JPH0142674B2 - - Google Patents

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JPH0142674B2
JPH0142674B2 JP58038089A JP3808983A JPH0142674B2 JP H0142674 B2 JPH0142674 B2 JP H0142674B2 JP 58038089 A JP58038089 A JP 58038089A JP 3808983 A JP3808983 A JP 3808983A JP H0142674 B2 JPH0142674 B2 JP H0142674B2
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plasmid
dna
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escherichia coli
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Toshiaki Kudo
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RIKEN
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、新規プラスミド及びその調製方法並
びに該プラスミドを含有する新規微生物に関し、
代謝産物であるペニシリナーゼの菌体外選択生産
に関与する特定の遺伝情報を担うデオキシリボ核
酸（DNA）を組み込んだ新規プラスミドと該プ
ラスミドによつて形質転換した新規微生物を提供
することを目的とするものである。 プラスミドは、微生物の細胞内に見出される染
色体外遺伝子で、そのDNAの円形分子であり、
近年、微生物の遺伝子組み換えの手段として利用
され、発酵工業の分野の研究におけるその重要性
は益々増大して来ている。 近年、アミノ酸やペプチドの例にみられるよう
に、微生物の生育に必要とする特定の要求性や代
謝産物の生産能に関与する遺伝情報を担うDNA
を租み込んだプラスミドについての研究がなさ
れ、また若干のプラスミドが宿主微生物に導入さ
れ、その形質転換株が得られている。 本発明は、バチルス（Bacillus）属に属する微
生物の代謝産物であるペニシリナーゼの菌体外選
択生産に関与する遺伝情報を担うDNAを組み込
んだ新規プラスミドを調製することに成功し、更
にプラスミドをエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）HB101株に導入して新規且
つ有用な形質転換株、エシエリヒア・コリ
（Escherichia clli）HB101（pEAP2）を得ること
に成功して本発明を完成するに至つた。 以下、本発明について詳細に説明する。 本発明において用いられる宿主微生物は、エシ
エリヒア属のプラスミドとして知られるコリシン
E1因子等の、培養された細胞内で増殖し得る形
式をとるプラスミド（ベクターDNA）に、外来
の遺伝子DNAとしてバチルス属に属する微生物、
バチルス・No.170菌（微工研菌寄第3221号）から
調製された染色体DNA断片を組み込んだプラス
ミドを含有する、エシエリヒア・コリによつて代
表されるエシエリヒア属に属する微生物である。 前記ベクターDNAに組み込まれる、バチル
ス・No.170菌から調製された染色体DNA断片は、
前記バチルス属菌の代謝産物であるペニシリナー
ゼの菌体外選択生産に関与する遺伝情報を担う
DNAであり、前記ベクターDNAとしては、天然
に存在するものを抽出したものゝ他、増殖に必要
な部分以外のDNAの部分が一部欠落しているも
のでもよく、例えばColE1の系統、pMB9の系統、
pSC101の系統、R6Kの系統、ラムダーフアージ
の系統等が挙げられる。 また、前記ベクターDNAに前記染色体DNA断
片を組み込む方法は、既知のいずれの方法も適用
し得る。例えば、適当な制限酵素
（Endonuclease）を選択、処理してDNAを特定
部位で切断し、次いで同様に処理したベクターと
して用いるDNAと混合し、リガーゼによつて再
結合する方法が用いられる。このようにして得ら
れた前記染色体のDNA断片とベクターDNAの結
合物を、形質転換法によつて受容菌であるエシエ
リヒア属の微生物の菌体に導入し、遺伝形質とし
て安定するまで増殖すると所望の染色体上の遺伝
形質とベクターDNAの形質を併せもつ形質転換
株が得られる。 後述の実施例において得られる形質転換株は、
ベクターDNAとしてpMB9プラスミドのDNAを
用い、これにバチルス・No.170菌から調製された
染色体DNA断片を組み込んで得られた新規
pEAP2プラスミドを、エシエリヒア・コリ
HB101株（エシエリヒア・コリＫ−12株とエシ
エリヒア・コリＢ株のハイブリツド株）に導入し
