JPH0149298B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

ａ 産業上の利用分野 本発明は、側鎖のカルボキシル基に細胞毒性物
質を多数結合すると共に、主鎖の片末端には活性
ジスルフイド結合を含む反応性基を有する、反応
性に富んだ重合体の製造法に関する。そして本発
明の目的とするところは、腫瘍細胞等の標的物に
結合能を有する抗腫瘍抗体等と、制ガン剤等の細
胞毒物を結合して標的指向型制ガン剤（抗腫瘍
剤）等を製造するに際し、両者を有効かつ効率良
く結合させるために用いることができる重合体を
提供することになる。 ｂ 従来技術 ある種の細胞だけを選択的に殺すことを目的と
して、その標的細胞と特異的に結合しうる免疫グ
ロブリンを種々の細胞毒性物質と結合させる試み
がなされてきた。例えば、免疫グロブリンにｐ−
ビス（２−クロロエチル）アミノ−Ｌ−フエニル
アラニン等を結合した複合体（特開昭51−61640
号）、免疫グロブリンにメトトレキセート等を結
合した複合体（特開昭56−65829号）、免疫グロブ
リンにクロラムブシル等を結合した複合体（特開
昭56−65828号）免疫グロブリンにマイトマイシ
ンーＣ等を結合した複合体（特開昭55−92325
号）、免疫グロブリンにダウノマイシンを結合し
た複合体（特開昭51−144723号）等が公知であ
る。 更に、特開昭51−126281号には、抗腫瘍免疫グ
ロブリンと、１分子当り制ガン剤を５〜500分子
共有結合している重合体担体（例えば、ポリダル
タミン酸）を、アミド結合によつて結合させて抗
腫瘍剤を得たことが開示されている。 これらの方法で得られた細胞毒性複合体は、腫
瘍細胞と選択的に結合し腫瘍細胞に毒性を発揮す
ることが期待されるものであり、非常に興味のあ
る薬剤である。しかしながら細胞毒性物質を直接
免疫グロブリンに結合する場合は、免疫グロブリ
ンに多数の細胞毒性物質を結合すると、免疫グロ
ブリンの抗原認識活性が低下してしまうので、か
かる困難を回避するためには、少数の細胞毒性物
質を結合するにとどめざるをえない。 一方、重合体を細胞毒性物質の担体として用い
る場合は、上記の難点を改善することができると
考えられる。しかし、特開昭51−126281号記載の
方法は、重合体担体に多数の細胞毒性物質を結合
する反応と、重合体−制ガン剤結合体に免疫グロ
ブリンを結合する反応が同一な反応のため、多数
の免疫グロブリンが重合体担体に結合してしま
い、そのため得られる複合体が均一なものとなり
得ないのみならず、治療剤として用いるのが不適
当な高分子量物質も含む、といつた問題を生じる
のである。 ｃ 発明の目的 本発明者等は、かかる先行技術の欠点を解決す
べく鋭意研究を行なつた結果、免疫グロブリンと
の結合反応に供する反応基を１コだけ含有し、か
つ、それとは異なる、細胞毒性物質を結合するた
めの、反応基を多数含む重合体担体を用意し、先
づ多数の反応基によつて多数の細胞毒性物質を該
重合体担体に結合した後に、免疫グロブリンとの
反応基によつて免疫グロブリンと結合する、とい
う手順を踏むことによれば、治療剤として用いる
のが不適当な高分子物質を含まず、かつ、多数の
細胞毒性物質を結合した免疫グロブリン−細胞毒
性物質複合体を製造し得ることを見い出した。本
発明は、かかる抗腫瘍剤あるいは又その他の標的
指向型薬剤を製造する際に最適に使用できる、細
胞毒性物質を結合した反応性重合体を提供するも
のである。 ｄ 発明の構成 本発明は、下記式〔〕 〔式〔〕において、Ｓは硫黄原子を表わす。
Ｗは２価の有機基を表わす。R₁はα−アミノ酸
のα位側鎖又はその誘導体（但しカルボキシル基
を有する基は除く）を表わす。Ｙは分子中にアミ
ノ基又はイミノ基を含む細胞毒性物質のアミノ基
又はイミノ基反応残基を表わす。Ｚは水素原子又
は１価の陽イオンを表わす。ｍは１〜４の整数を
表わす。ｎ，ｐ，ｑは構成単位の数を表わし、ｎ
＝５〜1500、ｐ＝０〜1500、ｑ＝０〜1500であ
る。X′は２−ピリジルチオ基、４−ピリジルチ
オ基、３−カルボキシ−４−ニトロフエニルチオ
基、４−カルボキシ−２−ピリジルチオ基、Ｎ−
オキシ−２−ピリジルチオ基、２−ニトロフエニ
ルチオ基、４−ニトロ−２−ピリジルチオ基、２
−ベンゾチアゾイルチオ基、２−ベンゾイミダゾ
イルチオ基及びＮ−フエニルアミノ−N′−フエ
ニルイミノメチルチオ基から成る群から選ばれた
隣接する硫黄原子と共に活性ジスルフイド結合を
形成し得る基を表わす。〕 で表わされる細胞毒性物質を結合した反応性重合
体の製造法である。 式〔〕で表わされる細胞毒性複合体におい
て、Ｙは分子中にアミノ基又はイミノ基を含む細
胞毒性物質のアミノ基又はイミノ基反応残基を表
わす。本発明における細胞毒性物質とは、そのま
まの状態で細胞に毒性を発揮する物質、あるいは
そのままでは毒性を発揮しないが、生体内で細胞
に毒性を発揮し得る物質に転換し得る物質をい
う。これらの例としては、 ｐ−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）〕フエ
ニレンジアミン ｐ−〔ビス（２−クロロエチル）アミノ〕 Ｌ−フエニルアラニン（メルフアラン） １−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）シトシン
またはそのモノホスフエート １−〔5′−（２−アミノエチルホスホリル）−β
−Ｄ−アラビノフラノシル〕シトシン ２−アミノ−Ｎ−〔ｐ−ビス（２−クロロエチ
ル）アミノ〕フエニル−３−ヒドロキシ−２−ヒ
ドロキシメチルプロピオンアミド メトトレキセート アクチノマイシンＤ マイトマイシンＣ 等を挙げることができるが、これらに限られるも
のではない。 Ｚは水素原子又は１価の陽イオン、例えば
Na⁺，K⁺，NH₄ ⁺である。 Ｗは２価の有機基を表わし、本発明の原料とし
て用いる反応性重合体を得る過程で何ら反応に関
与しない不活性な基である限り特に限定されな
い。これらの基としては、例えば２−アミノプロ
ピオン酸残基（−CH₂CH₂−）の如き直鎖の、あ
るいはＮ−ベンゾイルシステイン残基

