JPS5951353A - 液体中のハプテン又は抗原を分析するための不均一系免疫分析方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、液体中のハシテン又は抗原（対象物質）の存
在を、特異的結合（特定結合）の相手物質に対する該対
象物質の親和性に基づいて測定するための方法及びｉｌ
ｌ：薬に関するものである。更に詳しくは、本発明は、
標識物質として放射性物質もしくは部分変形した酵素を
用いない特異的結合（特定結合）による分析に用いる方
法及び試薬に関するものである。なお、本明細書中では
「特異的」と「特定」とを同義に用いている。

液体中の低濃度の物質の存在を検出するための便利かつ
信頼性が高く、更に危険性のない方法への要望があるこ
とは明白である。このことは、１０−１１モル濃度程度
の低濃度で体液中に存在する成分が病理学上重大である
臨床化学の分野に於いては、特に該当する。そのような
低濃度の物質を検出することの困難さは、通常は試料の
量が非常に制限される臨床化学の分野に於いて増加する
。

以前に於いては、物質は、その検出される物質が必ず反
応体であるような反応系に基づいて、液体中で検出され
ていた。未知物質の存在は、反応生成物の出現もしくは
既知反応体の消失によって検出されている。ある場合に
於いては、そのような分析方法は、生成物の出現もしく
は反応体の消失の速度あるいは生成した生成物もしくは
平衡に達した際に費やされた反応体の総量の測定を行な
うことにより、定１′的にもなシ得た。それぞれの分析
の反応系は必然的に小さなグループの物質の検出のみＫ
Ｒ定されるか、あるいは特異性のないもののいずれかで
ある。

特異性が高く、かつ広範囲の物質の検出に応用できる分
析系の研究により、放射性免疫分析法が生み出された。

この方法によると、検出対象の物質の放射性標識を付さ
れたもののｉ−は、未知のものに特異性を有する限られ
た量の抗体について、未知のものと競い合わされるよう
Ｋされる。そして、抗体に結合されるようになる標識を
付されたものの量は、存在する未知物質の水準に逆比例
して変化する。放射性免疫分析技術に於いては、本来、
抗体に結合されるようになる標識を付された形の検出対
象物質（束縛相）を、そのような結合・を起さない物質
（遊離相）と分離することが必要となる。この必要とさ
れる分離を遂行するための種々の手段が、例えは米国特
許第３．５０５．０１９号、３．５５５，１４３号、３
，６４６，３４６号、３，７２０．７６０号、及び３，
７９３，４４５号に示されるように開発されてきた。し
かし、それらの手段は全て、束縛相と遊離相の効率的な
分離を確実にするために口過、遠心分離、洗浄もしくは
カラムの溶出などの少なくとも一つの人手による操作工
程を必要としている。そのような分離は応々にして、束
縛相を含む不溶性部分と遊離相を含む液体部分から成シ
、各部分中の放射性活性標識の量が標識化物質の結合の
大きさの関数、従って検査された試料中の対象物質の量
の関数となるようにされている系を形成させることによ
シ行なわれている。科学の本分野に於いて一般に用いら
れ、かつ本明細書に於いて用いられる「不均一系」とは
、束縛相と遊離相の分離が行なわれることが含まれる特
異的結合分析を意味している。このような分離は、束縛
相中の標識化物質が遊離相中のｍ識化物質と区別がつき
にくい系の特異的結合分析を行なうときに必要である。

放射性物質を扱うための危険性及び困難さのために、放
射性免疫分析法と同程度に感度良く迅速で、しかし結合
反応を監視検出するための手段として放射性以外の性質
を利用する使いやすい特異的結合分析系を案出する多く
の試みがなされてきた。本明細書中に以下更に充分に記
述されるように、放射性原子もしくは分子の代カに標識
物質として利用されてきたものとしては、酵素、蛍光物
質及びバクテリオファージのような種々のものが含まれ
る。

標識物質として用いられる酵素を用いて開発された方法
の例としては、米国特許第３，６５４，０９０号、第３
，７９１，９３２号、第３．８３９，１５３号、及び第
３，８５０，７５２号、そしてジャーナル・オプ・イミ
ュノロジカルψメソツズ、　１　：２４７（１９７２）
及びジャーナル・オプ・イミュノロジー、１０９：１２
９（１９７２）に記載された方法が挙げられる。記載さ
れた各々の方法に於いては、酵素は検出対象の物質（リ
ガンド）もしくはその結合の相手物質のいずれかに化学
的に結合されておシ、試料と共装置いた後に、不溶部分
もしくはリガンド部分のいずれかに含まれる酵素活性の
量が試料中のリガンド（対象物質）の量の関数となるよ
うに適当な不均一系特異的結合反応の図式が組み立てら
れる。従って、酵素結合体の合成及び特性付けに関連す
る問題が、この解決方向の重大な隘路となる。

