JPS6119635A - 細胞毒性物質と蛋白質複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細胞毒性物質と生理活性蛋白質との複合体及び
それらの製造方法に関する。更に詳しくは本発明は腫瘍
細胞等の標的物に結合能を有する抗腫瘍抗体等の生理活
性蛋白質と細胞毒物とを結合して標的指向型制ガン剤等
として有用な細胞毒性物質と生理活性蛋白質との複合体
及びその製造法に関するものである。

従来抗腫瘍抗体ｉこ細胞毒物を結合して抗腫瘍剤を製造
する事は公知である。抗腫瘍抗体と細胞毒墓の結合にあ
た゛・て抗腫瘍抗体の標的結合能を低下させずに多数の
細胞毒性物質を結合せしめるためポリマー担体が用いら
れている。

ポリマー担体として用いられている代表的ポリマーはデ
キストラン、ポリグルタミン酸である。

デキストランの場合は主として過ヨウ素酸等で酸化して
アルデヒド誘導体にして用いるが、細胞毒性物質と抗腫
瘍抗体を同一官能基にて反応させるため再現性良く結合
体を得るのが困難であり、かつ必要以上に抗腫瘍抗体が
結合し高分子量体を生成して腫瘍細胞等との結合能力を
低下させやすい。又ポリグルタミン酸は上記欠点を有す
る他電荷を有するため抗体の結合能を低下せしめると同
時−と体内の特定臓器に集まるので標的指向型制ガン剤
として望ましくない。

本発明者らはかかる欠点を解決すべく鋭意検討を行なっ
た結果、細胞毒性物質を結合した、電荷を有しないポリ
マー担体を合成し、生理活性蛋白をその活性を低下させ
ずに該ポリマー担体と結合し、細胞毒性物質と抗腫瘍抗
体等の住理活性蛋白との複合体を得ることを見いだし本
発明にいたった。

本発明は標的指向型治療剤を製造するために使用できる
細胞毒性物質を結合した反応性高分子と標的能を有する
抗腫瘍抗体等の住理活性蛋白質との複合体を提供するも
のである。

即ち、本発明は細胞毒性物質を結合した下記の一般式〔
１〕〜〔６〕 （３］　　　　　　　　　　（４） 〔上記式〔１〕〜〔６〕において、ｘ、ｙ、ｗおよび２
は各々次の意味を示す。

Ｘ：分子中にアミノ基もしくはイミノ基を有する細胞毒
性物質の反応残基 Ｙ：水溶性脂肪族第一アミン残基 Ｗ：低級アルキレン基 ２：水素原子または一般式Ｚ′で示される基（但し、２
が水素原子である場合、−ＳＺで表わされるーＳＨ基は
分子内または分子間で他の一５Ｈ基と平衡的に一５Ｓ−
結合を形成し得るが、これらを含んで 一８Ｈと表現するものとする。） Ｚ′：隣の硫黄原子と共に活性ジスルフィド結合を形成
しうる基〕 で表わされる構成単位から成り、かつ１分子中における
各構成単位（１）　、　（２］　、　（３）　’、　（
４）　、　（５）および〔６〕の　数が各々ｎ　、　ｍ
　、　ｌ！、　ｒ　、　ｐおよび９であってこれらの数
はＯｌたは自然数であり、これらの関係は ｎ−４−ｍ≧２ ０．００１≦（ｐ＋ｑ）／（ｎ＋ｍ＋ｒ＋ｒ＋ｐ＋ｑ）
＝ｏ、ｓ。

であり、平均分子量が２，０００〜ｉ　、ｏｏｏ、ｏｏ
ｏであるポリサクシンイミド誘導体（１）と生理活性蛋
白とを結合せしめた蛋白質−ボリサクシンイミド複合体
である。

ここで、隣ケの硫黄原子と共に活性ジスルフィド結合を
形成しつる基（２′）としては、例えジルチオ基（イｌ
）“ｓ−）、５−カルボキシ−などの置換もしくは無置
換ピリジルチオ基またはそのＮ−オキシド、および３−
カルボキシ−４−ニトロフェニルチオ基 ルチオ基類、さらに 及びＮ−フェニルアミノ−Ｎ′−フェニルイミノＷは低
級アルキレン基であり、例えば炭素数１〜４の直鎖状ま
たは分枝鎖状のアルキレン基を挙げることができる。

式〔１〕および〔２〕のＸは分子中にアミノ基もしくは
イミノ基を含む細胞毒性物質の反応残基又はヒドロキシ
ル基を表わす。

本発明における細胞毒性物質とは、そのままの状態で細
胞に毒性を発揮する物質、あるいはそのままでは毒性を
発揮しないが、生体内で細胞に毒性を発揮し得る物質に
転ｍし得る物質をいう。ξれらの例としては次のような
ものを挙げることができる。

ｐ　−（Ｎ　、　Ｎ−ビス（２−クロロエチル）〕フェ
ニレンジアミン ｐ−（ビス（２−クロロエチル）アミノ〕−Ｌ−フェニ
ルアラニン（メル）１ラン）２−アミノ−Ｎ−（ｐ−ビ
ス（２−クロロエチル）アミノコフェニル−３−ヒドロ
キシプロピオンアミド １−（５’−（２−アミノエチルホスホリル）−β−Ｄ
−アラビノフラノシル〕長トシトシン２ミノ−Ｎ　−［
ｐ−ビス（２−クロロエチル）アミノ〕フェニルー３−
ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチルプロピオンアｔＦ メトトレキセート アクチノマイシンＤ マイトマイシンＣ ＸとＨ，ダウノマイシン Ｘ、ＯＨ，アドリアマイシン 式〔３〕および〔４〕のＹは水溶性の脂肪族第一アミン
の反応残基である。本発明の目的には必ずしも用いる必
要はない（Ｊ＋ｒ−０）が反応性重合体（ポリサクシン
イミド誘導体〔Ｉ〕）の水溶性を向上する目的で導入す
る。用いられる水溶性の脂肪族第一アミンとしては例え
ばエタノールアミン、３−アミノ−１，２−プロパンジ
オール等の水酸基を有する脂肪族第一アミン、（Ｊ（３
（ＣＨ２）ｇＭ（２（ｇ　−ｉ〜４の整数）の脂肪族ア
ミン等である。特に水酸基を有するエタノ−ルア、ミン
、３−アミノ−１，・２−プロパンジオール等のアミン
が好ましい。

酸単位の数を表わし、ｐ＋ｑは２が結合した構成単位の
数をあられす。

（ｎ＋ｍ）／（ｎ＋ｍ−１＋ｒ＋ｐ＋ｑ）はモノマーユ
ニットであるサクシンイミド基１モルに対してＸの縮合
モル数をあられす。

＜ｐ＋ｑ＞／＜ｎ＋ｍ＋ｔ＋ｒ＋ｐ＋ｑ）はモノマーユ
ニットであるサクシンイミド基１モルに対して一般式　
−Ｎｕ−ＷＳ−Ｚ　　で示される基の縮合モル数を表わ
す。

分子量は末端のアミノ基の定量で得られた値で表示した
。

構成単位の重合体中での配列状態は任意である。たとえ
ばランダム共重合体を含みこれ１こ限定されるものでな
い。

分子量は２，０００〜ａ、ｏｏｏ、ｏｏｏ好ましくは２
．０００〜３，０００，０００であり、ｎ十ｍは２以上
、（ｎ＋ｍ）／（ｎ＋ｒｎ＋ｌ＋ｒ＋ｐ＋ｑ）が１未満
であり：　（ｐ＋ｑ）／（ｎ十ｍ＋／十ｒ＋ｐ＋ｑ）が
０゜００１以上、０．５０以下好ましくは０．３以下で
ある。

分子量がこれ以下であると反応性重合体１分子に結合し
ている細胞毒性物質の数が少なくなって抗腫瘍抗体等に
結合できる細胞毒性物質の量が少なくなるので好ましく
ない。又分子量が大きすぎると抗腫瘍抗体の会合体が生
じゃすくなり不溶化分、大分子量が生成しゃすくなるの
で好ましくない。

（ｐ十ｑ）／（ｎ＋ｍ＋／＋ｒ＋ｐ＋ｑ）は０．００１
以上であり、これ未満であると抗腫瘍抗体等との結合比
率が低くなるので好ましくない。又０゜５以下好ましく
はＯ６３以下であって多過ぎると抗腫瘍抗体等の会合体
が生じゃすくなり不溶化分、大分子量分が増加するので
好ましくない。