【式】やＮ−ベンゾイルホモ システイン残基

【式】のごと き側鎖を有するアルキレン、４−メルカプト安息
香酸残基

【式】の如き置換基を有しな い、あるいは置換基を有するフエニレン基が挙げ
られるが、炭素数１〜４のアルキレン基が特に好
ましい。R₁はα−アミノ酸のα位側鎖又はその
誘導体（但しカルボキシル基を有する基は除く）
であり、例えばα−アミノ酸がグリシンの場合は
R₁＝Ｈ、アラニンの場合はR₁＝CH₃、フエニル
アラニンの場合は

【式】、セリ ンの場合はR₁＝CH₂OHである。式〔〕の複合
体において、かかるα−アミノ酸からなる単位
は、細胞毒性物質との結合には何ら関与しない
が、複合体の脂溶性や水溶性、あるいは細胞膜と
の親和性等を調節するのに役立つものである。従
つて、脂溶性や水溶性の調節が格別に必要ない場
合には、かかるα−アミノ酸単位を含有しないも
のの方（式〔〕においてｑ＝０）が実用的に有
利である。 ｍは１〜４の整数を表わすが、好ましいのはｍ
が１又は２の場合である。なお、式〔〕で表わ
される複合体としては、例えば、ｍ＝１のものと
ｍ＝２のものが混在している様な重合体も含む。 式〔〕においてｎは細胞毒性物質が結合した
構成単位の数を表わし、ｐは細胞毒性物質が結合
していない構成単位の数を表わし、ｑは側鎖にカ
ルボキシル基を有しないα−アミノ酸単位（側鎖
は修飾されていてもよい）の数を表わすが、これ
らの単位の重合体中の配列状態は任意である。即
ち、式〔〕においては、便宜上ブロツク重合体
の如く表わしてあるが、これに限られるものでは
なく、通常の方法で得られるものはランダム配列
の重合体である。ｎ＝５〜1500、好ましくは10〜
500であり、ｐ＝０〜1500、好ましくは０〜500で
あり、ｑ＝０〜1500、好ましくはｑ＝０〜500で
ある。 Ｓは細胞毒性物質を結合した反応性重合体上の
チオール基又は活性ジスルフイド基に由来する硫
黄原子を表わす。 式〔〕においてＸで表わされる、結合してい
る硫黄原子と共に活性ジスルフイド基を形成し得
る１価の有機基の具体例としては、例えば２−ピ
リジルチオ基