酵素付加免疫分析として興味あるものが米国特許第３，
８１７，８３７号に記載されている。この方法は分＃（
即ち不溶性部分と液体部分）特異的結合反応系を用いる
必要がなく、従ってそれのための分離操作を必要としな
い。これは、酵素付加された対象物質が、対象物質の該
結合の相手物質との反応によｐ酵素活性が阻害されるよ
うに作られているからである。こうして、酵素付加され
た物質の束縛（結合）状態にあるものと、遊離（自由）
状態にあるものとの比を、酵素活性の変化を測定するこ
とによシ決定する。しかしながらこの方法には、特性の
優れた酵素付加結合体の調製及びこの系の基本方式に適
合する酵素を見いだすことの困難さがある。

英国特許第１．３９２，４０３号及びフランス国特許第
２．２０１．２９９号には、標識物質として分光々度測
定に於いて活性な物質の不活性な前駆体を用いる特異的
結合分析が記されている。特異的結合反応系と共に試別
全保持した後、不溶性部分と液体部分を分離し、試料中
で検出されるべき対象物質の量の関数であるところの液
体部分に存在する標識物質の量は、不活性な標識物質を
色変化もしくは蛍光活性物質に変え、次いでこれを通常
の手段で計測することから成る反応工程によシ測定され
る。

異なったタイプの標識物質を用いる他の特異的結合分析
方法は以下のように開示されている。即ち、米国特許第
３．８５０，５７８号には標識手段として電子スピン共
鳴を用いることが開示されており：米国特許第３，９０
１，６５４号には標識手段として蛍光発光の停止及び増
大を用いることが開示されている。米国商務省の国家技
術情報サービス（ＮＴＩＳ）の報告ｍＰＢ　−２２４，
８７５（１９７３）には、化学発光反応によシ監視検出
する不均一系分析系で標識物質としてヘミン魯クロリド
を用いた試み（成功していない）が記されている。ネイ
チャー。

２１９：１８６（１９６８）には、ある種の放射性免疫
分析操作について非常に詳しく記載されておシ、更に標
識物質として放射性同位元素の代わシに補酵素及びビー
ルスを用いることの可能性について、非常に概括性な性
質として付随的に言及している。しかし著者は、そのよ
うな代夛の標識物質を用いて如何に分析を行なうかＫつ
いて、あるいは実際問題として、そのような分析法が突
流可能であるかどうかの点については教示していない。

更に背景を記せば、「競合蛋白−結合分析法の原理Ｊ　
（Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖ
ｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ａｓ５ａｙｓ）
オデル及びドウディ編（ジエー・ビー・リッ被ンコット
・カンパニー、フイラデイルフイア、１９７２）には、
種々の既知の分析方法及び特異的結合分析用の標識とし
て用いられてきた様々な物質や特性などが広範囲に議論
されている。

これまでに多くの新しいタイプの特異的結合分析方法が
示唆され研究されてきたが、放射性免疫分析法と種々の
酵素付加免疫分析法が最も広く用いられ改良されるもの
として残ってきた。しかし、両方のタイプのシステムは
明白な欠点を有している。即ち、放射性免疫分析に於い
ては、放射性物質の取扱いが危険で、注意を必要とし、
酵素付加免疫分析に於いては、有用な酢素付加結合体ヲ
調製するのが難しい。

従って本発明の目的は、不便な放射性物ηもしくは部分
変形酵素を標識物質として使用しない、液体中の対象物
質（リガンド）を検出するための新規な方法及び試薬を
提供することである。

更に、先行技術の方法よｐも更に応用範囲が広く便利な
不均一系特異的結合（特定結合）分析方法及び試薬′ｆ
：提供することも目的の一つである。

対象物質もしくはその特異的結合の相手物質に先行技術
方法の酵素よりも更に都合よく組み合わせ結合すること
のできる標識物質を用いる不均一系特異的結合分析方法
及び試薬を提供することも本発明の目的の一つである。

種々の広範囲の鋭敏な反応系を用いることによシ、先行
技術方法に於ける酵素の活性のいかなる変化よシも更に
都合良くいかなる活性の変化についても検出できる標識
物質を含む結合体を用いた不均一系特異的結合分析方法
及び試薬を提供することもまた本発明の目的の一つであ
る。

本発明は、非常に便利で、応用性が広く、かつ鋭敏な不
均一系特異的結合分析方法及び試薬を、前以って決めら
れた反応の成分として賦寿された反応活性を示す物質を
標識物質として使用することに基礎を置いて提供するも
のである。そのような物質はここに於いて「反応体」と
して示される。

本発明の標識物質は、従来のいかなる不均一系特異的結
合分析方法に於いても使用することができる。束縛相及
び遊離相の各々に存在する反応体についての量は、特異
的結合反応を監視検出するための手段として働く前以っ
て決められた反応系を反応体と共に形成する少なくとも
一種の試薬と各相を接触させることにより測定される。

定量的な測定は、既知量の測定対象の対象物質（リガン
ド）を含有する液体で同じ方法により得られた値と一つ
の相で測定された反応体の活性とを比較することによシ
行なわれる。

