JPH0142673B2 - - Google Patents
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- JPH0142673B2 JPH0142673B2 JP58037530A JP3753083A JPH0142673B2 JP H0142673 B2 JPH0142673 B2 JP H0142673B2 JP 58037530 A JP58037530 A JP 58037530A JP 3753083 A JP3753083 A JP 3753083A JP H0142673 B2 JPH0142673 B2 JP H0142673B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- pykl
- gene
- cerevisiae
- restriction enzyme
- Prior art date
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
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- Microbiology (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
本発明は酵母キヤンデイダ・ユテイリス
（Candida utilis以後C.utilisと略記する）に由来
する遺伝子を含有する新規な雑種プラスミドおよ
びそれを含有する微生物に関する。 一般に、遺伝子操作における宿主として大腸菌
が用いられているが高等生物の作る有用物質（イ
ンシユリンや生長ホルモンなど）の微生物生産に
は、酵母のような真核生物を宿主とする方が有利
だと考えられる。また、Ｂ型肝炎ウイルス表層抗
原遺伝子のように大腸菌では生産されず、酵母で
その生産が確認された例も報告されている。
（Atsushi Miyanohara等Proc.Natl.Acad.Sci.
USA80、１−５（1983） 現在では、宿主用の酵母としてサツカロミセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae、
以後S.cerevisiaeと略記する。）のみが許可され
ているにすぎない。 しかしながら微生物菌体の大規模な工業生産に
は、亜硫酸パルプ廃液発酵や石油発酵の様に、キ
ヤンデイダ属酵母が一般的に使用されている。ま
た、キヤンデイダ属は、炭素資化域が広いことな
ど、S.cerevisiaeに較べて実用上、多くの有利な
性質を有しているために、遺伝子操作技術を用い
て、高等生物に由来する有用物質を生産する際の
宿主菌としての役割が期待される。 なかでも、キヤンデイダ・ユテイリス（C.
utilis）は、食料飼料用酵母として安全性は既に
実証済みであり、今日では、グルタチオンやコエ
ンザイムＡ（CoA）などの有用医薬品や臨床検査
薬の生産菌としてその重要性が増している。 本発明者等は、遺伝子操作技術におけるC.
utilisの宿主でベクター系の開発を目標に、まず
C.utilisの特定遺伝子を選択マーカーとして含有
するベクターの開発を検討した結果、目的とする
新規な雑種プラスミドの作成に成功し本発明を完
成した。 本発明では、クローニングベクターとしてS.
cerevisiaeとE.coliとの共用ベクターであるYRp7
（K.StruhlらProc.Natl.Acad.Sci.76 1035
（1979））を用いた。即ち、YRp7の制限酵素
BamHI部位にC.utilisATTCC9226DNAの制限
酵素Sau3AI部分分解断片を連結させたプラスミ
ド混合物でE.coliRRI株（leuB）を形質転換さ
せ、leu+となる株を選択した。尚、E.coliのleuB
変異はS.cerevisiaeのLEU2遺伝子によつて相補
されることが既に確認されている。（（B.Ratzkin
and J.Carbon：Proc.Natl.Acad.Sci.74487
（1977））．その結果アンピシリン耐性を示し、
leuB変異を相補するコロニーが得られた。この
大腸菌の形質転換体より分離したプラスミドを
pYKL−30と命名した。 本プラスミドは、10.7キロベース（Kb）（6.4メ
ガダルトン（Md））の分子量をもち、アンピシ
リン耐性、TRP1およびLEU2遺伝子を有する。
制限酵素地図および大体の構成を第１図に示し
た。ここでクローニングされた約4.9KbのLEU2
遺伝子は、Southern hybridization（E.M.
