JPS5942454A - 液体中のハプテン又は抗原を分析するための均一系免疫分析方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、液体中のハプテン又は抗原（対象物質）の存
在を、特定（又は、特異的）結合の相手物質に対する該
対象物質の親和性に基づいて測定するための方法及び試
薬に関するものである。更に詳しくは、本発明は分離工
程を必要とせず、かつ標識物質として放射性物質もしく
は部分変形した酵素を用いない特定結合による分析に用
いる方法及び試薬に関するものである。なお、本明細書
中では、「特定」と「特異的」とは同鵜に用いている。

液体中の低濃度の物質の存在を検出するための便利かつ
信頼性が高く、更に危険性のない方法への要望があるこ
とは明白である。このことは、１０−１１モル濃度程度
の低濃度で体液中に存在する成分が病理学上重大である
臨床化学の分野に於いては、特、に該当する。そのよう
な低濃度の物質を検出することの困難さは、通常は試料
の量が非常に制限される臨床化学の分野に於いて増加す
る。

以前に於いては、物質は、その検出される物質が必ず反
応体であるような反応系に基づいて、液体中で検出され
ていた。未知物質の存在は、反応生成物の出現もしくは
既知反応体の消失によって検出されている。ある場合に
於いては、そのような分析方法は、生成物の出現もしく
は反応体の消失の速度あるいは生成した生成物もしくは
平衡に達した際に費やされた反応体の総量の測定を行な
うことにより、定量的にもなり得た。それぞれの分析の
反応系は必然的に小さなグループの物質の検出のみに限
定されるが、あるいは個別性（特異性）のないもののい
ずれかである。

個別性が高く、かつ広範囲の物質の検出に応用できる分
析系の研究により、放射性免疫分析法が生み出された。

この方法によると、検出対象の物質の放射性標識を付さ
れたものの量は、未知のものに個別性を有する限られた
川の抗体について、未知のものと競い合わされるように
される。そして、抗体に結合されるようになる標識を付
されたものの量は、存在する未知物質の水準に逆比例し
て変化する。放射性免疫分析技術に於いては）本来、抗
体に結合されるようになる標識を付された形の検出対象
の物質を、そのような結合を起さない物質と分所するこ
とが必要となる。この必要とされる分離を遂行するため
の種々の手段が、例えば米国特許第３．５０５．０１９
号、３．５５５．１４３号、３．６４６，３４６号、３
．７２０．７６０号及び３．７９３．４４５号に示され
るように開発されてきた。しがし、それらの手段は全て
、結合−被標識付与体の非結合−被標識付与体からの効
率的な分離を確実にするために口過、遠心分離もしくは
洗浄などの少なくとも−っの人手による操作工程を必要
としている。

分離操作を不要にすることができれば分析方法が非常に
簡単になり、臨床試験室に於いて更に有用となることで
あろう。

免疫分析に於いて放射性物質を用いることは、放射性物
質の代わりに酵素を付けた物質を用いることによりある
程度避けることができるようになった。米国特許第３．
６５４．０９０号及び３．７９１．９３２号に例示され
ているように、酵素を付けた免疫分析を遂行するために
必要な人手による操作工程は大体に於いて放射性免疫分
析に於いて必要とされることと同じで、煩わしい分離工
程を必要とする。

酵素を付けた物質を用いることについては、付けられる
各々の酵素がその付された結合体の形成に用いられるた
めに個別に化学的な変形が加えられなければならないと
いった他の不利益もある。付けられる他の物質、例えば
補酵素もしくはビールス（ネイチャー、田、１８６（１
９６８））を使用することが提案され、更に蛍光標識を
用いること（フランス国特許第２．２１７．３５０号）
も提案されている。

放射性標識もしくは付けられた酵素による免疫分析方法
は、検出可能物質の幅を広げること、もしくは操作を簡
素化させることにより将来に於て改良されうるにしても
、その本質として、これらの方法はある種の分離工程が
必ず必要となる。最近になり、分離工程を必要としない
別種の方法が公表された。従ってこの方法は、分離が必
要である不均一系との対照として、均−系と言われる。

米国特許第３．８１７．８３７号には、検出対象物質（
リガンド）に共有結合する標識物質としての酵素と対象
物質用の可溶性受容体（通常は抗体）から成る可溶性複
合体を分析対象の液体と結合させる工程及び複合体中の
酵素活性に対する対象物質の効果を測定する工程を含む
競合結合分析方法が開示されている。

この方法は、酵素−結合−リガンドの複合体と受容体と
の反応により複合体中の酵素の酵素活性が抑制される結
果になるため、分離工程が不必要となり、この点有利で
あるが、それにもかかわらずこの方法はその能力につい
て厳しい制限があるため広範囲な分析の要求には応じら
れない。例えば、酵素−結合−リガントの複合体の製造
に於いて、検出対象の物質もしくはリガンドは酵素に、
その結合位置が酵素の酵素的に活性な位置に近接するよ
うに注意深く制御された方法により結合されなければな
らないことは、明らかに必須である。

このことは複合体とされたりガントと受容体との間の反
応により酵素的に活性な位置を封鎖する目的で必要とさ
れる。酵素は、その大きさが、分子量約ｉｏ、ｏｏｏか
ら１．０００．０００の範囲で大きく変動する。こうし
て、分子量が５００．０００もしくはそれ以上の平均的
酵素の活性位置を物理的に封鎖することができるように
、１５０，０００と３００．０００の間の分子量を有す
る抗体の形の受容体の結合位置は厳密に制御されなけれ
ばならない。酵素の化学構造は複雑であるため、そのよ
うな化学的結合を厳密に制御することは実際困難であり
、種々広範囲の酵素をふるい分けることによっても、わ
ずか少数のみの酵素がこの均一系分析方法に於いて使用
できるものと考えられるであろう。