−”、’　　　　　　、　　　　＋　　。

７４目片改良された液体中のハゲ テン又は抗原を分析するための方法は、一般には、次の
（ａ）、（ｂ）及び（ｅ）工程を含んでいる。即ち、（
ａ）試験液体を、予め定められた特性を有する標識物質
とハプテン若しくは抗原、若しくはそれに対する抗体又
はそれに対する特異的結合の相手物質との結合体からな
る試薬と接触させる工程、ここで、該試薬と結合反応糸
を生成する対象物質（リガンド）が標識化された結合体
の束縛相又は遊離相を生ずる； （ｂ）該束縛相と該遊離相とを分離する工程；及び （Ｃ）分離された層の−における、該液体中のハプテン
又は抗原の指標としての特性を測定する工程 からなる不均一系免疫分析方法であって、結合体中の標
識物質が、酵素触媒反応の基質であることを特命とする
ものである。

この後に更に詳しく述べるように、本結合反応系は、放
射性免疫分析系や不拘−系酵素一免疫分析系に於いて用
いられるような既知の通常の技術のいかなる形をとるこ
ともできるであろう。

監視検出反応は酵素触媒が用いられることが好ましい。

通常は、監視検出反応は、結合体中の反応体に対して高
度に鋭敏なものから選ばれる。この点に於いて、発光も
しくは蛍光発光反応系は非常に有用である。特に好まし
いのは循環反応系で、反応体が循環する物質である反応
系が特別に好ましい。好ましい循環反応系の中でも、酵
素を触媒として利用する系が特に有利である。本発明に
おける結合体中の反応体は酵素系の反応体、即ち、酵素
触媒反応における酵素基質である。

本明細書に於いて用いられる用語は以下のよりに定義さ
れる。「リガンド」、「対象物質」もしくは「対象物質
（リガンド）」は、物質もしくは一群の物質で、その液
体中の存在もしくは量が測定されるものである。「対象
物質（リガンド）の特異的結合の相手物質」とは、物質
もしくは一群の物質で、他の物質を排除して対象物質に
対して特定の結合の親和性を示すものである。「対象物
質の特異的結合に関する類似物質」とは、物質もしくは
一群の物質で、対象物質への特異的結合の相手物質の結
合親和性に関して対象物質と本質的に同じ挙動をとるも
のである。

本発明の不均一系免疫分析試薬は、液体中のハプテン又
は抗原を分析するための： 予め定められた特性を有する標識物質とハシテン若しく
は抗原、若しくはそれに対する抗体又はそれに対する特
異的結合の相手物質との結合体からなル、かつ、試薬と
ハプテン又は抗原が結合反応系を形成して標識化された
結合体の束縛相又は遊離相を生成し、該束縛相若しくは
該遊離相のいずれかの特性が、該液体中のハプテン又は
抗原の１の関数である不均一系免疫分析用の試薬であっ
て、 結合体中の標識物質が酵素触媒反応の基質であることを
特徴とするものである。

特異的結合試薬は種々の形をと夛得る。一般に、そのよ
うな試薬は三種の基本成分を含有している。

即ち（］）検出対象物質（リガンド）、＋２１リガンド
の特異的結合の相手物質、及び（３）、普通は標識化さ
れた形の（ａ）リガンド、（ｂ）リガンドの特異的結合
に関する類似物質もしくは（ｅ）特異的結合の相手物質
である標識化成分、である。この結合反応の成分は同時
に一緒にされるか、おるいは順次添加される。そして適
当な保持（保存）期間の間に、標識化成分は、例えば結
合の相手物質に束縛（結合）された標識化成分の量と不
束縛（不結合）の標識化成分の量との比率のような結合
の量、大きさ等が、存在する対象物質の量の関数となる
ように、対応する競合結合の相手物質に束縛（結合）さ
れる。

以下に本発明の方法全実施する場合に用いられる種々の
結合反応の概要のいくつかについて簡単に記述する。

放射性免疫分析法や不均一系酵素免疫分析法のような通
常の不均一系特異的結合分析法に於いては、放射活性や
酵素活性のような標識化結合体に於ける標識特性は、束
縛（結合）状態及び遊離（自由）状態の結合体にとって
本質的には同じである。一方、本発明方法によれば、標
識物質としての反応体の活性は、場合によっては、標識
化結合体の結合に影Ｉｌｌ受ける。そのような状況に於
いては、監視検出反応は、対象物質が液体中に存在しな
い場合、或は有意でない程度に少ない量で存在する場合
、比較的に一定の性質を示す。液体中に対象物質が存在
する時は、監視検出反応の特性もしくは性質が変化する
。一般には、結合体中の反応体の活性は、反応体が監視
検出反応に関与することができる量もしくは速度となる
でろろう。

このようにして、監視検出反応の性質は液体中の対象物
質の存在により、通常はその全反応速度、もしくは一種
もしくは数種の生成する反応生成物の平衡量について変
化する。この場合に於いて一般には、監視検出反応に関
与する結合体の反応体の活性能力は、それが結合する特
異的結合物質と該特異的結合物質の特異的結合の対応物
質との間の反応によシ低下する。即ち、遊＃（自由）状
態の結合体は監視検出反応に於いて、束縛（結合）状態
にある場合よシも活性が太きい５、次に示す概略式には
、以下の記号が用いられる。