Southern、J.Mol.Biol.98503（1975））の結果、C.
utilis由来であることを確認した。 また、本プラスミドによりS.cerevisiaeDBY−
746（Trp1、leu2）を形質転換した結果、C.utilis
由来のLEU2遺伝子が、S.cerevisiaeのleu2を相
補することが見出された。C.utilisの遺伝子がS.
cerevisiaeで発現されたことは、初めての例であ
る。 次に、C.utilisの遺伝子とpBR322だけから成る
プラスミドを作成するため、S.cerevisiaeの由来
のTrp1geneを除去した。pYKL−30を制限酵素
EcoRIにより部分分解し、再び連結した。この混
合物によつて、E.coli JA300（leuB、TrpC）を
形質転換し、アンピシリン耐性およびleu+の株を
選択した。続いて、レプリカ法によつて、トリプ
トフアン要求性を調べ、trp-株を選択した。この
leu+およびtrp-を示すコロニーからプラスミドを
分離し、目的とするTrp1遺伝子を除き、C.utilis
のLEU2とpBR322とから成るプラスミドpYKL
−40を取得した。 本プラスミドは、9.25Kb（5.55Md）アンピシリ
ン耐性およびLEU2遺伝子のマーカーを持ち第２
図に示す制限酵素地図を有する。 本プラスミドのサブクローニング解析の結果、
LEU2遺伝子は、図に示す部位に位置することが
わかつた。 YRp7のTRP1遺伝子部分を切り出し、本プラ
スミドのEcoRI部分分解物に導入すればpYKL−
30を再構築することができるし、2μmDNAなど、
S.cerevisiaeで増殖可能な断片を連結させ、酵母
と大腸菌との新たな共用ベクターを作成すること
も可能である。 このサブクローニング解析データをもとに
pYKL−40から制限酵素Hfndにより、LEU2遺
伝子部分を含む約2.5Kbの断片を切り出し、
pBR322のHind部位に連結した結果、アンピシ
リン耐性およびLEU2遺伝子を含み、更に都合の
良いことには、テトラサイクリン耐性遺伝子が回
復したプラスミドpYKL−45が得られた。 本プラスミドは、6.9Kb（4.1Md）の分子量をも
ち第３図に示す様に、PstおよびSalの単一制
限酵素部位を有し、C.utilisの複数開始部位や、
他の遺伝子のクローニングベターとして有効であ
る。 本発明により作成したプラスミドの応用例とし
て、第４図に示すプラスミドpYKL−60を作成し
た。即ち、M.J.CaSadabanら（M.J.Casadaban
et al、J.Bact.143971〜980（1980））によつて調製
されたプロモータークローニング用ベクター
pMC1403のlacZ′部分（β−galactosidaseの構造
遺伝子上のブロモーター領域を８コドン欠失）を
BamHとSalで切り出し、pYKL−30の
BamHとSalで切り出される3.9Kb部分に挿
入した。その新たなプラスミドをE.coliのlacZ′株
に形質転換しアンピシリンおよびXgal（５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクト
ース）を含む合成培地上で選択したところ、青色
を示すコロニー即ち、lacZ+株でのみ、目的とす
るプラスミドpYKL−60を含有していた。このこ
とは、pYKL−30が、異種遺伝子産物を同様の手
法により発現しうることを示しており、本プラス
ミドに発現ベクターとしての役割が期待される。
また、他のpYKL−40やpYKL−45は大腸菌での
発現ベクターやC.utilisDNAの複製開始点のクロ
ーニングベクターとして使用することができる。 なお、プラスミドpYKL−30、pYKL−40、
pYKL−45をE.coliRR株に、pYKL−60をE.
coliMC1061株に、またpYKL−30をS.
cerevisiaeDBY−746株に夫々移入した株は、工
業技術院微生物工業技術研究所に各々受託番号、
微工研菌寄第6927号（FERM Ｐ−6927）、同第
6928号（FERM Ｐ−6732）、同第6945号
（FERM Ｐ−6945）、同第6958号（FERM Ｐ−
6958）、および同第6944号（FERM Ｐ−6944）
として寄託された。 本発明のプラスミドを移入したE.coliまたはS.
cerevisiaeは公知の親株と同じ菌学的性質を示す
ほか次の第１表に示す特徴を有する。
（Candida utilis以後C.utilisと略記する）に由来
する遺伝子を含有する新規な雑種プラスミドおよ
びそれを含有する微生物に関する。 一般に、遺伝子操作における宿主として大腸菌
が用いられているが高等生物の作る有用物質（イ
ンシユリンや生長ホルモンなど）の微生物生産に
は、酵母のような真核生物を宿主とする方が有利
だと考えられる。また、Ｂ型肝炎ウイルス表層抗
原遺伝子のように大腸菌では生産されず、酵母で
その生産が確認された例も報告されている。
（Atsushi Miyanohara等Proc.Natl.Acad.Sci.