【式】４−ピリジルチ オ基

【式】３−カルボキシ−４−ニ トロフエニルチオ基

【式】４− カルボキシ−２−ピリジルチオ基

【式】Ｎ−オキシ−２−ピ リジルチオ基

【式】２−ニトロフエ ニルチオ基

【式】４−ニトロ−２− ピリジルチオ基

【式】２−ベン ゾチアゾイルチオ

【式】２−ベ ンゾイミダゾイルチオ基

【式】 及びＮ−フエニルアミノ−N′−フエニルイミノ
メチルチオ基

【式】等を挙 げることができる。 式〔〕で表わされる活性基を有している反応
性重合体と、分子中にアミノ基又はイミノ基を含
む細胞毒性物質との反応は、通常、水又はジメチ
ルホルムアミドやジメチルスルホキシド等の有機
溶剤を反応溶媒とする均一反応系で行なわれる。
反応に際しては、例えば１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
やジシクロヘキシルカルボジイミドで重合体中の
カルボキシル基を活性化してもよく、あるいはカ
ルボキシル基を混合酸無水物の形に活性化してお
いてもよい。反応時間は−40〜100℃、反応時間
は10分〜10日間が適当である。用いられる重合体
と細胞毒性物質との割合は、通常重合体中の−
COOZ基の５〜200％に相当する量が適当である。
反応終了後、反応液をゲル過又は透析等に付す
ことにより式〔−１〕で表わされる細胞毒性物
質を結合した反応性重合体を精取する。必要な
ら、凍結乾燥品として得ることもできる。 かくして得られた式〔−１〕で表わされる細
胞毒性物質を結合した反応性重合体をチオール化
合物や水素化ホウ素化合物と反応させて、重合体
中のジスルフイド結合を還元的に切断することに
よつて、式〔−２〕で表わされる細胞毒性物質
を結合し、チオール基を含有する反応性重合体を
得ることができる。式〔−１〕で表わされる重
合体とチオール化合物との反応は、通常、水又は
ジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシド等
の有機溶剤を反応溶媒とする均一反応系で行なわ
れる。適当なチオール化合物としては、例えば、
ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール
がある。チオール化合物は、重合体中のジスルフ
イド結合に対し１〜100倍モル量用いられる。反
応温度は−5゜〜70℃、反応時間は５分〜10日間が
好ましい。 水素化ホウ素化合物、例えば水素化ホウ素ナト
リウム、水素化ホウ素カリウムを用いる場合に
は、重合体との反応は通常、水溶液中で行なわれ
る。重合体中のジスルフイド結合に対し１〜100
倍モルの還元剤が好ましく用いられる。反応温度
は−5゜〜40℃、反応温度は１分〜５時間が好まし
い。 反応終了後反応液をゲル過又は透析等に付す
ことにより、式〔−２〕で表わされる重合体を
精取することができる。必要なら、凍結乾燥品と
して得ることもできる。 かくして得られた式〔−２〕で表わされる細
胞毒性物質を結合し、チオール基を含有する反応
性重合体に、活性ジスルフイド類を反応せしめる
ことによつて、式〔−１〕で表わされる活性ジ
スルフイド基を含有する反応性重合体を得ること
ができる。好適に用いることができる活性ジスル
フイド化合物としては、例えば、２−ピリジルジ
スルフイド

【式】４−ピ リジルジスルフイド

【式】５，５−ジチオ ビス（２−ニトロ安息香酸）

【式】４−カ ルボキシ−２−ピリジルジスルフイド Ｎ−オキシ−２−ピリジルジスルフイド

【式】２−ニトロフエニ ルジスルフイド

【式】４ −ニトロ−２−ピリジルジスルフイド

【式】２−ベ ンゾチアゾイルジスルフイド

【式】２−ベ ンゾイミダゾイルジスルフイド

【式】Ｎ−フ エニルアミノーN′−フエニルイミノメチルジス
ルフイド を挙げることができる。 両者の反応は、通常、水又はジメチルホルムア
ミドやジメチルスルホキシド等の有機溶剤を反応
溶媒とする均一反応系で行なわれる。あるいはま
た、重合体の水溶液に活性ジスルフイド化合物又
はそのアセトン溶液又はジオキサン溶液等を添加
混合した反応系で行なうこともできる。反応温度
は−5゜〜70℃、反応時間は１分〜24時間が適当で
ある。反応終了後、反応液をゲル過または透析
などに付すことにより式〔−１〕で表わされる
細胞毒性物質を結合した反応性重合体を精取す
る。必要なら凍結乾燥品として得ることができ
る。 本発明の原料物質である、式〔〕で表わされ
る末端の活性基を有している反応性重合体は、例
えばＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等の
重合体又は、それらと他のアミノ酸との間の共重
合体のアミノ末端（Ｎ−末端）に、チオール基又
は、保護チオール基導入剤を反応させ、しかる後
に、直接又は保護基をはずして得られたチオール
含有重合体に、活性ジスルフイド化合物を反応さ
せることにより、容易に得られるものである。チ
オール基導入剤として好的に用いることができる
物質としては、例えばＮ−サクシンイミジル３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート

【式】ジチオビス （サクシンイミジルプロピオネート）

【式】Ｎ−アセチルホモ システイン

【式】などがあ る。反応性重合体の製造方法は、さらに参考例で
詳述する。 ｅ 発明の効果 本発明で得られる細胞毒性物質を結合した反応
性重合体は、分子中に反応性に富んだチオール基
又は活性ジスルフイド結合を有しているので、か
かる基又は結合の反応性を利用して抗腫瘍免疫グ
ロブリン又はそのフラグメントと直接又は適当な
架橋剤を用いて結合させることができる。かくし
て得られる抗体一細胞毒性物質結合体は腫瘍細胞
等に選択毒性を発揮することが期待されるもので
ある。 以下、参考例および実施例により本発明を詳述
する。 参考例 １ Ｎ−末端に反応性基を含有するポリ−Ｌ−グル
タミン酸（ナトリウム塩）（３〜）の製造。 １−１ Ｎ−末端にジスルフイド結合を導入した
重合体の製造。 ポリ−Ｌ−グルタミン酸のナトリウム塩（平均
分子量21000）226.5mgの0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液（PH7.5）（15ml）中溶液に、Ｎ−サクシイ
ミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト（以下SPDPと省略する）68.8mgのエタノール
（６ml）溶液を撹拌下、２度に分けて加え、1.5時
間室温下り反応させた。反応液をセロフアン透析
チユーブに入れ、0.01Mリン酸緩衝液（PH7.5）
に対して4゜で２日間透析して低分子物質を除去す
ると、ポリ−Ｌ−グルタミン酸分子のアミノ末端
に３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル基が
アミド結合により導入されて生成したジスルフイ
ド結合を有する重合体を含有する溶液50mlが得ら
れた。 １−２ ジスルフイド結合の導入率 参考例１−４）の結果より、生成した重合性に
含有されかつ単離できるジスルフイド基導入重合
体量は35.4mg（15.6重量％）である。 １−３ Ｎ−末端にチオール基を有する反応性重
合体（２〜）の製造。 １−１）によつて得られた、アミノ末端に３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオニル基を導入し
た、ジスルフイド結合を有する重合体を含有する
溶液50mlに、ジチオスレイトール17mgの0.1Mリ
ン酸ナトリウム（PH0.6）緩衝液2.0ml中溶液を加
え、室温下に80分間反応させた。次いで塩酸酸性
とし、生じた沈澱を遠心分離した。得られたポリ
−Ｌ−グルタミン酸の、沈澱物（末端にチオール
基を有するポリ−Ｌ−グルタミン酸と有しないポ
リ−Ｌ−グルタミン酸を含む。）は、0.01NHCl
で洗浄した。 一方、チオプロピルセフアロース6Bゲル
（Thiopropyl Sepharse6B、フアルマシア社
製）15mlを0.1Mリン酸ナトリウム（PH6.0）−
1mMエチレンジアミンテトラ酢酸（以後EDTA
と省略する）（PH6.0）緩衝液40mlに分散し、得ら
れた分散溶液に、前記で得られたポリ−Ｌ−グル
タミン酸を同一緩衝液10mlに溶解して得られる溶
液を加え、室温下、窒素雰囲気中でゆるやかに１
夜撹拌した。これで末端にチオール基を有するポ
リ−Ｌ−グルタミン酸が樹脂に結合する。次いで
樹脂をロ別し、0.01Mリン酸緩衝液PH7.5で充分
洗浄した。 かくして得られた樹脂を0.1Mトリスー塩酸−
1mMEDEA（PH8.5）緩衝液50mlに分散し、２−
メルカプトエタノール1.17ｇを加え、室温下窒素
雰囲気中で10時間ゆるやかに撹拌した。これで末
端がチオール基のポリ−Ｌ−グルタミン酸（２〜）
が樹脂から遊離する。 樹脂を別し、0.01Mトリス−塩酸−
0.1mMEDTA（PH8.5）緩衝液でよく洗浄し、次い
で数を氷冷下塩酸でPH1.8とし、生じた末端に
チオール基を有するポリ−Ｌ−グルタミン酸
（２〜）の沈澱を遠心分離した。生成物の末端基量
は参考例１−４）、１−５）の結果より
1.984μmoleであつた。 １−４ Ｎ−末端に活性ジスルフイド基を有する
反応性重合体（３〜）の製造 １−３）で得られた末端にチオール基を有する
ポリ−Ｌ−グルタミン酸の沈澱を、再び0.4Mリ
ン酸ナトリウム−1mMEDTA（PH7.5）緩衝液１
mlに溶解し、得られた溶液を２−ピリジルジスル
フイド（以下２−PDSと省略する）23mgのエタ
ノール（４ml）溶液を0.1Mリン酸ナトリウム−
1mMEDTA（PH6.0）10mlに加えて得られた溶液
に加え、室温下で30分間反応させた後、（ポリ−
Ｌ−グルタミン酸の末端が活性ジスルフイド基と
なる）反応液をセロフアンチユーブに入れ、
