JPH0375153B2 - - Google Patents

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JPH0375153B2
JPH0375153B2 JP58232507A JP23250783A JPH0375153B2 JP H0375153 B2 JPH0375153 B2 JP H0375153B2 JP 58232507 A JP58232507 A JP 58232507A JP 23250783 A JP23250783 A JP 23250783A JP H0375153 B2 JPH0375153 B2 JP H0375153B2
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、宿主の微生物細胞内に、生理活性高
分子物質の菌体外生産に関与する特定の遺伝情報
を担うデオキシリボ核酸（DNA）を組み込んだ
プラスミドを含有させてこれを培養し、この特定
の遺伝情報によつて前記高分子物質を菌体外に生
成（分泌）、蓄積させて著量の生産物質を採取す
ることを目的とするものである。特定の遺伝情報
を担うDNAを組み込んだプラスミドを宿主の微
生物に導入し、この微生物を培養することによつ
てアミノ酸、ペプチド等の比較的低分子物質を生
産する方法が提案されているが、高分子物質の生
産能をもつプラスミドは宿主の微生物によつて増
殖の程度が異なり、且つプラスミドの十分な発現
機能を実現することができず、またその有効な培
養方法も確立されていない。 従来、微生物の代謝産物である高分子物質を菌
体外に生産する遺伝情報を担うDNAを組み込ん
だプラスミドによつて他に属に属する微生物を宿
主として形質転換させた場合、特定の生産物のみ
を菌体外に著量に生産せしめることができず、宿
主として通常用い得るエシエリヒア属の微生物で
はプラスミドによる形質転換によつてもこれを達
成することができなかつた。 これに対し、本発明者は、先に、バチルス属に
属する微生物の代謝産物である高分子物質として
ペニシリナーゼの菌体外生産（分泌）に関与する
遺伝情報を担うDNAを組み込んだプラスミドを
エシエリヒア属に属する微生物に導入し、この微
生物の培養方法を見出してその菌体外に、ペニシ
リナーゼ等の酵素蛋白を著量に生産（分泌）せし
め得ることに成功し、前記の目的の達成を初めて
可能とした。 更に、鋭意研究の結果、本発明者は、高分子物
質としてキシラナーゼの菌体外生産（分泌）に関
与する遺伝情報を担うDNAを組み込んだプラス
ミドをエシエリヒア属に属する微生物に導入して
形質転換した新規微生物を得、当該微生物の培養
方法を見出してその菌体外にキシラナーゼ等々の
酵素蛋白によつて代表される高分子物質を著量に
生産（分泌）せしめ得ることに成功して本発明を
完成するに至つた。 本発明において「高分子物質」とは、微生物の
産出する代謝産物である酵素蛋白類、抗生物質
等々の他、動物起源の生理活性蛋白類を包含する
一連の有用な生理活性高分子物質群を指称するも
のである。 以下、本発明方法について詳細に説明する。 本発明方法において用いられる微生物は、エシ
エリヒア属の染色体外遺伝子（プラスミド）とし
て知られるコリシンE1因子等の、培養された細
胞内で増殖し得る形式をとるプラスミド（染色体
外DNAすなわちベクターDNA）に、外来の遺伝
子DNAを組み込んだプラスミドを含有する、エ
シエリヒア・コリによつて代表されるエシエリヒ
ア属に属する微生物である。 前記ベクターDNAに組み込まれる外来遺伝子
（DNA断片）は、特定の高分子物質の菌体外生産
（分泌）に関与する情報を担うDNAであり、高分
子物質、例えばキシラナーゼ、ペニシリナーゼ、
ホスフアターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アミラ
ーゼ、プロテアーゼ、β−グルカナーゼ等々の酵
素蛋白類を生産して菌体外に分泌せしめる情報を
担うDNAが挙げられる。 前記外来の遺伝子DNAは、微生物起源の高分
子物質の菌体外生産（分泌）に関与する情報を担
うDNAとして、例えば、バチルス（Bacillus）
属に属する微生物のバチルス・C125菌（微工研
菌寄第7344号）から調製されたDNA断片が有利
