JPS6012027B2 - 新規なグリセロ−ル脱水素酵素およびその製造法 - Google Patents
新規なグリセロ−ル脱水素酵素およびその製造法Info
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- JPS6012027B2 JPS6012027B2 JP54096459A JP9645979A JPS6012027B2 JP S6012027 B2 JPS6012027 B2 JP S6012027B2 JP 54096459 A JP54096459 A JP 54096459A JP 9645979 A JP9645979 A JP 9645979A JP S6012027 B2 JPS6012027 B2 JP S6012027B2
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Description
本発明は新規なグリセロール脱水素酵素およびその製造
法に関する。 更に詳しくは、下記の諸性質を有する新規なグリセロー
ル脱水素酵素に関するものであり、また該酵素生産能を
有するバチルス属に属する新菌株から該酵素を効率よく
製造する方法に関するものである。従来、グリセロール
脱水素酵素〔ＥＣＩ．１．１．６〕（以下ＧＤＨと略す
る）は、アェロバクター・アェロゲネス、エシエリヒア
・コリ、バチルス・ズプチリス等の菌体に所在すること
が、古くから知られている。 またその他の微生物起源のものとしては、プロテウス属
、ェルビニア属、セラチア属に属する微生物（特公昭５
０−２１５５３号）あるいは、アクロモバク夕属、アル
スロバクタ属、ブレビバクテリワム属、シュードモナス
属に属する微生物によるもの（特関昭５３−１２７８８
号）が知られている。 近年、酵素の性質、特に高い基質特異性が注目され、臨
床検査分野で酵素法による検査薬が、その簡便さと相換
って、多大の関′Ｄを集めている。ＧＤＨもリポプロテ
ィン・リパーゼとの共役で、体液中のトリグリセラィド
の定量に、あるいは、グリセリン酸を基質とするホスフ
アターゼの活性測定用に利用できることが知られており
、ＧＤＨを安価に工業的に製造する方法を提供すること
が強く望まれている。本発明者等はかかる要望に応える
べく、該酵素活性を有する菌株を広く自然界に検索した
結果、明石市下の土壌より分離したバチルス属に属する
Ｇ−１殊に著しいＧＤＨ生産能を有することを見出した
。 また該菌株の生産するＧＤＨ‘こつき鋭意研究の結果、
該酵素の分子量はセフアデツクスＧ−２００を用いて測
定したところ、８５０００±５０００で、従来から知ら
れているＧＤＨの分子量がいずれも１０００００以上で
あるのに対して小さく、分子サイズ的に極めて特徴的な
性質を有すると共に以下の如き諸性質を有することを見
出し本発明を完成するに至った。すなわち本発明は少な
くとも下記性質１１〜■を有してなる新規なグリセロー
ル脱水素酵素である。 ｍ 分子量：８５０００土５０００（セフアデックスＧ
−２００によるゲル櫨過法）‘２｝ 作用至適ｐＨ：９
．５〜１０．０（０．１Ｍグリシン−Ｋｑ−ＫＯＨ緩衝
液中、２５００反応）醐 安定ｐＨ範囲：ｐＨ５．０〜
９．０（５００、１５時間処理）
法に関する。 更に詳しくは、下記の諸性質を有する新規なグリセロー
ル脱水素酵素に関するものであり、また該酵素生産能を
有するバチルス属に属する新菌株から該酵素を効率よく
製造する方法に関するものである。従来、グリセロール
脱水素酵素〔ＥＣＩ．１．１．６〕（以下ＧＤＨと略す
る）は、アェロバクター・アェロゲネス、エシエリヒア
・コリ、バチルス・ズプチリス等の菌体に所在すること
が、古くから知られている。 またその他の微生物起源のものとしては、プロテウス属
、ェルビニア属、セラチア属に属する微生物（特公昭５
０−２１５５３号）あるいは、アクロモバク夕属、アル
スロバクタ属、ブレビバクテリワム属、シュードモナス
属に属する微生物によるもの（特関昭５３−１２７８８
号）が知られている。 近年、酵素の性質、特に高い基質特異性が注目され、臨
床検査分野で酵素法による検査薬が、その簡便さと相換
って、多大の関′Ｄを集めている。ＧＤＨもリポプロテ
ィン・リパーゼとの共役で、体液中のトリグリセラィド
の定量に、あるいは、グリセリン酸を基質とするホスフ
アターゼの活性測定用に利用できることが知られており
、ＧＤＨを安価に工業的に製造する方法を提供すること
が強く望まれている。本発明者等はかかる要望に応える
べく、該酵素活性を有する菌株を広く自然界に検索した
結果、明石市下の土壌より分離したバチルス属に属する
Ｇ−１殊に著しいＧＤＨ生産能を有することを見出した
。 また該菌株の生産するＧＤＨ‘こつき鋭意研究の結果、
該酵素の分子量はセフアデツクスＧ−２００を用いて測
