JPH0141158B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はアルカリフオスフアターゼ（牛の肝臓
由来）を阻害する活性を有する新規な生理活性ペ
ンタペプチドに関し、またその製造法に関する。 詳しく言えば、本発明は次式 で表わされる新規なペンタペプチド、製薬学的に
許容しうるその塩およびそれらの水和物（以下、
単に本発明化合物と言うことがある）に関する。
また、それらの製造方法、およびそれらを含有す
る製薬学的調製物に関するものである。本発明化
合物は、牛の肝臓中に存在するアルカリフオスフ
アターゼを強く阻害する生理活性および制癌作用
を有する。アルカリフオスフアターゼは主として
細胞膜に存在し、また小胞体、リソゾーム、ミト
コンドリア外膜、ゴルジ体、核膜などに見出され
る。 生体内におけるアルカリフオスフアターゼ本来
の生理的意義については、いまだ確立されていな
い。しかし本酵素に膜結合のものが多いことや、
その局在性から膜機能に何らかの役割（たとえ
ば、合成、分解、輸送など）を果たしているもの
と推測される（菰田二一、坂田良克、蛋白質・核
酸・酵素24，131〜144（1979））。 アルカリフオスフアターゼ阻害物質は細胞膜に
存在する酵素あるいは結合蛋白などに結合したの
ち、免疫を含む細胞機能に影響を与える可能性の
あることが示唆される。 現在、アルカリフオスフアターゼの阻害物質と
して、フオルヘニシン、レバミゾールなどが知ら
れているが、これらの化合物はいずれも免疫賦活
作用を有する。本発明化合物は、細胞毒性がない
にもかかわらず、動物実験において制癌作用を示
し、この物質がアルカリフオスフアターゼの阻害
活性を持つことを考慮すると、この制癌作用には
免疫の関与が考えられ、医薬の領域において制癌
剤、および免疫賦活剤として有用な化合物であ
る。本発明者らは、微生物の培養液中にアルカリ
フオスフアターゼ阻害物質を探索し、微生物
BMG59―R2株が、新規な構造を有するアルカリ
フオスフアターゼ阻害物質を生産することを見出
し、この化合物が同時に制癌作用を有することを
発見した。 本発明はバチルス属に属し且つ次式 で示されるペンタペプチドを生産する菌を培養
し、培養物中から該ペンタペプチド又はその塩又
は水和物を採取することを特微とする該ペンタペ
プチド又はその塩又は水和物の製造法にも関す
る。 前記ペンタペプチド生産菌の例には、昭和53年
７月、微生物化学研究所構内の土壌より分離した
バクテリアで、BMG59―R2の菌株番号が付され
たものがある。 BMG59―R2株の菌学的性状 １ 形態 BMG59―R2株は、グラム陽性の有芽胞桿菌
で、菌体の大きさは1.2〜1.4×2.6〜3.6ミクロン
位で、鞭毛を認めない。芽胞は、卵円形、0.9〜
1.0×1.6〜1.8ミクロン位の大きさを示し、その位
置は中立（central）、菌体の明瞭な膨隆は認めら
れない。非抗酸性である。 ２ 各種培地における生育状態 肉汁ゼラチン穿刺培養以外は、すべて37℃で培
養した。 (1) 肉汁寒天平板培養 コロニーは、光沢のない不透明な円形で、辺
縁は不規則、色は茶白（Brownish white）を
示す。 (2) 肉汁寒天斜面培養 画線にそつてよく生育し、光沢のない不透明
な表面を呈する。 (3) 肉汁液体培養 培養１日目で培地全体が濁り、試験管底部に
わずかに菌体が沈澱する。培養後７日目まで、
培地全体の濁りはほとんど変化せず、試験管底
部の菌体は増加してくる。培地表面に菌膜は形
成されない。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 20℃で培養すると、培養１日目に培地表面に
増殖が認められ、２日目から液化が始まる。そ
