JPS6279781A

JPS6279781A - ペルオキシダ−ゼの製造法

Info

Publication number: JPS6279781A
Application number: JP21861085A
Authority: JP
Inventors: Satoko Noda; 野田　さとこ; Susumu Matsui; 侑松井
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1985-10-01
Filing date: 1985-10-01
Publication date: 1987-04-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はペルオキシダーゼの製造法に関する。

さらに詳しくは担子菌を培養して、その培養物よりペル
オキシダーゼを製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

ペルオキシダーゼは一般に植物界に広く存在しており、
特に西洋ワサビ、イチジクおよび大用箋番二名Ｚ今孝ｈ
、イいスー王Ｕ炸手り土面性ワ廿ビ根部のペルオキシダ
ーゼ含量が最も高いなどの理由により、西洋ワサビより
ペルオキシダーゼが工業生産され、臨床診断試薬、例え
ば各酸化酵素と併用して血清中のグルコース、総コレス
テロールなどの定量にあるいは酵素免疫測定法における
標識酵素として幅広く用いられている。

また、微生物起源のペルオキシダーゼとしては細菌およ
び糸状菌の生産するチトクロームＣペルオキシダーゼや
ＮＡＤＨペルオキシダーゼ等があるが、これらは西洋ワ
サビなどの植物起源のペルオキシダーゼとは作用が異な
り、臨床診断試薬としては利用できない。

最近、アルタナリア属、コクリオポラス属、ペリキユラ
リア属、カープラリア属（特開昭５７−９９１９２号）
およびバチルス属（特開昭５８−１７９４８８号）など
の微生物が臨床診断試薬として使用可能なペルオキシダ
ーゼを生産するとの報告がなされた。しかし、これらの
菌株のペルオキシダーゼ生産量は少なく、工業生産には
不利である。

本発明者らは、工業的にペルオキシダーゼを製造する方
法として先蚤こ担子菌の生産するペルオキシダーゼにつ
いて鋭意検討を重ねた結果ヒトヨタケ属に属する担子菌
が培養物中に臨床診断試薬として優れた性質を有するペ
ルオキシダーゼを生産することを見い出した（特願昭５
９−２５０９００号）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは、上述したヒトヨタケ属に属する担子菌の
生産するペルオキシダーゼの生産量をさら（こ増大させ
るためそこ鋭意検討を重ねた結果、上記担子菌培養のた
めの培地中に鉄塩を添加して培養すればペルオキシダー
ゼの生産量が、鉄塩を含まぬ同じ培地で培養した場合に
比し、ペルオキシダーゼ生産量を２〜４倍に増大するこ
とができることを見い出し、本発明を完成した。

従って本発明の目的はヒトヨタケ属に属する担子菌を培
養して、臨床診断試薬として優れた性質を有するペルオ
キシダーゼを工業的条こさらに安価に製造する方法を提
供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明はペルオキシダーゼの製造
法に関するものであって、ヒトヨタケ属に属し、ペルオ
キシダーゼ生産量を有する担子菌を、鉄塩を含有させた
培地で培養し、培養物からペルオキシダーゼを採取する
ことからなる。

本発明方法で得られるペルオキシダーゼは過ｅ化水ｆｌ
の存在下、４−７ミノアンチビリン（以下４−ＡＡと略
す）−フェノール系、４−ＡＡ　−ジメチルアニリン系
、４−Ａｈ−Ｎ−エチル−Ｎ−ハイドロキシエチル−ｍ
−トルイジン（以下ＥＨＭＴと略す）系および３−メチ
／Ｌ／−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（以下ＭＢ
ＴＨと略す）−ジメチルアニリン系などを水素供与体と
して発色する故臨床診断試薬として使用可能である。

本発明に使用される担子菌には、ヒトヨタケ科（Ｃｏｐ
ｒｉｎａｃｅａｅ　）ヒトヨタケ属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ
）に属する菌株、例えばコプリナス・マクロリーザスＫ
　−１３３０（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ　ｍａｃｒｏｒｈｉｚ
ｕｓ、和名ネナガノヒトヨタケ）がある。この菌株は工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第６４８号
として寄託しである。

本発明方法をさらに詳しく説明すれば、縞地に加える栄
養源は使用する菌株が利用し、ペルオキシダーゼを生産
するものであればよく、炭素源としては例えばグルコー
ス、デンプン、シュクロース、マルトース、ラクトース
、グリセロール、デキストリン、油脂類などが利用でき
、窒素源としては酵母エキス、ペプトン、脱脂大豆、コ
ーンスチープリカー、肉エキスなどが適当である。その
他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩などの無機
質および金属塩類を加えてもよく、さらにはビタミン類
、生長促進因子を加えてもよい。