定したところ、８５０００±５０００で、従来から知ら
れているＧＤＨの分子量がいずれも１０００００以上で
あるのに対して小さく、分子サイズ的に極めて特徴的な
性質を有すると共に以下の如き諸性質を有することを見
出し本発明を完成するに至った。すなわち本発明は少な
くとも下記性質１１〜■を有してなる新規なグリセロー
ル脱水素酵素である。 ｍ 分子量：８５０００土５０００（セフアデックスＧ
−２００によるゲル櫨過法）‘２｝ 作用至適ｐＨ：９
．５〜１０．０（０．１Ｍグリシン−Ｋｑ−ＫＯＨ緩衝
液中、２５００反応）醐 安定ｐＨ範囲：ｐＨ５．０〜
９．０（５００、１５時間処理）
【４）作用至適温度：
４５ｑ０付近（０．１ＭグリシンーＫＣＩ−ＫＯＨ緩衝
液中、ｐＨ９．５）｛５｝ 安定温度範囲：５０ｏｏ以
下（０．０９Ｍカリウム一燐酸緩衝液中、ｐＨ７．５
１５分間処理）｛６’グリセロールに対するＫｍ値：１
．３３×１０‐２Ｍ及びＮＡＤに対するＫの値：１．２
８×１０‐４Ｍまた本発明はバチルス属に属する上詔性
質｛１｝〜‘６｝を有してなる新規なグリセロール脱水
素酵素を生産する菌を培地に培養し、その培養物から上
記性質【１｝〜｛６｝を有してなる新規なグリセロール
脱水素酵素の製造法である。 本発明による新規なＧＤＨ生産菌Ｇ−１株は次のような
繭学的性質を有する。 Ａ形態 （１’肉汁寒天培地に生育し、菌の形態は、梓状であり
、１．２〜１．５×３〜５仏の大きさで、通常５〜６蓮
となっているが、培養後期になると単独となる形態的な
変化を示す。 細胞の多形性はない。■ 運動性なし ‘３’ 胞子の形成あり（０．５×０．８〃の楕円形で
中央部に存在）｛４１ グラム染色性は腸性 Ｂ生育淵態 ｛１｝ 肉汁寒天平板培養 半透明黄白色で、や）光沢を有する円形のや）隆起した
コロニ−を生じ、周辺は円形で拡散性、色素は生産しな
い。 ‘２１ 肉汁寒天斜面培養 生育は良好で、黄白色を呈す。 拡布状をなす。｛３１ 肉汁液体培地培養生育は良好で
、表面に膜を形成することなく、培地は濁る。 ｛４’肉汁寒天穿刺培養 上面および穿刺孔中に生育する。 【５１ 肉汁ゼラチン穿刺培養 表面に生育しゼラチンを液化する。 Ｃ生理的性質 ○’硝酸塩の還元：陰性 ■ Ｍ旧テスト：陰性 ｛３’ ＶＰテスト：陰性 ｛４１インドールの生成：陰性 ■ 硫化水素の生成：陰性 側 デン粉の加水分解：陽・性 ｛７）クエン酸の利用：陽性 棚 無機窒素源の利用：陽性 脚 色素の生成：キングＡ培地およびＢ培地では色素の
生成はなし、また肉汁寒天、肉汁ゼラチン、ポテトデキ
ストロース培地では、水溶性色素の生成は認められない
。 肌 ウレアーゼ：陰性 ００ オキシダーゼ：陰性 ０２ カタラーゼ：陽・性 ０３ 酸素に対する態度：好気性および通性嫌気性胸
生育ｐＨ：５〜９、特に６．５〜７．５で良く生育する
。 ０３ 生育温度：１５〜４０ｑｏ、特に２５〜３０つ○
で良く生育する。 ０８ ０−Ｆテスト：陽性／陽性 ０７）糖の利用：ヒューラィフソン塔地を用いて糖の利
用を調べた。 酸の生成 Ｌ−アラビノース十ＤーキシロースーＤーグルコース＋
Ｄーマンノース−Ｄーフラクトース＋Ｄ−力Ｊラクトー
ス十麦芽糖＋廉 糖＋乳 糖十 トレハロース十Ｄ−ソルビツト−Ｄ−マンニツト十ィノ
シツト＋グリセロール＋デン粉十 ガスの生成 いずれもなし ■ ０．００１％リゾチーム存在下での生育：生育しな
い。 ■ エッグ・ヨーク反応（レシチナーゼ活性）：陰性上
記の菌学的および生理的諸性質を「パージェイのマニュ
アル・デイタミネーテイブ・バクテリオロジー」（第８
版）〔（氏ｒ袋ｙ’ ｓ ｍａｎ雌ｌｏｆＤｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅ 母ｃｔｅｒｉｏｌｏ鋤）（第８版、１
９７４年）〕を参考にして検討すると、該菌株は、樟菌
でありグラム染色性が陽‘性であること、内生胞子を形
成すること、カタラーゼ陽性であること、炭水化物を酪
薙淳的に分解し酸を生成すること等の性質からバチルス
属に属すると判定させる。 更にアセチルメチルカルビノール反応（ＶＰ反応）が陽
性であり、種々の糖の資化性の有無は、バチルス、メガ
テリウム（母ｃｉｌｌ雌ｍｅ鞍ｔｅｒｊ山ｍ）に類似し
ている。しかし、日２Ｓを生成しないこと、Ｍ旧反応が
陽・性を示すこと通性嫌気性下で生育すること等の性質
が、バチルス・メガテリウムと明らかに異なるので、バ
チルス属に属する新菌株と同定される。なお、本菌株は
、工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番号第
５０５９号（以下徴工研菌寄第５０５計号と略記する）
として寄託されている。本発明による新規なＧＤＨは前
記バチルス属に属する新規なＧＤＨ生産株を栄養培地、
好ましくは、酵素生産能を高めるためにグリセロールを