て形質転換反応により得られる新規微生物であ
り、エシエリヒア・コリHB101（pEAP2）
〔Escherichia coli HB101（pEAP2）〕（微工研菌
寄第6939号（FERMP−6939）と呼称される。前
記エシエリヒア・コリHB101（pEAP2）の
pEAP2プラスミドの制限酵素切断地図は、第４
図に示すとおりである。 第４図から明らかなように、このプラスミド
は、pMB9プラスミドDNAの制限サイトのHind
サイトに前記バチルス・No.170菌のペニシリナ
ーゼの菌体外選択生産に関与する遺伝情報を担う
ペニシリナーゼDNA断片が組み込まれている
DNA円形分子、即ちpMB9プラスミドDNAと約
2000の塩基対のDNAから成る7.7KbのDNA円形
分子である。 次に、前記エシエリヒア・コリHB101
（pEAP2）の菌学的性質は、DNA受容菌である
エシエリヒア・コリHB101株の性質と、ペニシ
リン耐性を除いて、同一であるが〔Molecular
Cloning Ａ Laboratory Manual、p.504（1982）
参照、遺伝形質：F-、hsd Ｓ 20（ｒ B 、ｍ B ）、
rec A13、ara−14、proA2、lacY1、galK2、
rpsL20（Sm′）、xyl−５、mtl−１、supE44λ-〕、
他の特性として、前記pEAP2プラスミドの特性、
即ちペニシリナーゼ生産能の遺伝情報を担う
pEAP2プラスミドによつてペニシリナーゼを菌
体外に選択的に生産せしめる特性を附加して成る
点がその特徴である。 エシエリヒア・コリHB101（pEAP2）によるペ
ニシリナーゼの菌体外選択生産は、後述の実施例
で示されるように、菌体内生産を含めた全酵素生
産の80％以上に達し、且つ長時間その生産量が持
続される。これに対し、公知のエシエリヒア・コ
リHB101（pBR322）によるペニシリナーゼ生産
は、全酵素生産の80％以上が菌体内生産であり、
また公知のバチルス・No.170菌によるペニシリナ
ーゼの菌体外生産は長時間の持続性を欠くもので
あり、これらの点において全く対照的である。 従つて、前記エシエリヒア・コリHB101
（pEAP2）は、従来皆無であつた酵素蛋白の菌体
外選択生産能を有する微生物を創製し、且つペニ
シリナーゼを極めて有利に生産し得る微生物を提
供する点において、新規性と有用性を具備するも
のである。 また、その生産物質は目的とする単一の高分子
物質のみならず、複数の酵素蛋白類がそれぞれ菌
体外に著量に生産（分泌）され、併せて採取する
ことができる。即ち、エシエリヒア・コリ
HB101株の培養により、従来、菌体内にのみ検
出されていたアルカリホスフアターゼ及びβ−ガ
ラクトシダーゼ並びに約10種の蛋白質から成る蛋
白質群が、後述の実施例に記載の如く、それぞれ
菌体外に著量に分泌されることが明らかにされ
た。 これは、本発明によつて得られるpEAP2プラ
スミドに含まれる約2000の塩基対のDNAが、代
謝産物の菌体外選択生産（分泌）能を宿主に附与
していることを意味するものである。 以下に、本発明のプラスミドの調製方法と該プ
ラスミドを含有する前記形質転換株、エシエリヒ
ア・コリHB101（pEAP2）の調製方法並びに前記
形質転換株による効果として、ペニシリナーゼ等
の菌体外選択生産について、実施例により説明す
る。 実施例 １ (1) ペニシリナーゼ生産能の遺伝情報をもつ染色
体DNAの調製 ペニシリナーゼを菌体外に生成、蓄積する能
力を有する好アルカリ性のバチルス・No.170菌
（微工研菌寄第3221号）を培地〔（ｇ／）：グ
リセロール2.0、酵母エキス5.0、ポリペプトン
5.0、K2HPO41.0、MgSO4・7H2O0.2を
NaHCO310でPH9.0に調整したもの〕中、30℃
で19時間振盪培養を行ない、対数増殖後期の菌
体を集菌後、フエノール法によるDNA抽出法
によつて染色体DNAを抽出、精製し、染色体
DNA5mgを得た。 (2) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇをとり、制限エ
ンドヌクレアーゼHindを加え、37℃で５分、
10分、20分、30分、60分反応させて部分的に切
断した。一方、ベクターとして用いるテトラサ
イクリン抵抗性（Tetr）のpMB9プラスミド
DNA（Bethesda Research Laboratories社
（米国）製）をHindで完全に切断して65℃、
５分の熱処理後、前者と混合し、T4フアージ
由来のDNAリガーゼによつて10℃、24時間
DNA鎖の連結反応を行ない、65℃、５分の熱
処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて
染色体DNAを組み込んだプラスミドDNAを沈
澱、採取した。 (3) ペニシリナーゼの菌体外選択生産遺伝子を担
うプラスミドによる形質転換 エシエリヒア・コリＫ−12株とエシエリヒ
