JPH0143551B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はウロキナーゼの精製法に関し、なお詳
しくは人尿またはそれに由来する粗製ウロキナー
ゼから高純度のウロキナーゼを工業的に有利に取
得する方法に関する。

ウロキナーゼは血清中に含まれるプラスミノー
ゲンを活性化して、フイブリン溶解能を有するプ
ラスミンを生成する機能をもつので、線溶系の賦
活剤として有用であり、末梢血管におこる血栓症
や心筋梗そく症などの治療に広く臨床使用されて
いる。

またウロキナーゼは近年マイトマイシンＣなど
の抗ガン剤との併用により、抗ガン剤の薬効を著
しく向上せしめることが見出され、その需要は急
速に増大している。

ウロキナーゼの精製法としては、既に種々の方
法が提案されている。しかしながら工業的に有利
な精製法の目安として、吸着体の単位容積当りの
ウロキナーゼ吸着能を見ると、いずれも１ml当り
100万国際単位（以下「IU」と略す）に達せず吸
着能の高い吸着体の開発が望まれていた。本発明
者らはこの点について研究を重ね本願発明を完成
するに致つた。本発明による時は、吸着体１ml当
り100万IU以上の吸着能を有し、吸着されたウロ
キナーゼはほゞ定量的に溶離回収が可能である。

本発明に関連する方法として、CMセフアロー
ス（フアルマシア社製）を用いた特許出願（特開
昭53−130485）などがある。該方法はウロキナー
ゼ（分子量約33000）とウロキナーゼ（分子
量約54000）を分離取得し、ウロキナーゼの比
活性は５万〜７万“CTAu／mg蛋白質”を示して
おり比較的優れた方法である。しかしながらその
実施例の記載によると、CMセフアロース１ml当
りのウロキナーゼ吸着量は、40万CTAu前後にす
ぎない。本発明の方法によるときは、吸着体単位
体積当りのウロキナーゼ吸着量を減ずることな
く、これらウロキナーゼの分離精製が可能であ
る。

その他にもカルボキシメチル（CM）化吸着体
を用いた方法が多数提案されている。これらの方
法で用いるCM化吸着体の多くは、セルロース、
アガロース、綿などの水不溶性担体に、モノクロ
ル酢酸などのα−ハロゲノ置換脂肪酸を結合して
CM基を導入したものか、またはCM化モノマー
を重合させて得られたポリマーである。中でもフ
アルマシア社などから供給されているCMセルロ
ース、CMセルフアロース、CMセフアデツクス
等が広く用いられている。

本発明者らは、これらCM化吸着体によるウロ
キナーゼの精製を検討中、ウロキナーゼの吸着
量、使用至適PH、使用至適電導度、精製度等が吸
着体によつてそれぞれ異なることを知り、この現
象はウロキナーゼがCM化吸着体に吸着、解離す
る場合、CM基とウロキナーゼの間の親和力のほ
かに、ウロキナーゼあるいは夾雑蛋白質と非特異
的に結合する要因が、CM化吸着体の側に存在す
ることを示すものと判断した。

本発明者らは、吸着体とウロキナーゼおよび夾
雑蛋白質の非特異的結合要因の排除、並びにCM
基の導入量（率）などにつき鋭意研究を重ね、本
発明を完成するに致つた。すなわち、CM基をい
わゆるスペーサーを介してアガロースと結合させ
ることにより得られる吸着体が、工業的に有利な
ウロキナーゼ吸着能を有し、さらに発熱性物質を
含まない高純度のウロキナーゼをウロキナーゼ
およびに分別して採取し得ることを見出したの
である。

以下に本発明の方法を具体的に説明する。

まず本発明に使用する水不溶性アガロースとし
ては、セフアロース4B、セフアロース6B（いず
れもフアルマシア社製）などが好適である。

特許請求の範囲第１項に記載したアガロース誘
導体の合成方法としては、例えば松本らの方法
〔J.Biochem.87、535（1980）〕によつても可能で
ある。即ち、セフアロースとエピクロルヒドリン
を反応させた後、アンモニア水でエポキシ基を加
水分解し、生成するアミノ基に無水コハク酸、無
水グルタル酸などの無水ジカルボン酸を反応させ
るものである。

このようにして得られた吸着体は、酸・アルカ
リによる再生処理時に、PHの変化に伴なつて起る
膨潤度の変化が少なく、したがつてカラムに充て
んしたまま再生処理するのが、きわめて容易であ
る。これに対して、セフアデツクス、セルロース
などでは、PHの変化に伴つて膨潤度が大きく変化
したり、酸・アルカリ処理時に細断化が見られる
など不都合が生じ易い。