記号　　　　　　　　定　　　義 Ｌ　　　検出対象物質 ■　　　対象物質もしくはその特異的結合に関する類似
物質 Ｂ　　　対象物質の結合の相手物質 ＊　　　標識物質、例、反応体 ト　　　不溶性の相 一→　　適当な分離に続く保持期間 （ｔｉｍ）　　　限定量；選択された保持期間中に選択
された反応条件下で、結合可能箇所の 全てに結合することのできる量よシも 少なく存在すること；例、他の成分と 結合を競い合う成分 （ｅｘｅ）　　　過剰量；選択された保持期間中に選択
された反応条件下で、結合可能箇所の 全てに結合することのできる量よシも 多く存在すること １、　結合分析法 ａ）　Ｌ十の十Ｂ（Ａｉｍ）→十Ｂ　　もしくは［Ｆ］
　の不溶化剤 これは従来からの競合結合方法によるものである。この
不溶化剤の例としては、特異的沈降抗体、特異的不溶化
抗体、Ｂもしくは■８が蛋白性物質である場合には硫酸
アンモニウムのような蛋白質沈殿剤、Ｂもしくは■”が
小さな吸収され得る分子である場合には、デキストリン
で被接したチャコール（木炭）が挙けられる。同様な系
についての記述はバイオケミカル・ジャーナル、８８：
１３７（１９６３）及び米国特許第３．８３９，１５３
号に見られる。

ｂ）　　Ｌ　　＋　　（ｐ”十　　ト３３（ｔｉｍ）→
この方法は通常固相（ソリッド・フェーズ）技術と呼ば
れる。同様な放射性免疫分析法及び酵素免疫分析法の技
術についての記述は米国特許第３．５０５，０１９号、
第３，５５５，１４３号、第３，６４６．３４６号、及
び第３，６５４，０９０号に見られる。

ｃ）Ｌ十Ｂ＊＋Ｉ−■（ｔｉｍ）→ 参考文献：米国特許第３．６５４，０９０号ｄ）　Ｌ十
ト■十Ｂ＊（ｔｉｍ）→ 参考文献：米国特許第３．８５０，７５２号ａ）　Ｌ　
十Ｂ（ｅｘｅ）→十■＊（ｅｘｅ）−十　Ｂもしくは■
８の不溶化剤 順次飽和技術に於いては、最初の保持期間後に残存する
Ｂの結合箇所の一部もしくは全部が標識化成分に結合さ
れている。

ｂ）　　Ｌ十　トＢ（ｅｘｃ）→十■＊（ｅｘｅ）→同
様な放射性免疫分析法及び酵素免疫分析法の技術につい
ての記載は、米国特許第３　、７２０　、７６０号及び
ジャーナル・オプ嗜イミュノロジー、２０９：１２９（
１９７２）に見られる。

ｃ）　　Ｌ　十Ｂ＊（ｅｘｅ）→十Ｆ（ｐ−（ｅｘｃ）
→Ｌ　十　　トＢ（ｅｘＣ）　　→　Ｂ＊（ｅＸＣ）→
サンドイッチ分析法では、不活性化された結合の相手物
質に結合したリガンド（対象物質）分子の一部もしくは
全部が標識化成分に結合されている。

参考文献：米国特許第３　、７２０　、７６０号４、　
固相希薄化分析法 Ｌ　十　ｃ十　　ト非特異的）→ ＋　　Ｂ（ｔｉｍ）　　→ この技術に於いて、リガンドと標識化成分は非特異的結
合剤に結合され、その比例する量はその後リガンド及び
標識化成分に更に大きな親和性を示す結合の相手物質と
の結合によシ解離する。

この技術の最も有用な形としては、米国特許第３．６５
９，１０４号に記載された非特異的結合剤のカラムを用
いる方法がある。そのような技術は、除去されない限り
競合結合反応を妨害する試料中の内因性結合物質にリガ
ンドが結合している場合に有用である。非特異性結合剤
に結合された後、内因性結合物質は適当な洗浄により除
去される。

通常の不均一系分析系に含まれる変数に関する記載、例
えば分析方法及び代替できる分離技術の更に詳しい記述
等については、「競合蛋白−結合分析法の原理」（前出
）を参考文献として挙げることができる。

他の添加順序及び他の結合反応の構成もまた、ここに述
べた発明概念から逸脱せずに不均一系特定結合分析を行
なうために考案されるであろうことは予測されることで
ある。

前取って決められた監視検出反応の成分の結合体の反応
体の活性を束縛相もしくは遊離相同で評価する工程は、
監視検出反応を結合体の反応体と共にその相を形成する
少なくとも一種の物質と接触させ、次いでその反応の特
性を測定することＫより、都合良く達成される。監視検
出反応は一つのあるいは一連の複数の化学的に変形もし
くは転換する反応から成る。