0.01Mリン酸ナトリウム（PH7.5）に緩衝液に対
して６時間、純水に対して１日透析した。回収液
を減圧で30mlに減少し、凍結乾燥すると、末端に
２−ピリジルジチオ基が導入されたポリ−Ｌ−グ
ルタミン酸（ナトリウム塩）（３〜）の綿状固体
35.4mgが得られた（原料である(1)よりの重量収率
15.6％）。末端基量は１−５）の結果より
1.984μmoleであつた。従つて平均分子量は35.4÷
1.984×10³＝1.78×10⁴、平均ユニツト数は1.74×
10⁴／151＝118個と計算される。 １−５ （３〜）の重合体末端２−ピリジルジチオ
基定量 一定量のサンプルを精秤し（1.895mg）3.00ml
の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（PH7.2）に溶解
し、ジチオスレイトールの小片を加え、遊離した
２−メルカプトピリジンに由来する吸収
（343nm、分子吸光係数ε＝8080）を測定した
（Ａ＝0.286）。精秤されたサンプル中の末端基量
は0.1062μmole、従つて、同サンプル中の末端活
性ジスルフイド含有ポリ−Ｌ−グルタミン酸分子
の分子量は17.800、又同分子中のグルタミン酸
（ナトリウム塩）のユニツト数は、１ユニツトの
質量数が151であることより、118と計算された。
従つて参考例１−３）、１−４）で得られた末端
チオール型及び末端２−ピリジルジチオ型重合体
に含有される末端基量は、35.4／1.895×0.1062＝ 1.984μmoleである。 実施例 １ 側鎖にダウノマイシンを結合し、末端に反応性
基を含有する重合体の製造。 １−１ 側鎖にダウノマイシンを結合し、Ｎ−末
端に２−ピリジルジチオ基を含有するポリ−Ｌ
−グルタミン酸（ナトリウム塩（４〜）の製造。 参考例１−３）で得られたＮ−末端に２−ピリ
ジルジチオ基を含有するポリ−Ｌ−グルタミン酸
（ナトリウム塩）（分子量17800）（３〜）25mg
（1.40μmole）を５％食塩水６mlに溶解し、これ
にダウノマイシン塩酸塩11.2mgと、１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド塩酸塩（以下、EDCI・HClと省略する）
38.1mgを加え、室温下にて一夜反応させた。反応
液をセロフアンチユーブに入れ、水に対して4゜で
充分透析して低分子物質を除去した。透析内液を
減圧で10.5mlに濃縮すると、目的物である末端に
２−ピリジルジオ基を含有し、側鎖にダウノマイ
シンを結合したポリ−Ｌ−グルタミン酸（ナトリ
ウム塩）（４〜）の水溶液が得られた。 生成物は490nmにダウノマイシンに由来する吸
収極大を示したことより、側鎖にダウノマイシン
を結合していることが明らかとなつた。490nmの
吸光度の測定より重合体に結合したダウノマイシ
ンの量は1.16×10^-5moleであつた。又、１−２）
の結果より、重合体に含有される２−ピリジルジ
チオ基の量は1.36×10^-6moleである。従つて重合
体１分子に結合したダウノマイシン分子の数は、
1.16×10^-5mole／1.36×10^-6mole＝8.53個と計算
された。 １−２ ダウノマイシンを側鎖に結合し、Ｎ−末
端にチオール基を含有するポリ−Ｌ−グルタミ
ン酸（ナトリウム塩）（５〜）の製造。 １−１）で得られた側鎖にダウノマイシンを結
合し末端に２−ピリジルジチオ基を含有するポリ
−Ｌ−グルタミン酸（４〜）の溶液10.5mlに、
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）中1mMジチオスレイ
トール溶液2.0mlを添加し、室温下に30分間反応
せしめた。遊離した２−メルカプトピリジンに由
来する343nmにおける吸光度増加量を測定して求
めた末端基量は、1.36×10^-6moleであつた。 反応液を純水に対し4゜で充分透析することによ
り低分子物質を除くと、側鎖にダウノマイシンを
結合し、末端がチオール基に変換したポリ−Ｌ−
グルタミン酸（５〜）の水溶液が得られた。 １−３ ダウノマイシンを側鎖に結合し、Ｎ−末
端に３−カルボキシ−４−ニトロフエニルジチ
オ基を含有するポリ−Ｌ−グルタミン酸（６〜）
の製造。 １−２）で得られた側鎖にダウノマイシンを結
合し、末端にチオール基を含有するポリ−Ｌ−グ
ルタミン酸（５〜）（末端基量0.27×10^-6mole、グ
ウノマイシン量2.5×10^-6mole）の水溶液５mlに、
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.6）中1mMの５，5′−ジ
チオビス（２−ニトロ安息香酸）溶液3.0mlを加
えた。室温下15分反応した後、反応液を4゜で純水
