JPH0147995B2

JPH0147995B2 -

Info

Publication number: JPH0147995B2
Application number: JP58250400A
Authority: JP
Inventors: Susumu Matsui; Tomoko Uchida; Tsutomu Taniguchi
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1983-12-23
Filing date: 1983-12-23
Publication date: 1989-10-17
Also published as: JPS60137287A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は新規グルタチオン・オキシダーゼおよ
びその製造法に関する。さらに詳しくは、還元型
グルタチオン（以下GSHと略す）のみに作用し
て、他のスルフヒドリル化合物には全く作用しな
い新規グルタチオン・オキシダーゼ、および担子
菌によるその製造法に関する。本発明の新規グルタチオン・オキシダーゼは酸
素の存在下、GSHのみに作用して、酸化型グル
タチオン（以下GSSGと略す）と過酸化水素を生
成する。それ故、過酸化水素の生成量あるいは酸
素の減少量の公知の方法で測定することによつ
て、生体試料中または食品中のGSH量を測定す
ることが可能である。〔従来技術〕従来、フラビン化合物を補酵素としてGSHを
GSSGに酸化する酵素、スルフヒドリル・オキシ
ダーゼがラツト精のう分泌物から単離されている
〔バイオケミストリー（Biochemistry）第19巻第
2639頁（1980年）〕。しかし、この酵素はGSHの
みならずシステイン、２―メルカプトエタノー
ル、ジチオスレイトールなどのスルフヒドリル化
合物にも作用し、特にジチオスレイトールには最
も強い親和性を示す。また、微生物起源の酵素と
して、特開昭57―132879号公報にアスペルギルス
属、ペニシリウム属、スザリウム属、トリコデル
マ属、パエシロミセス属またはグリオクラデイウ
ム属に属する微生物がGSHに特異性が高くフラ
ビン化合物を補酵素とするグルタチオン・スルフ
ヒドリル・オキシダーゼを生産するという報告が
ある。しかし、これらの菌株の生産するグルタチ
オン・スルフヒドリル・オキシダーゼはジチオス
レイトール、Ｌ―システイン、２―メルカプトエ
タノール、その他のスルフヒドリル化合物にも作
用し、GSHのみに特異性があるとはいい難い。
さらに、上記酵素は主に固体培地で生産されるか
ら大量生産には不適当である。〔発明の目的〕本発明者らは、生体試料中あるいは食品中の
GSHを特異的に定量する方法について鋭意検討
を重ねた結果、ある種の担子菌が培養物中に
GSHのみに特異性を示し、優れた性質を有する
新規グルタチオン・オキシダーゼを生産すること
を見出し、本発明を完成した。それ故、本発明の
目的は、GSHを特異的に定量できる新規グルタ
チオン・オキシダーゼおよび担子菌を培養して上
記酵素を工業的に安価に製造する方法を提供する
ことにある。〔発明の構成〕本発明を概説すれば、本発明は新規グルタチオ
ン・オキシダーゼ、およびその製造法に関するも
のであつて、詳しくはチヤハリタケ属およびフウ
センタケ属に属し、新規グルタチオン・オキシダ
ーゼ生産能を有する担子菌を培養し、培養物から
新規グルタチオン・オキシダーゼを採取すること
からなる。本発明に使用される担子菌は、イボタケ科
（Phylactericeae）チヤハリタケ属（Calodon）
に属する菌株、例えばニオイハリタケＫ―1971株
（Calodon suaveolens Ｋ―1671）またはフウセ
ンタケ科（Cortinariaceae）フウセンタケ属
（Cortinarius）に属する菌株、例えば、サザナミ
ツバフウセンタケＫ―946株（Co―rtinarius
bovinus Ｋ―946）である。ニオイハリタケＫ―
1671株は富士山にて針葉樹林内の地上に群生して
いた子実体より分離され、サザナミツバフウセン
タケＫ―946株は奈良県春日山にて松林内地上に
群生していた子実体より分離された。上記菌株の子実体および胞子の形態的特徴は以
下のとおりである。 (a) ニオイハリタケＫ―1671株高さは３〜５cm位、傘は直径５〜12cm、肉は厚
く扁平、ほぼ円形、２〜３癒着して横に連なつて
いる。その表面は凸凹で、あらい皺と瘤があり、
最初はほとんど白く、後に淡茶と青味をおびる。
肉は革質で厚さ５mm前後、上層は軟らかく、下層
は硬く、青蓋色の輪紋を示す。針は３〜６mm位で
灰藍色、後に灰褐色になる、先端は白色、茎に垂
生している。茎は太く短く、硬いコルク質であ
り、１〜３×0.6〜１cm位で濃藍色を呈し、内部
には同じ色の輪紋がある。胞子は類球形でほとん
ど無色で、４〜６×４〜5μである。以上の特徴を保育社発行、今関六也および本郷
次雄共著「原色日本菌類図鑑」の記載と比較する
と本菌はニオイハリタケであることが明瞭であ
る。本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に微
生物受託番号微工研条寄第398号として寄託され
ている。 (b) サザナミツバフウセンタケＫ―946株傘は直径４〜７cmで、開けばほとんど平にな
る、表面は粘性がなく、汚褐色あるいはニツケイ
褐色で、周辺部は最初白色繊維状である。ヒダは
やや疎で茎に上生し、灰褐色後にニツケイ褐色と
なる。茎は高さ５〜８cm、根元はふくれて直径
1.5〜3.5cm、中央部付近に早落性の白いツバ様の
ものがあり、これより上部は白色で、下部は傘と
ほぼ同じ色である。胞子は7.5〜10.5×５〜6.5μで
ある。以上の特徴を保育者発行、今関六也および本郷