酵素触媒の反応系が利用される場合、その系は結合体の
反応体と更に少なくとも一種の酵素を含むものであシ、
また基質や補酵素の如き酵素反応体の一種もしくは数種
を含んでも良い。そのような酵素触媒反応系は、単一の
簡単な酵素反応を含むか、又は複雑な一連の酵素反応及
び非酵素反応を含むであろう。例えば、酵素反応系は単
一の酵素触媒による劣化もしくは解離反応から成るかも
しれない。そのような系に於いて結合体の反応体は、劣
化もしくは解離を起こす酵素基質であり、選はれた束縛
相もしくは遊離相と接触するために必要な反応系の唯一
の成分は、劣化もしくは解離反応に触媒作用を及ばず酵
素である。要に襟維な酵素触媒の反応系は二相もしくは
それ以上の反応体が関与する単一の酵素反応でも良く、
あるいは数種の反応体が関与していても良い（但し、こ
の反応の内の一つは酵素触媒によるものである）。

そのような系に於いて、結合体の反応体は酵素触媒によ
る反応の酵素反応体の一つであり、選ばれた束縛相もし
くは遊離相は、結合体中のものとは別で選ばれた酵素触
媒反応系を形成するのに必要な適当な酵素及び反応成分
と接触せしめられる。

この酵素触媒反応系は、微生物の如き生物体の細胞の生
態系のように複離な生化学系を含むこともまた意図され
ている。例えば、特定な微生物の成長に必須な栄養物質
が結合体中の反応体として選ばれても良い。反応体の唯
一の栄養物質源が結合体である環境内にそのような微生
物が置かれた場合、反応体の活性は微生物の特性、例え
ば微生物の生長速度、を監視検出することによシ測定で
きる。

結合体中の反応体と共に監視検出反応系を形成する適当
な反応成分は、特定結合反応の開始の前、又はそれと同
時に、あるいはそれに引き続き、単独で或は結合した形
で選ばれた分離された相（分離相）に接触せしめられる
。特定結合反応の開始後、監視検出反応の必須成分の一
部もしくは全てを含む反応混合物は通常、得られた束縛
相及び遊離相の分離の前の前身って決められた時間培養
される。分離の後、監視検出反応に必要で、未だ選ばれ
た分離相中に充分な量存在していない成分をこれに加え
る。そしてその中の反応体の活性を評価測定して、液体
中の対象物質の存在もしくａ量の指標とする。

監視検出反応の反応速度が、選ばれた束縛相もしくは遊
離相中の反応体の活性を評価測定するのに用いられる特
性である時（これが好ましい）には、その速度は通常、
反応体の消失速度もしくは反応生成物の出現速度を測定
することによシ決められる。そのような測定は、通常の
クロマトグラフ、重量分析、電位差滴定、分光光度測定
、蛍光測定、濁度測定、容量測定等の分析技術を含む広
範囲の種々の方法によ多行なわれる。本方法は第一とし
て低濃度の対象物質の検出を目的として考えられている
ので、非常に感度の良い反応系が本発明の新規な特定結
合反応系と組合わせて用いるように開発された。

好ましい鋭敏な監視検出反応の他の型としては、蛍光発
光を含み、かつ酵素触媒により得られる現象を含むもの
がある。そのような反応系に於いては、結合体中の反応
体は酵素反応に於ける基質であシ、その酵素反応が、結
合体中の基質と区別される蛍光発光性を有する生成物を
生成するものである。そのような酵素触媒による反応系
のための一般的な反応式は以下の通シである。

上式に於てＸは酵素によシ開裂する結合もしくは連結（
橋かけ）基、例えばエステル基もしくはアミド基、を表
わし、２は利用される特定結合反応技術によシ対象物質
（リガンド）、対象物質の特定の結合に関する類似物質
もしくは対象物質の特定結合の相手物質のいずれかとな
る特定結合物質である。この型の反応系で用いることの
できる特定の結合体は、フルオレセイン、ウンベリフェ
ロン、３−インドール、β−ナフトール、３−ビリドー
ル、レゾルフィン、ローダミンＢ、その他の酵素によシ
開裂可能な種々の誘導体である。そのような誘導体の可
能な構造式の例は以下の通シである。

上式ニ於イテ、ＲｌＨ−ＯＨ又１ｄ　−Ｘ−Ｚ　　（）
ｌび２は前述と同じ）であり、Ｒ２は−Ｘ−Ｚ、そして
Ｒ３は−Ｈ又は−ＣＨｓである。

本発明は、特定結合の相手物質が存在するいかなるハプ
テン又は抗原（対象物質）の検出にも適用することがで
きる。対象物質は通常、ペプチド、蛋白質、炭水化物、
糖蛋白質、ステロイド、又は生物系内に特定結合の相手
物質が存在するか或は相手物質を合成することができる
他の有機分子である。この対象物質は、機能面の用語で
言えば、抗原、その抗体、ハプテン（付着体）、　その
抗体及びビタミン並びにそれらの受容体及び結合物質か
ら成る群よシ選ばれる。本発明を用いて検出することの
できる対象物質を特に例示すれば、フェリチン、プラデ
キニン、プロスタグランディン及び腫瘍特異性抗原のよ
うな抗原及びノ１ブテン；ビオチン、ビタミンＢ１２　
、葉酸、ビタミンＥ及びアスコルビン酸のようなビタミ
ン；ミクロソーム抗体、肝炎抗体、アレルゲン抗体のよ
うな抗体；そしてチロキシン結合グロブリン、アビジン
、内因子及びトランスコバラミンのような特定結合受容
体等が挙げられる。

