JPH0142675B2 - - Google Patents
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- JPH0142675B2 JPH0142675B2 JP58232508A JP23250883A JPH0142675B2 JP H0142675 B2 JPH0142675 B2 JP H0142675B2 JP 58232508 A JP58232508 A JP 58232508A JP 23250883 A JP23250883 A JP 23250883A JP H0142675 B2 JPH0142675 B2 JP H0142675B2
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Description
本発明は、新規プラスミド及びその調製方法並
びに該プラスミドを含有する新規微生物に関し、
代謝産物であるキシラナーゼの菌体外生産（分
泌）に関与する特定の遺伝情報を担うデオキシリ
ボ核酸（DNA）を組み込んだ新規プラスミドと、
該プラスミドによつて形質転換した新規微生物を
提供することを目的とするものである。 プラスミドは、微生物の細胞内に見出される染
色体外遺伝子で、そのDNAの円形分子であり、
近年、微生物の遺伝子組み換えの手段として利用
され、発酵工業の分野の研究におけるその重要性
は益々増大して来ている。 近年、アミノ酸やペプチドの例にみられるよう
に、微生物の生育に必要とする特定の要求性や代
謝産物の生産能に関与する遺伝情報を担うDNA
を組み込んだプラスミドについての研究がなさ
れ、また若干のプラスミドが宿主微生物に導入さ
れ、その形質転換株が得られている。 本発明者は、バチルス（Bacillus）属に属する
微生物の代謝産物であるキシラナーゼの菌体外生
産（分泌）に関与する遺伝情報を担うDNAを組
み込んだ新規プラスミドを調製することに成功
し、更に前記プラスミドをエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）HB101株に導入して新規且
つ有用な形質転換株、エシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）HB101（pCX311）を得るこ
とに成功して本発明を完成するに至つた。 以下、本発明について詳細に説明する。 本発明において用いられる宿主微生物は、エシ
エリヒア属のプラスミドとして知られるコリシン
E1因子等の、培養された細胞内で増殖し得る形
式をとるプラスミド（ベクターDNA）に、外来
の遺伝子DNAとしてバチルス属に属する微生物、
バチルス・C125菌（微工研菌寄第7344号）から
調製されたDNA断片を組み込んだプラスミドを
含有させ得る、エシエリヒア・コリによつて代表
されるエシエリヒア属に属する微生物である。 本発明に使用される、キシラナーゼの菌体外生
産に関与する遺伝情報を担うDNAを含有する微
生物の例としては、バチルス・C125菌（微工研
菌寄第7344号）を挙げることができる。バチル
ス・C125菌は埼玉県入間郡鶴ケ島町で採取され
た土壌より分離された微生物であり、次の菌学的
性質を有する。なお、菌学的性質の試験及び分類
方法は、「エアロビツク・スポア・ホーミング・
バクテリア」〔“Aerobic Spore―forming
Bacteria”（United State Department of
Agriculture，Nov.1952byN.R.Smith，R.E.
Gordon＆F.E.Clark）〕及び「バージエース・マ
ニユアル・オブ・デタミネイテイブ・バクテリオ
ロジー」（1975年）〔Bergey′s Manual of
Determinative Bacteriology（1957年）〕に基づ
いて行われた。 Γ菌学的諸性質 ａ）形態 １）大きさは0.5〜0.7μ×3.0〜4.0μの桿菌
である。 ２）胞子を形成し、大きさは0.6〜0.8μ×
1.0〜1.2μの卵形であつて、胞子のうはふ
くらんでいる。 ３）グラム染色性は陽性である。 ｂ）各培地における生育状態
びに該プラスミドを含有する新規微生物に関し、
代謝産物であるキシラナーゼの菌体外生産（分
泌）に関与する特定の遺伝情報を担うデオキシリ
ボ核酸（DNA）を組み込んだ新規プラスミドと、
該プラスミドによつて形質転換した新規微生物を
提供することを目的とするものである。 プラスミドは、微生物の細胞内に見出される染
色体外遺伝子で、そのDNAの円形分子であり、
近年、微生物の遺伝子組み換えの手段として利用
され、発酵工業の分野の研究におけるその重要性
は益々増大して来ている。 近年、アミノ酸やペプチドの例にみられるよう
に、微生物の生育に必要とする特定の要求性や代
謝産物の生産能に関与する遺伝情報を担うDNA
を組み込んだプラスミドについての研究がなさ
れ、また若干のプラスミドが宿主微生物に導入さ
れ、その形質転換株が得られている。 本発明者は、バチルス（Bacillus）属に属する
微生物の代謝産物であるキシラナーゼの菌体外生
産（分泌）に関与する遺伝情報を担うDNAを組
み込んだ新規プラスミドを調製することに成功
し、更に前記プラスミドをエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）HB101株に導入して新規且
つ有用な形質転換株、エシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）HB101（pCX311）を得るこ
とに成功して本発明を完成するに至つた。 以下、本発明について詳細に説明する。 本発明において用いられる宿主微生物は、エシ
エリヒア属のプラスミドとして知られるコリシン
E1因子等の、培養された細胞内で増殖し得る形
式をとるプラスミド（ベクターDNA）に、外来
の遺伝子DNAとしてバチルス属に属する微生物、
バチルス・C125菌（微工研菌寄第7344号）から
調製されたDNA断片を組み込んだプラスミドを
含有させ得る、エシエリヒア・コリによつて代表
されるエシエリヒア属に属する微生物である。 本発明に使用される、キシラナーゼの菌体外生
産に関与する遺伝情報を担うDNAを含有する微
生物の例としては、バチルス・C125菌（微工研
菌寄第7344号）を挙げることができる。バチル
ス・C125菌は埼玉県入間郡鶴ケ島町で採取され
た土壌より分離された微生物であり、次の菌学的
性質を有する。なお、菌学的性質の試験及び分類
方法は、「エアロビツク・スポア・ホーミング・
バクテリア」〔“Aerobic Spore―forming
Bacteria”（United State Department of
Agriculture，Nov.1952byN.R.Smith，R.E.