ア・コリＢ株のハイブリツド株であるエシエリ
ヒア・コリHB101株〔Molecular Cloning Ａ
Laboratory Manual p.504（1982）参照〕
（遺伝形質：F-、hsd Ｓ 20（ｒ B 、ｍ B ）、rec
A13、ara−14、pro A2、lac Y1、gal K2、
rps L20（Sm′）、xyl−５、mtl−１、sup
E44λ-）をLB培地（純水１当りトリプトン
（Difco）10ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース
１ｇ、NaCl10ｇをPH7.0に調製したもの）10ml
に接種し、37℃で振盪培養を行ない、対数増殖
後期まで生育させた後に集菌した。これを氷冷
下、最終濃度で0.03M CaCl2の溶液に順次懸濁
させてコンピテントな細胞とした。この細胞懸
濁液に(2)で得たプラスミドDNAの溶解液を加
えて氷冷下で60分反応させ、42℃、１〜２分間
ヒートシヨツクを与えて前記プラスミドDNA
を細胞内に取り込ませた。次いで、この細胞懸
濁液を別途、前記LB培地に接種し、37℃、３
〜５時間振盪培養して形質転換反応を行なつた
後、集菌、洗滌して形質転換株、エシエリヒ
ア・コリHB101（pEAP2）（微工研菌寄第6939
号）を得た。 実施例 ２ 実施例１の(3)で得られた形質転換株、エシエリ
ヒア・コリHB101（pEAP2）（微工研菌寄第6939
号）（FERM Ｐ−6939）を、LB培地（１当り
トリプトン10ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース１
ｇ、グリセロール２ｇ、NaCl10ｇ）100mlを含む
500ml容のフラスコで37℃にて振盪培養した。細
胞の生育（菌体量の測定）は、波長660nmにおけ
る吸光度（OD）を測定し、菌体外及び菌体内生
産のペニシリナーゼ活性をサージエント
（Sargent）の変法〔Sawai et al；Antimicrob.
Agents Chemother.13、910（1978）参照〕で測
定し、30℃、１分間に１マイクロモル（μmole）
のベンジルペニシリンを水解する酵素量をペニシ
リナーゼ１単位（Ｕ）とした。 前記形質転換株の菌体量は接種後、16時間で最
大に達し、第１図に示すとおり、菌体外ペニシリ
ナーゼの活性はほゞ20時間後から増大しはじめ、
28時間後に最大に達した（≒20U／ml）。 生産されたペニシリナーゼは非常に安定であ
り、第１図ａに示されるように、更にそのまゝ培
養を48時間まで継続しても生産量は減少せず、全
酵素活性の80％以上に達した。これに対して、菌
体内ペニシリナーゼは、培養初期（接種後８〜20
時間）において認められたが、その生産は全酵素
活性の10％程度であり、最高で8U／mlに過ぎず、
しかもその活性は急速に減少し、48時間後では全
く認められなかつた。第１図ｂは、全酵素活性に
対する菌体外ペニシリナーゼと菌体内ペニシリナ
ーゼの生成の割合を示すものである。比較とし
て、DNA供与菌の前記バチルス・No.170菌（微工
研菌寄第3221号）及びDNA受容菌の公知のエシ
エリヒア・コリHB101（pBR322）株（ペニシリ
ナーゼ生産能の遺伝情報を担うpBR322プラスミ
ドを含有する菌株）〔Boyer etal；Gene、vol2、
p.95−113（1977）参照〕を、それぞれ培養してペ
ニシリナーゼ活性を測定した。 前記バチルス・No.170菌の場合は、使用培地
〔（ｇ／）：グルコース（又はグリセロール）
2.0、酵母エキス5.0、ポリペプトン5.0、
K2HPO41.0、MgSO4・7H2O0.2をNaHCO310で
PH9.0に調整したもの〕100mlを含む500ml容のフ
ラスコに接種し、37℃で振盪培養した。培養液の
菌体外ペニシリナーゼ活性を４時間毎に測定し、
接種後、12時間で活性は最高（19U／ml）に達
し、以後急速に減少して40時間では全く認められ
なかつた（第２図参照）。 一方、エシエリヒア・コリHB101（pBR322）
の場合は、前記エシエリヒア・コリHB101
（pEAP2）株の培養に用いたLB培地の100mlを
500ml容のフラスコに入れて接種し、37℃で振盪
培養した。第３図ａに示されるように、接種後、
20時間で全活性の80％以上が菌体内ペニシリナー
ゼとして認められたが（最高35U／ml）、以後急
速に減少し、菌体外ペニシリナーゼ活性は10％以
下が認められるに過ぎなかつた。第３図ｂは、全
酵素活性に対する菌体外ペニシリナーゼと菌体内
ペニシリナーゼの生成の割合を示すものである。 なお、実施例１の形質転換株の培養液を10分
間、10000×ｇで超遠心してアンモニウム硫酸塩
で80％飽和溶液とした。この沈澱物を水に溶解
し、一夜、0.1M NaClを含む0.05M隣酸緩衝液
（PH7.0）で透析した。この透析物を同一の緩衝液
で平衡化したセフアデツクスＧ−75（Sephadex