に対して充分透析すると、目的物であるダウノマ
イシンを側鎖に結合し末端に３−カルボキシ−４
−ニトロフエニルジチオ基を含有する、ポリ−Ｌ
−グルタミン酸（６〜）の水溶液12mlが得られた。 水溶液の一部にジチオスレイトールを加える
と、遊離した５−メルカプト−２−ニトロ安息香
酸にもとずき、412nmにおいて吸光度の増大が生
じたことより（６〜）の末端構造を確認した。 実施例 ２ 側鎖にマイトマイシンＣを結合し、末端に反応
性基を含有する重合体の製造。 ２−１ 側鎖にマイトマイシンＣを結合し、Ｎ−
末端に２−ピリジルジチオ基を含有する重合体
（８〜）の製造 Ｎ−末端に２−ピリジルジチオ基を含有するポ
リ−Ｌ−グルタミン酸（ナトリウム塩）（分子量
16500）（７〜）20mg（1.212μmole）を５％食塩水
５mlに溶解し、これにマイトマイシンC9.0mgと
EDCI・Cl25mgを加え、室温下に１夜反応させた。
反応液をセロフアンチユーブ中水に対して4゜で充
分透析して低分子物質を除き、目的物である末端
に２−ピリジルチオ基を含有し、側鎖にマイトマ
イシンＣを結合したポリ−Ｌ−グルタミン酸（ナ
トリウム塩）（８〜）の水溶液8.5mlを得た。実施例
２−２）の結果より、得られた重合体は末端基量
で1.1μmoleであり、9.8μmoleのマイトマイシン
Ｃを結合していることが判明した。 生成物は360〜nmにマイトマイシンＣに由来す
る吸収を示したことにより、ポリ−Ｌ−グルタミ
ン酸の側鎖にマイトマイシンＣが結合しているこ
とが明らかになつた。360nmの吸光度の測定よ
り、重合体は9.8×10^-6moleのマイトマイシンＣ
を結合していることが判明した。又、２−２）の
結果より、重合体に含有される２−ピリジルジチ
オ基の量は1.1×10^-6moleである。従つて重合体
１分子に結合したマイトマイシンＣの数は、9.8
×10^-6／1.1×10^-6＝9.0個と計算された。 ２−２ 側鎖にマイトマイシンＣを結合し、Ｎ−
末端にチオール基を含有するポリ−Ｌ−グルタ
ミン酸（ナトリウム塩）（９〜）の製造。 実施例２−１）で得た、側鎖にマイトマイシン
Ｃを結合し、末端に２−ピリジルジチオ基を含有
するポリ−Ｌ−グルタミン酸（８〜）の溶酸8.3ml
に、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.6）中20mM2−メル
カプトエタノール溶液1.5mlを添加し、室温下に
30分間反応せしめた。遊離した２−メルカプトピ
リジンに由来する343nmにおける吸光度増加量よ
り、末端基量を求めると1.10×10^-6moleであつ
た。反応液を純水に対し4゜で充分透析して、低分
子物質を除くことにより精製し、マイトマイシン
Ｃを側鎖に結合し、末端にチオール基を含有する
ポリ−Ｌ−グルタミン酸（９〜）の水溶液を得た。 ２−３ 側鎖にマイトマイシンＣを結合し、Ｎ−
末端に５−ニトロ−２−ピリジルジチオ基を含
有するポリ−Ｌ−グルタミン酸（ナトリウム
塩）（１０〜）の製造。 実施例２−２）で得られた、側鎖にマイトマイ
シンＣを結合し、末端にチオール基を含有するポ
リ−Ｌ−グルタミン酸（９〜）（末端基量
0.1μmole、マイトマイシンＣ量8.9μmole）の水
溶液２mlに、２，2′−ジチオビス（５−ニトロピ
リジン）の0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）中、
10mM溶液0.5mlを加え、室温下30分間反応せし
めた。反応液を４℃にて純水に対して充分透析
し、目的物である側鎖にマイトマイシンＣを結合
し、末端に５−ニトロ−２−ピリジルジチオ基を
含有するポリ−Ｌ−グルタミン酸（ナトリウム
塩）（１０〜）の水溶液3.2mlを得た。生成物の一部
にジチオスレイトールを加えると、遊離した５−
ニトロ−２−メルカプトピリジンに由来する
386nmにおける吸光度の増大が生じたことによ
り、（１０〜）の末端構造を確認した。 実施例 ３ 側鎖にメルフアランを結合し、末端に反応性基
を含有する重合体の製造。 ３−１ 側鎖にメルフアランを結合し、Ｎ−末端
に２−ピリジルジチオ基を含有するＬ−グルタ
ミン酸とＬ−アラニンの共重合体（ナトリウム
塩）（１２〜）の製造 Ｎ−末端に２−ピリジルジチオ基を含有する、
Ｌ−グルタミン酸とＬ−アラニンの共重合体（ナ
トリウム塩）（構成当量比30.3：１）（分子量
13900）（１１〜）10mgを３mlの水に溶解し、4゜にて
EDCI・HCl12.5mgを加え、２分間撹拌したのち、
ｐ−〔ビス（２−クロロエチル）アミノ〕Ｌ−フ
エニルアラニン（メルフアラン）10mgを３mlに溶
解して得られた水溶液を滴下し、反応液を4゜にて
12時間撹拌した。反応液をセロフアンチユーブに