Gordon＆F.E.Clark）〕及び「バージエース・マ
ニユアル・オブ・デタミネイテイブ・バクテリオ
ロジー」（1975年）〔Bergey′s Manual of
Determinative Bacteriology（1957年）〕に基づ
いて行われた。 Γ菌学的諸性質 ａ）形態 １）大きさは0.5〜0.7μ×3.0〜4.0μの桿菌
である。 ２）胞子を形成し、大きさは0.6〜0.8μ×
1.0〜1.2μの卵形であつて、胞子のうはふ
くらんでいる。 ３）グラム染色性は陽性である。 ｂ）各培地における生育状態
【表】
ｃ）生理的性質
【表】
【表】
以上の諸性質を総括すると、前記バチルス
C125菌は、好気性の有胞子細菌であることから、
バチルス（Bacillus）属に属する微生物であるこ
とは明らかであるが、特に生育し得る範囲が
pH11.0と55℃までである点において明らかに公
知の菌種と区別され、好アルカリ性細菌の新菌種
と認定することが妥当であると結論された。 前記ベクターDNAに組み込まれる、バチルス
C125菌から調製されたDNA断片は、前記バチル
ス属菌の代謝産物であるキシラナーゼの菌体外生
産（分泌）に関与する遺伝情報を担うDNAであ
り、前記ベクターDNAとしては、天然に存在す
るものを抽出したものの他、増殖に必要な部分以
外のDNAの部分が一部欠落しているものでもよ
く、例えばColE1の系統、pMB9の系統、
pBR322の系統、pSC101の系統、R6Kの系統、
ラムダーフアージの系統等が挙げられる。 また、前記ベクターDNAに前記DNA断片を組
み込む方法は、既知のいずれの方法も適用し得
る。例えば、適当な制限酵素（Endonuclease）
を選択、処理してDNAを特定部位で切断し、次
いで同様に処理したベクターとして用いるDNA
と混合し、リガーゼによつて再結合する方法が用
いられる。このようにして得られた前記DNA断
片とベクターDNAの結合物を、形質転換法によ
つて受容菌であるエシエリヒア属の微生物の菌体
に導入し、遺伝形質として安定するまで増殖する
と、所望の遺伝形質とベクターDNAの形質を併
せもつ形質転換株が得られる。 後述の実施例において得られる形質転換株は、
ベクターDNAとしてpBR322プラスミドのDNA
を用い、これにバチルス・C125菌から調製され
たDNA断片を組み込んで得られた新規pCX311
プラスミドを、エシエリヒア・コリHB101株
（エシエリヒア・コリＫ−12株とエシエリヒア・
コリＢ株のハイブリツド株）に導入して形質転換
反応により得られる新規微生物であり、エシエリ
ヒア・コリHB101（pCX311）〔Escherichia coli
HB101（pCX311）〕（微工研菌寄第7345号
（FERMP−7345）と呼称される。前記エシエリ
ヒア・コリHB101（pCX311）のpCX311プラスミ
ドの制限酵素切断地図は、第４図に示すとおりで
ある。 第４図から明らかなように、このプラスミド
は、pBR322プラスミドDNAの制限サイトの
Hindサイトに前記バチルス・C125菌のキシラ
ナーゼの菌体外生産（分泌）に関与する遺伝情報
を担うキシラナーゼDNA断片が組み込まれてい
るDNA円形分子、即ちpBR322プラスミドDNA
と約4000の塩基対のDNAから成る9.01Kbの新規
なDNA円形分子である。 次に、前記エシエリヒア・コリHB101
（pCX311）の菌学的性質は、DNA受容菌である
エシエリヒア・コリHB101株の性質と、ペニシ
リン耐性、キシラナーゼ生産性を除いて、同一で
あるが〔Molecular Cloning Ａ Laboratory
Manual.p.504（1982）参照、遺伝形質：F-，hsd
S20（ｒ，ｍ）、rec A13、ara−14、proA2、
lacY1、galK2、rpsL20（Sm′）、xyl−５、mtl−
１，supE44λ-〕，他の特性として、前記pCX311
プラスミドの特性、即ちキシラナーゼ生産能の遺
伝情報を担うpCX311プラスミドによつてキシラ
ナーゼを菌体外に分泌し、蓄積せしめる特性を附
加して成る点がその特徴である。 エシエリヒア・コリHB101（pCX311）による
キシラナーゼの菌体外生産（分泌）は、後述の実
施例で示されるように、菌体内生産を含めた全酵
素生産の80％以上に達し、且つ長時間その生産量
が持続される。これに対し、前記バチルス・
C125菌によるキシラナーゼの菌体外生産（分泌）
は、第３図に示すように、培養後、徐々に長時間
で最高に達し、以後、急速に活性が減少して長時
間の持続性を欠く点において全く対照的である。 従つて、本発明は、前記エシエリヒア・コリ
HB101（pCX311）、すなわち、従来皆無であつた
酵素蛋白の菌体外生産（分泌）能を有し且つキシ
ラナーゼを極めて有利に生産し得る微生物を創
製、提供する点において、新規性と有用性を具備
するものである。また、その生産物質は目的とす
る単一の高分子のみならず、他の高分子物質や複
数の酵素蛋白類がそれぞれ菌体外に著量に生産
（分泌）され、併せて採取することができる。即
ち、前記エシエリヒア・コリHB101（pCX311）
の培養により、キシラナーゼと共にペニシリナー
ゼや従来、菌体内にのみ検出されていたアルカリ
ホスフアターゼ等が後述の実施例に記載の如く、