添加した培地で培養することにより、菌体中に生産蓄積
されるので、公知の方法で抽出、精製、乾燥することに
よって酵素粉末を得ることが出来る。 更に具体的に説明すると、前記バチルス属に属するＧ−
１株を適当な栄養塔地、例えば適当な糠質、室秦源、無
機塩類と酵素生産能を高めるためにグリセロールおよび
有機促進物質を含む培地で培養し、新規なＧＤＨを菌体
中に蓄積せしめるのであるが、ここで糟質には、グルコ
ース、ガラクトース、フラクトース、シユクロース、ラ
クトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの糖類、グリセ
ロール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコー
ル類などが使用できる。窒素源としては、酵母エキス、
ベブトン、肉エキス、コーンステイープリカー、カゼイ
ン加水分解物、脱脂大豆、アンモニウム塩などが使用さ
れる。無機塩類としてはマンガン、ナトリウム「カリウ
ム、マグネシウム、カルシウム、鉄、コバルトニッケル
、亜鉛などの金属塩類や硫酸、燐酸、塩酸、硝酸などの
塩類が使用できる。特にマンガンは、増殖に必須の金属
塩であり、それが欠乏すると生育は起こらない。生長促
進物質としては酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、ベ
プトン、コーンステイープリカーなどが良い。本発明に
おいては、特に酵素の誘導物質としてグリセロールおよ
びグリセロールを含有する物質ならびに、その他の誘導
体を培地に添加すれば大量の新規なＧＤＨを生成せしめ
ることが出来る。これら添加物の添加は、培養当初から
でも培養途中に行なっても良い。添加量としては通常グ
リセロールとして、培地に対して約２％量の割合で添加
すれば良い結果が得られる。培地のｐ則ま、中性付近と
し、通気燈拝などの好気培養を３０℃前後で１〜２日間
行なう。かくして、得られた新規なＧＤＨを含む菌体を
猿過または遠心分離によって分別し、適当な緩衝液に懸
濁後、磨砕、超音波処理、機械的圧縮または、自己消化
などの公知の方法で破砕して酵素を抽出する。 その抽出液から不港物を猿過または遠心分離によって分
別し、無細胞酵素液としたのち、硫酸アンモニウム、主
硝などによる塩析またはアセトン、アルコール等を用い
る溶媒沈澱などの公知の方法で酵素標品を得た。更に高
度に精製された酵素標品を得るには、イオン交換を応用
した吸着漆出法およびゲル嬢過法などを用いれば良い。
新規なＧＤＨの活性は、グリセロールとＮＡＤを基質と
して反応させた場合、生成するＮＡＤＨの３４仇皿にお
ける吸光度の増加を分光光度計で測定することによって
算出する。 すなわち、グリセロール３．仇ｈモル、ＮＡＤ８．０仏
モル、グリシン−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ９．３）０．３ｈ
モルを含む反応混液２．９叫に酵素液０．１の‘を混合
し、２５℃で反応させ、反応開始から４分間３４仇ｍの
波長における紫外部吸収の増加を測定し、その直線部分
から１分間当りの吸光度の増加を算出する。すなわち対
照として、上記組成で、グリセロールの代りに水を用い
て同様の操作を行ない、試験液の３４０ｎｍの吸光度の
増加から、対照のそれを差し引く。ＮＡＤＨの３４仇伽
における分子吸光係数として（ご＝６．２２×１ぴ）を
用い、差し引いた吸光度値から生成するＮＡＤＨ量を求
め、これをもとにして、試料中の酵素力価を算出する。
酵素力価の表示は、上記条件下で１分間に１山モルのＮ
ＡＤＨを生成せしめる酵素量を１単位として行なう。 本発明によって得られる新規なＧＤＨの理化学的性質を
Ｇ−１株の生産する酵素について示す。 ｍ作用本酵素はＮＡＤの共存下にグリセロールを脱水素
し、ジヒドロキシアセトンとＮＡＤＨを生成する反応を
触媒する。 ｛２｝ 基質特異性 本酵素はグリセロール以外にも、１，２ープロパンジオ
ール、２，３−ブタンジオール、グリセロールーＱ−モ
ノクロロヒドリン等にも作用しうるが、メチルアルコー
ル、エチルアルコール、プロピルアルコール等のアルコ
ール類は脱水素しない。 グリセロールに対するＫの値は１．３３×１０‐２Ｍ、
ＭＡＤに対するＫの値は１．２８×１０‐４Ｍである。 各基質に対する相対活性を第１表に示す。第１表 ‘３１至適鮒および安定ｐＨ範囲 本酵素の至適ｐＨは前記の活性測定条件下において９．
５〜１０．０にある（第１図参照）。 本酵素の安定母城は５℃、１虫時間処理でｐＨ５．０〜
９．０の範囲にある（第２図参照）。更に最も安定な柵
は７．５（０．０９Ｍカリウム−燐酸緩衝液）付近で、
該ｐＨでは、５０ｏｏで１５分間処理でもほぼ１００％
の活性が残存する。‘４１ 作用適温の範囲 本酵素の作用最適温度は、下記の活性測定条件下におい