更に、定量的な試験結果を得るためには、各々の酵素−
結合−リガント複合体について酵素の数とりガントの数
を厳密に制御することが必須となる。この点でもまた、
酵素の複雑なペプヂド構造のためにこのような制御が附
加ｆとなる。従ってやはり、リガンドと酵素の比の必要
な制御が確実に行なえるような適当な分子構造を有する
酵素はわずか少数であろうと考えられる。

先行技術の均一系分析方法は酵素による増幅を含んでお
り、このため非常に鋭敏であるとされている。しかし、
標識物質である酵素がそれ自身先行技術の分析方法の鋭
敏性を決定する制限要素となっているため、この方法の
応用性は非常に限定されたものとなる。この鋭敏性は明
らかに酵素−結合−リガンド結合体に於ける特定の酵素
の触媒的活性に制限される。従って先行技術方法の応用
性は、有用な結合体の形成のための結合への要求のみな
らず、そのような結合体を使用する分析の鋭敏性の、特
定の結合体の酵素への依存性によっても制限される。

先行技術の均−系の分析方法は、尿やリンパ液のような
生物の液体の試験に応用する際にも更に不利益である。

酵素−結合−リガント結合体中に含まれる酵素種が試験
対象の液体試料中にかなりの量存在するので、それによ
り分析方法の精度に相当な影響を与える制御不可能の活
性が背景（バッタグラウンド）として現われるようにな
る。従　　　　：つて、人間もしくは動物の生物学的液
体を試験する際に使用できる分析方法を形づくるために
は、そのような液体に対して内因性ではない外部的な酵
素を選んでこれを用いて酵ヅ（−結合−リガント結合体
を形成するようにする必要があり、そのため、この分析
方法の応用性は更に制限を受けることになる。

従って本発明の目的は、分離工程を必要とせず、かつ不
便な放射性物質もしくは部分変形酵素を標識物質として
使用しない、液体中のハプテン又は抗原（対象物質）を
検出するための新規な方法及び試薬を提供することであ
る。

更に、先行技術の方法よりも更に応用範囲が広く便利な
均−系免疫分析方法及びその系を提供することも目的の
一つである。

対象物質もしくはその特定結合の相手物質に先行技術方
法の酵素よりも更に都合よく結合することのできる標識
物質を用いる均一系免疫分析方法及びその系を提供する
ことも本発明の目的の一つである。

特定の結合反応によって、先行技術方法の酵素よりも更
に容易に影響を受けやすい活性を有する標識物質を含む
結合体を用いる均−系免疫分析方法及びその系を提供す
ることもまた本発明の目的の一つである。

種々の広範囲の鋭敏な反応系を用いることにより、先行
技術方法に於ける酵素の活性のいかなる変化よりも更に
都合良くいかなる活性の変化についても検出できる標識
物質を含む結合体を用いた均−系特定結合分析方法及び
その系を提供することもまた本発明の目的の一つである
。

更に、先行技術の方法よりも更に容易に生物の液体の試
験に応用できる均−系特定結合分析方法及びその系を提
供することも本発明の目的の一つである。

本発明の均一系免疫分析方法は、液体中のノ１ブテン又
は抗原を分析するための： （ａ）　　液体を為 （１）予め定められた特性を有する標識物質とハプテン
又は抗原との結合体、及び （２）標識化された結合体の抗体−束縛相及び抗体−遊
離相を生成する、ハプテン又は抗原に対する抗体 からなる試薬と接触させる１私・；及び（ｂ）　　束縛
相と遊離相を分離することなく、液体中のハプテン又は
抗原の指標としての特性を測定する工程 からなる均一系免疫分析方法であって、結合体中の標識
物質が、化学発光反応の反応体であることを特徴とする
ものである。

又、本発明の均一系免疫分析試薬は、液体中のハプテン
又は抗原を均一系免疫分析方法により分析するための： （１）予め定められた特性を有する標識物質と、ハプテ
ン又は抗原との結合体、及び （２）ハプテン又は抗原に対する抗体 からなる試薬であって、 試薬とハプテン又は抗原が標識化された結合体の抗体−
束縛相及び抗体−遊離相を生成する結合反応系を形成し
、かつ、束縛相又は遊離相のどちらかにおける特性が液
体中のハプテン又は抗原の量の関数であって、 結合体中の標識物質が、化学発光反応の反応体であるこ
とを特徴とするものである。

本発明は、非常に便利で、応用性が広く、かつ鋭敏な均
−系特定結合分析方法及びその系を、前以って決められ
た反応の成分として賦与された反応活性を示す物質を標
識物質として使用することに基礎を置いて提供するもの
である。そのような物質はここに置いて「反応体」とし
て示される。

この方法は、部分的には、ハプテン又は抗原（対象物質
）とその特定結合の相手物質（このうちの一つに反応体
が結合される）との間の反応が前以って決められた反応
に於いて反応体の活性を変化させるという事実に基づい
ている。この反応が、特定結合反応を監視検出するため
の手段として働く。この基本的現象により、本発明の方
法を実施する場合に種々の試験組成物及び装置を含む種
々の操作工程が採用される。好ましい基本的な操作業は
、直接結合技術と競合結合技術である。

直接結合技術に於いては、検出対象のハプテン又は抗原
を含んでいると推定される液体は、該対象物質の特定結
合の相手物質と結合している反応体を含有する結合体と
接触せしめられ、次いで反応体の活性の何らかの変化が
分析される。競合結合技術に於いては、液体は対象物質
の特定結合の相手物質と接触せしめられ、また対象物質
（リガンド）もしくはその特定の結合に関する類似物質
の一方もしくは両方に結合している反応体を含有する結
合体と接触せしめられ、次いで反応体の活性の何らかの
変化が分析される。両方の技術に於いて、反応体の活性
は、前以って決められた監視検出反応を反応体と共に形
成する少なくとも一種の試薬を液体と接触させることに
より測定される。

液体中の対象物質の定性的な測定は、得られた反応と、
対象物質を含まない液体中に於ける監視検出反応をその
特性（通常は反応速度）について比較することにより行
なわれる。その両者の差異が反応体の活性の変化を指示
している。液体中の対象物質の定五七的測定は、得られ
た反応と既知量の対象物質を含有する液体中での監視検
出反応を比較することにより行なわれる。