それぞれ菌体外に著量に分泌されることが明らか
にされた。 これは、本発明によつて得られるpCX311プラ
スミドに含まれる約4000の塩基対のDNAが、代
謝産物の菌体外生産（分泌）能を宿主に附与して
いることを意味するものである。 以下に、本発明のプラスミドの調製方法と該プ
ラスミドを含有する前記形質転換株、エシエリヒ
ア・コリHB101（pCX311）の調製方法並びに前
記形質転換株による効果として、キシラナーゼを
主とする種々の酵素蛋白の菌体外生産（分泌）に
ついて、実施例により説明する。 実施例 １ (1) キシラナーゼ生産能の遺伝情報をもつDNA
の調製 キシラナーゼを菌体外に生成、蓄積する能力
を有する好アルカリ性のバチルス・C125菌
（微工研菌寄第7344号）を培地〔（ｇ/）：皺
10.0、酵母エキス5.0、ポリペプトン5.0、
K2HPO41.0、MgSO4・7H2O0.2をNa2CO3で
pH6.0に調整したもの〕中、30℃で19時間振盪
培養を行ない、対数増殖後期の菌体を集菌後、
フエノール法によるDNA抽出法によつてDNA
を抽出、精製し、DNA5mgを得た。 (2) DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇをとり、制限エ
ンドヌクレアーゼHindを加え、37℃で５分、
10分、20分、30分、60分反応させて部分的に切
断した。一方、ベクターとして用いるテトラサ
イクリン抵抗性（Tetr）とアンピシリン抵抗
性（Ampr）をもつpBR322プラスミドDNA
（Bethesda Research Laboratories社（米国）
製）をHindで完全に切断して65℃、５分の
熱処理後、前者と混合し、T4フアージ由来の
DNAリガーゼによつて10℃、24時間DNA鎖の
連結反応を行ない、65℃、５分の熱処理後、反
応液に３倍容のエタノールを加えてDNAを組
み込んだプラスミドDNAを沈澱、採取した。 (3) キシラナーゼの菌体外生産（分泌）遺伝子を
担うプラスミドによる形質転換 エシエリヒア・コリＫ−12株とエシエリヒ
ア・コリＢ株のハイブリツド株であるエシエリ
ヒア・コリHB101株〔Molecular Cloning Ａ
Laboratory Manual p.504（1982）参照〕
（遺伝形質：F-、hsd S20（ｒ，ｍ），rec
A13、ara―14、proA2、lacY1、galK2、rps
L20（Sm′）、xyl―５，mtl―１、supE44λ-）を
LB培地（純水１当りトリプトン（Difco）10
ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース１ｇ、Nacl
10ｇを含み、pH7.0に調製したもの）10mlに接
種し、37℃で振盪培養を行ない、対数増殖後期
まで生育させた後に集菌した。これを氷冷下、
最終濃度で0.03MCacl2の溶液に順次懸濁させ
てコンピテントな細胞とした。この細胞懸濁液
に(2)で得たプラスミドDNAの溶解液を加えて
氷冷下で60分反応させ、42℃、１〜２分間ヒー
トシヨツクを与えて前記プラスミドDNAを細
胞内に取り込ませた。次いで、この細胞懸濁液
を別途、前記LB培地に接種し、37℃、３〜５
時間振盪培養しと形質転換反応を行なつた後、
集菌、洗滌して得られた形質転換株の中から、
エシエリヒア・コリHB101（pCX311）（微工研
菌寄第7345号）を得た。 実施例 ２ 実施例１の(3)で得られた形質転換株、エシエリ
ヒア・コリHB101（pCX311）（微工研菌寄第7345
号）（FERM Ｐ−7345）を、LB培地（１当り
トリプトン10ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース１
ｇ、グリセロール２ｇ、NaCl10ｇ、ペニシリン
10mgを含む）100mlに0.5％のキシランを含む500
ml容のフラスコで37℃にて振盪培養した。細胞の
生育（菌体量の測定）は、660nmの吸光度（OD）
で、酵素活性は、酵素液0.05mlにキシラン液（生
化学工業(株)製）0.1ml及びpH8.0の0.2Mトリスマ
レイト緩衝液0.1mlを加えて40℃で10分間反応さ
せ、DNS（３，５−dinitrosalic−ylic acid）１
mlを加えて100℃で５分間反応させた後に水４ml
を加えて510mμの吸光度を測定し、１分間にキシ
ロース１mgの還元力を生ずる酵素量をキシラナー
ゼ１単位（Ｕ）とした。 第１図は、前記LB培地に0.5％キシランを加え
た培地を用いた場合のキシラナーゼの活性、即ち
キシラナーゼの菌体外生産（分泌）能を示すグラ
フである。 前記形質転換株の菌体量は接種後、９〜12時間
で最大に達し、第１図に示すとおり、菌体外キシ
ラナーゼの活性はほぼ６時間後から増大しはじ
め、13時間後に最大に達した（≒0.35U/ml）。 生産されたキシラナーゼは非常に安定であり、
第１図に示されるように、更にそのまま培養を48
時間まで継続しても生産量は減少せず、全酵素活
性の80％以上に達した。これに対して、菌体内キ
シラナーゼは、培養初期（接種後９時間）におい
て若干認められたが、その生産は全酵素活性の10
％程度であり、最高で0.13U/mlに過ぎず、しか
もその活性は徐々に減少した。また、第２図は、