本発明におけるポリサクシンイミド誘導体〔Ｉ〕の製造
法は特願昭５９−２５６６５号明細書に示されている。

すなわち下記一般式（ＩＩ）の構成単位を主成分とする
ポリサクシンイミド（ポリサクシンイミド１：］Ｉ））
より容易に誘導され得る。

す 、〔式中、ｋは自然数を示す。〕 ポリサクシンイミドは別名アンヒドロポリアスパラチッ
クアシッドとも呼ばれる重合体であって、主としてアス
パラギン酸の熱縮合にょっ　−て得ることができる。（
Ｊ　、Ｋｏｖａｃｓ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｊ　。

Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、　２６１０８４（１９６１）　；　
Ｐ、Ｎｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ　、　。

Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、　１６　８９３（１９７３））
具体的製造法の例としては、アスパラギン酸（光学活性
体又はＤＬ体であっても良い）を常圧又は減圧下、１６
０’Ｃ以上２４０℃以下で脱水重合することによって得
ることができる。

重合後反応生成物をＤＭＦ又はＤＭＳＯ＃こ溶解して水
にて再沈を行ない未反応アスパラギン酸及び低分子縮合
体を除去してガラスフィルターで沖過後乾燥を行なう。

必要とあればこの操作を繰返す。

かくして得られた重合体が一般式［ＩＩ）で表わされる
ものである事がＩＲ，ＮＭＲから示唆されているが、部
分的にこれ以外の構成単位を含んでいたとしても実質的
に一般式（ＩＩ］の構成単位が主成分である事は一般に
認められているところである。

本発明におけるポリザクシンイミド誘導体〔Ｉ〕を得る
方法としては２つの方法がある。

第一の方法は、ポリザクシンイミドを下記一般式（ＩＩ
［）で示される誘導体にして、さらに分子中にアミノ基
又はイミノ基を含む細胞毒性物質を結合させ、必要とあ
れば水溶性脂肪族第一アミンと反応させる方法である。

第二の方法はアミノ基を有する細胞毒性物質を結合する
のに有効な方法で、細胞毒性物質、抗腫瘍抗体等との結
合能を有する官能基供与化合物（ＮＨ，−Ｗ−Ｓ　−Ｚ
　）　　及び水溶性脂肪族第一アミンをいずれもそれら
が有するアミノ基を用いて直接ザクシンイミド基 ミド誘導体〔Ｉ）にする方法である。

第一の方法としては、以下（１）〜（３）の方法がある
。

（１１（ａ）ポリザクシンイミド〔■〕と（イ）一般式
　□Ｈ２Ｎ　Ｗ−８−Ｚ　（Ｗ　トＺ　ハ前記ト同じ）
で表わされる化合物、（ロ）必要とあれば水溶性脂肪族
第一アミンと反応した後、アルカリ水溶液で処理して一
般式（１１［）の中間体を得る。

（ｂ）その後（ハ）アミノ基又はイミノ基を含む細胞毒
性物質、に）必要とあれば水溶性脂肪族第一アミンと反
応せしめる方法 （２）　　ポリザクシンイミドと（ａ）　（（Ｊ一般式
Ｈ２Ｎ−Ｗ−５−５−及〔Ｗは前記と同じ。又はアルキ
ル基（例えば炭素数１〜５の低級アルキル基）アラルキ
ル基（例えば無置換または置換フェニルアルキル基）ま
たはアリール基（例えば無置換また゛は置換フェニル基
）等の炭化水素基を示す。〕、（０口必要とあれば水溶
性脂肪族−アミンと反応させた後、アルカリ水溶液で処
理し一般式（ｍ）　（ｚ　＝　−８−Ｒ）の中間体を得
る。

（ｂ）その後（ハ）アミノ基又はイミノ基を含む細胞毒
性物質、に）必要とあれば水溶性脂肪族第一アミンを反
応させる。

生 （ａｌまたは（ｂ）の反応後、必要とあれば反応←酸物
のジスルフィド基をチオール化合物あるいは水素化ホウ
素化合物等で反応させて還元的に切断することによって
２＝水素原子であるポリザクシンイミｐ誘導体〔Ｉ）を
得る。

（３）上記いずれかの方法で得られたチオール型反応性
重合体（Ｚ−水素原子であるポリザクシンイミド誘導体
〔Ｉ）に活性ジスルフィド化合物を反応させることによ
って得る方法がある。この時はｚ　ｌｌｅ　ｚ／である
ポリザクシンイミド誘導体〔Ｉ〕が得られる。

さらに上記（１）および（２）の方法として上述の（ａ
）にお”ける（イ）、（ロ）および（ｂ）におけるｅｌ
）、に）の反応は任意の順番で逐次行なう逐次反応法、
二成分の反応を同時番こ行なう同時反応法がある。

反応溶媒として（イ）、（ロ）の反応はポリサクシンイ
ミドの良溶媒であるＤＭＦ又はＤＭＳＯを用いる。

ポリザクシンイミド（ｎ）をＤＭＦ又はＤＭＳＯ中に１
〜３０（Ｗ／Ｗ）　　％番どなるよう溶解し、げ）、（
ロ）の−ないし二成分（ポリザクシンイミド（ＩＦ）の
モノマーユニットであるザクシンイミド基１モルに対し
て一成分につき０．００１〜１０モル）と、−４０〜８
０℃において１分〜２日間攪拌下反応せしめるのが適当
である。未反応の成分は透析又はゲル沖過により除去す
ることができる。一般式（ＩＩＩ）で表わされる中間体
を得るには、前記（１１、＋２１における（ａ）のアル
カリ水溶液処理前の反応中間体に未反応ザクシンイミド
基がある事が望ましい。未反応ザクシンイミド基が加水
分解を受けて−ＣＯＯＨ基を形成するからである。

かくして得られたポリザクシンイミド誘導体をアルカリ
条件にする事により容易にカルボキシル基を導入する事
ができる。アルカリ水溶液との反応はＤＭＦ　、ＤＭＳ
Ｏ溶液中にアルカリ水溶液を滴下するか、又はアルカリ
水溶液中にポリザクシンイミド誘導体を加える事により
行う事ができる。アルカリ水溶液としては、Ｐ）Ｉ８以
上で良いが０゜ＯＩＮ〜２ＮＮＩＯＨ水溶液が適当であ
る。

かくして得られた一般式（ＩＩ）で表わされる中間体と
方法（１）、（２）におけるｒＸＩ、に）との反応は任
意の順番で行なう逐次反応法、即時におこなう同時反応
法がある。本発明の目的では（ハ）を多く導入する事が
好ましいので（ハ）を反応後にに）を反応するのが好ま
しい。

反応溶媒としては通常水又はＤＭＦ、ＤＭＳＯ等の有機
溶剤を反応溶液とする均一反応系でおこなわれる。

反応に際しては、例えば１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩やジシクロへ
キシルカルボジイミド存在下でカルボキシル基を有する
ポリザクシンイミド誘導体とアミノ基又はイミノ基を有
する細胞毒性物質を共存せしめる方法、ポの形で活性化
しておいてアミノ基又はイミノ基を有する細胞毒性物質
を反応せしめる方法等がある。反応温度は一り０℃〜Ｉ
００’Ｃ１反応時間は１０分〜１０日間が適当である。

用いる中間体とぐＳｌとの割合は中間体の１０〜２００
　’１６特ニ１００〜２ｏｏＩｓが望ましい。ｐｉとの
反応においてカルボキシル基が未反応で残存している時
はに）との反応においてカルボキシル基をなくする。

アミノ基を含む細胞毒性物質を用いる時はより簡単な第
二の方法で製造が可能である。

アミノ基を含む細胞毒性物質とは細胞毒性を有すると共
に、分子中のアミノ基がポリザクシンイミドのザクシン
イミド基 有する化合物を言う。

換言すればザクシンイミド基と反応してアミド結合を形
成するアミノ基を有していなければならない。

これらの例としては、ダウノマイシン、アドリアマイシ
ン、Ｐ−アミノ−Ｎ−［ｐ−ビス（’２−１０ロエチル
）アミノコフェニル−３−ヒドロキシアミド、２−アミ
ノ−Ｎ−〔Ｐ−ビス（２−クロロエチル）アミノコフェ
ニル−３−ヒドロキシ−２−ヒドロキシメチルプロピオ
ンアミド、ｐ−（ビス（２−り。

ロエチル）アミノ〕−Ｌ−フェニルアラニン等脂肪族ア
ミ７基を有するものが挙げられる。

第２の方法としては以下の（４１〜（６ンの方法がある
。

（４１ポリザクシンイミド（ｆｆ）と（イ）アミノ基を
有する細胞毒性物質（ロ）一般式Ｈ２Ｎ　Ｗ　５−Ｚ（
Ｗ、Ｚは前記と同じ）で表わされる化合物およびｅ１必
要とあれば水溶性脂肪族第一アミンとの反応によって得
る方法。