入れ、水に対して4゜で充分透析して低分子物質を
除くことによつて精製し、目的物である末端に２
−ピリジルジチオ基を含有し、側鎖にメルフアラ
ンを結したＬ−グルタミン酸とＬ−アラニンの共
重合体（ナトリウム塩）（１２〜）の水溶液7.4mlが
得られた。 生成物は259nmと302nmにメルフアランに由来
する吸収極大を示したことより、側鎖にメルフア
ランを結合していることが明らかとなつた。
259nmの吸光度の側定より、重合体に結合したメ
ルフアラン量は、4.92×10^-6moleであつた。又３
−２）の結果より、重合体に含有される２−ピリ
ジルジオ基の量は、0.70×10^-6moleである。従つ
て、重合体１分子に結合したメルフアラン分子の
数は、4.92×10^-6／0.70×10^-6＝7.0と計算され
た。 ３−２ 側鎖にメルフアランを結合し、Ｎ−末端
にチオール基を含有するＬ−グルタミン酸とＬ
−アラニンの共重合体（ナトリウム塩）（１３〜）
の製造。 実施例３−１）で得られた、側鎖にメルフアラ
ンを結合し、Ｎ−末端に２−ピリジルジチオ基を
含有するＬ−グルタミン酸とＬ−アラニンの共重
合体（ナトリウム塩）（１２〜）の溶液7.4mlに、
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）中1mMジチオスレイ
トール溶液2.0mlを添加し、室温下に30分間反応
せしめた。遊離した２−メルカプトピリジンに由
来する343nmにおける吸光度の増加量より末端基
量を定量した結果、0.70×10^-6moleであつた。 反応液を純水に対し4゜で透析することにより生
成物を精製し、目的物である側鎖にメルフアラン
を結合し、Ｎ−末端にチオール基を含有する共重
合体（ナトリウム塩）（１３〜）の水溶液を得た。 ３−３ メルフアランを側鎖に結合し、Ｎ−末端
に３−カルボキシ−４−ニトロフエニルジチオ
基を含有するＬ−グルタミン酸とＬ−アラニン
の共重合体（ナトリウム塩）（１４〜）の製造。 ３−２）で得られた、側鎖にメルフアランを結
合し、末端にチオール基を含有するＬ−グルタミ
ン酸とＬ−アラニンの共重合体（ナトリウム塩）
（１３〜）（末端基量0.7μmole、メルフアラン量
4.92μmole）11.7mlに、0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.6）中5mM5，5′−ジチオビス（２−ニトロ安息
香酸）溶液２mlを加え、室温下に15分間反応させ
た。反応液を4゜で純水に対して充分透析すると、
目的物であるメルフアランを側鎖に結合し、末端
に３−カルボキシ−４−ニトロフエニルジチオ基
を含有するＬ−グルタミン酸とＬ−アラニンの共
重合体（ナトリウム塩）（１４〜）の水溶液16.3ml
が得られた。生成物の一部にジチオスレイトール
を反応せしめたところ、遊離ある５−メルカプト
−２−ニトロ安息香酸に由来する412nmにおける
吸光度の増大があつたことから、末端基の構造を
確認した。 実施例 ４ 側鎖にアラーＣを結合し、末端に反応性基を含
有する重合体の製造。 ４−１ 側鎖にアラーＣ誘導体を結合し、Ｎ末端
に４−ニトロ−３−カルボキシフエニルジチオ
基を含有するポリ−Ｌ−グルタミン酸（ナトリ
ウム塩）（１６〜）の製造。 Ｎ−末端に４−ニトロ−３−カルボキシフエニ
ルジチオ基を含有するポリ−Ｌ−グルタミン酸
（ナトリウム塩）（分子量13100）（１５〜）10mgを、
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）３mlに溶解し、これ
に5′−（２−アミノエチルホスホリル）−１−（β
−Ｄ−アラビノフラノシル）シトシン（アラーＣ
誘導体）47mgと、EDCI・HCl50mgを加えて溶解
し、12時間撹拌して反応せしめた。反応液をセロ
フアンチユーブに入れ、水に対して4゜で充分透析
して、低分子物質を除くことによつて精製すると
目的物質である側鎖にアラーＣ誘導体を結合し、
末端に４−ニトロ−３−カルボキシ−フエニルジ
チオ基を含有したポリ−Ｌ−グルタミン酸（ナト
リウム塩）（１６〜）の水溶液4.7mlが得られた。 生成物は272nmにアラーＣに由来する吸収極大
を示したことより、側鎖にアラーＣ誘導体を結合
していることを確認した。272nmの吸光度の測定
より、結合したアラーＣ誘導体の量は15.9×
10^-6moleであつた。又、４−２）の結果より、
重合体に含有される４−ニトロ−３−カルボキシ
フエニルジチオ基の量は、0.68×10^-6moleであ
る。従つて、重合体１分子に結合したアラーＣ誘
導体の分子の数は15.9×10^-6／0.68×10^-6＝23.4
個と計算された。 ４−２ 側鎖にアラーＣ誘導体を結合し、Ｎ−末