て４５ｑｏ付近にある（第３図参照）。 ‘５｝ ｐＨ、温度などによる失活条件本酵素は、ｐＨ
７．５（０．０８ Ｍカリウム−燐酸緩衝液）、１粉ご
間の処理で５０こ０まで安定で７０℃では完全に失活す
る（第４図参照）。 ‘６｝ 種々薬剤の影響 本酵素活性は、Ｃｕ＋十イオン、ＺｎＨイオン、ＣｄＨ
イオン、ＰｂＨイオン、Ａｇ＋イオン、Ｈｇ＋＋イオン
によって顕著に阻害される。 他方Ｃａ＋＋イオン、ＦｅＨ十イオン、ＦｅＨイオン、
Ｍｎ＋＋イオン、Ｃｏ＋＋イオンによって活性化が認め
られ、ＥＤＴＡのような金属キレート剤で顕著な阻害が
認められる。また、ＰＣＭＢのようなＳＨ阻害剤によっ
て活性が顕著に阻害されることから、本酵素の活性発現
にはＳＨ基が関与しているものと推察される。次に各薬
剤の影響を第２表に示す。第２表夫 ｐ−Ｃｈと。 ｒｏｍｅｒＣｕｒｉｂｅｎＺＯａｔｅの分子量セフアデ
ックスＧ−２００のゲル渡過法により本酵素の分子量は
８５０００土５０００と算出される（第５図参照）。 図中、Ａはキモトリプシ／−ゲンＡ（牛肝由来）（分子
量２５０００）、Ｂは卵白アルブミン（分子量４５００
０）、Ｃは牛血清アルブミン（分子量６７０００）、Ｄ
は本発明のＧＤＨ、Ｅはッーグロプリン（人由来）（分
子量１６０００）、Ｆは従釆のＧＤＨ（バチルス・メガ
テリウム由釆）を示す。 次に本発明による新規なＧＤＨの製造法をＧ−１株を用
いた実施例で説明する。 実施例 １ グリセロール２％、ポリベプトン（大五栄養製）２％、
ＫＨ２Ｐ０４０．４％、Ｋ２ＨＰ０４２．５％、酵母エ
キス（オリエンタル酵母製）０．１％、ＭｎＣ１２・４
比０ ０．００５％、Ｍが０４・７日２０ ０．００５
％、ＦｅＣ１２・４日２００．００５％、ＣａＣ】２・
２も０ ０．００５％、消泡剤アデカノールＬＧ−１２
６（旭電化製）０．０４％（ｐＨ７．５）の組成からな
る培地５０肌を５００叫客坂口フラスコに仕込み、１２
０ｏｏ、１０分間加圧滅菌後、Ｇ−１株（徴工研菌寄第
５０５ｙ号）を１白金耳無菌的に植菌し、３０ｏｏで２
４時間振麓培養した（１４＄．Ｐ．ｍ．振中７ｃの）。 新規なＧＤＨは菌体内に生成蓄積されるが、その生産性
は、培養液１のＺ当り４．２単位であった。なお糠質を
グルコースとした場合（他の組成は上記と同一）は０．
３単位であった。実施例 ２実施例１に示した培地組成
（但しグリセロール濃度４％）で１３０〆の培地を調製
し、２００そ客醗酵槽に仕込んだ。 １２０ｏｏ、１０分間蒸気滅菌後、予め同組成の培地で
３０ｏｏ、２独特間振濠培養しておいたＧ−１株（徴工
研菌寄受理番号５０５叫号）の培養液１．３〆（１％）
を無菌的に楯菌し、３０ｏｏで２餌時間通気（ＩＶ．Ｖ
．ｍ）雛枠（１８び．ｐ．ｍ．）培養した。 培養液１２２夕を連続遠Ｄ分離機にて処理して菌体を集
め、この菌体を０．０９Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
て２０のこ懸濁した。この懸濁液を磨砕機にかけ菌体を
磨砕した。磨砕後、不落物を珪藻±を渡過助剤として櫨
別し、得られる渡液に硫酸アンモニウムを６５％飽和に
なる様に加え、新規なＧＤＨを沈澱として回収した。こ
の沈澱への新規なＧＤＨの活性収率は９０％で比活性は
７倍に上昇した。得られた沈澱を２その０．０９Ｍ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、０．０２Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で緩衝化したセフアデックスＧ一２５（
ファルマシア製、スウェーデン）を充填したカラム（１
５そ容量カラム）に通じ、脱塩を行ない、活性区分を集
めた。得られた脱塩酵素液を次いで予め０．０９Ｍ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化しＤＥＡＥーセルロース
（ブラウン製、Ｕ．Ｓ．Ａ）カラム（２そ容量カラム）
に通して新規なＧＤＨを吸着させ、同緩衝液で洗浄した
後、０．２Ｍ食塩を溶解した同緩衝液と０．８Ｍの食塩
を溶解した同緩衝液とで濃度勾配をつくり、徐々に食塩
濃度を上げながら新規なＧＤＨを溶出させた。溶出され
た新規なＧＤＨ活性区分を集め、これに硫酸アンモニウ
ムを６７％飽和になるように加えて新規なＧＤＨを沈澱
させた。沈澱を遠心分離（１００００×夕、２０分）で
集め、８００の‘の０．０９Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．５
）に熔解して後、２０％（Ｖ／Ｖ）燐酸でｐＨを６．０
に調整し、不純蛋白質を除去するために、３７０で４粉
ご間放置し、生ずる不漆物を遠心分離（１００００×夕
、２０分）で除去し、上燈液を得た。かくして得られた