の型は層状で、６日目で深さ５mm位まで液化さ
れ、８日目には約１cmの深さまで液化されたの
みで、完了を読めなかつた。30℃培養では、培
養２日目に培地表面の増殖を認め、３日目から
液化が始まり、11日目に完了した。 (5) BCPミルク BCPミルク培地に37℃で培養すると、培養
３日目からBCPが青変し、凝固が認められる。
培養液４日目には凝固が完了し、直ちにペプト
ン化が始まり、約２週間で完了した。 (6) サブロー・デキストロース寒天培地およびサ
ブロー・デキストロース・ブロスサブロー・デ
キストロース寒天斜面およびサブロー・デキス
トロース・ブロス（ペプトン10ｇ、デキストロ
ース40ｇ、寒天15ｇ、精製水1000ml、PH5.6；
サブロー・デキストロース・ブロスは斜面培地
から寒天を除いたもの）に培養すると、液体培
地ではほとんど生育を認めないが、斜面培地で
は発育が認められた。 ３ 生理的性質 特に記さない限り、培養温度はすべて37℃であ
る。 (1) 硝酸塩の還元 硝酸塩肉汁培地（牛肉エキス10ｇ、ペプトン
10ｇ、NaCl5ｇ、KNO₃1ｇ、精製水1000ml、
PH7.2）およびコハク酸―硝酸塩培地（コハク
酸ナトリウム10ｇ、K₂HPO₄1ｇ、NaNO₃1ｇ、
MgSO₄・7H₂O0.5ｇ、KCl0.2ｇ、FeSO₄・
7H₂O微量、精製水1000ml、PH7.2）で、培養
１，３，５日目のいずれの場合も亜硝酸塩の検
出をみなかつた。 (2) 脱窒反応 脱窒反応試験を駒形らの方法（長谷川武治編
著；微生物の分類と同定223頁、東京大学出版
会、1975年）で行なつた結果、陰性であつた。 (3) MRテスト プロテオース・ペプトン７ｇ、ブドウ糖５
ｇ、NaCl5ｇ、精製水1000ml、PH7.0（無修正）
の培地（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology 8th edition；R.E.Buchanan＆
N.E.Gibbons.The Williams＆Wickins
Company，Baltimore；p.532，1974）を用い
て、30℃および37℃で培養し、１，２，３日目
にメチルレツド試験を行なつた結果、30℃では
３日目の、37℃では２，３日目の培養液が陽性
を示した。 (4) VPテスト MRテストに用いた培養液で同時にVP反応
を試験したが、いずれも陰性であつた。 (5) インドールの生成 ペプトン10ｇ、NaCl5ｇ、精製水1000ml、PH
7.2の培地で培養し、コバツク試薬、シユウ酸
紙、パラージメチルアミノベンズアルデヒド試
験紙のそれぞれの方法で試験したが、培養18日
目まですべて陰性であつた。 (6) 硫化水素の生成 TSI寒天培地（Triple sugar iron agar、栄
研）で、７日間培養したが硫化水素の生成は認
められなかつた。 (7) デンプンの加水分解 可溶性デンプンを0.2％含んだ肉汁寒天平板
に画線培養して、３日目にヨード・ヨードカリ
液で試験した結果、デンプンの分解が認められ
た。 (8) クエン酸の利用 コーザーの培地及びクリステンセン・クエン
酸塩培地で、クエン酸の利用を認めた。 (9) 無機窒素源（硝酸塩およびアンモニウム塩）
の利用 基礎培地（ブドウ糖10ｇ、KH₂PO₄1ｇ、
MgSO₄・7H₂O0.5ｇ、KCl0.2ｇ、精製水1000
ml、PH7.2）に各窒素源NaNO₃1ｇ、
（NH₄）₂SO₄0.78ｇ、グルタミン酸ナトリウム
1.7ｇを加えて試験した結果、いずれの場合も
増殖し、利用することを認めた。 (10) 色素の生成 キングＡ寒天培地（栄研）で１夜培養後、室
温に12日間放置、一方、キングＢ寒天培地（栄
研）で13日間培養すると、キングＡでは３日目
に、キングＢでは11日目に、うす茶色の溶解性
