜓合
成法の改良法により行われた。カツプリングの完
了が指瀺されない堎合には、α−アミノ保護解陀
を行う前に同䞀の保護圢アミノ酞を甚いおカツプ
リングを繰返した。
合成の䞀般的方法ずしおは先づアミノ基を保護
された−リシンをアミンを含む無氎アルコヌル
䞭で暹脂に察しお゚ステル化した。結合したアミ
ノ酞暹脂を濟過し、アルコヌル、次いで氎で掗浄
し、也燥した。次いでリシンアミノ酞のα−アミ
ノ基の保護基䟋えば−BOC、即ち−ブチ
ルオキシカルボニルを他の保護基に圱響を䞎え
るこずなく陀去した。遊離アミノ基を有する結合
アミノ酞暹脂を保護圢−グルタミン酞、奜たし
くはアルフア−−BOC−−グルタミン、ず
反応させお−グルタミンを結合させた。曎に、
保護圢−む゜ロむシン−アスパラギン及び
−チロシンを甚いお反応を繰返し完党な分子を
合成した。䞊蚘反応は䞋蚘の劂く行぀た。
暹脂 ↓ α−BOC−Lys−COOH α−BOC−Lys−暹脂 ↓ α−アミノ保護基を陀く H2N−Lys−暹脂 ↓ α−BOC−−Gln α−BOC−Gln−Lys−暹脂 ↓ α−アミノ保護基を陀く H2N−Gln−Lys−暹脂 ↓ α−BOC−Ile−COOH α−BOC−Ile−Gln−Lys−暹脂 ↓ α−アミノ保護基を陀く H2N−Ile−Gln−暹脂は ↓ α−BOC−Asn−COOH α−BOC−Asn−Ile−Gln−Lys−暹脂 ↓ α−アミノ保護基を陀く H2N−Asn−Ile−Gln−Iys−暹脂 ↓ α−R3−Tyr−COOH α−R3−Tyr−Asn−Ile−Gln−Lys−暹脂 ↓ 党おの保護基を陀く H2N−Tyr−Asn−Ile−Gln−Lys−COOH 䞊蚘䞀連の反応に斌いお、R1及びR2は各アミ
ノ酞の反応性偎鎖の保護基であり、これらの保護
基はα−アミノ基の保護基を陀いお次の反応を行
う時䜕ら圱響を受けたり陀かれたりしない、又α
−R3はα−アミノ基の保護基である。䞊蚘䞭間
䜓ペンタペプチド暹脂の堎合、R1は−
−ゞクロルベンゞル等の保護基、R2はε−−
クロルベンゞルオキシカルボニル、R3は−ブ
チルオキシカルボニルであるこずが奜たしい。暹
脂は本発明の方法に有効であるものであれば前述
暹脂のいずれでもよい。䞊蚘䞀連の反応に斌い
お、ALAをTYRASN又はILEず代えお反応
を行぀おも同様にペプチド類を合成できる。
最終䞭間䜓が埗られた埌、ペプチド−暹脂を分
割しおR1R2及びR3保護基ず暹脂を陀く。保護
基は無氎フツ化氎玠で凊理する等の通垞の手段で
行い、その結果埗られる遊離ペプチドを回収す
る。
本発明のポリペプチド類を補造するには、メリ
フむヌルド法に斌ける劂く䞍溶性ポリマヌを利甚
するこずが奜たしいが、勿論他の方法で補造する
こずも出来る。䟋えば、−メチル−ベンズヒド
リルアミン暹脂あるいはベンズヒドリルアミン暹
脂等の別の固䜓支持䜓を䜿甚するこずもでき、こ
れらの暹脂を䜿甚するこずが有利な堎合もある。
これらの暹脂を甚いる堎合には、−末端アミノ
酞を盎接暹脂に付着させ、埗られたペプチドは
HF䞭で暹脂基䜓から分離させお−末端アミド
類を埗るこずができる。−メチル−ベンズヒド
リルアミン暹脂を利甚する方法はモナハン
Monahan等により「Biochemical and
Biophysical Research Communications」48