（５）　　ポリザクシンイミド（ＩＩ）と（イ）アミノ
基を有する細胞毒性物質（ロ）一般式Ｈ２Ｎ−ＷＳ　−
５−Ｒ（Ｗ、Ｒは前記と同じ。）で表わされる化合物お
よびｅ→必要とあれば水溶性脂肪族第一アミンと反応さ
せ、ジスルフィド型の重合体を得る方法又は必要とあれ
ばその後反応生成物のジスルフィド基をチオール化合物
あるいは水素化ホウ素゛化合物と反応させて還元的に切
断することによってチオール型重合体を得る方法。

（６）　　上記いずれかの方法で得られたチオール型反
応性重合体（ｚ、Ｌ水素原子であるポリザクシンイミド
誘導体〔Ｉ〕）に活性ジスルフィド化合物を反応させる
ことによって得る方法がある。これによりｚ　、、、　
ｚ’であるポリザクシンイミド誘導体〔Ｉ）が得られる
。

さらに上記（４）および（５）の方法としては上述のヒ
）、（ロ）および必要によりｅ→の各成分との反応を任
意の順番で逐次行なう逐次反応法、多成分との反応を同
時に行なう同時反応法がある。また（ハ）の成分との反
応が必要なときは任意の一成分との反応を単独で、残り
二成分との反応を同時に行なう二段階法が可能である。

反応溶媒としては、逐次反応又は二段階反応における第
一番目の反応および同時反応は、ポリザクシンイミドの
良溶媒であるＤＭＦ又はＤＭＳＯを用いる。逐次反応又
は二段階反応の第二番目以後は、ＤＭＦ又はＤＭＳＯあ
るいは第一番目又は第二番目の反応で得られたポリザク
シンイミド誘導体が水溶性となった時は水溶媒中で行な
う事ができる。

上記（４）及び（５）の反応方法において（イ）、（ロ
）、り埼の成分を反応させる１こは、以下の操作により
実施される。

ポリザクシンイミド（Ｉ［］又は第一もしくは第二反応
後の未反応のサクシンイミド基 誘導体ヲ、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ又は水ｊコｌ　〜３０（Ｗ
／Ｗ）％となるよう溶解し、反応させるべき成分（（ｌ
、（０）、ｅ号の１ないしそれ以上（ポリザクシンイミ
ド（ＩＦ）のモノマーユニットであるザクシンイミド基
１モルに対して一成分につき、０．００１〜１０モル）
と、−４０〜８０℃において１０分〜２０日間攪拌下反
応せしめる。未反応の成分は透析又はゲル沖過により除
去することができる。

目的とするポリザクシンイミド誘導体〔Ｉ〕は、溶媒の
減圧留去又は凍結乾燥によって得られる。

分子量の制御は、ポリザクシンイミド〔Ｉ）を得る縮合
条件の選択により行なわれ、さらに目的とする分子量を
有する重合体の分離はポリザクシンイミド（ＩＩ）のＤ
ＭＦ溶液でのデルｒ過に□　　　　よる分子量分画及び
ポリザクシンイミド誘導体〔Ｉ〕を得てからの水溶媒中
でのゲルｒ過による分子量分画の方法による。

（４）の方法において望ましい２は水素原子である。

目的とする分子量分画の収率向上のためポリザクシンイ
ミド（ｎ）を得る縮合条件の選択、ポリザクシンイミド
のＤＭＦ溶液でのゲルｒ過による分子量分画をあらかじ
め行なう。

前記（３）及び（６）の方法であるチオール型反応性重
合体（２−水素原子であるポリザクシンイミド〔工〕）
に活性ジスルフィド化合物を反応させて活性ジスルフィ
ド基を有する反応性重合体（ｚ　＊　ｚ’であるポリザ
クシンイミド〔■〕）を得る方法において用いられる活
性ジスルフィド化合物とは、前述の、隣の硫黄原子と共
番〔活性ジスルフィド結合を形成しうる基（２′）のジ
スルフィド体であり、そのような活性ジスルフィド化合
物の具体例としては２′として例示した前述の基のジス
ルフィド体、例えば２−ピリジルジスチオ基のジスルフ
ィド体である４−ピリジルジシｋ　−４−：、、トロフ
ェニルチオ基のジスルフィド体である５、５′−ジチオ
ビス（２−ニトロ安る。

チオール型反応性重合体と活性ジスルフィド化合物との
反応は、通常水又はＤＭＦやＤＭＳＯ等の有機溶媒を反
応溶媒とする均一反応系で行なわれる。あるいはまた、
重合体の水溶液に活性ジスルフィド化合物又はそのアセ
トン溶液又はジオキサン溶液等を添加混合した反応系で
行なうこともできる。反応温度は一５〜７０℃、反応時
間は１分〜２４時間が適当である。

本発明の目的である細胞毒性物質と生理活性蛋白質複合
体において、生理活性蛋白とは、腫亀部位と特異的結合
能力を有する生理活性蛋白のみならず、そのような生理
活性蛋白の部分的分解物すなわちフラグメントをも意味
する。

本発明における望ましい生理活性蛋白とじては、例えば
、血栓部位に特異的に結合することが知られているフィ
ブリノーゲンやウロキナーゼ、および腫瘍細胞等の特定
の抗原と特異的に結合しうる免疫グロブリン、特定の糖
の構造に特異的に結合するレクチンなどを挙げることが
できる。

フィブリノーゲンやウロキナーゼは、腫瘍細胞の周辺に
血栓部位が多いことがら′腫瘍部位での集積性が知られ
ている。また、フィブリノーゲンにトロンビンおよびＣ
，２＋を作用させて強固なフィブリン・クロット（ｃｌ
ｏｔ　）を作り、さらにプラスミンで処理することによ
って得られるフラグメントＥも、血栓部位と特異的結合
能力を有することが知られている。

望ましい生理活性蛋白は腫瘍細胞等の特定の抗原と特異
的に結合しうる免疫グロブリンである。

免疫グロブリンとしてはＡＦＰ、ＣＥＡ。

ＨＣＧ、）ランスフェリンリセブターの様な特定の蛋白
質または腫瘍細胞もしくは特定のリンパ球等の標的細胞
、またはそれらを含む組織を抗原として得られた、特定
の抗原と特異的に結合しうる免疫グロブリンを挙げるこ
とができる。

免疫グロブリンを得るには、抗原で免疫されたヒト、サ
ル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、
ハムスター、ラット、マウス等の動物から分離された抗
血清より、エタノール分画、硫安分画、イオン交換ある
いは分子法、あるいは抗原で免疫された動物より採取さ
れた抗体産生細胞を、発癌性のある物質で癌化させたり
、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを得、こ
れらの産生するモノクローナル抗体を取得する方法を実
施し得る。

免疫グロブリンは、そ、のＦｃ部分を除去しても抗原と
の特異的結合能力を有している。一般に免疫グロブリン
をパパイン、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン
等の蛋白分解酵素で分解すると抗原結合部位を１一つも
ついわゆるＦａｂフラグメントが得られ、またペプシン
分解、トリプシン分解を特定の条件で行えば抗原結合部
位を２つもついわゆるＦ　（ａ　ｂ’）２フラグメント
が得られる。

免疫グロブリンをジチオスレイトール、メルカプトエタ
ール等で還元処理するとメルカプト基を有する一量体が
得られる。Ｆ　（ａ　ｂ’）２　を同様に還元処理する
とメルカプト基を有するＦａｂ’を得ることができる。

ポリザクシンイミド誘導体〔Ｉ）と生理活性蛋白質との
結合は、例えば以下に述べるような公知のいずれの方法
でも良い。

第一の方法はメルカプト基を有する生理活性蛋白質（た
とえば免疫グロブリンもしくはそのフラグメントである
Ｆ　（ａ　ｂ’）ｚ　をジチオスレイトール、メルカプ
トエタノール等で還元処理したー量体又はＦａｂ’）の
メルカプト基を利用するか、または生理活性蛋白質のア
ミノ基に架橋基を介してメルカプト基を導入し、導入さ
れたメルカプト基を利用して、ポリサクシンイミド誘導
体〔Ｉ）においてｚ−２′である反応性重合体と反応せ
しめる方法である。