次雄共著「原色日本菌類図鑑」の記載と比較する
と本菌はサザナミツバフウセンタケであることが
明瞭である。本菌は工業技術院微生物工業技術研
究所に微生物受託番号微工研条寄第399号として
寄託されている。本発明方法を更に詳しく説明すれば、培地に加
える栄養源は使用する菌株が利用し得るものであ
ればよく、炭素源としては例えばグリセロール、
グルコース、デンプン、シユクロース、マルトー
ス、ラクトース、デキストリン、油脂類などが利
用でき、窒素源としては酵母エキス、ペプトン、
脱脂大豆、コーンステイープリカー、肉エキスな
どが適当である。その他にリン酸塩、カリウム
塩、マグネシウム塩などの無機質および金属塩類
を加えてもよく、更にはビタミン類、生長促進因
子を加えてもよい。担子菌を培養するにあたり、新規グルタチオ
ン・オキシダーゼの生産量は培養条件により大き
く変動するが、一般に培養温度は20〜35℃、培地
のPH４〜８が良く、３〜15日間の通気撹拌培養で
新規グルタチオン・オキシダーゼの生産は最高に
達する。培養条件は使用する菌株、培地組成など
に応じ、新規グルタチオン・オキシダーゼの生産
量が最大になるように設定するのは当然である。
本発明の菌株によつて生成された新規グルタチオ
ン・オキシダーゼは主に培養液中にあり、培養
液に可溶性塩類（例えば硫安、食塩など）を20
〜90W／Ｖ％加えることによりあるいは親水性有
機溶媒（例えばエタノール、アセトンなど）を50
〜80v／ｖ％加えることにより沈殿として分離さ
れる。得られた沈殿物を透析あるいはセフアデツ
クス処理によつて脱塩し、粗酵素液を得る。得ら
れた粗酵素液を精製するには、あらかじめ0.01M
酢酸緩衝液（PH5.0）で緩衝化したSP―セフアデ
ツクス（Ｃ―50）のカラムに粗酵素液を吸着さ
せ、吸着物を0.03M酢酸緩衝液（PH5.0）で洗浄
後、0.1M酢酸緩衝液（PH5.0）で溶出して活性区
分を集める。次にこの活性区分をコロジオン膜で
濃縮後、あらかじめ0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
で緩衝化したセフアクリルＳ―200のカラムでゲ
ル過を行ない、活性区分を得る。この活性区分
を再びコロジオン膜で濃縮後、あらかじめ0.1M
リン酸緩衝液（PH7.0）で緩衝化したセフアロー
スCL―6Bのカラムでゲル過を行ない、得られ
た活性区分を水で透析後、凍結乾燥し、精製酵素
粉末を得る。この酵素粉末はポリアクリルアミド
ゲルデイスク電気泳動的に単一である。本発明の新規グルタチオン・オキシダーゼの酵
素化学的および理化学的性質は次のとおりであ
る。 (1) 作用：本発明の酵素は、酸素の存在下GSHのみを酸
化し、GSSGと過酸化水素を生成する新規なグル
タチオン・オキシダーゼである。本酵素は下記反
応式のごとく、GSH2モルと酸素１モルから
GSSG1モルと過酸化水素１モルを生成する。 2GSH＋O₂→GSSG＋H₂O₂ (2) 基質特異性： GSHのみに作用する。他のスルフヒドリル化
合物、例えばＬ―システイン、Ｎ―アセチル―Ｌ
―システイン、Ｌ―システインメチルエステル、
システアミン、２―ナルカプトエタノール、ジチ
オスレイトール、チオフエノール、チオリンゴ
酸、チオサリチル酸、メチルメルカプタン、Ｄ―
システイン、DL―ホモシステイン、コエンザイ
ムＡ、２―メルカプトベンズイミダゾール、６―
メルカプトプリンには全く作用しない（PH5.0、
PH7.0およびPH9.0で測定）。 (3) 至適PHおよびPH安定性：本酵素の至適PHは第１図の曲線で表わされるご
とく、PH7.0付近に高い活性を有している。本酵
素を37℃においてそれぞれのPHで60分間処理した
ときのPH安定性を第３図に示した。第３図より明
らかなように本酵素はPH4.0〜PH8.0の間で安定で
ある。第１図および第３図において、PH３ではグ
リシン―塩酸緩衝液、PH４〜５では酢酸緩衝液、
PH６〜８ではリン酸緩衝液、PH９〜10ではホウ酸
緩衝液を使用した。 (4) 至適温度および熱安定性：本酵素の至適温度は第２図の曲線で表わされる
ごとく50℃付近に至適温度を有している。本酵素
をPH7.0においてそれぞれの温度で10分間処理し
たときの熱安定性を第４図に示した。本酵素は60
℃まで安定であつた。 (5) 分子量：本酵素の分子量は、セフアロースCL―6B（フ
アルマシア製）によるゲル過法では約450000で
あり、SDS―ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
では約55000であることから、本酵素はサブユニ
ツト８個から構成されている。 (6) 均一性： 7.5％ポリアクリルアミドゲル（PH9.4）を用い
てデイスク電気泳動を行ない、タンパク染色した
ところ１本の洗色帯が認められ単一であつた。ま
た、SDS―ポリアクリルアミドゲル電気泳動でも
単一バンドを示した。 (7) 補酵素：本酵素を熱処理あるいはトリクロロ酢酸
（TCA）処理し、遠心分離して得られた上澄の薄
層クロマトグラフイーを行なつたところ、Rf値
が標準フラビン・アデニン・ジヌクレオチド
（FAD）のRf値と同じであつた。また、この上澄
はＤ―アミノ酸オキシダーゼのアポ酵素を活性化
したので、FADが本酵素の補酵素であることが
判明した。FADの450nmにおける分子吸光係数
から判断すると、本酵素１分子当たり４分子の
FADが含まれていた（第５図参照）。 (8) 等電点：フアルマライト（PH３〜10、フアルマシア製）
を用いた焦点電気泳動法により求めた本酵素の等
電点は5.65±0.05であつた。 (9) 阻害剤、金属イオン、金属キレート剤の影
響：本酵素はPCMB（Ｐ―クロルメルクリ安息香
酸）、Ｌ―アスコルビン酸ナトリウム、Hg²⁺など
によつて阻害された（第１表）。