前記LB培地に、キシランに代えて0.5％の皺を加
えた培地を用いた場合のキシラナーゼの活性を示
すグラフであり、第１図の場合とほぼ同様の傾向
が認められた。なお、比較として、DNA供与菌
の前記バチルス・C125菌（微工研菌寄第7344号）
を培養してキシラナーゼ活性を測定した。 前記バチルス・C125菌の場合は、使用培地
〔（ｇ/）：キシラン10.0、酵母エキス5.0、ポリ
ペプトン5.0、K2HPO41.0、MgSO4・7H2O0.2を
Na2CO3 10でpH6.0に調整したもの〕100mlを含
む500ml容のフラスコに接種し、37℃で振盪培養
した。培養液の菌体外キシラナーゼ活性を８時間
毎に測定した。接種後、８時間で徐々に活性が上
がり、48時間に至つてやつと活性は最高（≒0.5
Ｕ／ml）に達したが、以後急速に活性は減少した
（第３図参照）。 なお、実施例１の形質転換株の培養液に硫酸ア
ンモニウムを加えて塩析した後、沈澱を水に溶か
して一夜流水で透析し、pH4.5の20mM燐酸―燐
酸１ソーダ―緩衝液で平衝化したCMセルロース
に吸着させた後に、食塩濃度を0.1Mから0.7Mま
で変化させてキシラナーゼを溶出させると、
0.4M前後で溶出される。活性のある区分を集め
てセフアデツクス・Ｇ−100（Seph−adex Ｇ−
100）によるゲル過を行つて精製キシラナーゼ
を得た。また、前記バチルス・C125菌（微工研
菌寄第7344号）の培養液も同様に処理して精製
し、同様のキシラナーゼを得た。両者のキシラナ
ーゼの同一性をみるために、pH活性、超超心分
析、電気泳動及び分子量等を測定したところ、次
のとおり両者の同一性が確認された。 ａ） pH4〜５は酢酸塩、pH5〜８はトリスマレ
イト、pH7〜９はトリス塩酸、pH9〜11はグリ
シン苛性ソーダを用いて夫々調整し、前記測定
法によつてpHの影響を調べた結果、第５図の
とおり、両酵素のpH活性の同一性が明らかに
された。 ｂ） 超遠心分析では、両酵素ともに沈降定数約
3.5Sの単一ピークを示した。 ｃ） pH8.3のデイスク電気泳動で両酵素ともに
一本のバンドになつてあり、アンフオラインに
よるエレクトロホーカシングで単一のピークを
示し、等電点は6.3にあつた。 ｄ） 分子量は、両酵素ともにSDS−ポリアクリ
ルアミド法により約40000と測定された。 実施例 ３ 前記エシエリヒア・コリHB101（pCX311）（微
工研菌寄第7345号）（FERM Ｐ−7345）の菌体
外生産物質について、プラスミド（pCX311）を
導入しないエシエリヒア・コリHB101株及び
pBR322プラスミドを導入したエシエリヒア・コ
リHB101株の生産物質と比較して、キシラナー
ゼ以外の酵素蛋白類を調べた結果を第１表に示
す。 なお、培養条件は、実施例２のキシランを加え
たLB培地で、ペニシリナーゼについては、37℃
にて20時間振盪培養し、アルカリホスフアターゼ
及びβ―ガラクトシダーゼについては、15時間そ
れぞれ培養した結果である。また、アルカリホス
フアターゼ及びβ―ガラクトシターゼの酵素活性
は、波長420nmにおける吸光度（OD）を測定し
て表わしたものである。
C125菌は、好気性の有胞子細菌であることから、
バチルス（Bacillus）属に属する微生物であるこ
とは明らかであるが、特に生育し得る範囲が
pH11.0と55℃までである点において明らかに公
知の菌種と区別され、好アルカリ性細菌の新菌種
と認定することが妥当であると結論された。 前記ベクターDNAに組み込まれる、バチルス
C125菌から調製されたDNA断片は、前記バチル
ス属菌の代謝産物であるキシラナーゼの菌体外生
産（分泌）に関与する遺伝情報を担うDNAであ
り、前記ベクターDNAとしては、天然に存在す
るものを抽出したものの他、増殖に必要な部分以
外のDNAの部分が一部欠落しているものでもよ
く、例えばColE1の系統、pMB9の系統、
pBR322の系統、pSC101の系統、R6Kの系統、
ラムダーフアージの系統等が挙げられる。 また、前記ベクターDNAに前記DNA断片を組
み込む方法は、既知のいずれの方法も適用し得
る。例えば、適当な制限酵素（Endonuclease）
を選択、処理してDNAを特定部位で切断し、次
いで同様に処理したベクターとして用いるDNA
と混合し、リガーゼによつて再結合する方法が用
いられる。このようにして得られた前記DNA断
片とベクターDNAの結合物を、形質転換法によ
つて受容菌であるエシエリヒア属の微生物の菌体
に導入し、遺伝形質として安定するまで増殖する
と、所望の遺伝形質とベクターDNAの形質を併
せもつ形質転換株が得られる。 後述の実施例において得られる形質転換株は、
ベクターDNAとしてpBR322プラスミドのDNA
を用い、これにバチルス・C125菌から調製され
たDNA断片を組み込んで得られた新規pCX311
プラスミドを、エシエリヒア・コリHB101株
（エシエリヒア・コリＫ−12株とエシエリヒア・
コリＢ株のハイブリツド株）に導入して形質転換
反応により得られる新規微生物であり、エシエリ
ヒア・コリHB101（pCX311）〔Escherichia coli
HB101（pCX311）〕（微工研菌寄第7345号
（FERMP−7345）と呼称される。前記エシエリ