ペルオキシダーゼの生産量を高めるために、培地成分に
ついてさらに詳細に検討した結果、各種鉄塩の培地中へ
の添加がベルオキシダーゼル荒格か２〜ｌ忙憎士七ぜス
ー〉ｈ；如１■日また一培地に加える鉄塩としては、例
えば硫酸鉄、塩化鉄、硝酸鉄などがあげられ、これらは
それぞれ単独にまたは２種以上混合して使用できる。

また培地に添加する鉄塩の添加量としては０．０１％〜
０．５０％、好ましくは０１０８％〜０．２０％が適当
である。なお鉄塩の添加量は重量／容量％で示す。

担子菌を培養するにあたり、ペルオキシダーゼの生産量
は培養条件により大きく変動するが、一般に培養温度は
２０〜３５℃、培地のｐＨ４〜８が良く、４〜１２日間
の通気攪拌培養でペルオキシダーゼの生産は最高に達す
る。培養条件は使用する菌株、培地組成などに応じ、ペ
ルオキシダーゼの生産量が最大になるように設定するの
は当然である。本発明の菌株によって生成されたペルオ
キシダーゼは主に培養Ｆ液中にあり、培養ｐ液に沈澱剤
例えば硫安を２０〜８０ｗ　／　ｖ％加えることにより
、あるいは有機溶媒例えばアルコール、アセトンなどを
５０〜８０ｖ　／　ｖ％加えることにより沈澱として分
離される。得られた沈澱物を限外濾過、透析あるいはセ
ファデックス処理などによって脱塩し、粗酵素液を得る
。得られた粗酵素液を精側するには、あらかじめ０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化したＤＥＡＥ
−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカラムに粗酵素液を吸
着させ、吸着物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）テ洗浄後、０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐ）１７．
０）で溶出して活性区分を集める。次に、この活性区分
を限外濾過で濃縮、脱塩後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロース（Ｃ
Ｌ−６Ｂ）のカラムに再び吸着させ、吸着物を０．０２
　Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄後、０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して活性区分を集
める。

この活性区分を蒸留水で透析後、凍結乾燥し、２精製酵
素粉末を得る。この酵素粉末はポリアクリルアミドゲル
ディスク電気泳動的に単一である。

本発明のペルオキシダーゼの酵素化学的および理化学的
性質は次のとおりである。

（１）作　用：本酵素は過酸化水素に極めて特異的に作用し、過酸化水
素の存在下で種々の水素供与体となりうる化合物の酸化
を融媒する。その作用機構は以下に示すとおりである。

Ｈ２０□＋ＡＨ２→２Ｈ２０＋　Ａなお、ＡＨ２は水素供与体を、Ａは酸化された水素供与
体を示す。

（２）水素供与体に対する特異性：４−ＡＡと種々の化合物を組合せて水素供与体として用
いた場合に本酵素の水素供与体に第　　　１　　　表フェノール　　　　　　　５００　　　　　　１００レ
ゾルシン　　　　　　　　　　　　　　　　１０ピロカ
テコール　　　　　“　　　　　　　５８ヒドロキノン
　　　　　　　　　　　　　　　　１０α−ナフトール
　　　　　“　　　　　　　　１８２．４−ジブロムフ
　　５２０　　　　　　４フェノール２．４−ジクロロフ　　　“　　　　　　１１５エノー
ル２．６−シクロロフ　　　“　　　　　　１５４エノー
ル２．４．６−）リフ　　　“　　　　　　　９６０ロフ
エノールジメチルアニリン　　　５５０　　　　　　２１ジエチ
ルアニリン　　　　“　　　　　　　４９ＥＨＭＴ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　６２また、ＭＢＴ
Ｈとジメチルアニリン、ジエチルアニリンあるいはＥＨ
ＭＴを組合せて水素供与体とした場合の特異性について
検討した（第２主）　　　　　す−）、　　　　各ｔ　
「η　し　１　　イ　ＪＡ　＾　　−−−＋　　　Ｉ　
　　　　＋１・を水素供与体とした場合の相対値を１０
０とした。