除濁酵素液を次いで０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．５
）で緩衝化したセフアデツクスＧ−２５カラム（６そ容
量カラム）で脱塩を行ない、活性区分を集めた。得られ
た脱塩酵素液を凍結乾燥して新規なＧＤＨ標品１０夕を
得た。このものの比活性は１５．０単位／双９であり、
培養液からの収率は２８．９％で、比活性は６０倍上昇
した。
４５ｑ０付近（０．１ＭグリシンーＫＣＩ−ＫＯＨ緩衝
液中、ｐＨ９．５）｛５｝ 安定温度範囲：５０ｏｏ以
下（０．０９Ｍカリウム一燐酸緩衝液中、ｐＨ７．５
１５分間処理）｛６’グリセロールに対するＫｍ値：１
．３３×１０‐２Ｍ及びＮＡＤに対するＫの値：１．２
８×１０‐４Ｍまた本発明はバチルス属に属する上詔性
質｛１｝〜‘６｝を有してなる新規なグリセロール脱水
素酵素を生産する菌を培地に培養し、その培養物から上
記性質【１｝〜｛６｝を有してなる新規なグリセロール
脱水素酵素の製造法である。 本発明による新規なＧＤＨ生産菌Ｇ−１株は次のような
繭学的性質を有する。 Ａ形態 （１’肉汁寒天培地に生育し、菌の形態は、梓状であり
、１．２〜１．５×３〜５仏の大きさで、通常５〜６蓮
となっているが、培養後期になると単独となる形態的な
変化を示す。 細胞の多形性はない。■ 運動性なし ‘３’ 胞子の形成あり（０．５×０．８〃の楕円形で
中央部に存在）｛４１ グラム染色性は腸性 Ｂ生育淵態 ｛１｝ 肉汁寒天平板培養 半透明黄白色で、や）光沢を有する円形のや）隆起した
コロニ−を生じ、周辺は円形で拡散性、色素は生産しな
い。 ‘２１ 肉汁寒天斜面培養 生育は良好で、黄白色を呈す。 拡布状をなす。｛３１ 肉汁液体培地培養生育は良好で
、表面に膜を形成することなく、培地は濁る。 ｛４’肉汁寒天穿刺培養 上面および穿刺孔中に生育する。 【５１ 肉汁ゼラチン穿刺培養 表面に生育しゼラチンを液化する。 Ｃ生理的性質 ○’硝酸塩の還元：陰性 ■ Ｍ旧テスト：陰性 ｛３’ ＶＰテスト：陰性 ｛４１インドールの生成：陰性 ■ 硫化水素の生成：陰性 側 デン粉の加水分解：陽・性 ｛７）クエン酸の利用：陽性 棚 無機窒素源の利用：陽性 脚 色素の生成：キングＡ培地およびＢ培地では色素の
生成はなし、また肉汁寒天、肉汁ゼラチン、ポテトデキ
ストロース培地では、水溶性色素の生成は認められない
。 肌 ウレアーゼ：陰性 ００ オキシダーゼ：陰性 ０２ カタラーゼ：陽・性 ０３ 酸素に対する態度：好気性および通性嫌気性胸
生育ｐＨ：５〜９、特に６．５〜７．５で良く生育する
。 ０３ 生育温度：１５〜４０ｑｏ、特に２５〜３０つ○
で良く生育する。 ０８ ０−Ｆテスト：陽性／陽性 ０７）糖の利用：ヒューラィフソン塔地を用いて糖の利
用を調べた。 酸の生成 Ｌ−アラビノース十ＤーキシロースーＤーグルコース＋
Ｄーマンノース−Ｄーフラクトース＋Ｄ−力Ｊラクトー
ス十麦芽糖＋廉 糖＋乳 糖十 トレハロース十Ｄ−ソルビツト−Ｄ−マンニツト十ィノ
シツト＋グリセロール＋デン粉十 ガスの生成 いずれもなし ■ ０．００１％リゾチーム存在下での生育：生育しな
い。 ■ エッグ・ヨーク反応（レシチナーゼ活性）：陰性上
記の菌学的および生理的諸性質を「パージェイのマニュ
アル・デイタミネーテイブ・バクテリオロジー」（第８
版）〔（氏ｒ袋ｙ’ ｓ ｍａｎ雌ｌｏｆＤｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅ 母ｃｔｅｒｉｏｌｏ鋤）（第８版、１
９７４年）〕を参考にして検討すると、該菌株は、樟菌
でありグラム染色性が陽‘性であること、内生胞子を形
成すること、カタラーゼ陽性であること、炭水化物を酪
薙淳的に分解し酸を生成すること等の性質からバチルス
属に属すると判定させる。 更にアセチルメチルカルビノール反応（ＶＰ反応）が陽
性であり、種々の糖の資化性の有無は、バチルス、メガ
テリウム（母ｃｉｌｌ雌ｍｅ鞍ｔｅｒｊ山ｍ）に類似し
ている。しかし、日２Ｓを生成しないこと、Ｍ旧反応が
陽・性を示すこと通性嫌気性下で生育すること等の性質
が、バチルス・メガテリウムと明らかに異なるので、バ
チルス属に属する新菌株と同定される。なお、本菌株は
、工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番号第
５０５９号（以下徴工研菌寄第５０５計号と略記する）
として寄託されている。本発明による新規なＧＤＨは前
記バチルス属に属する新規なＧＤＨ生産株を栄養培地、
好ましくは、酵素生産能を高めるためにグリセロールを
添加した培地で培養することにより、菌体中に生産蓄積
されるので、公知の方法で抽出、精製、乾燥することに
よって酵素粉末を得ることが出来る。 更に具体的に説明すると、前記バチルス属に属するＧ−
１株を適当な栄養塔地、例えば適当な糠質、室秦源、無