生理活性蛋白のアミノ基に、架橋基を介してメルカプト
基を導入する際の架橋剤としてすでに多くの架橋剤が知
られている。本発明で用いる架橋剤は、そのような公知
の架橋剤のいずれでもよいが、例えば一般式〔■１〕 Ｈ Ｈ５”ｚ−ＣＱｌ　　　　　（Ｉ［ａ］（ここで、Ｌ□
は２価の有機基、Ｑ工はイミドエステルのアルコール残
基をあらオ）す）であられされる化合物まんはその塩（
例えばＨＣｌ塩、ＨＢｒ塩など）を用いることができる
。

上記二股式〔■３〕において、Ｌよで示される有機基と
しては、例え、ばエチレン、トリメチレンなどの炭素数
２〜６の直鎖状または分枝鎖状のアルキレン基を；Ｑユ
　で示されるアルコール残基としては、例えばメトキシ
、エトキシなどの炭素数１〜３のアルコキシ基を例示す
ることができる。より具体的には、上記架橋剤〔■１〕
　　として、例えばメチル−３−メルカプトプロピルＮ
ＨφＨＣ１！ イ５７’−）　（Ｈ５（Ｉ（２−ＣＨ，Ｃ０ＣＪ（３）
、メチル−４−メルカプトブチルイミデート れる。

Ｎ−アセチルホモシスティンチオラクトンともできる。

さらに、一般式［ＩＩｂ） Ｚ’　Ｓ−５−ＬニーＣ−Ｑ２〔Ｉ［ｂ］〔式中、Ｚ′
　　およびり、は前記のとおりである。Ｑ２は活性エス
テルのアルコール残基をあられす。〕 であられされる化合物、一般式［１［［、］％式％） 〔式中、Ｚ’、Ｌ工およびＱ、は前記のとおりである。

〕 であられされる化合物またはその塩（例えばＨ〔Ｉ！塩
、ＨＢｒ塩など）、一般式（Ｉ［ｄ）一←５−Ｌｌ−Ｃ
−Ｑ□）２［：］ｎａ）〔式中、Ｌ、およびＱ□は前記
のとおりである。〕 であられされる化合物またはその塩（例えばＨＣｌ塩、
ＨＢｒ塩など）、一般式Ｃｍｅ）”’−５−Ｌｌ−ＣＱ
２）、ｌ　　　（ＩＩ［ｅ）〔式中、Ｌ、およびＱ２は
前記のとおりである。〕 であられされる化合物またはその塩（例えばＨ〔Ｉ！塩
、ＨＢｒ塩など）、およびＳ−アセチルメルカプトコハ
ク酸無水物 などを架橋剤として用いることができる。この場合には
、生理活性蛋白のアミノ基と架橋剤とを反応せしめ、次
いでジチオスレイトール、メルカプトエタノールのよう
な還元剤を用いて還元するか又はアルカリで処理するこ
とにより、生理活性蛋白に架橋基を介してメルカプト基
を導入することができる。　　　− 上記一般式（Ｉｌｒｂ）であられされる架橋剤としては
、例えばＮ−ザクシンイミジル−３−（２−ピリジルチ
オ）プロピオネ−ト リ などを；一般式（Ｉｌｌｃ　）であられされる架橋剤と
しては、例えば３−（４’−ジチオピリジル）メルカプ
トプロピオイミデート 一般式（ｍｄ）であられされる架橋剤としては、例えば
ジメチル−３，３′−ジチオビスプロピオ洲、Ｈ〔Ｉ！ ンイミデート　〔÷Ｓ　ＣＨ２ＣＨ，Ｃ０ＣＲ３）、　
）などを一般式［１［［ｅ〕であられされる架橋剤とし
ては例えばジチオビス（ザクシンイミジルプロジザクシ
ンイミジル（Ｎ、Ｎ’−ジ／アセチルホなどを例示する
ことができる。

第２の方法は、まずメルカプト基を有する生理活性蛋白
のメルカプト基に２′基を導入してｓｚ’　基とするか
、または生理活性蛋白のアミノ基に架橋基を介して−Ｓ
Ｚ′基を導入し、次いでこの一ＳＺ′基を２＝水素原子
であるポリザクシンイミド（１）と反応せしめる方法で
ある。

生理活性蛋白に−ｓｚ’基を導入する方法は、メルカプ
ト基を有する生理活性蛋白を活性ジスルフィド化合物と
反応せしめるか、またはアミノ基に架橋基を介してメル
カプト基を導入した生理活性蛋白（前記第１の方法参照
）を活性ジスルフィド化合物と反応せしめる方法と；生
理活性蛋白のアミノ基に、前記一般式（Ｉｂ）または〔
Ｉ［ｃ　）で表わされるような架橋剤を反応せしめるこ
とにより、架橋基を介して直接−８ｚ′基を導入する方
法がある。

第３の方法は、メルカプト基を有する生理活性蛋白のメ
ルカプト基を利用するか、または生理活性蛋白のアミノ
基に架橋基を介してメルカプト基を導入し、このメルカ
プト基を利用して、該生理活性蛋白またはメルカプト基
を導入した生理活性蛋白と２−水素原子であるポリザク
シンイミド誘導体〔！〕とを、架橋剤で結合せしめる方
法である。架橋剤としては、メルカプト基と反応し得る
二官能性架橋剤を用いる。

この目的のために好適なメルカプト基と反応し得る二官
能性架橋剤としては例えば一般式（ＩＶ）で表わされる
シマレイミド化合物、又はベンゾキノンなどを挙げるこ
とができる。

［Ｌ、は２価の有機基を表わす。］ ＬＩＡ　であられされる２−価の有機基としては、例え
ばフェニレン基、アゾベンゼンジイル基、および例えば
一般式−（（Ｉ（、）、　−０（ＣＨ２）ａ−λ　　　
　　　　　　　２ 〔式中、為よ　および１２は１〜３の整数をあられす。

〕 であられされる酸素原子を介するアルキレン基などが挙
げられる。

さらに具体的なシマレイミド化合物の例としては、Ｎ、
Ｎ’−（１，２−フェニレン）ジマレーフェニレン）シ
マレイミド イルアミノ）アゾベンゼン ビス（Ｎ−マレイミドメチル）エーテルなどを例示する
ことができる。

水弟３の方法により生理活性蛋白とザクシンイミド誘導
体〔Ｉ）とを結合するには、■メルカプト基を有する生
理活性蛋白またはメルカプト基を導入した生理活性蛋白
　■Ｚ−水素原子であるポリザクシンイミド誘導体（Ｉ
’）の一方を、それが有するメルカプト基に対して過剰
の架橋剤と反応させた後、他方と反応せしめろ。

第４の方法は、生理活性蛋白のアミノ基を利用して、メ
ルカプト基と反応し得る官能基を架橋基を介して生理活
性蛋白に導入し、次いでＺ−水素原子であるポリザクシ
ンイミド誘導体〔Ｉ〕と反応せしめる方法である。

メルカプト基と反応し得る官能基としては、例えば式 で表わされるマレイミド基、一般式 ＣＨＬ 〔式中、Ｌはハロゲン原子である。〕 で表わされるハロゲン化メチル基などを挙げることがで
きる。上記ハロゲン原子としては、例えば塩素、臭素、
ヨウ素原子などをあげることができるが、ヨウ素原子が
好ましい。

生理活性蛋白のアミノ基ξζ、架橋基を介して官能基を
導入する架橋剤はすでに知られているが、それらの中で
好ましい架橋剤としては、例えば一般式（ＶＪ 〔式中、Ｌ３は２価の有機基であり、Ｑ２　は前記のと
おりである。〕 であられされる化合物をあげることができる。

こξで、２価の有機基としては、例えばフェニレン基、
一般式 ％式％ 〔式中、Ａはフェニレン基または炭素数５〜７のシクロ
アルカンジイルを、ｂは１〜３の整数をあられす。〕 であられされる基、炭素数２〜６のアルキレン基などが
挙げられる。

上記一般式（Ｖ）で表わされる架橋剤の具体的な例とし
ては、例えばｍ−マレイミドベンゾイックアシッドのＮ
−ハイドロキシザクシンイミドエステル ボキシシクロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−へイド
ロキシザクシンイミドエステルカルボキシフェニルメチ
ル）マレイミドのＮ−ハイドロキシサクシンイミドエス
テル マレイミドカブロキシ）サクシンイミドエステンイミド
エステル 上記第１．２．３および４の方法において、生理活性蛋
白のアミノ基と架橋剤との反応は、次のようにして実施
することができる。

生理活性蛋白を濃度が０．５〜１００η／ｒｎｌ（好ま
しくは１〜２０■／−）になるように溶解し調整したＰ
Ｈ５〜９の緩衝液に、生理活性蛋白１モルに対して架橋
剤を１〜１００モル加えて、０〜５０℃で攪拌しながら
反応させる。