USA80、１−５（1983） 現在では、宿主用の酵母としてサツカロミセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae、
以後S.cerevisiaeと略記する。）のみが許可され
ているにすぎない。 しかしながら微生物菌体の大規模な工業生産に
は、亜硫酸パルプ廃液発酵や石油発酵の様に、キ
ヤンデイダ属酵母が一般的に使用されている。ま
た、キヤンデイダ属は、炭素資化域が広いことな
ど、S.cerevisiaeに較べて実用上、多くの有利な
性質を有しているために、遺伝子操作技術を用い
て、高等生物に由来する有用物質を生産する際の
宿主菌としての役割が期待される。 なかでも、キヤンデイダ・ユテイリス（C.
utilis）は、食料飼料用酵母として安全性は既に
実証済みであり、今日では、グルタチオンやコエ
ンザイムＡ（CoA）などの有用医薬品や臨床検査
薬の生産菌としてその重要性が増している。 本発明者等は、遺伝子操作技術におけるC.
utilisの宿主でベクター系の開発を目標に、まず
C.utilisの特定遺伝子を選択マーカーとして含有
するベクターの開発を検討した結果、目的とする
新規な雑種プラスミドの作成に成功し本発明を完
成した。 本発明では、クローニングベクターとしてS.
cerevisiaeとE.coliとの共用ベクターであるYRp7
（K.StruhlらProc.Natl.Acad.Sci.76 1035
（1979））を用いた。即ち、YRp7の制限酵素
BamHI部位にC.utilisATTCC9226DNAの制限
酵素Sau3AI部分分解断片を連結させたプラスミ
ド混合物でE.coliRRI株（leuB）を形質転換さ
せ、leu+となる株を選択した。尚、E.coliのleuB
変異はS.cerevisiaeのLEU2遺伝子によつて相補
されることが既に確認されている。（（B.Ratzkin
and J.Carbon：Proc.Natl.Acad.Sci.74487
（1977））．その結果アンピシリン耐性を示し、
leuB変異を相補するコロニーが得られた。この
大腸菌の形質転換体より分離したプラスミドを
pYKL−30と命名した。 本プラスミドは、10.7キロベース（Kb）（6.4メ
ガダルトン（Md））の分子量をもち、アンピシ
リン耐性、TRP1およびLEU2遺伝子を有する。
制限酵素地図および大体の構成を第１図に示し
た。ここでクローニングされた約4.9KbのLEU2
遺伝子は、Southern hybridization（E.M.
Southern、J.Mol.Biol.98503（1975））の結果、C.
utilis由来であることを確認した。 また、本プラスミドによりS.cerevisiaeDBY−
746（Trp1、leu2）を形質転換した結果、C.utilis
由来のLEU2遺伝子が、S.cerevisiaeのleu2を相
補することが見出された。C.utilisの遺伝子がS.
cerevisiaeで発現されたことは、初めての例であ
る。 次に、C.utilisの遺伝子とpBR322だけから成る
プラスミドを作成するため、S.cerevisiaeの由来
のTrp1geneを除去した。pYKL−30を制限酵素
EcoRIにより部分分解し、再び連結した。この混
合物によつて、E.coli JA300（leuB、TrpC）を
形質転換し、アンピシリン耐性およびleu+の株を
選択した。続いて、レプリカ法によつて、トリプ
トフアン要求性を調べ、trp-株を選択した。この
leu+およびtrp-を示すコロニーからプラスミドを
分離し、目的とするTrp1遺伝子を除き、C.utilis
のLEU2とpBR322とから成るプラスミドpYKL
−40を取得した。 本プラスミドは、9.25Kb（5.55Md）アンピシリ
ン耐性およびLEU2遺伝子のマーカーを持ち第２
図に示す制限酵素地図を有する。 本プラスミドのサブクローニング解析の結果、