ジメチルアニリン　　　５９０　　　　　　５０ジエチ
ルアニリン　　　　“　　　　　　　４９ＥＨＭＴ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　４１（４−ＡＡ−
フェノール　　　５００　　　　　　１００）（３）至
適ｐＨおよびｐＨ安定性：本酵素の至適ｐＨは第１図のグラフで表わされる如（、
ｐＨ７，０付近に高い活性を有している。ｐＨ３〜３．
５は酢酸緩衝液、ｐＨ６〜８５はリン酸緩衝液、ｐＨ９
〜９．５はホウ酸緩衝液を使用した。本酵素を３７℃に
おいてそれぞれのｐＨで６０分間処理したときのｐＨ安
定性を第２図に示した。第２図より明らかなように本酵
素はｐＨ６，０−ｐＨ７，５の間で安定である。

（４）至適温度および熱安定性：本酵素の至適温度は第３図のグラフで表わされる如く、
３５°Ｃ〜４０℃付近に至ａ温度を有している。本酵素
をｐＨ７，０においてそれぞれの温度で１０分間処理し
たときの熱安定性を第４図に示した。本酵素は４５℃ま
で安定であった。

（５）分子量：本酵素の分子量は、セファクリルＳ−２００（ファルマ
シア製）によるゲ）ｖ濾過法では約３７０００であり、
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法では約４１
０００であつへ（６）均一性：７．５％ポリアクリルアミドゲル（ｐ１４９．４）を用
いてディスク電気泳動を行ない、タンパク染色したとこ
ろ１本の染色帯が認められ単一であった。また、５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動でも単一バンドを示
した。

（７）等電点：ファルマライト（ｐＨ３〜１０、ファルマシア製）を用
いた焦点電気泳動法により求めた本酵素の等電点はｐＬ
：３．４〜３，５であった。

（８）阻害剤、金属イオン、金属キレート剤の影響：本
酵素は８８代　シアン化カリウム、アジ化ナトリウム、
チオウレアなどによって阻害された（第３表）。

無添加　　１００　　ヨード首酸１００Ｌ−システィン
　　　　１０５　　　ＥＤＴＡ　　　　　　９７ジチオ
スレイトール　　　９５　　　　ＣｕＳ０．　　　　１
０５チオウレア　　　　　　５７　　　ＭｎＣ１，８６
シ７ン化カリウム　　　２２　　　ＦｅＣ１１０７アジ
化ナトリウム　　　５２　　　ＢａＣ１□　　　　９６
ＰＣＭＢ’　　　　　　９８　　ＣｏＣ１□　　９８Ｆ
ＭＳ−米　　　　９８　　ＺｎＣ１ｚ　　　８５フツ化
ナトリウム　　１０３　　５ｎＣ１□　　　　９２硫化
ナトリウム　　　　８２　　　ＮｉＳＯ４９２α、α′
−ジピリジル　　１０３　　　ＨｇＣｌ２６米米　フェ
ニルメチルスルホニルフルオリド（９）可視部吸収スペ
クトル；このスペクトルを第５図に示す。

α０）酵素活性測定法：ペルオキシダーゼ活性の測定は水素供与体として臨床診
断試薬に用いられる４−ＡＡ−フェノール系を用いて行
なった。即ち、５ｍＭ過酸化水素溶液０．１ｍＪ１０．
３　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１．０ｄ、２４
．６ｍＭ　４−ＡＡ溶液０．１コ、０．４２Ｍフェノー
ル溶液Ｑ、　ｌ　ｍｌ、水１．６−および適当に希釈し
た酵素液０．１　ｍｌ　、反応液量３、０　ｍｌで３７
℃、６０秒間反応させた後５００ｎｍの吸光度（ＯＤサ
ンプ／Ｌ／）を測定する。別に対照として過酸化水素溶
液の代わりに水を０．１１加え、同様の操作によって吸
光度（ＯＤブランク）を測定し、△ＯＤ、。。（ＯＤサ
ンプル−〇Ｄブランク）を求めた。ペルオキシダーゼ活
性は下記の計算式によって求められる。

６．１７ＸｔＸＶｓ＝△ＯＤ５゜。Ｘ４．８６Ｘｄｆｖｔ：反応液ｉ（３，０ｒｌＬｔ）ｖ８：酵素液（Ｑ、　ｌ　ｍｌ）ｔ：反応時間（１分間）ｄｆ：希釈率〔実施例〕以下に本発明によるペルオキシダーゼの製造方法を実施
例をもって示すが、本発明が以下の実施例に限定される
ものではない。