機塩類と酵素生産能を高めるためにグリセロールおよび
有機促進物質を含む培地で培養し、新規なＧＤＨを菌体
中に蓄積せしめるのであるが、ここで糟質には、グルコ
ース、ガラクトース、フラクトース、シユクロース、ラ
クトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの糖類、グリセ
ロール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコー
ル類などが使用できる。窒素源としては、酵母エキス、
ベブトン、肉エキス、コーンステイープリカー、カゼイ
ン加水分解物、脱脂大豆、アンモニウム塩などが使用さ
れる。無機塩類としてはマンガン、ナトリウム「カリウ
ム、マグネシウム、カルシウム、鉄、コバルトニッケル
、亜鉛などの金属塩類や硫酸、燐酸、塩酸、硝酸などの
塩類が使用できる。特にマンガンは、増殖に必須の金属
塩であり、それが欠乏すると生育は起こらない。生長促
進物質としては酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、ベ
プトン、コーンステイープリカーなどが良い。本発明に
おいては、特に酵素の誘導物質としてグリセロールおよ
びグリセロールを含有する物質ならびに、その他の誘導
体を培地に添加すれば大量の新規なＧＤＨを生成せしめ
ることが出来る。これら添加物の添加は、培養当初から
でも培養途中に行なっても良い。添加量としては通常グ
リセロールとして、培地に対して約２％量の割合で添加
すれば良い結果が得られる。培地のｐ則ま、中性付近と
し、通気燈拝などの好気培養を３０℃前後で１〜２日間
行なう。かくして、得られた新規なＧＤＨを含む菌体を
猿過または遠心分離によって分別し、適当な緩衝液に懸
濁後、磨砕、超音波処理、機械的圧縮または、自己消化
などの公知の方法で破砕して酵素を抽出する。 その抽出液から不港物を猿過または遠心分離によって分
別し、無細胞酵素液としたのち、硫酸アンモニウム、主
硝などによる塩析またはアセトン、アルコール等を用い
る溶媒沈澱などの公知の方法で酵素標品を得た。更に高
度に精製された酵素標品を得るには、イオン交換を応用
した吸着漆出法およびゲル嬢過法などを用いれば良い。
新規なＧＤＨの活性は、グリセロールとＮＡＤを基質と
して反応させた場合、生成するＮＡＤＨの３４仇皿にお
ける吸光度の増加を分光光度計で測定することによって
算出する。 すなわち、グリセロール３．仇ｈモル、ＮＡＤ８．０仏
モル、グリシン−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ９．３）０．３ｈ
モルを含む反応混液２．９叫に酵素液０．１の‘を混合
し、２５℃で反応させ、反応開始から４分間３４仇ｍの
波長における紫外部吸収の増加を測定し、その直線部分
から１分間当りの吸光度の増加を算出する。すなわち対
照として、上記組成で、グリセロールの代りに水を用い
て同様の操作を行ない、試験液の３４０ｎｍの吸光度の
増加から、対照のそれを差し引く。ＮＡＤＨの３４仇伽
における分子吸光係数として（ご＝６．２２×１ぴ）を
用い、差し引いた吸光度値から生成するＮＡＤＨ量を求
め、これをもとにして、試料中の酵素力価を算出する。
酵素力価の表示は、上記条件下で１分間に１山モルのＮ
ＡＤＨを生成せしめる酵素量を１単位として行なう。 本発明によって得られる新規なＧＤＨの理化学的性質を
Ｇ−１株の生産する酵素について示す。 ｍ作用本酵素はＮＡＤの共存下にグリセロールを脱水素
し、ジヒドロキシアセトンとＮＡＤＨを生成する反応を
触媒する。 ｛２｝ 基質特異性 本酵素はグリセロール以外にも、１，２ープロパンジオ
ール、２，３−ブタンジオール、グリセロールーＱ−モ
ノクロロヒドリン等にも作用しうるが、メチルアルコー
ル、エチルアルコール、プロピルアルコール等のアルコ
ール類は脱水素しない。 グリセロールに対するＫの値は１．３３×１０‐２Ｍ、
ＭＡＤに対するＫの値は１．２８×１０‐４Ｍである。 各基質に対する相対活性を第１表に示す。第１表 ‘３１至適鮒および安定ｐＨ範囲 本酵素の至適ｐＨは前記の活性測定条件下において９．
５〜１０．０にある（第１図参照）。 本酵素の安定母城は５℃、１虫時間処理でｐＨ５．０〜
９．０の範囲にある（第２図参照）。更に最も安定な柵
は７．５（０．０９Ｍカリウム−燐酸緩衝液）付近で、
該ｐＨでは、５０ｏｏで１５分間処理でもほぼ１００％
の活性が残存する。‘４１ 作用適温の範囲 本酵素の作用最適温度は、下記の活性測定条件下におい
て４５ｑｏ付近にある（第３図参照）。 ‘５｝ ｐＨ、温度などによる失活条件本酵素は、ｐＨ
７．５（０．０８ Ｍカリウム−燐酸緩衝液）、１粉ご
間の処理で５０こ０まで安定で７０℃では完全に失活す