LEU2遺伝子は、図に示す部位に位置することが
わかつた。 YRp7のTRP1遺伝子部分を切り出し、本プラ
スミドのEcoRI部分分解物に導入すればpYKL−
30を再構築することができるし、2μmDNAなど、
S.cerevisiaeで増殖可能な断片を連結させ、酵母
と大腸菌との新たな共用ベクターを作成すること
も可能である。 このサブクローニング解析データをもとに
pYKL−40から制限酵素Hfndにより、LEU2遺
伝子部分を含む約2.5Kbの断片を切り出し、
pBR322のHind部位に連結した結果、アンピシ
リン耐性およびLEU2遺伝子を含み、更に都合の
良いことには、テトラサイクリン耐性遺伝子が回
復したプラスミドpYKL−45が得られた。 本プラスミドは、6.9Kb（4.1Md）の分子量をも
ち第３図に示す様に、PstおよびSalの単一制
限酵素部位を有し、C.utilisの複数開始部位や、
他の遺伝子のクローニングベターとして有効であ
る。 本発明により作成したプラスミドの応用例とし
て、第４図に示すプラスミドpYKL−60を作成し
た。即ち、M.J.CaSadabanら（M.J.Casadaban
et al、J.Bact.143971〜980（1980））によつて調製
されたプロモータークローニング用ベクター
pMC1403のlacZ′部分（β−galactosidaseの構造
遺伝子上のブロモーター領域を８コドン欠失）を
BamHとSalで切り出し、pYKL−30の
BamHとSalで切り出される3.9Kb部分に挿
入した。その新たなプラスミドをE.coliのlacZ′株
に形質転換しアンピシリンおよびXgal（５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクト
ース）を含む合成培地上で選択したところ、青色
を示すコロニー即ち、lacZ+株でのみ、目的とす
るプラスミドpYKL−60を含有していた。このこ
とは、pYKL−30が、異種遺伝子産物を同様の手
法により発現しうることを示しており、本プラス
ミドに発現ベクターとしての役割が期待される。
また、他のpYKL−40やpYKL−45は大腸菌での
発現ベクターやC.utilisDNAの複製開始点のクロ
ーニングベクターとして使用することができる。 なお、プラスミドpYKL−30、pYKL−40、
pYKL−45をE.coliRR株に、pYKL−60をE.
coliMC1061株に、またpYKL−30をS.
cerevisiaeDBY−746株に夫々移入した株は、工
業技術院微生物工業技術研究所に各々受託番号、
微工研菌寄第6927号（FERM Ｐ−6927）、同第
6928号（FERM Ｐ−6732）、同第6945号
（FERM Ｐ−6945）、同第6958号（FERM Ｐ−
6958）、および同第6944号（FERM Ｐ−6944）
として寄託された。 本発明のプラスミドを移入したE.coliまたはS.
cerevisiaeは公知の親株と同じ菌学的性質を示す
ほか次の第１表に示す特徴を有する。
【表】
＊ 微工研菌寄番号
以下実施例をあげて本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ プラスミドpYKL−30の調製 S.cerevisiaeで既に知られている方法（J.R.
Broach et al.、Gene8 121〜133（1979））に従つ
て、C.utilisATCC9226のDNA部分消化物とプラ
スミドYRp7とを連結した雑種プラスミドの作成
を行い、大腸菌（leu-株）に形質転換した結果、
leu+を示す株を分離しその株より目的とするプラ
スミドpYKL−30を抽出した。 即ち、プラスミドYRp7 10μｇを制限酵素Bam
H140単位により、37℃、１時間消化し続いてア
ルカリ性フオスフアターゼ処理（１単位、60℃、
30分間）し5′末端のリンを除いた。別にC.