色素をわずかに認めた。 (11) ウレアーゼ 尿素培地（栄研）で、24時間培養したが、ウ
レアーゼ陰性であつた。 (12) オキシダーゼ チトクローム・オキシダーゼ試験紙（日水）
で試験した結果、オキシターゼ反応陰性であつ
た。 (13) カタラーゼ 肉汁寒天斜面培地で１夜培養した新鮮菌につ
いて、３％過酸化水素水でカタラーゼ試験を行
うと、気泡を認め陽性であつた。 (14) 生育の範囲 滅菌後のPHがそれぞれ3.0，4.0，5.0，6.0，
7.0，7.8，8.6，9.6の肉汁ブイヨン培地で、24
時間培養すると、PH5.0〜8.6の範囲で生育を認
めた。生育の最適PHは、6.0〜7.8である。又、
肉汁ブイヨン培地に接種後、７，12，14，20，
24，27，30，37，50℃の各温度で、それぞれ24
時間培養すると、12〜37℃の範囲で生育を認
め、３日間培養では50℃においてもわずかに生
育が認められた。生育の最適温度は、37℃前後
である。 (15) 酸素に対する態度 １％ブドウ糖肉汁寒天培地に菌液を懸濁後高
層に固めて培養すると、培地表面及び表面に近
い部分によく生育した。 (16) Ｏ―Ｆテスト（Hugh―Leifson試験） 好気的、嫌気的条件のいずれの場合も生育弱
く、わずかではあるがブドウ糖を分解し、酸を
生成した。 (17) 糖類からの酸およびガスの生成 基礎培地（（NH₄）₂HPO₄1ｇ、KCl0.2ｇ、
NgSO₄・7H₂O0.2ｇ、酵母エキス0.2ｇ、寒天
15ｇ、ブロムクレゾール―パープル0.2％水溶
液４ml、精製水1000ml、PH7.0）に別に滅菌し
た糖をそれぞれ最終濃度が１％になるように加
え、斜面に固めた後、BMG59―R2株を培養
し、30日間にわたつて、酸の生成を観察した。
その結果、Ｄ―マンノース、Ｄ―フラクトー
ス、Ｄ―ガラクトース、麦芽糖、シヨ糖、乳
糖、トレハロース、Ｄ―ソルビツト、Ｄ―グル
コース、Ｌ―アラビノース、Ｄ―キシロース、
Ｄ―マンニツトからは、それぞれ酸を生成した
が、イノシツト、グリセリン、デンプンから
は、いずれも酸を生成しなかつた。 一方、ガスの生成は、基礎培地（ペプトン５
ｇ、酵母エキス３ｇ、NaCl5ｇ、寒天３ｇ、ブ
ロムクレゾール―パープル0.2％水溶液４ml、
精製水1000ml、PH7.0）に前記と同様に各糖を
加え、高層に固めた後、BMG59―R2株をそれ
ぞれ穿刺培養し、30日間にわたつて観察した。
上記の糖のいずれからも、ガスの生成は認めら
れなかつた。 (18) カゼインの加水分解 カゼイン寒天平板（肉汁寒天に滅菌した脱脂
牛乳（Difco製）を５％の濃度に加え、固化し
た。PH7.4）に画線培養すると、培養後１日目
からカゼインの消化が認められ、11日目で加水
分解が完了した。 (19) 塩化ナトリウムの耐性 基礎培地（ペプトン10ｇ、精製水1000ml、PH
7.0に、７％の濃度になるように塩化ナトリウ
ムを加え、菌液を接種後静置培養し、７日間に
わたつて菌の増殖を観察した。その結果、基礎
培地と塩化ナトリウム７％を含む双方の培地
で、培養後１日目から同程度の菌の増殖が観察
された。 (20) フエニルピルビン酸試験 Ｄ・Ｌ―フエニルアラニン２ｇ、酵母エキス
３ｇ、Na₂HPO₄1ｇ、NaCl5ｇ、寒天20ｇ、精
製水1000ml、PH7.2組成の斜面培地に培養し、
培養後１日目及び７日目に10％塩化第二鉄水溶
液で試験した結果、共に陽性であつた。 (21) チロシンの溶解性試験 チロシン寒天培地（ペプトン５ｇ、肉エキス
３ｇ、寒天20ｇ、精製水1000ml、チロシン５
ｇ、Hz7.2）で培養し、５日目ごろよりチロシ
ンの溶解が認められた。 (22) リゾチーム感受性 基礎培地（ペプトン10ｇ、牛肉エキス10ｇ、