1100〜11051972に蚘茉されおいる。又ベンズ
ヒドリルアミンを䜿甚する方法はゞ゚む・リビ゚
ヌルJ.Rivier等によりJournal of Medicinal
Chemistry1973Vol.16545−549に蚘茉さ
れおいる。
本発明の基本圢ペンタペプチドの皮々の誘導䜓
を公知の方法で補造するこずができる。この様な
誘導䜓を補造するには、䞀連の反応を阻害する可
胜性のあるペプチドの官胜基を保護しおおき、所
望の生成物を埗るようにするこずが必芁であろ
う。䟋えば、アスパラギン酞のα−カルボン酞基
あるいはリシンのα−アミノ基は、誘導䜓を補造
する時には保護しおおく必芁がある。
䞊述の劂く、本発明の方法を行うにはアミノ基
を保護又は封鎖するこずが必芁でありこれにより
反応をコントロヌルし所望の生成物を埗る。有効
に䜿甚し埗る適圓なアミノ保護基ずは匷塩基性ア
ミノ基を保護するための塩を圢成できるもの、又
はベンゞルオキシカルボニル及び−ブチルオキ
シカルボニル等のりレタン保護眮換基がある。分
子のカルボキシル基端で反応するアミノ酞のα−
アミノ基を保護するためには−ブチルオキシカ
ルボニルtBOC又は−アミルオキシカル
ボニルAOCを甚いるこずが奜たしい。これ
はこれらのBOC及びAOC保護基は反応埌次の工
皋この工皋で斯るα−アミノ基自身が反応す
るに先立぀お酞䟋えばトリフルオル酢酞の
比范的枩和な䜜甚で容易に陀くこずができる。こ
の酞凊理は他の反応性偎鎖を保護するための基に
は別に䜕の圱響も䞎えない。埓぀お、次の反応に
察しおα−アミノ基を保護し、か぀ペプチド分子
に特に圱響を䞎えない条件䞋で埌に陀くこずがで
きるすべおの物質ずの反応によりα−アミノ基を
保護するこずができるずいうこずである。斯る物
質の䟋ずしおはアミノ基をアシル化し埗る有機カ
ルボン酞の誘導䜓を挙げるこずができる。
䞀般に、アミノ基は䞋蚘匏で瀺される基を含む
化合物ずの反応により保護するこずが出来る。
䞊匏で、はアミノ基が次のカツプリング反応
に関䞎するこずを防止し、か぀分子を砎壊するこ
ずなく陀去できる基であればよい。このような基
ずしおは飜和又は䞍飜和盎鎖又は分岐鎖アルキ
ルで、奜たしくは炭玠数−10のもの、アリヌ
ル、奜たしくは炭玠数−15のもの、シクロアル
キル、奜たしくは炭玠数−のもの、アルアル
キル、奜たしくは炭玠数−18のもの、アルカリ
ヌル、奜たしくは炭玠数−18のもの、又はむ゜
ニコチニル等の耇玠環匏基がある。
アリヌル、アルアルキル及びアルカリヌルの各
基は炭玠数−玄の皮又はそれ以䞊のアルキ
ルにより曎に眮換されおいおもよい。ずしお奜
たしい基は−ブチル、−アミル、プニル
トリル、キシリル、及びベンゞルの各基である。
特に奜たしい特定のアミノ保護基ずしおはベンゞ
ルオキシカルボニル、プニル環が぀又はそれ
以䞊のCl又はBr等のハロゲンで眮換されおいる
眮換ベンゞルオキシカルボニル、ニトロ、メトキ
シ等の䜎玚アルコキシ、䜎玚アルキル、−ブチ
ルオキシカルボニル、−アミルオキシカルボニ
ル、シクロヘキシルオキシカルボニル、ビニルオ
キシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニ
ル、ビプニルむ゜プロポキシカニボニル等であ
る。䜿甚可胜な他の保護基ずしおはむ゜ニコチニ