utilisDNAを制限酵素Sau3A0.5単位により部
分消化し、その断片と前記プラスミドとを混合
し、T4リガーゼ0.1単位により15℃、16時間連結
反応を行う。 一方、事前に普通ブイヨン培地で対数増殖中期
まで培養したE.coli RR株（leuB-）を、
50mM塩化カルシウム水溶液に懸濁し、０℃30分
間放置した中に、前記連結混合物を加え更に、０
℃、30分間処理し、形質転換を完了する。形質転
換体は、アンピシリン100μｇ／mlを含有する普
通ブイヨン寒天培地上で、37℃、16〜24時間培養
し、生じたコロニーを、レプリカ法により、プロ
リンとチアミン各25μｇ／mlを含むDavis最小培
地に移し生じるコロニーを選択する。この様にし
て得られたコロニーから分離したプラスミドが
pYKL−30である。 実施例 ２ プラスミドpYKL−40の調製 実施例１で得られたプラスミドpYKL−305μｇ
を制限酵素Eoc Ｒ５単位により37℃、15分間
部分消化し、T4−リガーゼにより連結する
（0.05単位、15℃、16時間）。この混合プラスミド
によつてE.coli JA−300株（leuB、trpC）を形
質転換してアンピシリン100μｇ／ml、トリプト
フアン、スレオニン、チミンおよびチアミンを
各々25γ／ml含むDavis最小培地(1)で、37℃、24
〜48時間培養する。生じたコロニーをレプリカ法
により培地(1)からトリプトフアンを除いた培地(2)
での生育を調べる。その結果、培地(1)でのみ生育
し、培地(2)で増殖しないコロニーから分離したプ
ラスミドがpYKL−40である。 実施例 ３ プラスミドpYKL−45の調製 実施例２で得られたプラスミドpYKL−40 10μ
ｇを制限酵素Hind40単位により37℃、１時間
消化し、0.8％アガロースゲルにて各断片を分画
する。エチジウムプロミド染色後、紫外線照射下
で、約2.5Kbの断片を切り出し、ゲル内のDNA
断片を凍結融解法によつて抽出する。 一方、pBR322 2μｇをHind８単位で37℃、
１時間消化後、アルカリ性フオスアターゼ処理
（0.2単位、60℃、１時間）し、前記2.5Kb断片と
を混合、T4−リガーゼにより両者を連結させて、
E.coli RR（leu-）株に形質転換する。次に、
アンピシリン100γ／ml、プロリンおよびチミン
各25γ／mlを含むDavis最少倍地に撒き、37℃、
24〜48時間培養する。生じたコロニーについて、
テトラサイクリン25γ／mlを含有する普通ブイヨ
ン培地に移し、耐性を示したコロニーから分離し
たプラスミドがpYKL−45である。 参考例 １ プラスミドpYKL−60の調製 実施例１において得られたプラスミドpYKL−
30 10μｇを、制限酵素BamHおよびSal各40
単位で37℃、１時間消化し、0.8％アガローマゲ
ルにて、各断片を分画する。一方、プラスミド
pMC1403 10μｇを、同様にBamHおよびSal
にて消化し、0.8％アガローマゲルにて分画する。
前者においては、6.9Kb断片、後者においては
6.2Kb断片を各々抽出し、T4−リガーゼにより両
者を連結する。次に、E.coliMC1061（lacZ′）に
形質転換し、アンピシリン100γ／mlを含む普通
ブイロン培地上で37℃、16〜24時間培養する。生
じたコロニーをXgal（５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルβ−ガラクトース）、アラニンお
よびロイシン各25γ／mlを含むDavis最少培地上
に、ストリークし、β−galactosidase生産を示
す青色のコロニーを分離した。そのコロニーより
得られたプラスミドがpYKL−60である。 実施例 ４ 雑種プラスミドpYKL−30のS.cerevisiaeでの
発現 プラスミドpYKL−30によるS.cerevisiaeDBY
−746の形質転換を行つた。形質転換は、酢酸リ
チウム法（村田ら、日本農芸化学会、57年度溝演
要旨集、P568（1982））を用いた。即ち、YEPD
培養液10mlにより、O.D.1.0付近まで培養し、集
菌後0.5mlの0.2M酢酸リチウムに懸濁し、28℃、
１時間振とうし、その0.1mlをとり、10μｇの
pYKL−30を加え30℃、30分間放置する。70％ポ
リエチレングリコール4000を0.1ml加え30℃、１
時間放置する。42℃、５分間処理したあと、ウラ
シルおよびヒスチジン各25γ／mlを含有する酵母
用アミノ酸要求最少培地に撒くとき、30℃、２〜
４日間後にプラスミドpYKL−30により形質転換
された目的のコロニーが得られた。
以下実施例をあげて本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ プラスミドpYKL−30の調製 S.cerevisiaeで既に知られている方法（J.R.