Ｇ−75）に通じて精製ペニシリナーゼを得た。 また、前記バチルスNo.170菌（微工研菌寄第
3221号）の培養液を同様に処理して精製ペニシリ
ナーゼを得た。 両者のペニシリナーゼの同一性をみるために、
酵素活性におけるPHの影響、熱安定性、分子量等
を測定した。その結果、次のとおり両者の同一性
が確認された。 (a) 酵素の安定性は各PH値の緩衝液を用い、30
℃、45分でインキユベートした後、調べた。そ
の結果、両酵素は、いずれもPH７〜10で安定で
あり、至適PHはPH6.0〜7.0であつた。 (b) 酵素の熱安定性は、酵素を0.05M燐酸緩衝液
（PH7.0）に溶解し、その溶液を10分間、所定の
温度で熱処理し、残存活性をPH7.0で測定する
ことにより調べた。その結果、いずれの酵素も
50℃まで安定であつた。 (c) 酵素の分子量の測定は、ゲル過法で行なつ
た。両酵素の分子量はいずれも27000〜22000と
推定された。 実施例 ３ 前記エシエリヒア・コリHB101（pEAP2）（微
工研菌寄第6939号）（FERM Ｐ−6939）の菌体
外生産物質について、プラスミド（pEAP2）を
導入しないエシエリヒア・コリHB101株及び
pMB9プラスミドを導入したエシエリヒア・コリ
HB101株の生産物質と比較して、ペニシリナー
ゼ以外の酵素蛋白類を調べた結果を第１表に示
す。 なお、培養条件は、実施例１のLB培地で、37
℃にて20時間振盪培養し、また生産酵素蛋白の
内、アルカリホスフアターゼ及びβ−ガラクトシ
ダーゼの酵素活性は、波長420nmにおける吸光度
（OD）を測定して表わしたものであり、蛋白質
濃度は、培地１ml当りのmgとして表わし、その他
の条件は実施例１と同様である。
【表】 単位はmg／mlである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明方法で用いたエシエリヒア・
コリHB101（pEAP2）によるペニシリナーゼの活
性を、第２図は、バチルス・No.170菌によるペニ
シリナーゼの活性を、第３図は、公知のエシエリ
ヒア・コリHB101（pBR322）によるペニシリナ
ーゼの活性をそれぞれ示すグラフである。第４図
は、エシエリヒア・コリHB101（pEAP2）のプラ
スミド（pEAP2）の制限酵素切断地図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 宿主にペニシリナーゼの菌体外選択生産能を
    与えるプラスミドであつて、その制限サイトの
    Hindサイトにバチルス（Bacillus）属No.170菌
    のペニシリナーゼの菌体外選択生産に関与する遺
    伝情報を担うデオキシリボ核酸（DNA）断片を
    組み込んだプラスミド。 ２ プラスミドがpEAP2プラスミドである特許
    請求の範囲第１項記載のプラスミド。 ３ プラスミドのベクターがpMB9プラスミドの
    DNAである特許請求の範囲第１項記載のプラス
    ミド。 ４ 宿主がエシエリヒア（Escherichia）属に属
    する微生物である特許請求の範囲第１項記載のプ
    ラスミド。 ５ エシエリヒア属に属する微生物がエシエリヒ
    ア・コリ（Escherichia coli）である特許請求の
    範囲第４項記載のプラスミド。 ６ ペニシリナーゼの菌体外選択生産能を与える
    バチルス（Bacillus）属No.170菌の染色体DNA断
    片を制限酵素を用いて調製すること、前記染色体
    DNA断片のペニシリナーゼの菌体外選択生産に
    関与する遺伝情報を妨害しない制限酵素を用いて
    プラスミドのベクターDNAを制限すること、制
    限された前記プラスミドのベクターDNAの制限
    サイトのHindサイトに前記染色体DNA断片を
    組み換えること及び組換えられたプラスミドを抽
    出することから成るペニシリナーゼの菌体外選択
    生産に関与する遺伝情報を担うDNA断片を組み
    込んだプラスミドの調製方法。 ７ プラスミドがpEAP2プラスミドである特許
    請求の範囲第６項記載の調製方法。 ８ プラスミドのベクターとして、pMB9プラス
    ミドのDNAを用いる特許請求の範囲第６項記載
    のプラスミドの調製方法。 ９ ペニシリナーゼの菌体外選択生産能を有する
    エシエリヒア・コリHB101（pEAP2）
    〔Escherichia coli HB101（pEAP2）〕。
JP58038089A 1983-03-08 1983-03-08 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 Granted JPS59162886A (ja)

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