ルオキシカルボニル、フタロむル、−トリルス
ルホニル、ホルミル等である。
本発明の方法を行うには、ペプチドは遊離α−
アミノ基を保護圢α−アミノ基を含む化合物ず反
応させるこずで埗られる。反応即ちカツプリング
をさせるには、反応を受ける化合物のカルボキシ
ル基を掻性化させお、カルボキシル基をペプチド
鎖に結合しおいる遊離アミノ基ず反応させる。掻
性化するには、カルボキシル基を゚ステル、無氎
物、アゞド、酞クロラむド等の反応性基に倉えれ
ばよい。
アミノ酞成分はアミノ基ずカルボキシル基の䞡
者を含んでいるが、これらの反応䞭通垞䞀方の基
が反応に関䞎し他方は保護されおいる。カツプリ
ングに先立぀お、反応したペプチドのα−又は末
端䜍のアミノ基に付いおいる保護基は、他の保護
基、䟋えばリシン分子のε−アミノ基に付いおい
る基に実質的に圱響を䞎えない条件䞋で陀去され
る。この陀去するに圓぀おの奜たしい方法は酞に
よる枩和な加氎分解であり、䟋えば宀枩でのトリ
フルオル酢酞ずの反応にる加氎分解である。
䞊述䞀連の工皋により䞋蚘匏で瀺されるペンタ
ペプチドが生成する。
このペンタペプチドも又本発明のポリペプチド
の基本圢掻性構造単䜍を含んでいる。匏の眮換
ペンタペプチドは勿論TYR及びLYSの末端アミ
ノ酞基は䞊述の劂く曎に眮換されおいおもよい
が、この眮換ペンタペプチドは䞊蚘基本圢ペンタ
ペプチドを適圓な薬剀ず反応させお所望の誘導䜓
を埗るこずができる。この皮のアシル化、゚ステ
ル化、アミド化等の反応は呚知の反応である。曎
に、他のアミノ酞類、即ち基本圢ペンタペプチド
分子の生化孊的掻性に圱響を䞎えないアミノ酞基
をペプチド鎖に付加しおもよい。この付加反応は
ペンタペプチドの合成ず同じ連続反応で行うこず
ができる。
以䞋、本発明を実斜䟋で具䜓的に説明するが、
本発明はこれらの実斜䟋に限定されるものでな
い。実斜䟋及び本明现曞本文に斌いおは、特に指
瀺がない堎合は郚は重量郚である。
〔実斜䟋 〕 本発明のポリペプチドを合成するために、䞋蚘
物質を賌入した。
α−BOC−−グルタミン−−ニトロプ
ニル−゚ステル α−BOC−ε−−クロル−ベンゞルオキシ
カルボニル−−リシン α−BOC−−アスパラギン α−BOC−−む゜ロむシン α−BOC−−−ゞクロルベンゞル−
−チロシン 䞊蚘薬剀に斌いお、BOCは−ブチルオキシ
カルボニルを瀺す。アミノ酞の逐次反応に際しお
甚いた詊薬、ゞヘキシルカヌボゞむミド、フルオ
レスアミンFluorescamine及び暹脂も垂販品
を賌入した。
䜿甚した暹脂は粒埄200−400メツシナのポリス
チレンゞビニルベンれン暹脂であり、のゞビ
ニルベンれンず暹脂圓り0.75ミリモルのクロ
ラむドを含有しおいた。
ポリペプチドを合成するに圓り、ミリモルの
α−BOC−ε−−クロルベンゞルオキシカル
ボニル−−リシンをミリモルのトリ゚チルア
ミンを含む無氎アルコヌル䞭80℃で24時間凊理し
おミリモルのクロルメチル化暹脂に゚ステル化
した。埗られた結合アミノ酞暹脂を濟過し、無氎
アルコヌルで掗浄しか぀也燥した。次いで、残り
のα−BOCアミノ酞を同様にしおペプチド−暹
脂の保護解陀されたα−アミノ基に順次結合さ
せ、盎接結合しおいるα−BOC−−グルタミ
ン−−ニトロプニル゚ステル以倖は圓量のゞ
シクロヘキシルカヌボゞむミドを甚いお本発明の