反応時間は反応スケール、反応条件にもよるが、通常は
２日以内である。架橋剤は水溶液として用いるか、また
は架橋剤が水に溶けない場合には少量の有機溶媒（例え
ばＤＭＦ、ＤＭＳｏ。

１．２−ジメトキシエタン、１，４−ジオキサン、メタ
ノール、エタノール、アセトン等）に溶かした溶液とし
て用いる。

反応終了後は、透析またはゲル沖過などの通常の手段に
より低分子物質を除去し精製することができる。

前記第３の方法におけるメルカプト基を有するか、また
は導入された生理活性蛋白とチオール型ボリザクシンイ
ミド誘導体とを、二官能性架橋剤を用いて結合する反応
も上記と同様にして行うことができる。

前記の第１〜４の方法において、細胞毒性物質と生理活
性蛋白複合体を得る最後の反応は、生理活性蛋白もしく
は架橋基を介してメルカプト基を導入した生理活性蛋白
またはそれらの修飾体（以下、これらを総称して反応性
生理活性蛋白という。）と、前記ポリザクシンイミド誘
導体〔Ｉ）とを、前記第１〜４の方法で説明したように
適当な組合せで次のようにして反応せしめる。

反応性生理活性蛋白をｐＨ５〜９の緩衝液に、その濃度
が０．５〜１００　’ｆ／ｍ／　（好ましくは１〜２０
〜／−）になるように溶解し調整した溶液と、該反応性
生理活性蛋白と結合させるべきポリザクシンイミド誘導
体〔Ｉ）の水溶液または上記と同一の緩衝液溶液を混合
し、０〜５０℃で放置するかまたはゆるやかに攪拌する
ことによって反応せしめる。ポリザクシンイミド誘導体
（１）は、生理活性蛋白１モルに対して、０．１〜７０
モル用いる。反応時間は、通常は３日以内である。

反応混合物からの目的とする複合体の分離、精製は、ゲ
ル沖過、アフィニティークロマトグラフィー、透析、、
沈澱などの一般的手法を用いてＬ−アスパラギン酸６６
．５Ｆに８５％リン酸２０．６−を加えロータリーエバ
ポレーターで１９０℃に加熱しつつ、５．５時間１０ｍ
Ｈｔｔの減圧上重合を行なった。　　　　　　　　　　
　　　；重合後ＤＭＦＩこ溶解して水にて再沈を行なっ
た。再沈後ガラスフィルターで沖過し８０℃にて３日間
真空乾燥を行なうことによりポリザクシンイミドを得た
。

得られた重合体をＫＢｒ錠剤法にて赤外吸収の測定を行
なったところ１８００　、１７２０　。

１６６０　ａｓ　　にザクシンイミド基特有の吸収が認
められた。

分子量測定はＧＰＣ測定により行なった。

ＤＭＦ用ＧＰＣカラＡ（ＡＤ−８０Ｍ／Ｓ−昭和電工）
を用い、得られたポリザクシンイミドをＤＭＦ　＋０．
Ｑ　１ＭＩ４　Ｂｒ溶媒に０．２チの濃度になる様溶解
し、該溶液２５０μｌを注入し同一溶媒を溶出溶媒とし
て示差屈折針で測定を行なった。介種分子量のポリエチ
レングリコールを用いて検量線を作成した。得られたポ
リザクシンイミドはポリエチレングリコール換算で重量
平均分子量８゜９Ｘ１０’、数平均分子量１゜５Ｘ１０
’であった。

参考例２ 参考例１で得られたポリザクシンイミド１．５６１１（
ザクシンイミド基１５　ｍｍｏｌに相当）を９０−のＤ
ＭＦに溶解した。

この溶液にシステアミン３４．７■（０，４５ｍｍｏｌ
　）、エタノールアミン６５３１”Ｐ　（１０，７ｍｍ
ｏｌ　）をＤＭＦ　Ｉ　Ｑ−に混合した溶液を加えて、
４℃２４時間反応を行なった。反応後反応液に１ＮＮａ
ＯＨ溶液約５０−を攪拌下１時間にわたって滴下した。

この後ｐＨ４の水溶液で透析を行なった。ダイヤフロー
メンブラン■（アミコン社製分子量１万カツト）でＸ４
０ａａのカラムでゲルｒ過を行ない低分子成分を除去し
た。凍結乾燥を行ない、一般式（ＩＩ［）で２−水素原
子である中間体を得た。

中間体中のチオール基の定量を後に記す参考例４で示す
方法で測定したところ、中間体１・ｆ中に１゜５Ｘ１０
’モルのチオール基が存在していた。カルボキシル基の
定量は常法に従い酸−塩基滴定法番こより行なった。こ
の結果中間体ｌｆ中に２゜８Ｘ１０−８モルのカルボキ
シル基が存在していた。ＩＲ及び１３　Ｃ−ＮＭＲの測
定から未反応のザクシンイミド基は認められなかった。

上記測定結果よりザクシンイミド基１モルあたりのシス
テアミンの導入量（Ｘモル）、力。

ルボキシル基の導入量（７モル）を下記の連立方程式か
ら求めた。

ここでａ、ｂ、ｃ、ｔ、ｓは下記の如くである。

ザクシンイミド基がエタノールアミンと反応したモノマ
ーユニットの分子１ｔａ−１５８サクシンイミド基がシ
ステアミンと反応したモノマーユニットの分子ｉｔ　　
ｂ＝１７４サクシンイミド基が加水分解されたモノマー
ユニットの分子量　Ｃ＝　１１５ 中１１ｔ１体（ＩＩＩ３１　ｆ中のシステアミンの導入
量を冨１．４２Ｘ１０　　モル 中間体（ｎＩ）　１　ｆ／中のカルボキシル基の導入量
Ｓ冨２゜８Ｘ１０　モル 計算の結果Ｘ　−０，０２モル、ｙＰ＝ｏ、ａモルであ
った。

分子量は末端のアミンの測定により行なった。上記中間
体５ｗｖを０゜ＩＭホウ酸ナナトリウム溶液１に溶解し
、次に２．４．６−）リニトロベンゼンスルホン酸（Ｐ
ｔ下ＴＮＢＳ　と略す）３２■を１０−の０゜ＩＭホウ
酸ナナトリウム溶液溶解した溶液０．１　ｍＺを加え、
２５℃で４５分反応を行なった後、さらに０゜１Ｍホウ
酸ナナトリウム溶液１．９−加え４２００ｍの吸収の測
定を行なった。既知量のアスパラギン酸を用いた検量線
より、分子吸光係数１１．１００の値が得られ、この分
子吸光係数を用いて末端アミンの値を算出した。この結
果中間体ｌｆ中に５Ｘ１０’モルのアミノ基が存在して
いた。この結果より平均分子量は約２０．０００となる
。

”ｔ７の値から平均モノマーユニットの分子量は１４５
．４となり、分子量より重合度ｎ′十ｍ＋／’＋　ｒ’
＋　Ｐ’＋（１’（７）平均値ハ１３８゜”ｅＶよりｎ
’　−１−ｍ’の平均値は４１．ｒ’＋ｒ’の平均値は
９４．Ｐ＋９’の平均値は３となる。

参考例３ 参考例２で得られた中間体２０■を５−の水に溶解し、
これに１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩６８１１ｖを加え、Ｉ　Ｎ　ＨＣ／
　テｐＨ５，０に調整した。この液にダウノマイシン塩
酸塩２０ηを３１ｎｌの水に溶解したものを滴下する。

１時間室温で反応を行なった後ｌＮＮａＯＨでｐＨ９゜
５に調整した。その後０゜１５ＮＮａｃＩ！水溶液で平
衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ−２５スーパーフ；イン
（ファルマシャ社製）　３．９　ａａｇ　Ｘ７゜０ａ１
１のカラムでゲル沖過を行ない低分子成分を除去した後
８％ＮａＣｌ！水溶液で透析、を行ない透析後エタノー
ルアミン塩酸塩１００Ｆ。

１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩２００■を加えてｌＮＨＣｌ！でｐＨ
５，０とし１時間室温で反応を行なった。その後０．β
％ＮａＣｌ！水溶液で透析を行なった後凍結乾燥を行な
った。

収量１８η 得られたポリザクシンイミド誘導体中のダウノマイシン
の導入量は七〒忰Ｑ、Ｉ　Ｍリン酸ナトリウム−〇。１
５Ｍ食塩緩衝液ＣＰ１１７．４）の溶液中の４８５　ｎ
ｍの吸収より求めた。ポリサクシソイミド誘導体１ｇ中
に４９Ｘ１０　　’モルのダウノマイシンが導入されて
いた。