本発明の結合体に於いて、反応体は、その反応体の測定
可能な量の活性が維持されるような形で、特定結合物質
（選ばれた分析方法に依り、対象物質、対象物質の特定
の結合に関する類似物質もしくは対象物質の特定結合の
相手物質のいずれかである）に結合もしくは組合わされ
る。反応体と特定結合物質との結合は、活性を有する反
応体を用いる前以って決められた監視検出反応が、上述
の発光反応系及び循環反応系に於けるような結合を化学
的に壊すように、設計されていない分析の条件下では、
通常実質的に変更できない。しかし、ある場合には、そ
のような結合は、壊されるように設計されるか、あるい
は反応活性の変化を評価するための手段としての選ばれ
た監視検出反応によシ影響を与えられる。そのような場
合として、本発明の酵素による蛍光発生基質の反応系が
ある。

反応体は特定結合物質に直接に組み合わされ結合しても
良く、その結果結合体の分子量は反応体と特定結合物質
の全分子量に等しいか、又は小さくなるようになる。し
かし、通常は、反応体と特定結合物質は、１から５０個
、好ましくは１から１０個の炭素原子もしくは窒素、酸
素、硫黄、燐その他のような複素原子を含む橋かけ基に
より連絡されている。１個の原子を含む橋かけ基の例と
しては、メチレン基（炭素原子１個）及びアミン基（複
素原子１個）がある。橋かけ基は通常１０００を越えな
い分子Ｍを持っておシ、好ましくは２００よシ小さいも
のである。橋かけ基は炭素原子もしくは複素原子の鎖、
もしくはそれらを組合わせたものを含んでおシ、通常は
エステル、アミド、エーテル、チオエステル、チオエー
テル、アセタール、メチレンもしくはアミンの如き基の
形をした連結基によシ、反応体と特定結合物質もしくは
その活性誘導体とに結合されている。

本発明の結合体中の反応体は、前以って決められた監視
検出反応の成分として、賦与された（例えば、一定の又
は既知の）反応活性を有する物質である。更に詳しく言
えば、本明細曹による開示に於ては、「反応体」及び［
反応活性を有する物質」とは、自身とは異なるーもしく
は数個の生成物をもたらす、限定され、かつ測定可能な
化学的な変形（変質）をすることができ、更にその反応
体と化学物質（例、他の反応体、触媒、そのような化学
的な変形もしくは変質に関与するような他の型の物質）
の如き反応開始手段との相互作用により、電磁的放射、
熱エネルギー、もしくは音波エネルギーをもたらす物ａ
を意味する。従って本明細書に於いて「反応体］と定義
した物質群の内には通常の無機及び有機試薬及び生化学
的物質が含まれる。しかし、触媒（酵素を含む）や放射
性アイソトープのように監視検出反応に於ける反応体で
ないものは除外される。特定の化学物質は化学的環境に
従って種々の形で機能することかできるため、一つの化
学物質が種々の異なった分類に分類されることがあるが
、そのような物質が不明ＩＩ書の開示に於いていかなる
機能を有するかが決定されるのは、不明Ｍｉ１層１に記
された選ばれた監視検出反応に関するその物質の反応性
によるものであるということが認識されるであろう。

本発明の反応体は、酵素基質もしくはその活性を有する
部分変形物質もしくは誘導体のような酵素反応の反応体
である。酵素基質とは、酵素を触媒として化学的変形（
変質）をすることのできる化合物もしくは部分である。

基質が結合体の反応体として用いられる場合、その好ま
しい分子量は９０００よシ小さく、更に好ましくは５０
００よシ小さいものとなる。その程度の大きさの基質は
、分子としての複雑さが少ないため、結合体を作るため
に用いるのに特に都合が良い。更に、特定結合物質に結
合された時に、その程度の基質の活性は結合体とその特
定結合物質の特定結合の対応物質との反応により容易に
影響を受ける。本発明に於いて用いること全意図してい
る酵素基質の例としては、フルオレセインやウンベリフ
ェロンの誘導体のような前述した酵素により開裂する蛍
光物質；ｐＨ指示薬；及び分光光度測定用の指示色素（
ｆＦに発色型）が含まれる。