Broach et al.、Gene8 121〜133（1979））に従つ
て、C.utilisATCC9226のDNA部分消化物とプラ
スミドYRp7とを連結した雑種プラスミドの作成
を行い、大腸菌（leu-株）に形質転換した結果、
leu+を示す株を分離しその株より目的とするプラ
スミドpYKL−30を抽出した。 即ち、プラスミドYRp7 10μｇを制限酵素Bam
H140単位により、37℃、１時間消化し続いてア
ルカリ性フオスフアターゼ処理（１単位、60℃、
30分間）し5′末端のリンを除いた。別にC.
utilisDNAを制限酵素Sau3A0.5単位により部
分消化し、その断片と前記プラスミドとを混合
し、T4リガーゼ0.1単位により15℃、16時間連結
反応を行う。 一方、事前に普通ブイヨン培地で対数増殖中期
まで培養したE.coli RR株（leuB-）を、
50mM塩化カルシウム水溶液に懸濁し、０℃30分
間放置した中に、前記連結混合物を加え更に、０
℃、30分間処理し、形質転換を完了する。形質転
換体は、アンピシリン100μｇ／mlを含有する普
通ブイヨン寒天培地上で、37℃、16〜24時間培養
し、生じたコロニーを、レプリカ法により、プロ
リンとチアミン各25μｇ／mlを含むDavis最小培
地に移し生じるコロニーを選択する。この様にし
て得られたコロニーから分離したプラスミドが
pYKL−30である。 実施例 ２ プラスミドpYKL−40の調製 実施例１で得られたプラスミドpYKL−305μｇ
を制限酵素Eoc Ｒ５単位により37℃、15分間
部分消化し、T4−リガーゼにより連結する
（0.05単位、15℃、16時間）。この混合プラスミド
によつてE.coli JA−300株（leuB、trpC）を形
質転換してアンピシリン100μｇ／ml、トリプト
フアン、スレオニン、チミンおよびチアミンを
各々25γ／ml含むDavis最小培地(1)で、37℃、24
〜48時間培養する。生じたコロニーをレプリカ法
により培地(1)からトリプトフアンを除いた培地(2)
での生育を調べる。その結果、培地(1)でのみ生育
し、培地(2)で増殖しないコロニーから分離したプ
ラスミドがpYKL−40である。 実施例 ３ プラスミドpYKL−45の調製 実施例２で得られたプラスミドpYKL−40 10μ
ｇを制限酵素Hind40単位により37℃、１時間
消化し、0.8％アガロースゲルにて各断片を分画
する。エチジウムプロミド染色後、紫外線照射下
で、約2.5Kbの断片を切り出し、ゲル内のDNA
断片を凍結融解法によつて抽出する。 一方、pBR322 2μｇをHind８単位で37℃、
１時間消化後、アルカリ性フオスアターゼ処理
（0.2単位、60℃、１時間）し、前記2.5Kb断片と
を混合、T4−リガーゼにより両者を連結させて、
E.coli RR（leu-）株に形質転換する。次に、
アンピシリン100γ／ml、プロリンおよびチミン
各25γ／mlを含むDavis最少倍地に撒き、37℃、
24〜48時間培養する。生じたコロニーについて、
テトラサイクリン25γ／mlを含有する普通ブイヨ
ン培地に移し、耐性を示したコロニーから分離し
たプラスミドがpYKL−45である。 参考例 １ プラスミドpYKL−60の調製 実施例１において得られたプラスミドpYKL−
30 10μｇを、制限酵素BamHおよびSal各40
単位で37℃、１時間消化し、0.8％アガローマゲ
ルにて、各断片を分画する。一方、プラスミド
pMC1403 10μｇを、同様にBamHおよびSal
にて消化し、0.8％アガローマゲルにて分画する。
前者においては、6.9Kb断片、後者においては
6.2Kb断片を各々抽出し、T4−リガーゼにより両
者を連結する。次に、E.coliMC1061（lacZ′）に
形質転換し、アンピシリン100γ／mlを含む普通
ブイロン培地上で37℃、16〜24時間培養する。生
じたコロニーをXgal（５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルβ−ガラクトース）、アラニンお
よびロイシン各25γ／mlを含むDavis最少培地上
に、ストリークし、β−galactosidase生産を示
す青色のコロニーを分離した。そのコロニーより
得られたプラスミドがpYKL−60である。 実施例 ４ 雑種プラスミドpYKL−30のS.cerevisiaeでの
発現 プラスミドpYKL−30によるS.cerevisiaeDBY
−746の形質転換を行つた。形質転換は、酢酸リ
チウム法（村田ら、日本農芸化学会、57年度溝演
要旨集、P568（1982））を用いた。即ち、YEPD
培養液10mlにより、O.D.1.0付近まで培養し、集
菌後0.5mlの0.2M酢酸リチウムに懸濁し、28℃、
１時間振とうし、その0.1mlをとり、10μｇの
pYKL−30を加え30℃、30分間放置する。70％ポ
リエチレングリコール4000を0.1ml加え30℃、１
時間放置する。42℃、５分間処理したあと、ウラ
シルおよびヒスチジン各25γ／mlを含有する酵母
用アミノ酸要求最少培地に撒くとき、30℃、２〜
４日間後にプラスミドpYKL−30により形質転換
された目的のコロニーが得られた。
第１図−プラスミドpYKL−30の制限酵素地
図、第２図−プラスミドpYKL−40の制限酵素地
図、第３図−プラスミドpYKL−45の制限酵素地
図、第４図−プラスミドpYKL−60の制限酵素地
図。 図中 pBR322、S.CerevisiaeTRP1
遺伝子、．utilisLEU2遺伝子、E.coli
lacZ′遺伝子。
図、第２図−プラスミドpYKL−40の制限酵素地
図、第３図−プラスミドpYKL−45の制限酵素地