チオール基の定量は次に記す参考例４の方法で行なった
。ポリサクシンイミド誘導体ｌｆ中に９．８Ｘ１０〜５
モルのチオール基があった。

ｉＲ及び　Ｃ−ＮＭＲより未反応のカルボキシル基は検
出されなかった。

上記の結果、ザクシンイミド基１モルあたりのチオール
基は０００２モル、ダウノマイシンは０．１モル結合し
ている。

末端アミノ基の定量は参考例２と同様の方法で行なった
。ポリサクシンイミド誘導体ｌｆ中に３゜５３Ｘ１０’
　　モルのアミノ基が存在し、平均分子量は２８，００
０となる。

これらの値より、重合度ｎ＋ｍ＋／＋ｒ＋ｐ＋ｑの平均
値１３Ｂ、ｎ十ｍＯ）平均値１４゜／＋ｒの平均値１２
１．ｐ十ｑの平均値３である、Ｘ−ダウノマイシン、２
−水素原子であるポリサクシンイミド誘゛導体〔Ｉ）が
得られたことがわかった。

参考例４ 本実施例はチオール型の中間体（１）（Ｚ＝水素原子）
を、ｚ　、　ｚ’の中間体〔Ｉ〕にする方法を示すと共
１こ、千オ〜ル型中間体〔Ｉ〕中のチオール基の定量方
法をも示すものである。

参考例２で得られた中間体（ＩＩＩ）　２　Ｑ　１１９
を３−の０．１Ｍリン酸ナトリウム−１ｍＭ　ＥＤＴＡ
（ＰＨ７，０）　　の緩衝液に溶解し、ジチオスレイト
ール１０ｗ９を加えて３０℃１時間還元反応を行なった
。反応後前記緩衝液で平衡化した５ｅｐｈ＊ｄｅｘ■Ｇ
−２’５７．−パー７、イ、ン（フフルマシャ社製）　
２．０ａｎＸＸ　１５ｃｍ　テゲル濾過し、低分子成分
を除去した後回−緩衝液で２０倍に希釈した。この反応
液５００　ｕｌに５　ｍＭ　４−ピリジルジスルフィド
のメタノール溶液２０ｔｔｌを加え３０　℃１５分間反
応させ、この反応液と０．１　Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７゜
０テ平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ−２５スーパーフ
アイン（フフルマシャ社製）　２．０　ａｌＯＸｌ、５
〔ＩＩでゲル済遇し高分子成分と低分子成分にわけた。

低分子成分中化合まれる４−チオピリドンを３２４　ｎ
ｍで測定した。４−チオピリドンの分子吸光係数１．９
８　Ｘ　１０’　　を用いて中間体〔Ｉ〕　（Ｚ−水素
原子）のチオール基量を計算したところ中間体ｌｆ中に
１゜４×１０　　モルのチオール基が存在していた。

参考例５ 参考例１で得られたポリザクシンイミド８６■（ザクシ
ンイミド基０．８９　ｍｍｏｔ−当）を２−のＤＭＦに
溶解した。

仁の液番ζダウノマイシン塩酸塩２０ｖ９（３５μｍｏ
ｌ　）を加えたのちトリエチルアミン１２μＩ！（８６
μｍｏｌ）を加えて室温で１ｏ日間反応させた。その後
システアミン６゜７岬、エタノールアミン０．１３ｖ　
ＤＭＦ　１−を混合した溶液を加え４℃で４時間反応さ
せた。

この反応溶液を水番こ対して２日間透析後孔径０．４５
μｍの膜（ミリポアフィルタ−）で不溶化部分を除去し
ｒ液を５ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ−２５スーパーフアイン（
）１ルマシャ社１ｌ）２．６〔ＩＩＪ２’Ｘ４０３のカ
ラムで、溶出液として蒸留水を用いてゲル濾過し低分子
成分を除去した。

この後凍゛結乾燥を行いポリザクシンイミド誘導体を得
た。　収量４０１ＩＰ０ ＩＲ，１３ｃｍＮＭＲの測定より未反応ザクシンイミド
基は検出されなかった。

得られたポリザクシンイミド誘導体中のザクシンイミド
基１ｍｏｌあたりのダウノマイシンの導入量は参考例３
と同様の方法で求めた。

ポリサクシンイミド誘導体ｌｆ中に１．２×　・１０−
４モルのダウノマイシンが結合していた。

結合したシステアミンの量は参考例４の方法で行なった
。ポリサクシンイミド誘導体ｌｆ中に２．５Ｘ１０’モ
ルのシステアミンが存在していた。

ＩＲ及び　ＣＮＭＲの測定から未反応ザクシンイミド基
は検出されなかった。

上記の値よりサクシンイミド基１モル馨こダウノマイシ
ンが０．０２　モル、システアミンが０．００５モル結
合している。

参考例２と同様の方法で末端アミノ基の定量を行なった
ところポリザクシンイミド誘導体１ｆ中に１゜２５Ｘ１
０″　モルのアミノ基が存在していた。平均分子量はｓ
ｏ、ｏｏｏとなる。

以上の結果より重合度ｎ十ｍ＋／＋ｒ十ｐ＋９の平均値
は４７８となり、ｎ十ｍの平均値は１０、／＋ｒの平均
値は４６６、ｐ十ｑの平均値が２である、Ｘ社ダウノマ
イシン、ＺＩ＝水素原子であるポリザクシンイミド誘導
体〔Ｉ〕が得られたことがわかった。

参考例６　免疫グロブリンの製法 ヒト　トランスフェリン・芯セブターに対するモノクロ
ーナル抗体の製法は 計ｇｇ ’Ｏｍａｒｙ６Ｍ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒ
ｅ　２８６４ｊ−Ｍｌ　１９８０゜に記載されている。

ヒト慢性骨髄性白血病患者から得られたに５６２株で免
疫したＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの肺臓リンパ球と免疫グロ
ブリン非産生骨髄腫細胞であ；４５１９４１５ＸＸＯ，
ＢＵ、１株とを常法に従って細胞融合し、トランスフェ
リンリセブターに対する抗体を産生ずる融合細胞を選択
した。

上記融合細胞をブリスタンを前投与したＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスに注射し約２週間後に腹水を採集した。

腹水より免疫グロブリンを精製した。腹水を５０％飽和
硫安水溶液番ごて沈澱させリン酸ナトリウム緩衝液に溶
解し透析後ＤＥＡＥ−イオン交換カラムを用いてＩｇＧ
　　分画を得て更にアミコン膜（アミコンａ［−ＰＭ−
３）で濃縮して５η／−の蛋白濃度の液を得た。

実施例１ フィブリノーゲンーミドリ（ミドリ十字より購入）１０
５５”Ｐ（フィブリノーゲン量３３０ｗｆ）を蒸留水１
０ｍＨｍ加え、室温で３０分間攪拌し溶解した。この液
にジメチル−３−３′−ジチオビスプロピオンイミデー
ト（ピアス社より購入）　１２１１１９とジチオスレイ
トール６０１１９を６艷の蒸留水に溶解し２３℃４０分
反応せしめた。０゜ＯＩＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）ｐＨ８，０で平衡化した ５ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ−２’５スーパー７）ｐイン、（
７ｙルマシャ社製）の２゜６ａｌＯＸ４０ｃｍのカラム
を用いてゲル濾過を行ない低分子成分を除去した。この
分取液に参考例３で得られたチオール型反応性重合体に
参考例４と同様の方法を施して得られた活性ジスルフィ
ド基を有する反応性重合体３２■を加え４℃１８時間反
応を行なった。反応後回−緩衝液で平衡化した５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ■ＣＬ　−６−３−（ファルマシャ社製）の
２．６　ｃｓＸ　Ｘ　１（ｊＯａｍのカラムでゲル濾過
を行ないフィブリノーゲン分画を分取した。

蛋白回収率２０チ。

得られた複合体においてフィブリノーゲンの凝固能が変
化していない事を確認するため「Ａ 套ｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｇ−−ジ
２　　（１９５１）３１７−３２４に記載されている方
法で凝固能を」 測定した。複合体中のフィブリノーゲン０．５６岬／−
になる様に水溶液を調整し、この溶液４．５４にスロン
ビ７　（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）　　、５　Ｑ　ｕｎｉｔ／
−の同一緩衝液を０．５４加えて室温に１時間放置後生
じたクロット（ＣＬｅｔ　）を除去して２８０　ａｍの
吸光の測定より残液のフィブリノーゲン濃度を測定しフ
ィブリノーゲンの凝固率を計算した。凝固率は８５％で
あった。