監視検出反応は化学発光反応の反応体が用いられること
が好ましい。通常は、監視検出反応は、結合体中の反応
体に対して高度に鋭敏なものがら選ばれる。この点に於
いて、発光もしくは蛍光発光反応系は非常に有用である
。特に好ましいのは循環反応系で、反応体が循環する物
質である反応系が特別に好ましい。

本明細書に於いて用いられる用語は以下のように定砂さ
れる。「リガンド」、「対象物質」もしくは「対象物質
（リガンド）」は、物質もしくは一群の物質で、その液
体中の存在もしくは量が測定されるものである。「対象
物質（リガンド）の特定結合の相手物質」とは、物質も
しくは一群の物質で、他の物質を排除して対象物質に対
して特定の結合の親和性を示すものである。「対象物質
の特定の結合に関する類似物質」とは、物質もしくは一
群の物質で、対象物質への特定結合の相手物質の結合親
和性に関して対象物質と本質的に同じ挙動をとるもので
ある。

一般には、特定結合反応の各成分、例えば、リガンド又
は抗原（対象物質）を含有すると推定される液体、結合
体及び／又は対象物質の特定結合の相手物質は、分析の
目的にとって有意な息もしくは濃度の対象物質が液体に
含まれている時に結合体中の反応体の活性が測定できる
程度に変化するのであれば、いかなる量、方法及び順序
でも結合し得るものである。特定結合反応の全ての成分
は液体に可溶であることが好ましく、そうであれば均一
分析系となる。しかし、対象物質の特定結合の相手物質
もしくは結合体が不溶性である不均一分析系も所望によ
り利用することができる。

直接結合技術を用いる場合、特定結合反応の成分は、対
象物質を含有すると推定される液体と、対象物質の特定
結合の相手物質と結合している反応体を含有するある量
の結合体である。結合体の反応体が液体に接触した時の
活性は、液体中の対象物質と結合体中の特定結合の相手
物質との間の結合の量に逆比例して変化する。ずなわち
、液体中の対象物質の量が増加すれば、結合体の反応体
の活性は低下する。定量的な結果を得るためには、液体
に接触する特定結合の相手物質の量は常に、結合体の反
応体の活性の何らかの変化の評価が完了する前の結合体
と液体が接触している間、液体中に存在すると考えられ
る対象物質の全部と結合できる量より多くされる。実際
には、特定結合の相手物質の量は、液体中に存在すると
考えられる対象物質の最大予測量に基づいて、上述した
規準に従い選ばれる。直接結合技術は特に、自身より小
さな特定結合の相手物質を持つ高分子量対象物質を検出
するのに有用である。

競合結合技術を用いる場合、特定結合反応の成分は、対
象物質を含有すると推定される液体、対象物質（リガン
ド）もしくは対象物質の特定の結合に関する類似物質に
結合されている反応体を含むある量の結合体、及びある
量の対象物質の特定の結合の相手物質である。特定結合
の相手物質は結合体と液体の両方に実質的に同時に接触
せしめられる。液体中のいかなる対象物質（リガンド）
も、特定結合の相手物質と結合するために結合体中のり
ガントもしくはその特定の結合の類似物質と競争するの
で、液体と接触したＩ３の結合体の反応体の活性は、液
体中の対象物質と特定結合の相手物質との間の結合の量
に正比例して変化する。

即ち、液体中の対象物質の量が増加するにつれ、結合体
の反応体の活性は増加する。定量的な結果を得るために
は、結合体中の反応体及び液体と接触している特定結合
の相手物質は通常、結合体の反応体の活性の何らかの変
化の評価が完了する前の特定結合の相手物質、結合体そ
して液体が接触している間、液体中に存在すると考えら
れる対象物質の全てと結合体の形をした対象物質もしく
はその類似物質の全てとに結合することのできる量より
も少なくされる。実際には、特定結合の相手物質のｍは
、液体中に存在すると考えられる対象物質の最大予測量
に基づいて、上述した規準に従い選ばれる。通常、液体
に接触する結合体の形の対象物質（リガンド）もしくは
その類似物質の量は、液体中の試験される対象物質の最
少量を超えてはならない。競合結合技術は特に、自身よ
り大きな特定結合の相手物質を持つ対象物質を検出する
のに有用である。

競合結合技術の変形としては置換結合技術があり、この
技術では結合体が先ず特定結合の相手物質に接触せしめ
られ、次いで液体に接触する。特定結合の相手物質に対
する競争はその時に起こる。

このような方法に於いては、特定結合の相手物質に接触
する結合体の量は、対象物質を含有すると推定される液
体との接触の前の結合体と特定結合の相手物質との接触
の間存在している特定結合の相手物質の爪と結合するこ
とのできる量より多い量の対象物質（リガンド）もしく
はその類似物質を含む量である。この接触の順序は二種
類の便利な方法のいずれによっても達成できる。一つの
方法によれば、結合体は、対象物質を含有すると推定さ
れている液体との接触の前に、液性環境下で特定結合の
相手物質と接触せしめられる。第二の方法によれば、対
象物質を含有すると推定される液体は、結合体と特定結
合の相手物質を含む複合体と接触せしめられる。この場
合、結合体中の特定結合物質と特定結合の相手物質は互
いに相対して結合している。第一の方法に於いて特定結
合の相手物質と結合するようになる結合体の量、これは
第二の方法に於ける複合体の形に於ける結合体の量にな
るが、この量は通常、結合体の反応体の活性の何らかの
変化のかト価の完了する前の特定結合の相手物質（又は
複合体）と液体が接触している時に液体中の対象物質の
全てと置き換わることのできる量よりも多くされる。