ヒア・コリHB101（pCX311）のpCX311プラスミ
ドの制限酵素切断地図は、第４図に示すとおりで
ある。 第４図から明らかなように、このプラスミド
は、pBR322プラスミドDNAの制限サイトの
Hindサイトに前記バチルス・C125菌のキシラ
ナーゼの菌体外生産（分泌）に関与する遺伝情報
を担うキシラナーゼDNA断片が組み込まれてい
るDNA円形分子、即ちpBR322プラスミドDNA
と約4000の塩基対のDNAから成る9.01Kbの新規
なDNA円形分子である。 次に、前記エシエリヒア・コリHB101
（pCX311）の菌学的性質は、DNA受容菌である
エシエリヒア・コリHB101株の性質と、ペニシ
リン耐性、キシラナーゼ生産性を除いて、同一で
あるが〔Molecular Cloning Ａ Laboratory
Manual.p.504（1982）参照、遺伝形質：F-，hsd
S20（ｒ，ｍ）、rec A13、ara−14、proA2、
lacY1、galK2、rpsL20（Sm′）、xyl−５、mtl−
１，supE44λ-〕，他の特性として、前記pCX311
プラスミドの特性、即ちキシラナーゼ生産能の遺
伝情報を担うpCX311プラスミドによつてキシラ
ナーゼを菌体外に分泌し、蓄積せしめる特性を附
加して成る点がその特徴である。 エシエリヒア・コリHB101（pCX311）による
キシラナーゼの菌体外生産（分泌）は、後述の実
施例で示されるように、菌体内生産を含めた全酵
素生産の80％以上に達し、且つ長時間その生産量
が持続される。これに対し、前記バチルス・
C125菌によるキシラナーゼの菌体外生産（分泌）
は、第３図に示すように、培養後、徐々に長時間
で最高に達し、以後、急速に活性が減少して長時
間の持続性を欠く点において全く対照的である。 従つて、本発明は、前記エシエリヒア・コリ
HB101（pCX311）、すなわち、従来皆無であつた
酵素蛋白の菌体外生産（分泌）能を有し且つキシ
ラナーゼを極めて有利に生産し得る微生物を創
製、提供する点において、新規性と有用性を具備
するものである。また、その生産物質は目的とす
る単一の高分子のみならず、他の高分子物質や複
数の酵素蛋白類がそれぞれ菌体外に著量に生産
（分泌）され、併せて採取することができる。即
ち、前記エシエリヒア・コリHB101（pCX311）
の培養により、キシラナーゼと共にペニシリナー
ゼや従来、菌体内にのみ検出されていたアルカリ
ホスフアターゼ等が後述の実施例に記載の如く、
それぞれ菌体外に著量に分泌されることが明らか
にされた。 これは、本発明によつて得られるpCX311プラ
スミドに含まれる約4000の塩基対のDNAが、代
謝産物の菌体外生産（分泌）能を宿主に附与して
いることを意味するものである。 以下に、本発明のプラスミドの調製方法と該プ
ラスミドを含有する前記形質転換株、エシエリヒ
ア・コリHB101（pCX311）の調製方法並びに前
記形質転換株による効果として、キシラナーゼを
主とする種々の酵素蛋白の菌体外生産（分泌）に
ついて、実施例により説明する。 実施例 １ (1) キシラナーゼ生産能の遺伝情報をもつDNA
の調製 キシラナーゼを菌体外に生成、蓄積する能力
を有する好アルカリ性のバチルス・C125菌
（微工研菌寄第7344号）を培地〔（ｇ/）：皺
10.0、酵母エキス5.0、ポリペプトン5.0、
K2HPO41.0、MgSO4・7H2O0.2をNa2CO3で
pH6.0に調整したもの〕中、30℃で19時間振盪
培養を行ない、対数増殖後期の菌体を集菌後、
フエノール法によるDNA抽出法によつてDNA
を抽出、精製し、DNA5mgを得た。 (2) DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇをとり、制限エ
ンドヌクレアーゼHindを加え、37℃で５分、
10分、20分、30分、60分反応させて部分的に切
断した。一方、ベクターとして用いるテトラサ
イクリン抵抗性（Tetr）とアンピシリン抵抗
性（Ampr）をもつpBR322プラスミドDNA
（Bethesda Research Laboratories社（米国）
製）をHindで完全に切断して65℃、５分の
熱処理後、前者と混合し、T4フアージ由来の
DNAリガーゼによつて10℃、24時間DNA鎖の
連結反応を行ない、65℃、５分の熱処理後、反
応液に３倍容のエタノールを加えてDNAを組
み込んだプラスミドDNAを沈澱、採取した。 (3) キシラナーゼの菌体外生産（分泌）遺伝子を
担うプラスミドによる形質転換 エシエリヒア・コリＫ−12株とエシエリヒ
ア・コリＢ株のハイブリツド株であるエシエリ
ヒア・コリHB101株〔Molecular Cloning Ａ
Laboratory Manual p.504（1982）参照〕
（遺伝形質：F-、hsd S20（ｒ，ｍ），rec
A13、ara―14、proA2、lacY1、galK2、rps
L20（Sm′）、xyl―５，mtl―１、supE44λ-）を
LB培地（純水１当りトリプトン（Difco）10
ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース１ｇ、Nacl
10ｇを含み、pH7.0に調製したもの）10mlに接
種し、37℃で振盪培養を行ない、対数増殖後期