端にチオール基を含有するポリ−Ｌ−グルタミ
ン酸（ナトリウム塩）（１６〜）の製造。 ４−１）で得られた、側鎖にアラーＣ誘導体を
結合し、Ｎ−末端に４−ニトロ−３−カルボキシ
フエニルジチオ基を含有するポリ−Ｌ−グルタミ
ン酸（１６〜）の溶液4.7mlに0.1Mリン酸緩衝液中
1mMジチオスレイトール溶液1.0mlを添加し、室
温下に30分間反応せしめた。遊離した５−メルカ
プト−２−ニトロ安息香酸に由来する412nmにお
ける吸光度の増大量を測定することにより、末端
基量を求めた結果、0.68×10^-6moleであつた。反
応液を純水に対して、4゜で充分透析することによ
り、低分子物質を除き、側鎖にアラーＣ誘導体を
結合し、末端がチオール基に変換したポリ−Ｌ−
グルタミン酸（１７〜）の水溶液を得た。 ４−３ アラーＣ誘導体を側鎖に結合し、Ｎ−末
端に２−ピリジルジチオ基を含有するポリ−Ｌ
−グルタミン酸（１８〜）の製造。 ４−２）で得られた、側鎖にアラーＣ誘導体を
結合し、Ｎ−末端にチオール基を含有するポリ−
Ｌ−グルタミン酸（末端基量0.14μmole、アラー
Ｃ量3.2μmole）の水溶液２mlに、0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.2）中0.5mM2，2′−ジチオジピリジン
2.0mlを加え、室温下30分間反応せしめた。反応
液を4゜で純水に対して充分透析すると、目的物で
あるアラーＣ誘導体を側鎖に結合し、末端に２−
ピリジルジチオ基を含有するポリ−Ｌ−グルタミ
ン酸（18）の水溶液5.4mlが得られた。末端基の
構造は、生成物の一部に過剰のジチオスレイトー
ルを反応せしめた時、遊離する２−メルカプトピ
リジンに由来する、343nmにおける吸収の増大が
生ずることで確認した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記式［］ 〔式［］において、Ｓは硫黄原子を表わす。
   Ｗは２価の有機基を表わす。R₁はα−アミノ酸
   のα位側鎖又はその誘導体（但しカルボキシル基
   を有する基は除く）を表わす。Ｚは水素原子又は
   １価の陽イオンを表わす。ｍは１〜４の整数を表
   わす。ｎ，ｐ，ｑは構成単位の数を表わし、ｎ＝
   ５〜1500、ｐ＝０〜1500、ｑ＝０〜1500である。
   X′は２−ピリジルチオ基、４−ピリジルチオ基、
   ３−カルボキシ−４−ニトロフエニルチオ基、４
   −カルボキシ−２−ピリジルチオ基、Ｎ−オキシ
   −２−ピリジルチオ基、２−ニトロフエニルチオ
   基、４−ニトロ−２−ピリジルチオ基、２−ベン
   ゾチアゾイルチオ基、２−ベンゾイミダゾイルチ
   オ基及びＮ−フエニルアミノ−N′−フエニルイ
   ミノメチルチオ基からなる群から選ばれた隣接す
   る硫黄原子と共に活性ジスフイド結合を形成しう
   る基を表わす。〕 で表わされる反応性重合体に分子中にアミノ基又
   はイミノ基を含む細胞毒性物質を反応させること
   を特徴とする、下記式［−１］ 〔式［−１］において、Ｓ，Ｗ，R₁，ｍ，
   ｎ，ｐおよびｑの定義は式［］の場合と同じで
   ある。X′の定義も式［］の場合と同じであ
   る。〕 で表わされる細胞毒性物質を結合した反応性重合
   体の製造法。 ２ 下記式［−２］ 〔式［−２］において、Ｓは硫黄原子を表わ
   す。Ｗは２価の有機基を表わす。R₁はα−アミ
   ノ酸のα位側鎖又はその誘導体（但しカルボキシ
   ル基を有する基は除く）を表わす。Ｙは分子中に
   アミノ基又はイミノ基を含む細胞毒性物質のアミ
   ノ基反応残基を表わす。Ｚは水素原子又は１価の
   陽イオンを表わす。は１〜４の整数を表わす。
   ｎ，ｐ，ｑは構成単位の数を表わし、＝５〜1500、
   ｐ＝０〜1500、ｑ＝０〜1500である。〕 で表わされる細胞毒性物質を結合した重合体と２
   −ピリジルチオ基、４−ピリジルチオ基、３−カ
   ルボキシ−４−ニトロフエニルチオ基、４−カル
   ボキシ−２−ピリジルチオ基、Ｎ−オキシ−２−
   ピリジルチオ基、２−ニトロフエニルチオ基、４
   −ニトロ−２−ピリジルチオ基、２−ベンゾチオ
   ゾイルチオ基、２−ベンゾイミダゾイルチオ基及
   びＮ−フエニルアミノ−N′−フエニルイミノメ
   チルチオ基からなる群から選ばれた隣接する硫黄
   原子と共に活性ジスルフイド結合を形成し得る活
   性ジスルフイド化合物を反応させることを特徴と
   する、下記式［−１］ 〔式［−１］において、Ｓ，Ｗ，R₁，Ｙ，
   Ｚ，ｍ，ｎ，ｐ，およびｑの定義は式［−２］
   の場合と同じである。〕 で表わされる細胞毒性物質を結合した反応性重合
   体の製造法。