に用いられる。 本発明に使用される、キシラナーゼの菌体外生
産に関与する遺伝情報を担うDNAを含有する微
生物の例としては、バチルス・C125菌（微工研
菌寄第7344号）を挙げることができる。バチル
ス・C125菌は埼玉県入間郡鶴ケ島町で採取され
た土壌より分離された微生物であり、次の菌学的
性質を有する。 なお、菌学的性質の試験及び分類方法は、「エ
アロビツク・スポア・ホーミング・バクテリア」
〔“Aerobic Spore−forming Bacteria”（Unitd
State Department of Agriculture、Nov.1952
by N.R.Smith、R.E.Gordon ＆ F.E.Clark）〕
及び「バージエースマニユアル・オブ・デタミネ
イテイブ・バクテリオロジー」（1957年）
〔Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology（1957）〕に基づいて行われた。 Γ菌学的諸性質 (a) 形態 (1) 大きさは0.5〜0.7μ×3.0〜4.0μの桿菌であ
る。 (2) 胞子を形成し、大きさは0.6〜0.8μ×1.0〜
1.2μの卵形であつて、胞子のうはふくらんで
いる。 (3) グラム染色性は陽性である。
【表】
【表】
【表】 以上の諸性質を総括すると、前記バチルス・
C125菌は、好気性の有胞子細菌であることから、
バチルス（Bacillus）属に属する微生物であるこ
とは明らかであるが、特に生育し得る範囲がPH／
1.0と55℃までである点において明らかに公知の
菌種と区別され、好アルカリ性細菌の新菌種を認
定することが妥当であると結論された。 前記ベクターDNAとしては、天然に存在する
ものを抽出したものゝ他、増殖に必須な部分以外
のDNAの部分が一部欠落しているものでもよく、
例えばColE1の系統、pMB9の系統、pBR322の
系統、pSC101の系統、R6Kの系統、ラムダーフ
アージの系統等が挙げられる。 また、前記ベクターDNAに前記外来遺伝子
DNAを組み込む方法は、既知のいずれの方法も
適用し得る。例えば、適当な制限酵素
（Endonuclease）を選択、処理してDNAを切断
し、次いで同様に処理した、ベクターとして用い
るDNAと混合し、リガーゼによつて再結合する
方法が用いられる。 このように得られた外来のDNA断片とベクタ
ーDNAの結合物を、形質転換法によつて受容菌
であるエシエリヒア属の微生物の菌体に導入し、
遺伝形質として安定するまで増殖すると、所望の
遺伝形質とベクターDNAの形質を併せもつ形質
転換株が得られる。このようにして得られた微生
物を培養するには、特定の遺伝情報によつて生成
される物質の生産に適した培地であつて且つ宿主
のエシエリヒア属の微生物の生育に適した培地を
用い得るが、本発明方法では、使用培地の組成と
して、生育のために要求される無機塩とともに、
選択された炭素源を必須に含有する培地で生育、
増殖させ、同一培地で菌体量が最大に達したとき
から実質的に前記培地中に代謝産物である高分子
物質の生成、蓄積が停止するまでの時間中、その
まま培養を継続することが必要である。無機塩と
しては、特に塩化ナトリウムが有効であり、また
塩化カリウムも用い得る。無機塩を含有する培地
としては、グルコース、シユークロース、ラクト
ース、マルトース、グリセロール、〓、キシラン
等々の炭素源、アンモニア水、アンモニウム塩等
の窒素源、無機イオンの他に、必要に応じてアミ
ノ酸、ビタミン等の栄養素を含有させることがで
き、特に前記炭素源の影響は重要であり、生産物
質に応じて適宜選択し、添加することが必要であ
る。通常、エシエリヒア．コリの生育培地として
用いられるLB培地（トリプトン、酵母エキス、
食塩）、BPB培地（Difco；ポリペプトン、酵母
エキス、リン酸カリウム）、栄養．寒天培地
（Difco0001）、トリプトン．食塩培地等を基本培
地として調製したものを用いればよい。 無機塩を含まない前記の培地では、80％以上の
物質が菌体内で生産されるので、生成物質のほと
んどを菌体外に生産させるためには無機塩の存在
は必須である。また、無機塩の使用量は、培地組
成に対してほゞ0.5〜3.0％が適当である。 炭素源の影響は、前記LB培地に〓及び／又は
キシランを加えたときに特にすぐれた結果が得ら
れ、培地組成に対してそれぞれほゞ0.5％量の添