競合結合技術の他の変形としては順次飽和技術がある。

この技術では特定結合反応の成分は競合結合技術で用い
られるものと同じであるが、添加の順序１あるいは各成
分の組合せ及び各成分の相対比が競合結合技術の場合と
異なっている。ｌｌｌＥｉ次結合技術によると、対象物
質の特定結合の相手物質は、液体と結合体の接触の前の
期間に、ス４象物質を含有すると推定される液体と接触
せしめられる。

液体に接触する特定結合の相手物質の量は通常、液体が
結合体と接触する前の、特定結合の相手物質と液体が接
触する時に、液体中に存在していると考えられている対
象物質の全てと結合できる量よりも多くされる。更に、
結合体の形の対象物質もしくはその類似物質の世は通常
、結合体の反応体の活性の何らかの変化の評価が完了す
る前の液体と結合体が接触する間、残存ずろ未結合の特
定結合の相手物質の量と結合できる量よりも多くされる
。実際には、特定結合の相手物質及び結合体中の対象物
質もしくはその類似物質の量は、液体中に存在すると思
われる最大予測量に基づき、上述した基準に従い選ばれ
る。

他の添加１１１＋ｆｆ序及び特定結合反応の成分の他の
相対比を含む操作工程もまた、ここに述べた発明概念か
ら逸脱せずに均一系特定結合分析を行なうために考案さ
れるであろうことは予Δｉｌｌされることである。

前以って決められた監視検出反応の成分の結合体の反応
体の活性の何らかの変化をｎ・１・価する工程は、特定
結合反応の反応混合物を、監視検出反応を結合体の反応
体と共に形成する少なくとも一種の物質と接触させ、次
いでその反応の特性に対する特定結合反応の影響を測定
することにより、都合良く達成される。監視検出反応は
一つのあるいは一連の複数の化学的に変形もしくは転換
する反応から成る。特に記さない限り、本明細書に記す
［反応系ｊの用語は、前以って決められた監視検出反応
の全体もしく４キ一部を意味する。

結合体中の反応体と共に監視検出反応を形成する適当な
反応成分は、特定結合反応の開始の前、又はそれと同時
に、あるいはそれに引き続き、単独で或は結合した形で
特定結合反応の反応混合物に接触せしめられる。特定結
合反応の開始後、監視検出反応の必須成分の一部もしく
は全てを含む反応混合物は、通常、結合体中の反応体の
活性の何らかの変化を評価する前の前以って決められた
時間培養される。培養期間の後、監視検出反応に必要で
、未だ反応混合物中に充分な量存在していない成分をこ
れに加える。そして監視検出反応に対する何らかの影響
を評価して、液体中の対象物質の存在もしくは量の指標
とする。

対象物質が液体に存在しないか、又は有意ではないｆＢ
シか存在しない状況に於いては、削具って決められた監
視検出反応は相対的に一定の性質を示す。液体中に対象
物質が存在する場合には、監視検出反応の少なくとも一
つの特性もしくは性質が変化する。一般には結合体の反
応体の活性は、その反応体が監視検出反応に関与するこ
とのできる滑もしくは速度と規定される。即ち、監視検
出反応の性質は液体中の対象物質の存在により、通常は
全反応速度もしくはその反応により生成する−もしくは
数種の反応生成物の平衡量について変化する。通常の場
合に於いては、結合体中の反応体の監視検出反応への関
与の能力は、該反応体が結合している特定結合物質とそ
の特定結合物質の特定結合対応物質との間の反応により
低下する。

即ち、遊離状態の結合体は、束縛された状態の場合より
も監視検出反応に対して更に活性である。

特定結合反応の培養後に存在する遊離の結合体及び束縛
された結合体の相対量は液体中の対象物質の量の関数と
なり、監視検出度゛応への影響を決定するものとなる。

監視検出反応の全反応速度の変化が、対象物質の存在を
決定するのに用いられる特性である時（これが好ましい
）には、その速度は通常、反応体の消失速度もしくは反
応生成物の出現速度を測定することにより決められる。

そのような測定は、通常のクロマトグラフ、重量分析、
電位差滴定、分光光度測定、蛍光測定、濁度測定、容量
測定等の分析技術を含む広範囲の種々の方法により行な
われる。本方法は第一として低濃度の対象物質の検出を
目的として考えられているので、非常に感度の良い反応
系が本発明の新規な特定結合反応系と組合わせて用いる
ように開発された。

監視検出ｙ応の−っの好ましい形態としては、生物発光
もしくは化学発光の現象を示す反応のように、好ましく
は酵素触媒による発光反応系がある。結合体中の反応体
は、光発生反応もしくは酵素によるか又はよらない発光
反応の準備段階である反応の反応体であっても良い。特
定結合反応の結果書られる結合体の反応体の何らかの変
化が、発生する光の全量、ピーク強度もしくは性質の変
化を引き起こす。発光反応系の例としてはＡ表に記され
たものが挙げられ、この表に於いては以下のような省略
形が用いられている。

ＡＴＰＨアデノシン三燐酸 ｋＭＰ：アデノシン−燐酸 ＮＡ、ＤＨニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド ＮＡＤＨＨ還元型のニコチンアミド・アデニン・ジヌク
レオチド １”　Ｍ　Ｎ　：フラビン・モノヌクレオチドＦＭＮ■
−１２：　　還元型のフラビン・モノヌクレオチド ｈν　　：電磁波放射、通常は赤外、可視或は紫外領域
のもの １１シ＋ＡＭＰ十酸化型ルシフェリン ＮＡＤ＋ＦＭＮＨ２ ２）ＦＭＮＨ２＋長鎖アルデヒド＋０□ピー・フィシエ
リ Ｄ、１）　　３’、　５’−アデノシン三燐酸＋還元型
ルシフェリン硫酸（塩）２）還元型ルシフェリン＋０２
−ｈν ＋酸化型ルシフェリン １１ν十酸化型ピロガロール十Ｈ２０ 量化酵素 Ｈ，還元型ピロガロール＋０２−−→　還元型ピロガロ
ール１１ν十酸化型ピロガロール ｈシ＋アミノフタル酸（塩）十Ｎ２ Ｊ。イソルミノール＋ＫＯ２ イソルミノール ｈシ＋アミノフタル酸（塩）十Ｎ２ 本発明方法で利用することができる発光反応系に閃する
更に詳細な事項及び議ｉｈは、次の文献に見られる。

ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー、２
３６：４８（１９６１） ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイティ
、８９：　３９４４　（１９６７） コルニア（Ｃｏｒｎｉｅｒ）他、生物発光の進歩、ジ田
ンソン他編、プリンストン大学出版部 にュー・シャーシー、１９６６）３６３−８４頁ビー・
クライス（Ｋｒｉｅｓ）、レニラ・ルシフェラーゼ（Ｒ
ｅｎｉｌｌａ　　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の精製と性質
１ジヨ一シア大学博士論文（１９６７） アメリカン・ジャーナル・オブ・フイジオロジー、４１
：４５４（１９１６） バイオロジカル・ビュレタン、５１３８９（１９２６）
ジャーナル・オブ：バイオロジカル・ケミストリー、２
４３：４７１４（１９６８） 本発明の好ましい実施態様に於いては必要性はないが、
液体中の対象物質の存在が結合体の反応体の活性に影響
を与えるような場合でも不均一系分析技術を用いること
が望ましいこともある。そのような状況は、不均一系方
法が特に都合の良１．ｚ場合にあられれる。ある不均一
系方法によれば分析系中の対象物質の有効濃度を増加す
ることができ、これにより感度を増大させることかでき
る。このような不均一系方法の例としては、本発明の結
合体もしくは対象物質の特定結合の相手物質（これは、
選ばれた髄室の操作の型に従い選ばれる）のいずれかよ
り成る不溶性マトリックスを含むカラム装置を用いたも
のがある。標識物質として放射性標識もしくはむγ累付
加された物質を用いる全ての他の不均一系分析方法もま
た、本発明の反応体を標識物質として用いて、同様に行
なわれる。

本発明は、特定結合の相手物質が存在するいかなるハプ
テン又は抗原（対象物質）の検出にも適用することがで
きる。対象物質は通常、ペプチド、蛋白質、炭水化物、
糖蛋白質、ステロイド、又は生物系内に特定結合の相手
物質が存在するが或は相手物質を合成することができる
他の有機分子である。この対象物質は、機能面の用Ｈｈ
で言えば、抗原、その抗体、ハプテン（付着体）、その
抗体及びビタミン並びにそれら【の受容体及び結合物質
から成る群より選ばれる。本発明を用いて検出すること
のできる対象物質を特に例示すれば、フェリチン、ブラ
デキニン、プロスタグランディン及び腫瘍特異性抗原の
ような抗原及びハプテン；ビオチン、ビタミンＢ１□、
葉酸、ビタミンＥ及びアスコルビン酸のようなビタミン
；ミクロソーム抗体、肝炎抗体、アレルゲン抗体のよう
な抗体；そしてチロキシン結合グロブリン、アビジン、
内因子及びトランスコバラミンのような特定結合受容体
が挙げられる。

一般に結合体は、より小さい対象物質（リガンド）に結
合された反応体及びその選ばれた特定結合の相手物質を
含むことが好ましい。選ばれた特定結合の相手物質の分
子量が対象物質の分子量の約１／１０もしくはそれ以下
である場合の対象物質を検出する場合には、直接結合技
術を用いるのが好ましい。従って、検出される対象物質
か抗体もしくは特定結合受容体である場合には、抗原に
結合した反応体或は抗体もしくは受容体の特定結合の低
分子ノン１の相手物質に結合したハプテンを含む結合体
が用いられる直接結合技術によることが好ましい。１′
！すばれた結合の相手物質の分子量が検出される対象物
質の分子量の１０倍もしくはそれ以上大きい場合、即ち
抗原、ハプテンもしくはビタミンが検出対象である時、
より小さな対象物質（すガント）に結合された反応体を
含む結合体が用いられる競合結合技術もしくは順次飽和
技術を利用することが特に有利である。

本発明の結合体に於いて、反応体は、その反応体の測定
可能な量の活性が維持されるような形で、特定結合物質
（選ばれた分析方法に依り、対象物質、対象物質の特定
の結合に関する類似物質もしくは対象物質の特定結合の
相手物質のいずれがである）に結合もしくは組合わされ
る。反応体と特定結合物質との結合は、活性を有する反
１５　ｆ’ｔ’を用いる監視検出反応が、上述の発光反
応系に於けるような結合を化学的に壊すように設計され
ていない分析の条件下では、通′帛実質的に変更できな
い。

しかし、ある場合には、そのような結合は、壊されるよ
うに設計されるか、あるいは反応活性の変化を評価する
ための手段としての選ばれた監視検出反応により影響を
与えられる。

反応体は特定結合物質に直接に結合しても良く、その結
果、結合体の分子量は反応体と特定結合物質の余分子爪
に等しいか、又は小さくなるようになる。しかし、通常
は、反応体と特定結合物質は、１から５０個、好ましく
は１から１０個の炭素原子もしくは窒素、酸素、硫黄、
燐その他のような複素原子を含む橋かけ基により連絡さ
れている。

１個の原子を含む橋かけ基の例としては、メチレン基（
炭素原子１個）及びアミノ基（複素原子１個）がある。

橋かけ基は通常１０００を超えない分子量を持っており
、好ましくは２００より小さいものである。橋−かけ基
は炭素原子もしくは複素原子の銅、もしくはそれらを組
合わせたものを含んでおり、通常はエステル、アミド、
エーテル、チオエステル、チオエーテル、アセタール、
メチレンもしくはアミノの如き基の形をした連結基によ
り、反応体と特定結合物質もしくはその活性誘導体とに
結合されている。