〔実施例の説明〕

以下に本発明による新規グルタチオン・オキシ
ダーゼの製造法を実施例をもつて示す。％は他に
特記せぬ限りＷ／Ｖ％である。実施例１グルコース２％、乾燥酵母（商品名エビオス：
朝日麦酒社製）0.5％および寒天1.5％（エビオス
培地）の組成の斜面培地にニオイハリタケＫ―
1671株を接種し、25℃にて１週間静置培養して種
菌とした。グルコース2.0％、酵母エキス0.3％、
ペプトン１％、KH₂PO₄0.3％およびMgSO₄・
7H₂O0.1％の組成の培地100mlを500ml容の三角フ
ラスコに分注し、120℃で20分間殺菌後、冷却し、
これに上記の種菌をかきとり接種して、25℃で７
日間、毎分100回転で振盪培養した。培養終了後、
過して菌体を除き、液を得た。この新規グル
タチオン・オキシダーゼ活性は0.25単位／mlであ
つた。実施例２実施例１のエビオス培地で培養したニオイハリ
タケＫ―1671株をグルコース２％、酵母エキス
0.3％、ペプトン１％、KH₂PO₄0.3％および
MgSO₄・7H₂O0.1％の培地100mlを分注して殺菌
（120℃、20分間）した500mlの三角フラスコに接
種し、25℃で４日間培養して、種培養液とした。
グルコース２％、酵母エキス0.1％、ペプトン２
％、KH₂PO₄0.3％、MgSO₄.7H₂O0.1％および消
泡剤（日本油脂社製CB―442）0.02％（Ｖ／Ｖ）
の組成の培地20を30容のジヤーフアーメンタ
ーに入れ、120℃で20分間殺菌した。冷却後、上
記の種培養液100mlを接種し、27℃で３日間、毎
分20の通気速度と毎分250回転の撹拌速度の条
件で培養した。培養終了後、過して菌体を除
き、液を得た。この新規グルタチオン・オキシ
ダーゼ活性は0.42単位／mlであつた。この培養
液16を分子量15000の限外過膜で濃縮後硫酸
アンモニウムを90％飽和になるように加えた。一
昼夜放置後、得た硫安沈殿物を大量の0.01M酢酸
緩衝液（PH5.0）で、一昼夜透析した。得られた
粗酵素液をあらかじめ0.01M酢酸緩衝液（PH5.0）
で緩衝化したSP―セフアデツクス（Ｃ―50）の
カラム（φ5.0cm×20cm）に吸着させ、吸着物
0.03M酢酸緩衝液（PH5.0）で洗浄後、0.1M酢酸
緩衝液（PH5.0）で溶出した。この活性区分をコ
ロジオン膜で濃縮後、あらかじめ0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.0）で緩衝化したセフアクリルＳ―200
のカラム（φ3.6cm×90cm）でゲル過を行なつ
た。この活性区分を再びコロジオン膜で濃縮後、
あらかじめ0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で緩衝化
したセフアロースCL―6Bのカラム（φ2.5cm×
105cm）でゲル過を行ない、得た活性区分を水
で透析後凍結乾燥し、精製酵素粉末20mgを得た。
この粉末の比活性は90単位／mgであつた。この酵
素粉末はポリアクリルアミドゲルデイスク電気泳
動的に単一であつた。以上の精製工程を第２表に
示す。