加が望ましい。 培養方法は、PH、温度、酸素供給量等の条件と
してエシエリヒア属の微生物の生育に適した条件
を採り得るが、前記微生物を培地に接種した後、
前記微生物が生育してその菌体量が最大に達した
とき、即ち対数増殖後期から実質的に培地中に高
分子物質の生成、蓄積が停止するまでの時間中、
同一培地で培養をそのまま継続することが必要で
ある。 エシエリヒア属の微生物の前記菌体量が最大に
達したときから実質的に培地中に高分子物質の生
成、蓄積が停止するまでの時間は、ほぼ12〜48時
間の範囲である。なお、PH条件は特に影響されな
いが、PH５〜８の範囲、特にPH７が適当である。
かくして、培養中に生育のために要求される無機
塩及び炭素源その他の成分を培地に更に添加する
ことなく、前記微生物の菌体外に高分子物質が著
量に生産（分泌）され、有利に採取し得る。 本発明方法によつて、生産物質は目的とする単
一の高分子物質のみならず、複数の酵素蛋白類が
それぞれ菌体外に著量に生産（分泌）され、併せ
て採取することができる。即ち、前記エシエリヒ
ア・コリHB101（pC×311）株の培養により、キ
シラナーゼと共にペニシリナーゼや従来、菌体内
にのみ検出されていたアルカリホスフアターゼ
が、後述の実施例に記載の如く、それぞれ菌体外
に著量に分泌されることが明らかにされた。これ
は、本発明によつて得られる後述のプラスミド
（pC×311）に含まれる約4000の塩基対のDNA
が、代謝産物の菌体外生産（分泌）能を宿主に附
与していることを意味するものである。 本発明の培養方法により、酵素蛋白の他、抗生
物質、多糖類その他の高分子発酵生産物を著量に
生産することができ、また更に、外来の生理活性
高分子物質の生産の遺伝情報を担うDNAと生理
活性高分子物質の菌体外選択生産（分泌）に関与
する遺伝情報を担うDNAとを併せもつプラスミ
ドを利用することによつて、インシユリン等のホ
ルモンペプチドやインターフエロン抗体等の生理
活性蛋白の大量生産法にも適用し得るので、有用
高分子物質の工業的発酵生産に寄与するところ極
めて大である。 以下に、本発明方法の一例として、酵素蛋白の
キシラナーゼの場合について説明する。まずその
菌体外生産（分泌）遺伝情報を担うDNAを組み
込んだプラスミドによるエシエリヒア・コリの形
質転換株の調製を例示する。 (1) キシラナーゼ生産能の遺伝情報をもつDNA
の調製 キシラナーゼを菌体外に生成、蓄積する能力
を有する好アルカリ性のバチルス・C125菌
（微工研菌寄第7344号）を培地〔（ｇ／）：〓
10.0、酵母エキス5.0、ポリペプトン5.0、
K2HPO41.0、MgSO4・7H2O0.2をNa2CO310で
PH6.0に調整したもの〕中、30℃で19時間振盪
培養を行ない、対数増殖後期の菌体を集菌後、
フエノール法によるDNA抽出法によつてDNA
を抽出、精製し、DNA5mgを得た。 (2) DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得たDNA10μｇをとり、制限エンドヌ
クレアーゼHind を加え、37℃で５分、10
分、20分、30分、60分反応させて部分的に切断
した。一方、ベクターとして用いるテトラサイ
クリン抵抗性（Tetr）とアンピシリン抵抗性
（Ampr）をもつpBR322プラスミドDNA
（Bethesda Research Laboratories社（米国）
製）をHind で完全に切断して65℃、５分
の熱処理後、前者と混合し、T4フアージ由来
のDNAリガーゼによつて10℃、24時間DNA鎖
の連結反応を行ない、65℃、５分の熱処理後、
反応液に２倍容のエタノールを加えてDNAを
組み込んだプラスミドDNAを沈澱、採取した。 (3) キシラナーゼの菌体外生産（分泌）遺伝子を
担うプラスミドによる形質転換 エシエリヒア・コリＫ−12株とエシエリヒ
ア・コリＢ株のハイブリツド株であるエシエリ
ヒア・コリHB101株〔Molecular Cloning Ａ
Laboratory Manual p.504（1982）参照〕
（遺伝形質：F-、hsdS20（r- B、m- B）、rec
A13、ara-14、pro A2、lac Y1、gal K2、
rps L20（Sm1）、xyl−５、mtl−１、sup