まで生育させた後に集菌した。これを氷冷下、
最終濃度で0.03MCacl2の溶液に順次懸濁させ
てコンピテントな細胞とした。この細胞懸濁液
に(2)で得たプラスミドDNAの溶解液を加えて
氷冷下で60分反応させ、42℃、１〜２分間ヒー
トシヨツクを与えて前記プラスミドDNAを細
胞内に取り込ませた。次いで、この細胞懸濁液
を別途、前記LB培地に接種し、37℃、３〜５
時間振盪培養しと形質転換反応を行なつた後、
集菌、洗滌して得られた形質転換株の中から、
エシエリヒア・コリHB101（pCX311）（微工研
菌寄第7345号）を得た。 実施例 ２ 実施例１の(3)で得られた形質転換株、エシエリ
ヒア・コリHB101（pCX311）（微工研菌寄第7345
号）（FERM Ｐ−7345）を、LB培地（１当り
トリプトン10ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース１
ｇ、グリセロール２ｇ、NaCl10ｇ、ペニシリン
10mgを含む）100mlに0.5％のキシランを含む500
ml容のフラスコで37℃にて振盪培養した。細胞の
生育（菌体量の測定）は、660nmの吸光度（OD）
で、酵素活性は、酵素液0.05mlにキシラン液（生
化学工業(株)製）0.1ml及びpH8.0の0.2Mトリスマ
レイト緩衝液0.1mlを加えて40℃で10分間反応さ
せ、DNS（３，５−dinitrosalic−ylic acid）１
mlを加えて100℃で５分間反応させた後に水４ml
を加えて510mμの吸光度を測定し、１分間にキシ
ロース１mgの還元力を生ずる酵素量をキシラナー
ゼ１単位（Ｕ）とした。 第１図は、前記LB培地に0.5％キシランを加え
た培地を用いた場合のキシラナーゼの活性、即ち
キシラナーゼの菌体外生産（分泌）能を示すグラ
フである。 前記形質転換株の菌体量は接種後、９〜12時間
で最大に達し、第１図に示すとおり、菌体外キシ
ラナーゼの活性はほぼ６時間後から増大しはじ
め、13時間後に最大に達した（≒0.35U/ml）。 生産されたキシラナーゼは非常に安定であり、
第１図に示されるように、更にそのまま培養を48
時間まで継続しても生産量は減少せず、全酵素活
性の80％以上に達した。これに対して、菌体内キ
シラナーゼは、培養初期（接種後９時間）におい
て若干認められたが、その生産は全酵素活性の10
％程度であり、最高で0.13U/mlに過ぎず、しか
もその活性は徐々に減少した。また、第２図は、
前記LB培地に、キシランに代えて0.5％の皺を加
えた培地を用いた場合のキシラナーゼの活性を示
すグラフであり、第１図の場合とほぼ同様の傾向
が認められた。なお、比較として、DNA供与菌
の前記バチルス・C125菌（微工研菌寄第7344号）
を培養してキシラナーゼ活性を測定した。 前記バチルス・C125菌の場合は、使用培地
〔（ｇ/）：キシラン10.0、酵母エキス5.0、ポリ
ペプトン5.0、K2HPO41.0、MgSO4・7H2O0.2を
Na2CO3 10でpH6.0に調整したもの〕100mlを含
む500ml容のフラスコに接種し、37℃で振盪培養
した。培養液の菌体外キシラナーゼ活性を８時間
毎に測定した。接種後、８時間で徐々に活性が上
がり、48時間に至つてやつと活性は最高（≒0.5
Ｕ／ml）に達したが、以後急速に活性は減少した
（第３図参照）。 なお、実施例１の形質転換株の培養液に硫酸ア
ンモニウムを加えて塩析した後、沈澱を水に溶か
して一夜流水で透析し、pH4.5の20mM燐酸―燐
酸１ソーダ―緩衝液で平衝化したCMセルロース
に吸着させた後に、食塩濃度を0.1Mから0.7Mま
で変化させてキシラナーゼを溶出させると、
0.4M前後で溶出される。活性のある区分を集め
てセフアデツクス・Ｇ−100（Seph−adex Ｇ−
100）によるゲル過を行つて精製キシラナーゼ
を得た。また、前記バチルス・C125菌（微工研
菌寄第7344号）の培養液も同様に処理して精製
し、同様のキシラナーゼを得た。両者のキシラナ
ーゼの同一性をみるために、pH活性、超超心分
析、電気泳動及び分子量等を測定したところ、次
のとおり両者の同一性が確認された。 ａ） pH4〜５は酢酸塩、pH5〜８はトリスマレ
イト、pH7〜９はトリス塩酸、pH9〜11はグリ
シン苛性ソーダを用いて夫々調整し、前記測定
法によつてpHの影響を調べた結果、第５図の
とおり、両酵素のpH活性の同一性が明らかに
された。 ｂ） 超遠心分析では、両酵素ともに沈降定数約
3.5Sの単一ピークを示した。 ｃ） pH8.3のデイスク電気泳動で両酵素ともに
一本のバンドになつてあり、アンフオラインに
よるエレクトロホーカシングで単一のピークを
示し、等電点は6.3にあつた。 ｄ） 分子量は、両酵素ともにSDS−ポリアクリ
ルアミド法により約40000と測定された。 実施例 ３ 前記エシエリヒア・コリHB101（pCX311）（微
工研菌寄第7345号）（FERM Ｐ−7345）の菌体
外生産物質について、プラスミド（pCX311）を
導入しないエシエリヒア・コリHB101株及び
pBR322プラスミドを導入したエシエリヒア・コ
リHB101株の生産物質と比較して、キシラナー
ゼ以外の酵素蛋白類を調べた結果を第１表に示
す。 なお、培養条件は、実施例２のキシランを加え