る（第４図参照）。 ‘６｝ 種々薬剤の影響 本酵素活性は、Ｃｕ＋十イオン、ＺｎＨイオン、ＣｄＨ
イオン、ＰｂＨイオン、Ａｇ＋イオン、Ｈｇ＋＋イオン
によって顕著に阻害される。 他方Ｃａ＋＋イオン、ＦｅＨ十イオン、ＦｅＨイオン、
Ｍｎ＋＋イオン、Ｃｏ＋＋イオンによって活性化が認め
られ、ＥＤＴＡのような金属キレート剤で顕著な阻害が
認められる。また、ＰＣＭＢのようなＳＨ阻害剤によっ
て活性が顕著に阻害されることから、本酵素の活性発現
にはＳＨ基が関与しているものと推察される。次に各薬
剤の影響を第２表に示す。第２表夫 ｐ−Ｃｈと。 ｒｏｍｅｒＣｕｒｉｂｅｎＺＯａｔｅの分子量セフアデ
ックスＧ−２００のゲル渡過法により本酵素の分子量は
８５０００土５０００と算出される（第５図参照）。 図中、Ａはキモトリプシ／−ゲンＡ（牛肝由来）（分子
量２５０００）、Ｂは卵白アルブミン（分子量４５００
０）、Ｃは牛血清アルブミン（分子量６７０００）、Ｄ
は本発明のＧＤＨ、Ｅはッーグロプリン（人由来）（分
子量１６０００）、Ｆは従釆のＧＤＨ（バチルス・メガ
テリウム由釆）を示す。 次に本発明による新規なＧＤＨの製造法をＧ−１株を用
いた実施例で説明する。 実施例 １ グリセロール２％、ポリベプトン（大五栄養製）２％、
ＫＨ２Ｐ０４０．４％、Ｋ２ＨＰ０４２．５％、酵母エ
キス（オリエンタル酵母製）０．１％、ＭｎＣ１２・４
比０ ０．００５％、Ｍが０４・７日２０ ０．００５
％、ＦｅＣ１２・４日２００．００５％、ＣａＣ】２・
２も０ ０．００５％、消泡剤アデカノールＬＧ−１２
６（旭電化製）０．０４％（ｐＨ７．５）の組成からな
る培地５０肌を５００叫客坂口フラスコに仕込み、１２
０ｏｏ、１０分間加圧滅菌後、Ｇ−１株（徴工研菌寄第
５０５ｙ号）を１白金耳無菌的に植菌し、３０ｏｏで２
４時間振麓培養した（１４＄．Ｐ．ｍ．振中７ｃの）。 新規なＧＤＨは菌体内に生成蓄積されるが、その生産性
は、培養液１のＺ当り４．２単位であった。なお糠質を
グルコースとした場合（他の組成は上記と同一）は０．
３単位であった。実施例 ２実施例１に示した培地組成
（但しグリセロール濃度４％）で１３０〆の培地を調製
し、２００そ客醗酵槽に仕込んだ。 １２０ｏｏ、１０分間蒸気滅菌後、予め同組成の培地で
３０ｏｏ、２独特間振濠培養しておいたＧ−１株（徴工
研菌寄受理番号５０５叫号）の培養液１．３〆（１％）
を無菌的に楯菌し、３０ｏｏで２餌時間通気（ＩＶ．Ｖ
．ｍ）雛枠（１８び．ｐ．ｍ．）培養した。 培養液１２２夕を連続遠Ｄ分離機にて処理して菌体を集
め、この菌体を０．０９Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
て２０のこ懸濁した。この懸濁液を磨砕機にかけ菌体を
磨砕した。磨砕後、不落物を珪藻±を渡過助剤として櫨
別し、得られる渡液に硫酸アンモニウムを６５％飽和に
なる様に加え、新規なＧＤＨを沈澱として回収した。こ
の沈澱への新規なＧＤＨの活性収率は９０％で比活性は
７倍に上昇した。得られた沈澱を２その０．０９Ｍ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、０．０２Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で緩衝化したセフアデックスＧ一２５（
ファルマシア製、スウェーデン）を充填したカラム（１
５そ容量カラム）に通じ、脱塩を行ない、活性区分を集
めた。得られた脱塩酵素液を次いで予め０．０９Ｍ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化しＤＥＡＥーセルロース
（ブラウン製、Ｕ．Ｓ．Ａ）カラム（２そ容量カラム）
に通して新規なＧＤＨを吸着させ、同緩衝液で洗浄した
後、０．２Ｍ食塩を溶解した同緩衝液と０．８Ｍの食塩
を溶解した同緩衝液とで濃度勾配をつくり、徐々に食塩
濃度を上げながら新規なＧＤＨを溶出させた。溶出され
た新規なＧＤＨ活性区分を集め、これに硫酸アンモニウ
ムを６７％飽和になるように加えて新規なＧＤＨを沈澱
させた。沈澱を遠心分離（１００００×夕、２０分）で
集め、８００の‘の０．０９Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．５
）に熔解して後、２０％（Ｖ／Ｖ）燐酸でｐＨを６．０
に調整し、不純蛋白質を除去するために、３７０で４粉
ご間放置し、生ずる不漆物を遠心分離（１００００×夕
、２０分）で除去し、上燈液を得た。かくして得られた
除濁酵素液を次いで０．０１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７．５
）で緩衝化したセフアデツクスＧ−２５カラム（６そ容
量カラム）で脱塩を行ない、活性区分を集めた。得られ