E44λ-）をLB培地（純水１当りトリプトン
（Difco）10ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース
１ｇ、NaCl10ｇを含み、PH7.0に調製したも
の）10mlに接種し、37℃で振盪培養を行ない、
対数増殖後期まで生育させた後に集菌した。こ
れを氷冷下、最終濃度で0.03M CaCl2の溶液に
順次懸濁させてコンピテントな細胞とした。こ
の細胞懸濁液に(2)で得たプラスミドDNAの溶
解液を加えて氷冷下で60分反応させ、42℃、１
〜２分間ヒートシヨツクを与えて前記プラスミ
ドDNAを細胞内に取り込ませた。次いで、こ
の細胞懸濁液を別途、前記LB培地に接種し、
37℃、３〜５時間振盪培養して形質転換反応を
行なつた後、集菌、洗滌して形質転換株を得、
そのなかからエシエリヒア・コリHB101
（pCX311）（微工研菌寄第7345号）（FERMP−
7345）を得た。この形質転換株のプラスミド
（pC×311）は、キシラナーゼの菌体外生産
（分泌）に関与する遺伝情報を担うキシラナー
ゼDNA断片が組み込まれているDNA円形分
子、即ちpBR322プラスミドDNAと約4000の
塩基対のDNAから成る9.01Kbの新規なDNA
円形分子であり、その制限酵素切断地図は第４
図に示すとおりである。 実施例 １ 前記(3)で得られた形質転換株、エシエリヒア・
コリHB101（pC×311）（微工研菌寄第7345号）
（FERMP−7345）を、LB培地（１当りトリプ
トン10ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース１ｇ、グ
リセロール２ｇ、NaCl10ｇ、ペニシリン10mgを
含む）100mlに0.5％のキシランを含む500ml容の
フラスコで37℃にて振盪培養した。細胞の生育
（菌体量の測定は、660nｍの吸光度（OD）で、
酵素活性は、酵素液0.005mlにキシラン液（生化
学工業(株)製）0.1ml及びPH8.0の0.2Mトリスマレイ
ト緩衝液0.1mlを加えて40℃で10分間反応させ、
DNS（３，５−dinitrosalicylic acid）１mlを加
えて100℃で５分間反応させた後に水４mlを加え
て510ｍμの吸光度を測定し、１分間にキシロー
ス１mgの還元力を生ずる酵素量をキシラナーゼ１
単位（Ｕ）とした。 第１図は、前記LB培地に0.5％キシランを加え
た培地を用いた場合のキシラナーゼの活性、即ち
キシラナーゼの菌体外生産（分泌）能を示すグラ
フである。 前記形質転換株の菌体量は接種後、９〜12時間
で最大に達し、第１図に示すとおり、菌体外キシ
ラナーゼの活性はほぼ６時間後から増大しはじ
め、13時間後に最大に達した（≒0.35U／ml）。
生産されたキシラナーゼは非常に安定であり、第
１図に示されるように、更にそのまま培養を48時
間まで継続しても生産量は減少せず、全酵素活性
の80％以上に達した。これに対して、菌体内キシ
ラナーゼは、培養初期（接種後９時間）において
若干認められたが、その生産は全酵素活性の10％
程度であり、最高で0.13U／mlに過ぎず、しかも
その活性は徐々に減少した。 また、第２図は、前記LB培地にキシランに代
えて0.5％の〓を加えた培地を用いた場合のキシ
ラナーゼの活性を示すグラフであり、第１図の場
合とほゞ同様の傾向が認められた。なお、比較と
して、DNA供与菌の前記バチルス・C125菌（微
工研菌寄第7344号）を培養してキシラナーゼ活性
を測定した。 前記バチルス・C125菌の場合は、使用培地
〔（ｇ／）：キシラン10.0、酵母エキス5.0、ポリ
ペプトン5.0、K2HPO41.0、MgSO4・7H2O、0.2
をNa2CO310でPH9.0に調整したもの〕100mlを含
む500ml容のフラスコに接種し、37℃で振盪培養
した。 培養液の菌体外キシラナーゼ活性を８時間毎に
測定した。接種後、８時間で徐々に活性が上が
り、48時間に至つてやつと活性は最高（0.5U／
ml）に達したが、以後急速に活性は減少した（第
３図参照）。 実施例 ２ 前記エシエリヒア・コリHB101（pCX311）（微
工研菌寄第7345号）（FERMP−7345）の菌体外
キシラナーゼ生産について、培地中における無機
塩の影響を比較した。なお、培養条件は実施例１