たLB培地で、ペニシリナーゼについては、37℃
にて20時間振盪培養し、アルカリホスフアターゼ
及びβ―ガラクトシダーゼについては、15時間そ
れぞれ培養した結果である。また、アルカリホス
フアターゼ及びβ―ガラクトシターゼの酵素活性
は、波長420nmにおける吸光度（OD）を測定し
て表わしたものである。
第１図及び第２図は、本発明方法で用いたエシ
エリヒア・コリHB101（pCX311）によるキシラ
ナーゼ生産活性を、第３図は、バチルス・C125
菌によるキシラナーゼ生産活性をそれぞれ示すグ
ラフである。第４図は、エシエリヒア・コリ
HB101（pCX311）のプラスミド（pCX311）の制
限酵素切断地図であり、第５図は、エシエリヒ
ア・コリHB101（pCX311）とバチルス・C125菌
の産生するキシラナーゼのpH活性の同一性を示
すグラフである。
エリヒア・コリHB101（pCX311）によるキシラ
ナーゼ生産活性を、第３図は、バチルス・C125
菌によるキシラナーゼ生産活性をそれぞれ示すグ
ラフである。第４図は、エシエリヒア・コリ
HB101（pCX311）のプラスミド（pCX311）の制
限酵素切断地図であり、第５図は、エシエリヒ
ア・コリHB101（pCX311）とバチルス・C125菌
の産生するキシラナーゼのpH活性の同一性を示
すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 宿主にキシラナーゼの菌体外生産能を与える
プラスミドであつて、その制限サイトのHind
サイトにバチルス（Bacillus）・C125菌のキシラ
ナーゼの菌体外生産に関与する遺伝情報を担うデ
オキシリボ核酸（DNA）断片を組み込んだプラ
スミド。 ２ プラスミドがpCX311プラスミドである特許
請求の範囲第１項記載のプラスミド。 ３ プラスミドのベクターがpBR322プラスミド
のDNAである特許請求の範囲第１項記載のプラ
スミド。 ４ 宿主がエシエリヒア（Escherichia）属に属
する微生物である特許請求の範囲第１項記載のプ
ラスミド。 ５ エシエリヒア属に属する微生物がエシエリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）である特許請求の
範囲第４項記載のプラスミド。 ６ キシラナーゼの菌体外生産能を与える、バチ
ルス（Bacillus）・C125から調製されたDNA断片
を制限酵素を用いて調製すること、前記DNA断
片のキシラナーゼの菌体外生産に関与する遺伝情
報を妨害しない制限酵素を用いてプラスミドのベ
クターDNAを制限すること、制限された前記プ
ラスミドのベクターDNAの制限サイトのHind
サイトに前記DNA断片を組み変えること及び組
み換えられたプラスミドを抽出することから成る
キシラナーゼの菌体外生産に関与する遺伝情報を
担うDNA断片を組み込んだプラスミドの調製方
法。 ７ プラスミドがpCX311プラスミドである特許
請求の範囲第６項記載の調製方法。 ８ プラスミドのベクターとして、pBR322プラ
スミドのDNAを用いる特許請求の範囲第６項記
載のプラスミドの調製方法。 ９ キシラナーゼの菌体外生産能を有するエシエ
リヒア・コリHB101（pCX311） 〔Escherichia coli HB101（pCX311）〕。
Priority Applications (12)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58232508A JPS60126085A (ja) | 1983-12-09 | 1983-12-09 | 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
| DK138984A DK138984A (da) | 1983-03-08 | 1984-02-29 | Plasmid, fremgangsmaade til fremstilling heraf, mikroorganismer indeholdende samme samt fremgangsmaade til dyrkning af mikroorganismen |
| FI840843A FI85721C (fi) | 1983-03-08 | 1984-03-02 | Foerfarande foer extracellulaer produktion av penicillinas, plasmid anvaend vid foerfarandet och foerfarande foer konstruktion av plasmiden. |
| DE88121510T DE3486163T2 (de) | 1983-03-08 | 1984-03-07 | Plasmide, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Mikroorganismen und Methoden zur extrazellulären Herstellung von Xylanase durch Züchten dieser Mikroorganismen. |