なお用いたフィブリノーゲンの凝固率は８６’％であり
複合体になってもフィブリノーゲンの凝固能が低下して
いない事が確認された。　　２８０　ｎｍの吸収及び４
８５　ｎｍ　　の吸収よりフィブリノーゲン１−分子あ
たり結合したダウノマイシンの数を計算したところフィ
ブリノーゲン１分子に４０個のダウノマイシンが結合し
ていた。

ｉ４例６で得られπ児役クロフリン３１テで平衡化した
５ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ−２５（７，ルマシャ社製）カラ
ムにかけて緩衝液の交換を行ないアミコン膜（アミコン
社製−ＰＭ−ＩＱ）で５ｖＶ／−に１ｎ縮した液６−に
Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）マレイミ
ドのＮ−ハイドロキレサクシンイミドエステルメ ４　Ｑ　ｍＭのジオキサン溶液３０−を加えて３０℃１
時間反応を行なった。反応後間−緩衝液を用イテ８ｅｐ
ｈａｄｅｘ■ｃ　−２５２−パーファイン（）１ルマシ
ャ社製）の２．Ｏｃｒｎｌｆ　Ｘ２０αのカラムでゲル
を過を行ない低分子成分を除去した。

参考例３で得られた反応性重合体３０■を緩衝液Ａ３−
に溶解し、この溶液にジチオスレイトール１３キを加え
て３０℃２時間反応後、上記と同様の方法でゲル濾過を
行ない低分子成分を除去した。

両者のゲル濾過後の分取液を混合して４℃１８時間放置
し、反応した。未反応の反応性重合体を除去する目的で
反応液をＰｒｏｔｅｉｎ八〇（ファルへシャ社製）３０
−を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，２０）で平衡化し
たカラムにかけ、非吸着成分を平衡化緩衝液で十分除去
した後０゜１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ５，８）で
Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ［Ｆ］カラム吸着成分を溶出した。

溶出液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ８，０＞ＩＩ！に
対して透析を行なった。透析、後、透析１液をアミコン
膜（アミコン社製　ＰＭ−１０）で濃縮を行ない蛋白濃
度１．１３”Ｆ／−の液６−を得た。得られた複合体の
２８０　ｎｍの吸収と４８５ｎｍの吸収より免疫グロブ
リン１分子あたりに結合しているダウノマイシンの数を
計算したところ免疫グロブリン１分子に４０個のダウノ
マイシンが結合していた。

複合体の免疫グロブリンが抗体としての抗原との結合能
を保持している事を確認するた免役グロブリンにクロラ
ミン寸法によりヨード標識を行なった。

プラスチックチューブに０゜５Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ７，５（以下緩衝液Ｂとする。）を５μｌ、Ｎａ
１２６ＩをＱ、３ｍＣ１を入れて攪拌し次いで２００μ
ｆ／ｍｌのクロラミン−Ｔの緩衝液Ｂ溶液２０μｌを加
えて２０秒攪拌後０．５キ／−の免疫グロブリンの緩衝
液Ｂ溶液２０μｌを加えて１５秒攪拌下反応を行なった
。

反応後１４ｐｆｌ／ｍｌのＮａ２Ｓ２０．　（Ｆ）緩衝
液Ｂ溶液４００μｌ、２０η／−のＫｌ　　の緩衝液Ｂ
溶液２５μｌ、５チＢＳＡの緩衝液Ｂ溶液２５μｌを加
えた。この後５ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ−２５（７）カラム
で緩衝液Ｂを溶出液としてゲル濾過を行ない蛋白溶出分
を分取して低分子を除去した。

かくして得られた１２６１−標識免疫グロブリンの比放
射能を求めるため、２８０ｎｍの吸光から蛋白濃度を求
め総放射能の測定を行なった結果から４．３ｍＣ１／■
の比放射能であった。上記１２６エー標識免疫グロブリ
ンの放射能量２Ｘ１０５ｃｐｍ　となる量をｉ、ｎｔの
１′０％ＦＣ８−ＲＰＭ÷−１６４０　メディウム（半
井化学より購入）に加え、この溶液０．１艷に上記複合
体を１．０〜０．１’ｆ／−となるように溶解ラム溶液
０．４−を加え、この液にヒトトランスフェリンリセブ
ターを有する事が知られているＣＣＲＦ−Ｃ１Ｍ細胞（
Ｄｉ　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／−の１０チＦＣ５−Ｒ
ＰＭ＋−１５４Ｑメディウム溶液０．５−を加え４℃１
時間インキュベーションを行なった。この後２．００Ｏ
ｒｐｍで５分間遠心分離を行ない上清をすて沈渣をＱ　
、５　％　　Ｂ　Ｓ　Ａ　−Ｈａｎｋ’ｓ緩衝液を加え
た後２．０００　ｒＰｍで５分間遠心分離を行なって上
溝をすて沈渣の放射能を測定した。

比較の、ため複合体の代りに免疫グロブリンを同一濃度
となるように加えて実験を行なったところ、複合体と免
疫グロブリンのＣＣＲＭ−ＣＥＭ細胞１こ対する１２６
■−標識免疫グロブリンの結合を阻害する効果は同じで
あり、複合体の免疫グロブリンがもとの免疫グロブリン
と同じ結合能力を有している事が示された。

実施例３ ２゛ 参考例６で得られた免疫グロブリンを実施例２と同様１
ｍＭＥＤＴＡを含む０゜ＩＭリン酸ＭＮ液（Ｍ街液Ａ）
に交換し５５１ｎｙ／′−とした液６ｒｎｌに２Ｑ　ｍ
ＭＮ−ザクシンイミジルー３−（２−ピリジルチオ）プ
ロピオネートのエタノール溶液３０μｌを加えて２３℃
３０分間インキュベートした。反応後反応停止剤として
グリシン５キおよび還元剤ジチオスレイトール５■を加
えて２３℃３０分間インキュベートした。その後緩衝液
Ａで平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ　＠ｃ、　−２５（７
７／ｌ／　ｖ　シャ社製）の２゜０〔ＩＯＸ２０口のカ
ラムでゲル濾過を行ない低分子成分を除去して蛋白質画
分７−を分取した。この分取液に参考例３で得られたチ
オール型反応性重合体に参考例４と同様の方法を施して
得られた活性ジスルフィド結合を有する反応性重合体１
０〜を加え、４℃で１８時間インキエベートした。その
後未反応の反応性重合体を除去する目的で実施例２と同
様Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ■カラムで分離後濃縮を行ない蛋
白濃度１．１２　”？／−の成約６４を得た。

得られた複合体の２８００ｍの吸収と４８５　ｎｍの吸
収より免疫グロブリン１分子あたりに結合しているダウ
ノマイシンの数を計算したところ免疫グロブリン１分子
に４０個のダウノマイシンが結合していた。

複合体中の免疫グロブリンが抗体としての抗原との結合
能を保持しているかどうかの確認は実施例２と同様１２
６１−標識免疫グロブリンの抗原との結合の阻害能力を
もとの免疫グロブリンと比較する方法で行なったところ
結合能が低下していない事が確認された。

実施例４ 免疫グロブリン１．２ｆを０゜１Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４
，５）４０−に溶解し、２４■のペプシンを添加して３
７℃で約１８時間分解した後、分解生成物を生理食塩水
中で５ｅｐｈａｄｅｘ■ｃ−２００（フフルマシャ社製
）の３゜５３ｙ×１４０個のカラムにかけて、分子量約
１０万のところに流出する蛋白を取り出し、Ｆ　（ａ　
ｂ’）ａを得た。

Ｆ　（ａｂ’）２１０　ｍｙを含むｌ　Ｑ　ｍＭリン酸
Ｍ街荷液ｐＨ６，５）　１．１４１ｎｌ　にＮ−ヒドロ
キシザクシンイミジル−ｍ−マレイミド安息香酸０．４
２岬を含むＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド０．０５−を
添加し、室温で４０分反応させた。反応後は０．１４　
Ｍ塩化ナトリウム、ｌ　ｍ　Ｍ　−ＥＤＴＡを含む５ｍ
Ｍ酢酸Ｒ衝液ＰＨ５，５に透析して過剰の試薬を除きｍ
−マレイミドベンゾイルＦ　（ａ　ｂ’）２を得た。

参考例３で得られた反応性重合体４１■を０゜１Ｍリン
酸ナトリウム−１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液（ＰＨ７，０）３
−に溶解し、この溶液にジチオスレイトール１３キを加
えて３０℃２時間反応後０．１４Ｍ塩化ナトリウムおよ
び１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む５ｍＭ酢酸緩衝液ｐＩ（５，
５で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ２５　スーハーフ
ァイン（ファルマシャ社製）の２．０ｃｍ０Ｘ１３、．
５ｃｍのカラムでゲル濾過を行ない低分子成分を除去し
た。