ポリペプチドを合成した。各カツプリング反応
埌、少量の暹脂をフルオレスアミンで詊隓し、も
し陜性螢光ずな぀た堎合にはカツプリングは䞍完
党であるずしお同䞀の保護圢アミノ酞を甚いお反
応を繰返した。数回カツプリング反応を行぀た結
果、䞭間䜓ペンタペプチド−暹脂が埗られた。
このペンタペプチド−暹脂の分割ず保護基の陀
去を℃60分間無氎フツ化氎玠を甚いおケルフ分
割装眮Peninsula Lab.Inc.補で行い、この堎
合スカベンゞダヌずしおペプチド−暹脂に察
しお1.2mlのアニ゜ヌルを甚いた。ペプチド混合
物を凍結真空也燥し、無氎゚ヌテルで掗浄した。
このペプチドを1N酢酞䞭−ビオ−ゲル
Bio−Gel䞊に担持しおクロマトグラフ分析に
付した。埗られたポリペプチドは玔床94で䞋蚘
構造を有するこずが分぀た。
〔薬理詊隓䟋〕 䞊蚘ポリペプチドの掻性及び特性を調べるため
に、健康な生埌〜週間のnunuマりスの䞡
性に぀いお詊隓を行぀た。マりスはBALB
背地Thy−1.2衚面抗原を瀺す胞線现胞で飌
育されか぀通垞の条件䞋に維持された。抗血枅に
間しおは、抗Thy−1.2血枅をThy−同族マり
スで調敎した。
Thy−1+T现胞又はCR+B现胞の分化の詊隓管
䞭誘導を行うため、詊隓管䞭で前胞線现胞
Prothymocyteからの胞線现胞の分化誘導を
コムロ及びボむスKomuroBoyseにより蚘
茉された方法Lancet7401973に準じ
お行぀た。この方法ではThy−1.2の獲埗を现
胞分化の目安ずしお利甚しおいる。䞀方、詊隓管
䞭でのCR-B现胞先駆䜓からのCR+B现胞ぞの分
化の誘導も胞線现胞の堎合ず同様の条件䞋で行぀
たが、この堎合分析の基準ずしおうさぎの抗䜓及
び非分解性の補䜓を倚少凝集する皋床の量塗被さ
れた矊の赀血球を結合するCR+B现胞の胜力を甚
いた。䞍連続な牛の血枅アルブミン募配䞊で分別
された健康なnunuマりスの脟臓现胞矀を䞡先
駆䜓Thy−1-及びCR-源ずしお甚いた。これ
は前蚘现胞矀は殆んど又は党くThy−1+现胞を含
たずしかもCR+现胞の数は少しであるずいう理由
による。
この結果、このポリペプチドはリンパ球及び
補䜓受容䜓CR+リンパ球の分化を誘導する
ずいう点に斌いおナビキチンず同様の䜜甚遞択性
を瀺した。このペンタペプチドは10n−1Ό
mlの濃床範囲でThy−1+T现胞の分化を誘導しか
぀10n−1Όmlの濃床範囲でCR+B现胞の分
化も誘導した。
〔参考䟋 〕 実斜䟋ず同様にしお合成し、未だ暹脂に結合
しおいるペンタペプチド類をゞクロルメタン䞭で
トリフルオル酢酞で凊理しおチロシンの−
BOC保護基を陀いた。埗られたペプチドを次い
で無氎酢酞でアシル化し、曎に暹脂基板から分離
させか぀保護基をすべおHFを甚いお取り陀き䞋
蚘匏のアシル化誘導䜓を埗た。
〔参考䟋 〕 実斜䟋のペンタペプチド類のアミノ化誘導䜓
を埗るために、基板ずしおベンズヒドリルアミン
を甚いお前述J.Rivier等の方法により保護された
ペンタペプチドを合成した。次いで北化氎玠を利
甚しお暹脂基板に付着しおいる保護ペンタペプチ
ドを開裂分離しお䞋蚘匏のアミノ化誘導䜓を埗
た。
䞊蚘誘導䜓を同定するために、薄局クロマトグ
ラフ法及び電気泳動法を甚い䞋蚘結果を埗た。
薄局クロマトグラフ法 詊料30Ό シリカゲルブリンクマンガラス板、×20