| AT84102440T ATE61410T1 (de) | 1983-03-08 | 1984-03-07 | Plasmide, verfahren zu ihrer bereitung, mikroorganismen, die diese plasmide enthalten, und verfahren zur kultivierung der mikroorganismen. |
| EP84102440A EP0121138B1 (en) | 1983-03-08 | 1984-03-07 | Plasmids, methods for contruction of the same, microorganisms carrying the plasmids and methods for cultivation of the microorganisms |
| AT88121510T ATE90387T1 (de) | 1983-03-08 | 1984-03-07 | Plasmide, verfahren zu ihrer herstellung, sie enthaltende mikroorganismen und methoden zur extrazellulaeren herstellung von xylanase durch zuechten dieser mikroorganismen. |
| EP88121510A EP0316023B1 (en) | 1983-03-08 | 1984-03-07 | Plasmids, methods for their construction, microorganisms carrying them and methods for the extracellular production of xylanase by cultivation of the microorganisms |
| DE8484102440T DE3484207D1 (de) | 1983-03-08 | 1984-03-07 | Plasmide, verfahren zu ihrer bereitung, mikroorganismen, die diese plasmide enthalten, und verfahren zur kultivierung der mikroorganismen. |
| CA000449095A CA1226833A (en) | 1983-03-08 | 1984-03-08 | Plasmids, methods for construction of the same, microorganisms carrying the plasmids and methods for cultivation of the microorganism |
| US06/590,636 US4624922A (en) | 1983-12-09 | 1984-03-19 | Plasmid, method for construction of the same, microorganism carrying the plasmid and method for cultivation of the microorganism |
| FI890246A FI86438C (fi) | 1983-03-08 | 1989-01-17 | Plasmider som inducerar extracellulaer sekretion av xylanas, metoder foer framstaellning av dem och metoder foer produktion av xylanas. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58232508A JPS60126085A (ja) | 1983-12-09 | 1983-12-09 | 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60126085A JPS60126085A (ja) | 1985-07-05 |
| JPH0142675B2 true JPH0142675B2 (ja) | 1989-09-13 |
Family
ID=16940426
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58232508A Granted JPS60126085A (ja) | 1983-03-08 | 1983-12-09 | 新規プラスミド及びその調製方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60126085A (ja) |
-
1983
- 1983-12-09 JP JP58232508A patent/JPS60126085A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MOI.GEN.GENET=1983 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60126085A (ja) | 1985-07-05 |
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