次に、本発明のアガロース誘導体を用いるウロ
キナーゼの精製法は以下のとおりである。先ずウ
ロキナーゼを含有する溶液のPHを４〜6.5に、ま
た電導度を４〜８ミリモー／cmに調整する。

前述の方法によつて造られたアガロース誘導体
はカラムに充てんし、あらかじめウロキナーゼ含
有液と同一のPHと電導度をもつた緩衝液にて平衡
化しておき、これにウロキナーゼ含有液を通すと
ウロキナーゼが該吸着体に選択的に吸着される。
発熱性物質および夾雑蛋白質はほとんど吸着され
ないので、吸着体の平衡化に用いたのと同一の緩
衝液で洗浄することにより、これら不純物の大部
分を除去することが可能である。つづいて洗浄に
用いた緩衝液よりも若干高いPH値および（また
は）若干高い電導度を示す緩衝液を通すことによ
り、吸着体上に残存していた発熱性物質、夾雑蛋
白質と共に不必要な酵素様物質を溶離脱着させ
る。さらにつづいてPHおよび（または）電導度を
さらに高めた緩衝液によつてウロキナーゼ活性区
分を溶出採取すると、発熱性物質を含まない高純
度のウロキナーゼが高収率で得られる。

このようにしてウロキナーゼを吸着・溶出した
後の吸着体は、0.1N水酸化ナトリウム水溶液で
洗浄し、さらに0.1N塩酸で洗浄した後、要すれ
ば水洗し、緩衝液にて前述せるごとく平衡化を行
なえば、本発明の吸着体はウロキナーゼの吸着能
も精製能も損うことなく、反復使用が可能であ
る。

以下実施例により本発明をさらに詳細に説明す
る。なおウロキナーゼ活性はプラウグらのフイブ
リン平板法〔J.Ploug：Biochim、Biophys.Acta
24、278（1957）〕にて測定し、活性の表示はジ
ヨンソンらにより定められた国際単位（IU）〔A.
Johnson：Thrombos.Diathes.haemorrh.
（Stuttg.）21、259（1969）〕によつた。また蛋白
質の定量は「Folin−Lowry法」で、発熱性物質
試験はエンドトキシン量として「リムルステスト
（プレゲル）法」で行なつた。

実施例 １ (1) セフアロース6B（フアルマシア社製）約12ml
を、蒸留水15ml、2N−水酸化ナトリウム6.5
ml、エピクロルヒドリン1.5mlと共に、40℃に
て２時間反応後、生成したエポキシセフアロー
スを別水洗した。次にこのエポキシセフアロ
ース約12mlを18mlの濃アンモニア水と40℃にて
1.5時間反応させ、別後十分水洗した。こゝ
に生成したハイドロキシアミノプロピルセフア
ロース約12mlを、18mlの蒸留水中に添加し、４
℃で撹拌しつつ無水コハク酸1.3ｇを少量づつ
加え、同時に20％水酸化ナトリウムにてPHを
6.0に保つた。PHの変動がなくなつて後さらに
約５時間撹拌を続けた。別洗浄後0.1N水酸
化ナトリウム溶液中で室温にて30分間撹拌し、
再び過水洗した。こうしてサクシニル−２−
ハイドロキシ−プロピルアミド−セフアロース
（以下「サクシニルセフアロース」と略称する）
約12mlを得た。

(2) 「サクシニルセフアロース」0.5mlをカラム
に充てんし、PH5.2、電導度5.2ミリモー／cmの
酢酸緩衝液で平衡化した。一方、原尿からパー
ライトとアフイニテイークロマトグラフイーで
部分精製した粗ウロキナーゼ溶液150万IUを、
PH5.2、電導度5.2ミリモー／cmに調整して、前
記カラムに通した。この粗ウロキナーゼは比活
性68300IU／mg蛋白質、エンドトキシン量は
5000IU当り２×10^-3μｇであつた。

ウロキナーゼを吸着した前記カラムを平衡化
に用いた緩衝液で洗浄した後、PH5.2のリン酸
緩衝液を用い、常法により食塩を電解質として
電導度4.5〜2.0ミリモー／cmの直線的濃度勾配
法により溶出した。溶出液を分画採取してウロ
キナーゼ活性を有する２個の画分を得た。活性
画分の活性はそれぞれ158000IUおよび
1320000IUで、主たる画分の比活性は
108000IU／mg蛋白質、エンドトキシン量は
5000IU当り0.01×10^-3μｇであつた。