本発明の一形態として、対象物質が含有されていると考
えられる液体と組合わされる特定結合反応の成分は液体
もしくは固体の形である。本分析方法は、試験管のよう
な標準の実験室用の容器中で、固体もしくは液体の特定
結合反応の成分及びそれに加えられる反応系の成分によ
シ実施される。

−もしくは数種の特定結合反応の成分及び／又は−もし
くは数種の監視検出反応の成分は、担体に包含されてい
ても良い。一つの考え方として担体は、それらの成分の
一種もしくは数種をその内側部分に例えば液体もしくは
ゆるい固体の形で、あるいはその内部表面の被膜の中に
、含有する試験管又はカプセルのような液体保持用容器
でもよい。他の考え方として担体は、試験対象の液体に
関して不溶性かつ多孔性で、好ましくは吸収性であるマ
トリックスの形態であってもよい。そのようなマトリッ
クスは例えば吸収性紙；重合体のフィルム、膜、けばも
しくは塊状物；ゲル及びその他の形である。そのような
形の場合核装置は、試験対象液体を接触させ、特定結合
反応及び／又は監視検出反応を行ない、かつ必要な分離
を行なわしめ、そして得られる反答を観察するために都
合のよい手段を提供する。

試験対象となる液体は天然に存在するか或は人工的に作
られたものであって、ノ・ゾテン又は抗原（対象物質）
を含むことが知られているか或は推定されるものである
。通常は生物体の液状物又は、それを希釈もしくは他の
処理を施して得られた液体である。本発明方法により分
析することのできる生物体の液状物には、血清、プラズ
マ、尿、羊水、脳液、せきすい液等が含丑れる。細胞等
の固体材料もしくは気体状のもの等の他の材料も、固体
もしくは気体を溶解させるか又は固体を抽出する等の方
法によシ液体の形にして分析することができる。

先行技術の分析系とは対照的に、結合体中の標識付与物
質の反応活性と同じか又は類似した反応活性を有する物
質を含有する生物体の液体に於ける対象物質を、バック
グラウンドに邪魔されることなく分析することができる
。内因性バックグラウンド反応体活性は種々の方法で容
易に除くことができる。生物体の液体は、内因性反応体
活性を選択的に破壊するように処理することができる。

そのような処理としては例えば、内因性活性を化学的に
破壊する清浄剤を作用させ、次いで該清浄剤の破壊作用
を不活性にする処理を行なう処理が挙けられる。

本発明を以下において実施例によシ説明するが、これら
は本発明を制限するものではない。

実施例１ ビオチン−ウンベリフェロン結合体の製造（２−オキソ
−２−Ｈ−１−ベンゾビラン−７−イル）−５−４シス
−ヘキサヒドロ−２−オキソ−ＩＨ−チェノ−（３，４
−ｄ）−イミダゾール〕酪酸エステル ３００ＷＭｉ（１，２ミリモル）の無水ビオチンを２０
艷の乾燥ジメチルホルムアミドに溶かした溶液を一１０
℃で乾燥窒素下で撹拌し、次いで０．１７ｔｎｌ（１，
２ミリモル）の乾燥トリエチルアミンを加える。新たに
蒸留したクロルギ酸エチル（３ｍｌの乾燥エーテル中１
１４１　ｍｌ　）を滴下する。３０分間撹拌しながら保
持した後、得られた沈殿を乾燥窒素下で戸別し、直ちに
一１０℃に冷却する。戸別された残査に、１９７１ｎｇ
（１，２ミリモル）の無水７−ヒドロキシクマリン′ｆ
ｔ３ｍ１の乾燥ピリジンに溶かした溶液を加えた後、−
１０℃で１時間撹拌し、次いで２５℃で２０時間撹拌す
る。溶媒を高真空中４０℃で蒸発させる。冷却後、得ら
れた固体全戸別し、メタノールにより再結晶すると目的
生成物が得られる。融点２１６−２１８°Ｃ計算値（Ｃ
＋ｓＩ（＋ｏＮｚＰｓＳとして）　：　Ｃ、４８，７５
；Ｈ、４，１９：Ｎ　、　７．２１ｏ　　分析値：　Ｃ
、５８，４：Ｈ，５，１２：Ｎ、　６．８６゜ 実施例２ 標識物質として酵素基質を用いてのビオチンとアビジン
の特定（特異的）結合分析 本例に於いて用いられた特定結合分析系は次の反応に基
づいている。

ビオチン−ウンベリフェロン結合体 （４４８μｍｌＣ蛍光最大） Ａ、不溶化結合相手物質の製造 ビオチンに結合親和性を有するアビジンは、次のように
水不溶性高分子化合物ビーズに共有結合させることによ
り不溶化される。

適当１のセファローゼ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　４　
Ｂ　（スエーデン、ウプサラのファーマシア・ニー・ビ
ーより入手）を、マーチ他の方法（アナリテイカル・バ
イオケミストリー、６０：１４９（１９７４））を用い
てアビジンへの結合に関して活性化する。