NaCl5ｇ、PH7.4）に別に滅菌したリゾチーム
を0.001％になるように加え、菌を接種後、ロ
ータリ・シエーカー（r.p.m.180）で30℃、７
日間振とう培養したが、菌の増殖は全く認めら
れなかつた。 以上の性状を要約すると、BMG59―R2株は好
気性のグラム陽性の有芽胞桿菌で、鞭毛を認め
ず、運動性も確認できない。芽胞は卵円形で中立
（Central）、菌体の明瞭な膨隆は認められず、又
耐熱性である。寒天培地で、光沢のない辺縁が不
規則な不透明な円形のコロニーを形成し、液体培
地で菌膜を形成することはない。ゼラチンを液化
し、BCPミルクを青変して凝固し、ペプトン化
する。サブロー・デキストロース・ブロスでは発
育が認められないが、サブロー・デキストロース
寒天培地で発育がみられる。硝酸塩を還元せず、
脱窒反応陰性、MRテスト陽性、VPテスト陰性
である。インドールは培養18日目まで検出され
ず、硫化水素の生成も認められない。デンプンを
分解し、クエン酸を利用する。ウレアーゼ反応陰
性、オキシダーーゼ反応陰性、カタラーゼ反応陽
性である。PH5.0〜8.6の範囲で生育し、最適PH
は、6.0〜7.8である。また、12〜50℃の範囲で生
育し、最適温度は37℃前後である。ブドウ糖を酸
化的および発酵的に分解し、酸を生成する。Ｄ―
グルコース、Ｌ―アルビノース、Ｄ―キシロー
ス、Ｄ―マンニツトからそれぞれ酸を生成する
が、ガスは生成しない。カゼインを加水分解し、
チロシンを溶解する。リゾチームには感受性であ
る。 以上の性状をもとに、BMG59―R2株を
Bergey′s Manual Determinative Bacteriology
8th edition （R.E.Buchanan ＆ N.E.
Gibbons，The Williams ＆ WilKins
Company，Baltimore，1974）で検索すると、
536頁バチルス・メガテリウム（Bacillus
megaterium）が最も近縁の種として挙げられ
る。 BMG59―R2株の性状をバチルス・メガテリウ
ムの性状と比較し、又当研究所保管の菌株バチル
ス・メガテリウムAPF株について、同時に比較
試験した成積も合せて示すと、次の表１のように
なる。

【表】

【表】 表から明らかなように、BMG59―R2株は、バ
チルス・メガテリウムに極めて近縁である。又、
この種の特徴といわれるポリ・ベータ・ハイドロ
キシブチレート（poly―β―hydroxybutyrate）
様の細胞内小球を、BMG59―R2株とバチルス・
メガテリウムAPF株（当研究所保管）の双方を
弱く単染色した際に、それぞれ数個ずつ確認でき
た。この事実はBMG59―R2株がバチルス・メガ
テリウムにより近縁であることを立証している。
よつて、BMG59―R2株をバチルス・メガテリウ
ム（Bacillus megaterium）BMG59―R2と同定
する。なお、BMG59―R2株を工業技術院微生物
工業技術研究所に、昭和56年10月９日寄託申請
し、受託番号は微工研菌寄第6177号である。 本発明化合物はこれを生産するバチルス属に属
するBMG59―R2株の胞子または菌糸を栄養源含
有培地に接種して好気的に発育させることによつ
て得られる。栄養源としては、細菌、放線菌など
の栄養源として公知のものが使用できる。例え
ば、市販されているグリセリン、グルコース、ラ
クトース、蔗糖、澱粉、マルトース、糖密などの
炭水化物あるいは脂肪（動物脂肪、大豆油、綿実
油、落花生油などの植物油）などの炭素源および
市販されているペプトン、肉エキス、コーンステ
イプリカー、コーングルーテンミール、綿実油、
落花生粉、大豆粉、酵母エキス、Ｎ―Ｚ―アミ
ン、カゼイン、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、