実施例 ２ 実施例１で使用した「サクシニルセフアロー
ス」0.5mlを、0.1N水酸化ナトリウム溶液と0.1N
塩酸で洗い、さらに水洗後、PH4.8、電導度5.0ミ
リモー／cmの酢酸緩衝液で平衡化した。

実施例１と同様の粗ウロキナーゼ溶液150万IU
を、PH4.8、電導度5.0ミリモー／cmに調整しカラ
ムに通じた。平衡化に用いた緩衝液でカラムを洗
浄し、さらにPH5.0、電導度8.0ミリモー／cmのリ
ン酸緩衝液を通じ溶出する区分を除去した。つい
で緩衝液を、PH6.5、電導度13.0ミリモー／cmの
リン酸緩衝液に替え、溶出するウロキナーゼ活性
画分４mlを得た。回収されたウロキナーゼ画分の
総活性は1280000IU、比活性113000IU／mg蛋白
質、エンドトキシン量は5000IU当り0.01×10^-3μ
ｇであつた。

実施例 ３ 実施例２に使用した「サクシニルセフアロー
ス」0.5mlを実施例２と同様にアルカリ・酸によ
る洗浄および水洗により再生し、PH5.0、電導度
5.0ミリモー／cmの酢酸緩衝液で平衡化した。

原尿からパーライトに吸着・溶出し、さらに塩
析抽出して得た粗ウロキナーゼ溶液100万IUをPH
5.0、電導度5.0ミリモー／cmに調整してカラムに
通じた。この粗ウロキナーゼは、比活性
8900IU／mg蛋白質、エンドトキシン量は5000IU
当り1500×10^-3μｇであつた。ウロキナーゼを吸
着したカラムは、平衡化に用いた緩衝液で洗浄
後、実施例２と同様処理して溶出する区分を除き
さらにPH6.5、電導度13.0ミリモー／cmの緩衝液
でウロキナーゼ区分を溶出回収した。

得られたウロキナーゼ溶液は総活性926000IU、
比活性87600IU／mg蛋白質、エンドトキシン量は
5000IU当り1.8×10^-3μｇであつた。

実施例 ４ (1) セフアロース4B（フアルマシア社製）約10ml
を、実施例１と同様、蒸留水13ml、2N水酸化
ナトリウム5.5ml、エピクロルヒドリン1.3mlと
共に、40℃にて２時間反応させ生じたエポキシ
セフアロースを別水洗した。ついでエポキシ
セフアロース約10mlを15mlの濃アンモニア水と
40℃1.5時間反応させ、別水洗してハイドロ
キシアミノプロピルセフアロース約10mlを得
た。これに蒸留水15mlを加え、４℃で撹拌しつ
つ、1.2ｇの無水グルタール酸を少量づつ添加
し、20％水酸化ナトリウムでPHを6.0に保持し
た。PHが変化しなくなつてからさらに約５時間
撹拌を続けた。過洗浄後、0.1N水酸化ナト
リウム水溶液中にて30分間室温で撹拌した。再
び過水洗して、グルタリル−２−ハイドロキ
シ−プロピルアミド−セフアロース（以下「グ
ルタリルセフアロース」と略称）約10mlを得
た。

(2) 「グルタリルセフアロース」0.5mlをカラム
に充てんし、実施例１と同様な処理を行ない、
粗ウロキナーゼ130万IUを精製した。実施例１
と同一の粗ウロキナーゼを使用して、得られた
精製ウロキナーゼは、比活性105000IU／mg蛋
白質のものが、1120000IU得られた。また、エ
ンドトキシン量は5000IU当り0.02×10^-3μｇで
あつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ウロキナーゼの精製工程において、一般式が
   次式 （式中Ａはアガロースの残基、ｎは２または２以
   上の整数） で表わされるアガロース誘導体にウロキナーゼを
   吸着せしめ、後ウロキナーゼを溶離回収すること
   を特徴とする高純度ウロキナーゼの分離精製法。 ２ 一般式中、ｎが２であるアガロース誘導体を
   使用する特許請求の範囲第１項記載の高純度ウロ
   キナーゼの分離精製法。 ３ 前項記載のアガロース誘導体のウロキナーゼ
   吸着能が、吸着体１ml当り、100万国際単位以上
   である特許請求の範囲第１項記載の高純度ウロキ
   ナーゼの分離精製法。 ４ ウロキナーゼを溶離回収した後のアガロース
   誘導体を、洗浄再生し、反復使用する特許請求の
   範囲第１項記載の高純度ウロキナーゼの分離精製
   法。