と同様である。 即ち、実施例１の培地を基本培地とし、これに
無機塩を添加して14時間および20時間、それぞれ
培養し、無機塩の影響を調べた。 この結果を第１表に示す。
【表】
【表】 実施例 ３ 前記エシエリヒア・コリHB101（pCX311）（微
工研菌寄第7345号）（FERM Ｐ−7345）の菌体
外生産物質について、プラスミド（pCX311）を
導入しないエシエリヒア・コリHB101株及び
pBR322プラスミドを導入したエシエリヒア・コ
リHB101株の生産物質と比較して、キシラナー
ゼ以外の酵素蛋白類を調べた結果を第２表に示
す。 なお、培養条件は、実施例１のキシランを加え
たLB培地で、ペニシリナーゼについては、37℃
にて20時間振盪培養し、アルカリホスフアターゼ
及びβ−ガラクトシダーゼについては、15時間そ
れぞれ培養した。また、アルカリホスフアターゼ
及びβ−ガラクトシダーゼの酵素活性は、波長
420nｍにおける吸光度（OD）を測定して表わし
たものである。
【表】 参考例 実施例１の形質転換株の培養液に硫酸アンモニ
ウムを加えて塩析した後、沈澱を水に溶かして一
夜流水で透析し、PH4.5の20ｍＭ燐酸−燐酸１ソ
ーダー緩衝液で平衡化したCMセルロースに吸着
させた後に食塩濃度を0.1Mから0.7Mまで変化さ
せてキシラナーゼを溶出させると、0.4M前後で
溶出される。活性のある区分を集めてセフアデツ
クス・Ｇ−100（Sephadex Ｇ−100）によるゲル
過を行つて精製キシラナーゼを得た。また、前
記バチルス・C125菌（微工研菌寄第7344号）の
培養液を同様に処理して精製し、同様なキシラナ
ーゼを得た。 両者のキシラナーゼの同一性をみるために、PH
活性、超遠心分析、電気泳動及び分子量等を測定
したところ、次のとおり両者の同一性が確認され
た。 (a) PH４〜５は酢酸塩、PH５〜８はトリスマレイ
ト、PH７〜９はトリス塩酸、PH９〜11はグリシ
ン苛性ソーダを用いて夫々調整し、前記測定法
によつてPHの影響を調べた結果、第５図のとお
り、両酵素のPH活性の同一性が明らかにされ
た。 (b) 超遠心分析では、両酵素ともに沈降定数約
3.5Sの単一ピークを示した。 (c) PH8.3のデイスク電気泳動で両酵素ともに一
本のバンドになつており、アンフオラインによ
るエレクトロホーカシングで単一のピークを示
し、等電点は6.3にあつた。 (d) 分子量は、両酵素ともにSDS−ポリアクリル
アミド法により約40000と測定された。
【図面の簡単な説明】
第１図及び第２図は、本発明方法で用いたエシ
エリヒア・コリHB101（pCX311）によるキシラ
ナーゼ生産活性を、第３図は、バチルス・C125
菌によるキシラナーゼ生産活性をそれぞれ示すグ
ラフである。第４図は、エシエリヒア・コリ
HB101（pCX311）のプラスミド（pCX311）の制
限酵素切断地図であり、第５図は、エシエリヒ
ア・コリ101（pCX311）とバチルス・C125菌の産
生するキシラナーゼのPH活性の同一性を示すグラ
フである。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ バチルス（Bacillus）・C125菌の代謝産物で
    あるキシラナーゼの菌体外選択生産に関与する遺
    伝情報を担うデオキシリボ核酸（DNA）、また
    は、該DNAとキシラナーゼ以外の蛋白質をコー
    ドするDNAとを組み込んだプラスミドを含有す
    るエシエリヒア（Escherichia）属に属する微生
    物を、生育のために要求される無機塩を含有する
    培地に接種し、接種後、前記微生物の菌体量が最
    大に達したときから実質的に前記培地中にキシラ
    ナーゼ、または、キシラナーゼと前記蛋白質の生
    成、蓄積が停止するまでの時間中、培養をそのま
    ま継続することによつて、前記微生物の菌体外に
    キシラナーゼ、または、キシラナーゼと前記蛋白
    質とを生成せしめることを特徴とする微生物の培
    養方法。
JP58232507A 1983-03-08 1983-12-09 微生物の培養方法 Granted JPS60126077A (ja)

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