硫酸アンモニウムなどの窒素源と食塩、燐酸塩、
炭酸カルシウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩
を使用できる。その他、必要に応じて微量の金属
塩を添加する。これらのものは本発明化合物生産
菌が利用し、また本発明化合物の生産に役立つも
のであれば良い。公知の細菌、放線菌などの培養
材料はすべて利用できる。培養温度は本発明化合
物を生産する範囲で適用し得るが、殊に好ましい
のは25〜35℃である。培養は普通本発明化合物が
充分蓄積するまで継続される。例えば、グリセリ
ン３％、カゼイン３％、NaCl0.1％、K₂HPO₄0.1
％、MgSO₄・7H₂O0.3％の培地をPH7.6に調整し、
滅菌した後、BMG59―R2株の斜面培養したもの
から胞子および菌糸を接種し、28℃で好気的に振
盪培養を行うと培養25〜27時間目に培地中に本発
明化合物の蓄積が認められた。 本発明化合物の抗アルカリフオスフアターゼ活
性は次の方法で測定される。すなわちパラニトロ
フエニルリン酸ニナトリウム塩（第一化学社製）
を基質とし、牛の肝臓より得たアルカリフオスフ
アターゼ（シグマ社製、米国）により加水分解さ
れて遊離するパラニトロフエノールを比色法によ
り定量する方法である。パラニトロフエニルリン
酸ニナトリウム塩を水に溶解し、0.1M溶液とす
る。この基質溶液0.04mlに0.3M2―アミノ―２―
メチル―１，３―プロパンジオール緩衝液（PH
9.0）0.32ml、0.2M塩化マグネシウム0.02ml、お
よび蒸留水、あるいは検体を含む水溶液0.1mlを
加え、３分間37℃で加温したのち、アルカリフオ
スフアターゼ30μgを１mlの蒸留水に溶かした溶
液0.02mlを加えて37℃、20分反応し、0.15N苛性
ソーダ1.5mlを加えて反応を止め、毎分3000回転、
５分間遠心することにより得た上清液の420nmに
おける吸光度(a)を測定した。同時に上記検体を含
まない、蒸留水のみを加えた対照の吸光度(b)を測
定し、阻害率を（ｂ−ａ）／ｂ×100により計算
した。この方法で本発明化合物は3.4×10^-6Mで
50％阻害濃度（IC₅₀）を示した。 本発明化合物は、生産菌の培養液中に主として
存在する。培養液中の本物質の分離精製は、微生
物の生産する代謝産物をその微生物の培養物から
の採取するのに通常使用される分離手段が適宜使
用される。本発明化合物は、水溶性酸性物質であ
るので例えば次のような精製方法が利用できる。 培養ろ液を陽イオン交換樹脂、例えばダイヤイ
オンPK―216（H⁺）（三菱化成社）カラムに流し、
このカラムに吸着しない通過液を活性炭に吸着さ
せ、含水メタノール、含水アセトンなどで溶出
し、有効成分を集めて濃縮し、DEAE―セフアデ
ツクス（フアルマシア社）に吸着させ、ギ酸ナト
リウムにて溶出することにより精製し、ダイヤイ
オンPK―216（H⁺）にて脱塩を行うことにより本
発明化合物を得ることができる。 次に本発明化合物の理化学的性状について述べ
る。 本発明化合物は、水、希塩酸およびトリフルオ
ロ酢酸に可溶であるが、アセトン、酢酸エチル、
ベンゼンに難溶である。 本発明化合物は、ニンヒドリン、ライドン―ス
ミス試薬、モリブデン酸アンモニウム―過塩素酸
（Hanes試薬）、および過マンガン酸カリウムの諸
反応に陽性で、２，４―ジニトロフエニルヒドラ
ジン、ポーリイ試薬、坂口試薬、エーリツヒ試
薬、レゾルシン―塩酸の諸反応は陰性である。 本発明化合物の薄層クロマトグラフイーはシリ
カゲル（E.メルク社）を用い、展開溶媒として、
ｎ―ブタノール：酢酸：水（３：１：１）の系で
Rf0.21を与えた。 ギ酸：酢酸：水（25：75：900）を用いた