た脱塩酵素液を凍結乾燥して新規なＧＤＨ標品１０夕を
得た。このものの比活性は１５．０単位／双９であり、
培養液からの収率は２８．９％で、比活性は６０倍上昇
した。
第１図は本発明酵素のｐＨ活性曲線を示す。
第２図は本発明酵素のｐＨ安定曲線を示す。第３図は本
発明酵素の温度活性曲線を示す。第４図は本発明酵素の
温度安定曲線を示す。第５図は本発明酵素のセファデッ
クスＧ−２００ゲル櫨過法による分子量決定結果を示す
。※１楓 ※２図 多３■ 友ム図 ※６蟹
発明酵素の温度活性曲線を示す。第４図は本発明酵素の
温度安定曲線を示す。第５図は本発明酵素のセファデッ
クスＧ−２００ゲル櫨過法による分子量決定結果を示す
。※１楓 ※２図 多３■ 友ム図 ※６蟹
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも下記性質（１）〜（６）を有してなる新
規なグリセロール脱水素酵素。 （１） 分子量：８５０００±５０００（セフアデツク
スＧ−２００によるゲル濾過法）（２） 作用至適ｐＨ
：９．５〜１０．０（０．１Ｍグリシン−ＫＣｌ−ＫＯ
Ｈ緩衝液中、２５℃反応）（３） 安定ｐＨ範囲：５．
０〜９．０（５℃、１５時間処理）（４） 作用至適温
度：４５℃付近（０．１Ｍグリシン−ＫＣｌ−ＫＯＨ緩
衝液中、ｐＨ９．５）（５） 安定温度範囲：５０℃以
下（０．０５Ｍカリウム−燃酸緩衝液中、ｐＨ７．５、
１５分間処理）（６） グリセロールに対するＫｍ値：
１．３３×１０＾−＾２Ｍ及びＮＡＤに対するＫｍ値：
１．２８×１０＾−＾４Ｍ２ バチルス属に属する下記
性質（１）〜（６）を有してなる新規なグリセロール脱
水素酵素を生産する菌を培地に培養し、その培養物から
下記性質（１）〜（６）を有してなる新規なグリセロー
ル脱水素酵素を採取することを特徴とするグリセロール
脱水素酵素の製造法。 （１） 分子量：８５０００±５０００（セフアデツク
スＧ−２００によるゲル濾過法）（２） 作用至適ｐＨ
：９．５〜１０．０（０．１Ｍグリシン鴦ＫＣｌ−ＫＯ
Ｈ緩衝液中、２５℃反応）（３） 安定ｐＨ範囲：５．
０〜９．０（５℃、１５時間処理）（４） 作用至適温
度：４５℃付近（０．１Ｍグリシン−ＫＣｌ−ＫＯＨ緩
衝液中、ｐＨ９．５）（５） 安定温度範囲：５０℃以
下（０．０５Ｍカリウム−燐酸緩衝液中、ｐＨ７．５、
１５分間処理）（６） グリセロールに対するＫｍ値：
１．３３×１０＾−＾２Ｍ及びＮＡＤに対するＫｍ値１
．２８×１０＾−＾４Ｍ
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54096459A JPS6012027B2 (ja) | 1979-07-27 | 1979-07-27 | 新規なグリセロ−ル脱水素酵素およびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54096459A JPS6012027B2 (ja) | 1979-07-27 | 1979-07-27 | 新規なグリセロ−ル脱水素酵素およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5621590A JPS5621590A (en) | 1981-02-28 |
| JPS6012027B2 true JPS6012027B2 (ja) | 1985-03-29 |
Family
ID=14165604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP54096459A Expired JPS6012027B2 (ja) | 1979-07-27 | 1979-07-27 | 新規なグリセロ−ル脱水素酵素およびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6012027B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59156280A (ja) * | 1983-02-28 | 1984-09-05 | Rikagaku Kenkyusho | グリセロ−ル脱水素酵素及びその製造法 |
| JPH0775862B2 (ja) * | 1991-05-22 | 1995-08-16 | 日本製紙株式会社 | ポリスチレン系樹脂発泡シートの製造方法 |
-
1979
- 1979-07-27 JP JP54096459A patent/JPS6012027B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5621590A (en) | 1981-02-28 |
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