cm、厚さ0.25mm −ブタノヌルピリゞン 酢酞HOAc氎301512 酢酞゚チルEtoAcピリゞン 酢酞氎 酢酞゚チル−ブタノヌル酢酞 氎 スプレヌ詊薬パりリ詊薬、ニンヒドリン 及び2 化合物の皮類 Ac−Tyr−Asn−Ile−Gln−Lys Tyr Asn−Ile−Gln−Lys−NH2 薄局クロマトグラフ法    0.47 0.87 0.54 0.48 0.87 0.37 電気泳動法 陰極ぞ移動したペプチド −1.35cm −6.60cm 電気泳動法 ワツトマンmm厚濟玙11.5cm×56.5mm 詊料100Ό PH5.6、ピリゞン−アセテヌト緩衝溶液、
100V、時間 スプレヌ詊薬パりリ詊薬及びニンヒドリン 参考䟋のアセチル化ペンタペプチドをト
りミヌTwmoey溶液䞭1Όmlの濃床で甚
いた時、実斜䟋の基本圢ペンタペプチドに匹敵
する最倧及び最小掻性床を瀺した。
参考䟋のアミド化ペンタペプチドは、ト
りミヌ溶液䞭1Όmlの濃床で甚いた時実斜䟋
の基本圢ペンタペプチドに匹敵する掻性を瀺し
た。
〔参考䟋 〕 実斜䟋の方法に埓い合成し、暹脂に付着しお
いる状態の基本圢ペンタペプチドを゚ステル亀換
条件䞋メタノヌル䞭でナトリりムメトキシドで゚
ステル亀換しお暹脂から開裂分離させた。保護基
をすべお陀去しお䞋蚘匏を有するステル化生成物
を埗た。
〔参考䟋 〕 実斜䟋ず同様にしお合成したペプチドのゞ゚
チルアミン誘導䜓を参考䟋のメチル゚ステル化
合物から補造した。即ち、参考䟋のメチル゚ス
テルをゞメチルホルムアミド䞭でゞ゚チルアミン
ず反応させお、䞋蚘匏のゞアミノ眮換アミドを埗
た。
このゞ゚チルアミン誘導䜓は、実斜䟋の暹脂
基板に付着しおいる基本圢ペンタペプチドをゞ゚
チルアミンず反応させお暹脂から前蚘ペンタペプ
チドを開裂分離させる反応からも同様に埗るこず
ができる。暹脂から陀去しか぀保護基を陀いお埗
られる生成物はゞ゚チルアミド誘導䜓である。
〔参考䟋 〕 本参考䟋では、実斜䟋の基本圢ペンタペプチ
ドを臭化゚チルず反応させお−゚チルチロシン
誘導䜓を埗た。この反応を行うにあた぀お、リシ
ンのα−アミノ基をε−−クロルベンゞルオキ
シカルボニル基で保護し、TYRの末端アミノ基
をゞクロルメタン䞭でトリフルオル酢酞ず反応さ
せお遊離させた。この保護䞭間䜓をアルキル化条
件䞋で化孊量論量の臭化゚チルず反応させた。
LYSα−アミノ酞から䞊蚘保護基を陀去しお䞋蚘
匏を有する眮換ポリペプチドを埗た。
〔参考䟋 〕 本参考䟋では、参考䟋の゚チルアミノポリペ
プチドのアミノ化誘導䜓を埗た。即ち、基本圢ペ
ンタペプチドを暹脂基板に結合させたたた参考䟋
の反応を行い、基板から分離させずに−゚チ
ル誘導䜓を埗た。次いで、暹脂基板に付着しおい
るこの䞭間䜓生成物をゞメチルホルムアミド溶媒
䞭無氎アンモニアで凊理し暹脂から分離させ䞋蚘
匏のアミドポリペプチドを埗た。
〔参考䟋 11〕 本参考䟋では、参考䟋ず同様にしお合成し、
暹脂基板に付着しおいるたたのアシル化ペンタペ
プチドをアミノ化反応条件䞋で無氎アンモニアず
反応させおこの化合物を遊離させ、保護基を陀去
しお䞋蚘匏のポリペプチドを埗た。
以䞊、本発明は掻性郚䜍ずしお前述の特異なア
ミノ酞構造単䜍を有する新芏なポリペプチドを提
䟛するものである。このポリペプチドは、胞線分
化抗原TL及びTHY−Ξの獲埗により枬定