実施例　１ペルオキシダーゼ生産量に及ぼす鉄塩の添加効果グルコース２％、エビオス０．５％および寒天１．５％
（エビオス培地）の組成の斜面培地にコプリナス・マク
ロリーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）を接
種し、２５℃にて１週間静置培養して種菌とした。グル
コース２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ
２ＰＯ４０，３％、Ｍｇ５Ｏ，”７Ｈ，０，１％の組成
の培地１００ｍ１を５００Ｍ容の三角フラスコに分注し
、これにＦｅＳＯ４・７Ｈ２０が０％、０．０４％、０
．０８％、０．１２％、０．１６％、０．２０％、０．
２４％、０．３２％の濃度になるように各々のフラスコ
に添加して、１２０°Ｃで２０分間殺菌後、冷却し、こ
れに上記の種菌をかきとり接種して、２６℃で５〜１０
日間、毎分１００　ｒｐｍで振盪培養し、経時的にサン
プリングした。これらの培養液を濾過して菌体を除き、
得られたｐ液の各々のベルオキシダ、−ゼ活性（最大活
性）を第４表に示す。

無添加　　　　　　　　１９．４０．０４　　　　　　　　　２８．００．０８　　　　　　　　　　　　４６．４０．１２　
　　　　　　　　　　　７５．５０．１６　　　　　　
　　　　８０．２０．２０　　　　　　　　　　　　６
６．００．２４　　　　　　　　　　　　　３６．８０
．３２　　　　　　　　　　　　　１７．０第４表より
明らかなように培地中に鉄塩を添加すれば、ペルオキシ
ダーゼの生産量が著しく増大した。なおＦｅ５０．・７
Ｈ２０の最適添加量は０．０８〜０．２０％であった。

実施例　２実施例１のエビオス培地で培養したコプリナス・マクロ
リーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）をグル
コース２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ
，ＰＯ４０，３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ，ＯＯ，１％およ
びＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，１６％の組成の培地１００
ｍ／を分注して殺菌（１２０℃、２０分間）した５　０
０ｍ容の三角フラスコに接種し、２７℃で１０日間、毎
分１００　ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後、濾過し
て菌体を除き、Ｆ液を得た。このペルオキシダーゼ活性
は７９．４単位／　ｍｌであった。

実施例　３実施例１のエビオス培地で培養したコプリナス・マクロ
リーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）をグル
コース２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ
２ＰＯ４０，３％およびＭｇＳＯ４’７Ｈ２０，０，１
％の培地１００ｒＬｌを分注して殺菌（１２０°０１２
０分間）した５　００ｍＪ容の三角フラスコに接種し、
２６℃で７日間培養して、種培養液とした。グルコース
２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ２ＰＯ
４０，３％、ＭｇＳＯ４Φ７Ｈ２００，１％、ＦｅＳＯ
４・７Ｈ２００，１６％および消泡剤（日本油脂社製Ｃ
Ｂ−４４２）　０．０２％の組成の培地２０１を３０１
容のジャーファーメンタ−に入れ、１２０℃で２０分間
殺菌した。冷却後上記の種培養液１００ｄを接種し、２
６°Ｃで８日間、毎分１３１の通気速度と毎分２７０回
転の攪拌速度の条件下で培養した。培養終了後、濾過し
て菌体を除き、Ｆ液を得た。

このペルオキシダーゼ活性は８４．１単位／ＴＩＬｌで
あった。この培養戸液１７Ｊに硫酸アンモニウムを８０
％飽和になるように加えて、−昼夜放置後、得た硫安沈
澱物を約５００−の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に溶解した。この粗酵素液を限外炉渦で迫妹１−腫
市１各−予めｎｏ１Ｈリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩
衝化したＤＥＡＥ−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカラ
ム（直径５．０ｃｒｒＬ×長さ４α）に吸着させ、吸着
物を０．０２ＭＩＪン酸緩倫液（ｐＨ７，０）で洗浄後
、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して活性
区分を集めｔ為次にこの活性区分を限外濾過で濃縮し、
脱塩後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝
化したＤＥＡＥ−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカラム
（直径２、５　ｃｒｒＬＸ長さ４ｃｒｒＬ）に再び吸着
させ、吸着物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１７．０
）で洗浄後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
溶出して活性区分を集めた。この活性区分を蒸留水で透
析後、凍結乾燥し、精製酵素粉末１００７Ｔｎ９を得た
。この粉末の比活性は１１８２単位／ダであった。この
酵素粉末はポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動的
に単一であった。以上の精第　　　５　　　表培養ｐ液　　　２４００００　１４３００００　５９６
　１００硫安塩析　　　　４０５４０　１４２７０００
　３５．２　９９．８限外濾過　　　１６３９０　１４
１１０００　８６．１　９８．７参考例　１実施例１のエビオス培地で培養したコプリナス・マクロ
リーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）をグル
コース２％、酵母エキ７、０．３％、ペプトン１％、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４０，３％およびＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１
％の組成の培地１００−を分注して殺菌（１２０℃、２
０分間）ｌＪ、；５００ｍ１容の三角フラスコに接種し
、２７℃で１０日間、毎分１００　ｒｐｍで振盪培養し
た。培養終了後、濾過して菌体を除き、ｐ液を得た。こ
のペルオキシダーゼ活性は２０．０単位／４であった。