図、第４図−プラスミドpYKL−60の制限酵素地
図。 図中 pBR322、S.CerevisiaeTRP1
遺伝子、．utilisLEU2遺伝子、E.coli
lacZ′遺伝子。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 少くともバクテリアプラスミドDNAと、酵
母キヤンデイダ・ユテイリスATCC9226の制限酵
素Sau3AIによる部分分解断片由来であつてサツ
カロミセス・セレビシエのLEU2遺伝子を相補す
るLEU2遺伝子とからなる雑種プラスミド。 ２ 酵母サツカロミセス・セレビシエのTRP1遺
伝子をも含むことを特徴とする特許請求の範囲第
１項の雑種プラスミド。 ３ プラスミドがpYKL−30である特許請求の範
囲第１項の雑種プラスミド。 ４ プラスミドがpYKL−40である特許請求の範
囲第２項の雑種プラスミド。 ５ 少くともバクテリアプラスミドDNAと、酵
母キヤンデイダ・ユテイリスATCC9226の制限酵
素Sau3AIによる部分分解断片由来であつてサツ
カロミセス・セレビシエのLEU2遺伝子を相補す
るLEU2遺伝子とからなり、更に酵母サツカロミ
セス・セレビシエのTRP1遺伝子を含んでもよい
雑種プラスミドの制限酵素Hindにより切り出
される酵母キヤンデイダ・ユテイリスATCC9226
のLEU2遺伝子を含む断片をプラスミドpBR322
のHind部位に挿入してなりテトラサイクリン
耐性遺伝子が回復したことを特徴とする雑種プラ
スミド。 ６ プラスミドがpYKL−45である特許請求の範
囲第５項記載の雑種プラスミド。 ７ pYKL−30、pYKL−40、pYKL−45から選
ばれる雑種プラスミドを含有する大腸菌。 ８ プラスミドpYKL−30を含有する酵母サツカ
ロミセス・セレビシエ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58037530A JPS59162884A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | 新規な雑種プラスミドおよびそれを含有する微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58037530A JPS59162884A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | 新規な雑種プラスミドおよびそれを含有する微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59162884A JPS59162884A (ja) | 1984-09-13 |
| JPH0142673B2 true JPH0142673B2 (ja) | 1989-09-13 |
Family
ID=12500088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58037530A Granted JPS59162884A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | 新規な雑種プラスミドおよびそれを含有する微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59162884A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995032289A1 (en) * | 1994-05-25 | 1995-11-30 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transformant line of candida utilis yeast and expression of heterogene therewith |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3788764T2 (de) * | 1986-09-16 | 1994-06-23 | Gist Brocades Nv | Penicilliumtransformanten und Verfahren zu ihrer Herstellung. |
| CU22722A1 (es) * | 1996-10-03 | 2002-02-28 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Sistema de transformación para la expresión de genes heterólogos en la levadura candida utilis |
-
1983
- 1983-03-09 JP JP58037530A patent/JPS59162884A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995032289A1 (en) * | 1994-05-25 | 1995-11-30 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Transformant line of candida utilis yeast and expression of heterogene therewith |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59162884A (ja) | 1984-09-13 |
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