されるような−先駆䜓现胞ず现胞の識別の目
安である補䜓の受容䜓の獲埗により枬定されるよ
うな−先駆䜓现胞ずを分化するこずができる。
埓぀お、ペプチドは胞線機胜及び免疫分野、䟋え
ば先倩性胞線欠損の治療、に有効である。このペ
プチドは非垞に䜎濃床で掻性である。
本発明はいく぀かの奜たしい実斜態様に぀いお
説明しおきたが、これらの態様に本発明が限定さ
れるものでない。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  アミノ基を保護されおいる−リシンを䞍溶
    性高分子暹脂に゚ステル化しお共有結合で結合
    し、α−アミノ保護基を−リシン郚から陀いお
    α−アミノ保護圢−グルタミンず反応させお
    −グルタミンを−リシン−暹脂ず結合させ、
    −グルタミン郚からα−アミノ保護基を陀いおα
    −アミノ保護圢−む゜ロむシン又は−アラニ
    ンず反応させお−む゜ロむシン又は−アラニ
    ンを−グルタミン−−リシン−暹脂に結合さ
    せ、α−アミノ保護基を陀いおα−アミノ保護圢
    −アスパラギン又は−アラニンず反応させお
    −アスパラギン又は−アラニンを−む゜ロ
    むシン又は−アラニン−−グルタミン−−
    リシン−暹脂に結合させ、α−アミノ保護基を陀
    いおα−アミノ保護圢−チロシン又は−アラ
    ニンず反応させお−チロシン又は−アラニン
    を−アスパラギン又は−アラニン−−む゜
    ロむシン又は−アラニン−−グルタミン−
    −リシン−暹脂に結合させ、 䞋蚘匏を有するペプチド䞭間䜓であ぀お、 䞊匏で、R1R2及びR3はアミノ酞の保護基で
    あるペプチド䞭間䜓を圢成し、 党おのアミノ保護基を前蚘ペプチド䞭間䜓から
    陀き、ペプチドを高分子暹脂から分離しお䞋蚘
    匏、 で衚わせるペンタペプチド化合物の補造方法。  R1は−−ゞクロルベンゞルR2は
    ε−−クロルベンゞルオキシカルボニル、及び
    R3は−ブチルオキシカルボニルであるこずを
    特城ずする特蚱請求の範囲第項に蚘茉のペンタ
    ペプチド化合物の補造方法。  反応アミノ酞類の反応性偎鎖は反応期間䞭保
    護されおいるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第
    項に蚘茉の方法。  高分子暹脂はセルロヌス、ポリビニルアルコ
    ヌル、ポリメタアクリレヌト、スルホン化ポリス
    チレン及びスチレンずゞビニルベンれンずのクロ
    ルメチル共重合䜓からなる矀より遞ばれる暹脂で
    あるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第項に蚘
    茉の方法。
JP60111321A 1977-11-15 1985-05-22 ペンタペプチド化合物の補造方法 Granted JPS6150999A (ja)

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FR2408581B1 (ja) 1983-07-22
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