本発明の結合体中の反応体は、削具って決められた監視
検出反応の成分として、賦与された（例えば、一定の又
は既知の）反応活性を有する物質である。更に詳しく言
えば、本明細書による開示に於ては、「反応体」及び「
反応活性を有する物質」とは、自身とは異なるーもしく
は数個の生成物をもたらす、限定され、かつ測定可能な
化学的な変形（変質）をすることができ、更にその反応
体と化学物質（例、他の反応体、触媒、そのような化学
的な変形もしくは変質に関与するような他の型の物質）
の如き反応開始手段との相互作用により、電磁的放射、
熱エネルギー、もしくは音波エネルギーをもたらす物質
を意味する。従って本明細書に於いて「反応体」と定砂
した物質群の内には通常の無機及び有機試薬及び生化学
的物質が含まれる。しかし、触媒（酵素を含む）や放射
性アイソトープのように監視検出反応に於ける反応体で
ないものは除外される。特定の化学物質は化学的環境に
従って種々の形で機能することができるため、一つの化
学物質が種々の異なった分類に分類されることがあるが
、そのような物質が本明細書の開示に於いていかなる機
能を有するかが決定されるのは、本明細書に記された選
ばれた監視検出反応に関するその物質の反応性によるも
のであるということが認識されるであろう。

本発明の一形態として、対象物質が含有されていると考
えられる液体と組合わされる特定結合反応の成分は液体
もしくは固体の形である。好ましい均一系の分析系に於
いては、該成分は通常は溶液もしくは、液体に容易に溶
解することのできる固体の形である。試薬対象の液体は
通常、性質上水性であるので、該成分は一般には水溶性
の形態である。即ち水溶液か、又は粉末か樹脂のような
水溶性固体の形である。本分析方法は、試験管のような
標準の実験室用の容器中で、固体もしくは液体の特定結
合反応の成分及びそれに加えられる反応系の成分により
実施される。

−もしくは数種の特定結合反応の成分及び／又は−もし
くは数種の監視検出反応の成分は、担体に包含されてい
ても良い。一つの考え方として担体は、それらの成分の
一種もしくは数種をその内側部分に例えば液体もしくは
ゆるい固体の形で、あるいはその内部表面の被膜の中に
、含有する試験管又はカプセルのような液体保持用容器
でもよい。他の考え方として担体は、試験対象の液体に
関して不溶性かつ多孔性で、好ましくは吸収性である７
トリツクスの形態であってもよい。そのようなマトリッ
クスは例えば吸収性紙；重合体のフィルム、膜、りばも
しくは塊状物；ゲル及びその他の形である。そのような
形の場合、該装置は、試験対象液体を接触させ、特定結
合反応及び／又は監視検出反応を行なわしめ、かつ得ら
れる応答を観察するために都合のよい手段を提供する。

試験対象となる液体は天然に存在するが或は人工的に作
られたものであって、ハプテン又は抗原（対象物質）が
存在すると推定されるものである。

通常は生物体の液状物又はそれを希釈もしくは他の処理
を施して得られた液体である。本発明方法により分析す
ることのできる生物体の液状物には、血清、プラズマ、
尿、羊水、脳液、せきすい液等が含まれる。細胞等の固
体材料もしくは気体状のもの等の他の材料も、固体もし
くは気体を溶解させるか又は固体を抽出する等の方法に
より液体の形にして分析することができる。

先行技術の均−系分析系とは対照的に１結合体応活性を
有する物質を含有する生物体の液体に於ける対象物質を
、バックグラウンドに邪魔されることなく分析すること
ができる。内因性バックグラウンド反応体活性は種々の
方法で容易に除くことができる。生物体の液体は、内因
性反ＩｉＬ体活性を選択的に破壊するように処理するこ
とができる。

そのような処理としては例えば、内因性活性を化学的に
破壊する清浄剤を作用させ、次いで該清浄剤の破壊作用
を不活性にする処理を行ｔ「う処理が挙げられる。

本発明を以下において実施例により説明するが、これら
は本発明を制限するものではない。

実施例１ ビオチン−イソルミノール結合体の製造６−（３−ビオ
ナノイルアミド−２−ヒドロキシプロピルアミン）−２
，３−ジヒドロフタランー１．４−シメン Ａ、４−−（３−クロル−２−ヒドロキシプロピルアミ
ノ）−Ｎ−メチルフタルイミド ２５り（０，１４２モル）の４−アミノ−Ｎ−メチルフ
タルアミド（ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイテイ
、２６：（１９３７）に記載されている方法により得た
もの）と２０．７７（０２１モル）の１−クロル−２，
３−エボキシブ四パンを１５０ｍ／！の２．２．２−　
）リフロロエタ／−ルに加え、反応混合物を攪拌しなが
ら４８時間還流させた。７０−ＢＯｍｌの２．２．２−
　）リフロロエタノールを蒸留により除去し、残った溶
液を室温に冷する重い黄色沈殿が生成した。この沈殿を
酢酸エチルと共にすりつぶし、接遇により集め、乾燥さ
せると２９５ｙ（７７％収率）の目的の中間体が得られ
た。融点１３６１３８．５℃　計算値（Ｃｔ、２　Ｈｔ
　３ＣＬ　Ｎ　２０３として）：　Ｃ，５３，６４；Ｈ
，４，８８；Ｎ、　１０．４５．分析値：Ｃ，５３，８
７；Ｈ，４，８５；Ｎｐ　１０．８１゜Ｂ、４−（３−
（Ｎ−フタルイミド）−２−ヒドロキシプロピルアミノ
）−Ｎ−メチル７タルイミド 上記のＡで得−た中間体（１３，５グ、００５モル）と
１５７２（０，０８５モル）の７タルイミドカリウム塩
を１５０罰のジメチルポルムアミド中で攪拌しながら２
４時間還流させた。次いで、ジメチルホルムアミドを除
去し、残香を水で洗浄し、渉過した。濾紙に残った黄色
の塊を酢酸−水の混合溶媒で再結晶すると１２．８５’
　（６７％収率）の生成物が得られた。融点２４７−２
４８．５℃。計算値：　（Ｃ２ＤＨ１７Ｎ３０５　　と
して）　：　Ｃ，６３，３２；Ｈ，４゜５２　；Ｎｖ　
１１．０８．分析値：　Ｃ，６３，１６；Ｉ−（、４３
８；Ｎｔ　１０．９３゜ Ｃ，６−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピルアミ／
〕−２，３−ジヒドロフタラジン−１，４−ジオン 上記のＢの中間体（５，０ｙ、１３．２ミリモル）、９
０ｍ１ｌの無水エタノール及び３５ｍＪの９５％ヒドラ
ジンを攪拌しながら４時間還流させた。真空中で溶媒を
除失し、得られた固体を真空中１２０℃で２４時間乾燥
させた。この物質を７０ｍ？のｏ１Ｎ塩酸と共に１時間
攪拌した。不溶性の２，３−ジヒドロキシフタラジン−
１，４−ジオンを１ｙｔ過により除去し）濾液を飽和重
炭酸ナトリウムによりｐｌＪ６．５に調整した。生成し
た白色沈殿を便通により集め、乾燥させると２２２の生
成物が得られた。