【表】実施例３実施例１のエビオス培地にサザナミツバフウセ
ンタケＫ―946株を接種し、25℃にて１週間静置
培養して種菌とした。グルコース2.0％、酵母エ
キス0.3％、ペプトン１％、KH₂PO₄0.3％および
MgSO₄・7H₂O0.1％の組成の培地100mlを分注し
て殺菌（120℃、20分間）した500mlの三角フラス
コに上記の種菌をかきとり接種して、実施例１と
同様に25℃で７日間振盪培養した。この培養液
中の新規グルタチオン・オキシダーゼ活性は0.15
単位／mlであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により得られる新規グルタチオ
ン・オキシダーゼのPHと活性の関係を表わし、第
２図は温度と活性の関係を表わし、第３図は本発
明による酵素を37℃においてそれぞれのPHで60分
間処理した後のPHと活性の関係を表わし、第４図
はPH7.0においてそれぞれの温度で10分間処理し
た後の温度と活性の関係を表わす。第５図は本発
明による酵素の可視部吸収スペクトル（酵素濃度
0.45％、PH7.0）を表わす。

Claims

【特許請求の範囲】１次の理化学的性質を有する新規グルタチオ
ン・オキシダーゼ。 (1) 作用：酸素の存在下、還元型グルタチオンに
作用し、酸化型グルタチオンと過酸化水素を生
成する。 (2) 基質特異性：還元型グルタチオンのみに作用
し、他のスルフヒドリル化合物には全く作用し
ない。 (3) 至適PHおよびPH安定性：至適PHが7.0付近で
あり、37℃、60分間処理ではPH4.0〜8.0の間で
安定である。 (4) 至適温度および熱安定性：至適温度が50℃付
近であり、PH7.0、10分間処理では60℃まで安
定である。 (5) 分子量：ゲル過法で測定した分子量が約
450000で、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）―
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した分
子量が約55000で、サブユニツト８個から構成
されている。 (6) 補酵素：補酵素であるフラビンアデニン・ジ
ヌクレオチド（FAD）が酵素１分子当り４分
子存在する。 (7) 等電点：5.65±0.05。 (8) 阻害剤：Hg²⁺、ｐ―クロルメルクリ安息香
酸、Ｌ―アスコルビン酸ナトリウムなどによつ
て阻害される。 (9) 糖含量：約40％の糖を含む。２チヤハリタケ属またはフウセンタケ属に属す
る新規グルタチオン・オキシダーゼ生産菌を培養
し、培養物より次の理化学的性質を有する新規グ
ルタチオン・オキシダーゼを採取することを特徴
とする新規グルタチオン・オキシダーゼの製造
法。 (1) 作用：酵素の存在下、還元型グルタチオンに
作用し、酸化型グルタチオンと過酸化水素を生
成する。 (2) 基質特異性：還元型グルタチオンのみに作用
し、他のスルフヒドリル化合物には全く作用し
ない。 (3) 至適PHおよびPH安定性：至適PHが7.0付近で
あり、37℃、60分間処理ではPH4.0〜8.0の間で
安定である。 (4) 至適温度および熱安定性：至適温度が50℃付
近であり、PH7.0、10分間処理では60℃まで安
定である。 (5) 分子量：ゲル過法で測定した分子量が約
450000で、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）―
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した分
子量が約55000で、サブユニツト８個から構成
されている。 (6) 補酵素：補酵素であるフラビンアデニン・ジ
ヌクレオチド（FAD）が酵素１分子当り４分
子存在する。 (7) 等電点：5.65±0.05。 (8) 阻害剤：Hg²⁺、ｐ―クロルメルクリ安息香
酸、Ｌ―アスコルビン酸ナトリウムなどによつ
て阻害される。 (9) 糖含量：約40％の糖を含む。