600V、１時間の紙電気泳動では、本発明化合
物は、アラニンを１とした場合、Rm値0.058を示
した。 本発明化合物は、６規定塩酸中、窒素置換した
封管中にて、105℃、24時間加熱加水分解すると、
グルタミン酸、セリン、イソロイシン、およびイ
ソロイシル・イソロイシンが得られる。また、加
水分解液からモリブデン酸アンモニウム―FeSO₄
試薬によりリン酸が検出される。 以上のことより本発明化合物はリン酸を含むペ
プチドであると推定されるが、発明者による構造
決定の結果、本発明化合物は、次式(1)の如く新規
な構造を有するリン酸ペンタペプチドであること
が判明した。 上記の諸性状および構造決定の結果から、本発
明化合物に類似の既知代謝物質および化合物は見
当らず、本発明者らは、本発明化合物を新規な微
生物代謝物質であると認めた。 式(1)のペンタペプチドはそのカルボキシル基及
び／又はリン酸基における塩、特に薬学的に無害
な金属カチオンとの塩であることができ、またそ
のアミノ基における薬学的に無害な酸との酸付加
塩であることができる。また薬学的に無害なエス
テル形成基、例えばアルキル又はベンジル基など
とのエステルの形であることもでき、さらに水和
物の形であることもできる。 以下、本発明化合物のロイケミアＬ―1210細胞
に対する効果について検討した結果について述べ
る。 本発明化合物の共存下にて、Ｌ―1210 １×10²
個を37℃で１時間培養し、BDF₁マウスの尾静脈
内に静脈注射することで癌細胞を移植し、次式に
より延命効果を算出した。 Ｔ／Ｃ×100＝Ｔ／Ｃ％ Ｔ：投与群平均生存日数 Ｃ：対照群平均生存日数 結果は、表２に示す。

【表】 以上のような、本発明化合物のＬ―1210細胞に
対する効果は、本発明化合物が制癌剤として利用
され得ることが期待できる。 以下に本発明化合物の製造例を実施例として掲
げるがこれに限定されるものではない。 実施例 アルカリフオスフアターゼ阻害作用を有する物
質を産生するBMG59―R2株（FERM―P6177
号）の斜面培養から、１白金耳量をグルコース１
％、ポリペプトン１％、肉エキス0.5％、NaCl0.5
％を含む培地に接種し、28℃にて48時間振盪培養
して種培養を得た。次に、グリセリン３％、カゼ
イン３％、NaCl0.1％、K₂HPO₄0.1％、
MgSO₄・7H₂O0.3％、CuSO₄・5H₂O0.0007％、
FeSO₄・7H₂O0.0001％、MnCl₂・4H₂O0.0008％、
ZnSO₄.7H₂O0.0002％を含む液体培地30に上記
の種培養を２％容接種し、28℃で27時間振盪培養
した。この培養液を遠心分離機にかけて菌体を除
去すると、上澄液25が得られた。これをダイヤ
イオンPK―216（H⁺）カラムに流し、通過液をカ
ーボンカラムに吸着させた。このカーボンカラム
を水洗後80％メタノールにて溶出させ、溶出液を
減圧濃縮乾固すると飴状残渣が得られた。この残
渣を水に溶解してDEAE―セフアデツクス（ギ酸
型）に吸着させ、ギ酸ナトリウム溶液０〜0.5M
の直線濃度勾配で溶出させ、アルカリフオスフア
ターゼ阻害活性部分をダイヤイオンPK―216
（H⁺）にて脱塩して、溶出液を濃縮乾固すると、
前出の式(1)の本発明化合物ペンタペプチドが白色
粉末として100mg得られた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次式 で表わされる新生理活性ペンタペプチド、製薬学
   的に許容しうるその塩およびそれらの水和物。 ２ バチルス属に属し且つ次式 で示されるペンタペプチドを生産する菌を培養
   し、培養物中から該ペンタペプチド又はその塩又
   は水和物を採取することを特徴とする該ペンタペ
   プチド又はその塩又は水和物の製造法。