収率６７％。水で再結晶した化合物は２７３℃で分解し
た。計算値（Ｃ１１Ｈ１４Ｎ２０３として）：Ｃ，５２
，７９；Ｈ，５，６４；Ｎ、２２．３９゜分析値：Ｃ，
５２，７３；Ｈｔ　５．７２；Ｎ、２２５４゜ Ｄ＋　ビオチン−イソルミノール結合体ビオチン（”０
．２９１ｉｉ’、１．２ミリモル）と０．１７ｍ１のト
リエチルアミンを２０ｍ１の乾燥ジメチルボルムアミド
に無水の条件下で溶がし、−１０℃に冷却した。２．８
６　ｒｕｇのエーテルに０．１４１　ｍＪのクロロギ酸
エチルを溶かした溶液を徐々に加え、混合物を３０分間
攪拌した。生成した沈殿を濾過により分離した。上記の
Ｃで得られた中間体６００　ｍｐ（２，４ミリモル）、
乾燥ジメチルホルムアミド２０ｍ１及び乾燥ピリジン１
罰を濾液に素早く加えた。この混合物を一１０℃で３０
分間攪拌し、次いで室温で一夜攪拌した。この間に溶液
が得られた。ジメチルホルムアミドを０．１０　ｉｎ　
Ｈｆの圧力下、６０℃で蒸留して除去した。油状残香を
５０＋＋ｌの０、ＩＮ塩酸と共に１時間攪拌した。生成
した白色沈殿を沖過し、０１Ｎ塩酸、次いで水により洗
浄した。室温で真空中、−夜乾燥させると、０．５５ｆ
（９７％収率）の生成物が得られた。融点１．７０−３
℃ｏ引算値（Ｃ２１Ｈ２ｇＣ２１Ｈ２として）：Ｃ９５
２，９２；）丁、　５．９２　；Ｎ、　１７．６４゜分
析値二〇。

５１．６９　；Ｉ■＋　５．９０　；Ｎｐ　１７．６３
゜実施例２ 特定結合−化学発光分析；ビオチン−イソルミノールよ
−１合体の活性に対するアビジンとビオチンの影ワや 本実施例で用いた化学発光反応系は次の反応に基づいて
いる。

各々全量が１４０μｔで、各々ｐｌ−Ｉ　７．４の０．
１１ＶＩのトリス−（ビトロキシメチル）−アミノメタ
ン塩酸塩緩衝液及び第１表に示した濃度のビオチン、ビ
オチン−インルミノール結合体（実施例１で得たもの）
及びアビジン（最後に加える）を含有する９種類の特定
結合反応混合物を調製した。

２５℃で５分間保持した後、各反応混合物に、２０　単
位／　ｙｒｔｅのラクトペルオキシダーゼ（米国、ミズ
ーリ州、セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー
より入手、「酵素学の方法ＪＸＶＩＩＡ。

（１９７０）６５３頁−分析２に記載されている方法に
より分析）を含有するｐＨ７，４の０．１　Ｍの一アミ
／メタン塩酸塩緩衝液に溶かした溶液を各反応混合物中
に注入し、各々について得られるピーク光強度をデュポ
ン７６０型生物発光分先々度計（米国、プラウエア州、
ウィルミントンのイー・アイ・デュポン・ド・ヌムール
）ヲ用いて測定した。

結果を第１表に示す。

反応１．２．５及び７は対照実験で、ビオチン−イソル
ミノール結合体が存在しない場合には、わずかに少ない
バックグラウンド量の光しか計測されないことを示して
いる。反応３及び６の結果は、ビオチン−イソルミノー
ル結合体が化学発光反応に於いて活性であり、かつ遊離
のビオチンが存在してもその活性は有意な影響を与えな
いことを示している。反応４の結果によれば、ビオチン
への結合物質であるアビジンが存在する場合にはビオチ
ン−イソルミノール結合体の活性が増大することがわか
る。この結果は意外なものである。なぜならば、結合体
へのアビジンの結合が化学発光反応へのイソルミノール
部分の効力を制限するはずであると考えられるからであ
る。この観察された光発生の増大は理解し難い。反応４
及び８と反応９の結果を比較すると、光発生の増大は存
在する遊Ｎ＃ビオチンの量に対して逆に減少することが
わかる。

本実施例に於いては、対象物質であるアビジンとビオチ
ンは特定結合−化学発光分析技術を用いることにより測
定することができ、本発明によれば、結合体中の標識物
質と対応する結合相手物質との結合による影響は標識物
質の活性の阻害ではなく、むしろその増大であろうとい
うことが示されている。

実施例３ ビオチンの競合結合−化学発光分析；得られるピーク光
強度に対するビオチンの量の変動の影響本実施例に於い
て用いられた化学発光反応系は実施例２に記したものと
同じである。