参考例　２実施例１のエビオス培地で培養したコプリナス・マクロ
リーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）をグル
コース２％、酵母エキスＯ１３％、ペプトン１％、ＫＨ
２ＰＯ４０，３％およびＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，１％
の培地１００ｍ１を分注して殺菌（１２０℃、２０分間
）した５００ｍ１容の三角フラスコに接種し、２６℃で
７日間培養して、種培養液とした。グルコース２％、酵
母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ２ＰＯ４０，３
％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ
２００，００５％および消泡剤（日本油脂社製ＣＢ−４
４２）　０．０２％の組成の培地２０１を３０１容のジ
ャーファーメンタ−に入れ、１２０℃で２０分間殺菌し
た。冷却後上記の種培養液１００ｄを接種し、２６℃で
６日間、毎分１３Ｊの通気速度と毎分２７０回転の攪拌
速度の条件下で培養した。培養終了後、濾過して菌体を
除き、ｒ液を得た。

このペルオキシダーゼ活性は４１．５単位／　ｍｌであ
った。この培ＯＦ液１７１に硫酸アンモニウムを８０％
飽和になるように加えて、−昼夜放置後、得た硫安沈澱
物を約５００罰の０．　ＯＩ　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）に溶解した。この粗酵素液を限外濾過で濃縮し、
脱塩後、予め０．０１Ｈリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
緩尉化したＤＥＡＥ−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカ
ラム（直径５．０　ｃｍ×長さ４α）に吸着させ、吸着
物を０．０２Ｍ１ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄後
、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して活性
区分を集め九人にこの活性区分を限外濾過で濃縮し、脱
塩後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化
したＤＥＡＥ−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカラム（
直径２、５　Ｃ１ｒＬＸ長さ４ｃｒＩＬ）に再び吸着さ
せ、吸着物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
洗浄後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出
して活性区分を集めた。この活性区分を蒸留水で透析後
、凍結乾燥し、精製酵素粉末４９４ｒｎ９を得た。

この粉末の比活性は１１８０単位／即であった。

この酵素粉末はポリ７クリルアミドゲルデイスク？ｌｅ
ケ法＠Ｉ＋的にＢｔ−千木っｔ・へじＪμの詰ｎ母Ｔ程
を第６表に示す。

培養ｒ液　　　２３７５００　７０７０００　２．９８
　　１００硫安塩析　　　　４１２００　７２４０００
　１７．６　　１０２限外Ｆ’過１７０００　７０３０
００　４１．４　　９９．４〔発明の効果〕本発明により臨床診断試薬として有用なペルオキシダー
ゼの生産量が従来法と比較し２〜４倍に増大し、有利な
工業的生産に適した製造法が提供された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により得られるペルオキシダーゼのｐＨ
と活性の関係を表わす。第２図は本発明による酵素を３
７℃においてそれぞれのｐＨで６０分間処理した後のｐ
Ｈと活性の関係を表わし、第３図は温度と活性の関係を
表わし、第４図はｐＨ７，０においてそれぞれの温度で
１０分開始理した後の温度と活性の関係を表わす。第５
図は本発明による酵素の可視部吸収スペクトル（酵素濃
度０．０５７％、ｐＨ７，０）を表わす。

Claims

【特許請求の範囲】１、ヒトヨタケ属に属するペルオキシダーゼ生産菌を培
地で培養し、培養物よりペルオキシダーゼを採取するこ
とによるペルオキシダーゼの製造法において、上記培地
に鉄塩を含有させることを特徴とするペルオキシダーゼ
の製造法。２、鉄塩が硫酸鉄、塩化鉄、硝酸鉄の１種または２種以
上の混合物である特許請求の範囲第１項記載のペルオキ
シダーゼの製造法。