約４−の活性化されたセファローゼ４　Ｂ　ｆ　８　ｍ
ｌ！の０、Ｉ　Ｍ酒石酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁さ
せる。この懸濁液に、９．９単位／ｍｑの活性を有する
アビジン６■を含有する３ｗｔの水を加える。アビジン
活性の１単位とは、１μ２のビオチンと結合することの
できるアビジンの量である。得られた反応混合物′ｆｔ
７℃で６時間撹拌する。次いでアビジン−結合−セファ
ローゼ４Ｂを戸別し、１００　ｍｌの０．１　Ｍ重炭酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）で洗浄した後、アビジ
ン−結合−セファローゼ４Ｂ’ｋ１２−の０．１　Ｍ　
）リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩
衝液（ｐＨ８，０）中に懸濁させ、そして帆ＩＭのビス
−ヒドロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ７，０
）によシ１：１に希釈する。

Ｂ、ビオチンの競合結合分析：離脱するウンベリフェロ
ンの１−に対するビオチンの量の変動の影蕃各々全量が
０．２−で、各々０．１Ｍのビス−ヒドロキシエチルグ
リシン塩酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）、０．３μＭのビオ
チン−ウンベリフェロン結合体（実施例１で得たもの）
、１５μｔのアビジン−結合−セファローゼ４Ｂ懸濁液
（本例のＡで得たもの）、及び第１表に示した濃度のビ
オチンを含有する８種類の特定結合反応混合物を調製す
る。

反応混合物を穏やかに振とうしながら室温で２０分間保
持する。各反応混合物を遠心分離し、その上澄み１００
μを容量を、１．０８単位の豚のエステラーゼを含有す
る２ゴの帆ＩＭビスーヒドロキジエチルグリシン塩酸塩
緩衝液（ｐＨ８，２）と−給圧する。室温で５分間保持
した後、３６４　ｎｍに励起を伴う４４８　ｎｍで各反
応混合物中に発生する蛍光強度を、アミコｅボウマン（
Ａｍｉ　ｃ　ｏ−Ｂｏｗｍａｎ　）蛍光分光分析計を用
いて測定する。結果を第１表に示す。

第　　１　　表 １　　０．００　　０．３５５ ２　　０．１０　　０．４９５ ３　　０．２０　　０．４６９ ４　　０．３０　　０．５０３ ５　　０．４０　　　、０．５４７ ６　　０．５０　　０．５０２ ７　　０．７５　　０．５８０ ８　　１．００　　０．ｆｉ８８ 以上によシ本例に於いては、液相中のＮＡＤ−ビオチン
の量は、存在する遊離ビオチンの量に直接比例すること
が示されている。従って、本発明の分析方法及び試薬は
未知の液体試料中の対象物質（リガンド）の測定のため
に有用である。

２７５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　液体中のハプテン又は抗原を分析するための： （ａ）液体を、予め定められた特性を有する標識物質と
   ハシテン若しくは抗原、若しくはそれに対する抗体又は
   それに対する特異的結合の相手物質との結合体からなる
   試薬と接触させる工程、ここで、該試薬と結合反応系を
   生成する対象物質（リガンド）が標識化された結合体の
   束縛相又は遊離相を生ずる； （ｂ）該束縛相と該遊離相と全分離する工程：及び （ｅ）分離された層の−における、該液体中のハプテン
   又は抗原の指標としての特性を測定する工程 からなる不均一系免疫分析方法であって、結合体中の標
   識物質が、酵素触媒反応の基質であることを特徴とする
   分析方法。 ２、　該標識物質が、該結合体のそれから区別すること
   ができる検出可能な性質を有する生成物を生成する酵素
   触媒反応の基質である特許請求の範囲第１項記載の分析
   方法。 ３、該検出可能な性質が蛍光である特許請求の範囲第１
   項記載の分析方法。 ４、　液体中のハプテン又は抗原を分析するための； 予め定められた特性を有する標識物質とノ１ブテン若し
   くは抗原、若しくはそれに対する抗体又はそれに対する
   特異的結合の相手物質との結合体からなう、かつ、試薬
   とハシテン又は抗原が結合度パ応系を形成して標識化さ
   れた結合体の束縛相又は遊離相を生成し、該束縛相若し
   くは該遊離相のいずれかの特性が、該液体中のハシテン
   又は抗原の量の関数である不均一系免疫分析用の試薬で
   あって、 結合体中の標識物質が酵素触媒反応の基質であることを
   ％徴とする試薬。 ５．　　（］）標識物質がハシテン又は抗原と結合して
   いる該結合体及び（２）該ハプテン又は抗原に対する抗
   体からなる特許請求の範囲第４項記載の試薬。 ６　担体マトリックス中に包含されてなる特許請求の範
   囲第４項記載の試薬。 ７　該標識結合体が、該結合体のそれから区別すること
   ができる検出可能な性質を有する生成物を該結合体上に
   おいて酵素的開裂によシ放出するよう作用することが可
   能な酵素の基質である特許請求の範囲第４項記載の試薬
   。 ８、　該検出可能な性質が蛍光である特許請求の範囲第
   ４項記載の試薬。