各々全ＲＬが１４０μｔで、各々ｐｉ（７，４の０．１
Ｍのトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸
塩緩衝液、８４ｎＭのビオチン−ルミノール結合体（実
施例１で得られたもの）、第２表に示した濃度のビオチ
ン及び０．０３５単位／　ｍ、ｌのアビジン（最後に加
える）を含有する６種類の特定結合反応混合物をｉｌｌ
、ＪＩＩＡシた。

２５℃で５分間保持した後、各反応混合物に１０μｔの
ラクトペルオキシダーゼ（２０単位７ｒｙｔｌ　）を加
えた。更に２分間保持した後、１０μｔの０．９５ｍＭ
渦酸化水素を溶かしたｐＨ７，４の１０　ｍＭ　）鵞」
スー（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩衝液
を各反応混合物中に注入し、各混合物について得られる
ピーク光強度を実施例２と同４Ｊに氾ｌ定した。結果を
第２表及びグラスの形で添付図ｍｊの第１図に示す。

第　　２　　表 １ｏ２３．５ ２　　６７　　２１．１ ３　　１３４　　１５．５ ４　　２００　　１２．６ ５　　２６８　　１２．３ ６　　４００　　８．１ 以上により、化学発光反応系により得られるヒ。

−ク光強度の大きさは、特定結合反応混合物中に存在す
るビオチンの量の逆の関数であること力≦わかろ。従っ
て本発明によれば、液体中の久１象物質であるビオチン
の存在を測定するための、競合結合−化学発光分析技術
を用いる試験用の試ｐｌと方法が提供される。

実施例４ ビオチンの競合結合−化学発光分析 本実施例に於いて用いられた化学発光反応系は次の反応
に基づいている。

ビオチン−イソルミノール＋ＫＯ２−→ビオチンーアミ
ノフタレート＋Ｎ２＋ｈν 各々余計が１５０μｔで、各々ｐＩ−１８，Ｏの０１Ｍ
トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩
衝液、４２ｎＭのビオチン−ルミノール＆Ｖ　合体（実
施例１により得たもの）、第３表に示した濃度のビオチ
ン及び０１２単位／　ｍｅのアビジン（最後に加えろ）
を含有する１６欅類の特定結合反応混合物を調製した。

２５℃で５分間保持した後、各反応混合物中に、０１５
Ｍの過酸化カリウム（ＫＯ２、米国、マリチウセツツ州
、ベバリーのアルファ・プロダクツより入手）と０１０
Ｍの１．４．７．１０．１３．１６−へキサオキシアシ
ルコオクデカン（米国、ウィスコンシン州、ミルウオー
キーのアルドリッチ・ケミカル・カンパニーより入手）
とを含有する１０μｔのジメチルホルムアミドを注入し
た。各々につしＡて得られるピーク光強度を実施例２と
同様に濱１定した。結果を第３表及びグラフの形で添付
図面の第２図に示す。

第　　３　　表 １　　　０　　３８．５ ２　　　１３　　３８．５ ３　　　２７　　３４．３ ４　　　４０　　３６．１ ５　　　５３　　３５．２ ６　　　　’６７　　３６．２ ７　　　１０１　　３４．０ ８　　　１３３　　３１．７ ９　　　１６６　　２９．１ １０　　　　　　　　　　　２００　　　　　　　　　
　　　２４．２１１　　　　　　　　　　　２６７　　
　　　　　　　　　２２．８１２　　　　　　　　　　
　３３３　　　　　　　　　　　　２０．５１３　　　
　　　　　　　　４００　　　　　　　　　　　１３．
４１４　　　　　　　　　　　５３４　　　　　　　　
　　　　　８．６１５　　　　　　　　　　　６６７　
　　　　　　　　　　　　８．３１６　　　　　　　　
　　　８００　　　　　　　　　　　　　７、０以上に
より、化学発光反応系により得られるピーク光強度の大
きさは、反応混合物中に存在するビオチンの量の逆の関
数であることがわかる。従って本発明によれば、液体中
の対象物質であるビオチンの存在を測定するための、酵
累触媒を用いる監視検出反応を利用しない競合結合−化
学発光分析技術を用いる試験用の組成物と方法が提供さ
れる。

【図面の簡単な説明】

第１及び２図は各々、異なった二種の競合結合−化学発
光分析技術に於いて得られるピーク光強度に対する対象
物質の量を変動させた場合の影響をグラフによって示す
ものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　液体中のハプテン又は抗原を分析するための： （ａ）　　液体を、 （１）予め定められた特性を有する標識物質とハプテン
   又は抗原との結合体、及び （２）標識化された結合体の抗体−束縛相及び抗体−遊
   離相を生成する、ハプテン又は抗原に対する抗体 からなる試薬と接触させる工程；及び （ｂ）　　束縛相と遊離相を分離することなく、液体中
   のハプテン又は抗原の指標としての特性を測定する工程 からなる均一系免疫分析方法であって、結合体中の標識
   物質が、化学発光反応の反応体であることを特徴とする
   分析方法。 ２　該特性が、発生する光の全量又は発生する光のピー
   ク強度を測定することにより測定される特許請求の範囲
   第１項記載の分析方法。 ３、　該標識物質がルミノール若しくはイソルミノール
   又はそれらの誘導体である特許請求の範囲第１項記載の
   分析方法。 ４、液体中のへブテン又は抗原を均一系免疫分析方法に
   より分析するための： （１）予め定められた特性を有する標識物質と、ハプテ
   ン又は抗原との結合体、及び （２）ハプテン又は抗原に対する抗体 からなる試薬であって、 試薬とハプテン又は抗原が標識化された結合体の抗体−
   束縛相及び抗体−遊離相を生成する結合反応系を形成し
   、かつ、束縛相又は遊離相のどちらかにおける特性が液
   体中のハプテン又は抗原の量の関数であって、 結合体中の標識物質が、化学発光反応の反応体であるこ
   とを特徴とする試薬。 ５、　担体マトリックス中に包含されてなる特許請求の
   範囲第４項記載の試薬。 ６　該標識物質がルミノール若しくはイソルミノール又
   はそれらの誘導体である特許請求の範囲第４項記載の試
   薬。