ｍ−マレイミドベンゾイルＦ　（ａｂ’）　２３０■相
当のＭ荷液と反応性重合体１５η相当の緩衝液を混合し
更に０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）　０．３　ｒ
ｎｌを加え４℃で１６時間反応した。

反応後生理食塩水で　５ｅｐｈａｄｅｘ＠　Ｇ　−２０
０（）１ルマシャ社製）の３．５　ｃｍ　ｇ　Ｘ　１４
０　ｃｍのカラムを用いて分子量１０〜１５万の分画を
分取した。

得られた複合体の２８０　ｎｍの吸収と４８５　ｎｍの
吸収よりＦ　（ａ　ｂ’）２１分子あたりに結合したダ
ウノマイシンの数を計算したところＦ　（ａ　ｂ’）２
１分子中に４０個のダウノマイシンが結合していた。複
合体中のＦ　（ａ　ｂ’）２が抗原との結合能を保持し
ているかどうかの確認は比較としてＦ　（ａ　ｂ’）２
　を用いて実施例２と同様１２５　ｌ−標識免疫グロブ
リンが抗原と結合するのを阻害する能力をもとのＦ（ａ
ｂ’）２　と比較する方法で行なったところ（Ｆａｂ’
）２は複合体となっても結合能が低下していない事が確
認された。

実施例５ 実施例４と同様にして免疫グロブリンをペフシンテ分解
Ｌ／　１”　（Ｆ　ａｂ’）２　ヲ得た。Ｆ（ａｂ’）
２４０岬を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム−１ｍＭＥＤ
ＴＡ（ｐＨ６，０）緩衝液（以下緩衝液Ｃとする。）８
．４８８！、　　０．１Ｍ２−１ルカプトエチルアミン
の緩衝液Ｃ溶液を１　ｇｌ加えて８７℃で９０分間還元
した。反応後、その溶液を緩衝液Ｃで平衡化した８ｅｐ
ｈａｄｅｘ■Ｇ−２５（７アルマシヤ社製）のゲル濾過
により低分子量を除去した。蛋白分画を分取後、Ｎ、Ｎ
’−Ｑ−フェニレンジマレイミドの０．１Ｍ６Ｍ−１ｍ
　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔム緩衝液ｐＨ５，０に対する飽和溶液
２５、７　ｇｌを加え攪拌下８０　’０２０分間反応し
た。反応後０．０２Ｍ酢酸緩衝液ＰＨ５，０で平衡化し
た８ｓｐｈａｄｅｘ■Ｇ−２５で低分子成分を除去し、
その後濃縮を行ない、マレイミド基が導入されたＦａｂ
’　２．５１Ｆ／ｓｌの濃度の溶液を得参考例５で得ら
れた反応性重合体４１ηを０、１　Ｍリン酸ナトリウム
−１ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ人緩衝液（ｐｕｙ、ｏ　）　８
　ｍｌに溶解し、この溶液にジチオスレイトール１８ｐ
Ｉを加えて８０°Ｃ２時間反応後０．１４　Ｍ塩化ナト
リウム−１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む５ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ
５，５テ平衡化した８ｅｐｈａｄｅｘ■Ｇ−２５スーパ
ーフアインでゲル濾過を行ない低分子成分を除去した。

　′マレイミド基を導入したＦａｂ’１５ｑ相当の緩衝
液と反応性重合体１５ダ相当の緩衝液を混合し、更に０
．５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，５）０６８耐を加え４℃
で１６時間反応した。反応後生理食塩水テ８ｅｐｈａｄ
ｅｘ■Ｇ−２００（）１ルマシャ社ｇｓ）の８．５　ａ
ｎφＸ１４０ａｎのカラムを用いて球状蛋白質の２０万
以上に相当する両分を分取した。

得られた複合体の４８５ｎｍの吸収と２８０ｎｍの吸収
よりＦａｂ’　１分子あたりの結合ダウノマイシン量を
計算したとどろＦａｂ’１分子あたり１０個のダウノマ
イシンが結合していた。

Ｆａｂ’の抗原との結合性を確認するため実施例２と同
様　ニー標識免疫グロブリンの抗原への結合阻害能力を
測定したところ明らかに結合阻害能力が認められた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の一般式〔１〕〜〔６〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔１〕▲数式、化学
   式、表等があります▼〔２〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔３〕▲数式、化学
   式、表等があります▼〔４〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔５〕▲数式、化学
   式、表等があります▼〔６〕 〔上記式〔１〕〜〔６〕において、Ｘ、Ｙ、ＷおよびＺ
   は各々次の意味を示す。 Ｘ：分子中にアミノ基又はイミノ基を有す る細胞毒性物質の反応残基 Ｙ：水溶性脂肪族第一アミン残基 Ｗ：低級アルキレン基 Ｚ：水素原子または一般式Ｚ′で示される基（但し、Ｚ
   が水素原子である場合、 −ＳＺで表わされる−ＳＨ基は分子内ま たは分子間で他の−ＳＨ基と平衡的に −Ｓ−Ｓ−結合を形成し得るが、これら を含んで−ＳＨと表現するものとする。） Ｚ′：隣の硫黄原子と共に活性ジスルフィド結合を形成
   しうる基〕 で表わされる構成単位から成り、かつ１分子中における
   各構成単位〔１〕、〔２〕、〔３〕、〔４〕、〔５〕お
   よび〔６〕の数が各々ｎ、ｍ、ｌ、ｒ、ｐおよびｑであ
   ってこれらの数は０または自然数であり、これらの関係
   は ｎ＋ｍ≧２ ０．００１≦（ｐ＋ｑ）／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｒ＋ｐ＋ｑ）
   ≦０．５０であり、平均分子量が２，０００〜１，００
   ０，０００であるポリサクシンイミド誘導体〔 I 〕と
   生理活性蛋白とを結合せしめた蛋白質−ポリサクシンイ
   ミド複合体。 （２）ポリサクシンイミド誘導体〔 I 〕と生理活性蛋
   白との結合が、ポリサクシンイミド誘導体〔 I 〕の−
   ＳＺ基とメルカプト基を有する生理活性蛋白のメルカプ
   ト基とを利用して結合せしめたジスルフィド結合である
   特許請求の範囲第１項記載の蛋白質−ポリサクシンイミ
   ド複合体。 （３）ポリサクシンイミド誘導体〔 I 〕と生理活性蛋
   白との結合が、ポリサクシンイミド誘導体〔 I 〕の−
   ＳＺ基と生理活性蛋白のアミノ基を利用し、それらの間
   に架橋基を介する結合である特許請求の範囲第１項記載
   の蛋白質−ポリサクシンイミド複合体。 （４）ポリサクシンイミド誘導体〔 I 〕と生理活性蛋
   白との結合が、ポリサクシンイミド誘導体〔 I 〕の−
   ＳＺ基とメルカプト基を有する生理活性蛋白のメルカプ
   ト基とを利用して、それらの間に架橋基を介する結合で
   ある特許請求の範囲第１項記載の蛋白質−ポリサクシン
   イミド複合体。 （５）生理活性蛋白がフィブリノーゲン、ウロキナーゼ
   または免疫グロブリンである特許請求の範囲第１項記載
   の蛋白質−ポリサクシンイミド複合体。 （６）下記の一般式〔１〕〜〔６〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔１〕▲数式、化学
   式、表等があります▼〔２〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔３〕▲数式、化学
   式、表等があります▼〔４〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔５〕▲数式、化学
   式、表等があります▼〔６〕 〔上記式〔１〕〜〔６〕において、Ｘ、Ｙ、ＷおよびＺ
   は各々次の意味を示す。 Ｘ：分子中にアミノ基又はイミノ基を有す る細胞毒性物質の反応残基 Ｙ：水溶性脂肪族第一アミン残基 Ｗ：低級アルキレン基 Ｚ：水素原子または一般式Ｚ′で示される基（但し、Ｚ
   が水素原子である場合、−ＳＺ で表わされる−ＳＨ基は分子内または 分子間で他の−ＳＨ基と平衡的に−Ｓ −Ｓ−結合を形成し得るが、これらを含 んで−ＳＨと表現するものとする。） Ｚ′：隣の硫黄原子と共に活性ジスルフィド結合を形成
   しうる基〕 で表わされる構成単位から成り、かつ１分子中における
   各構成単位〔１〕、〔２〕、〔３〕、〔４〕、〔５〕お
   よび〔６〕の数が各々ｎ、ｍ、ｌ、ｒ、ｐおよびｑであ
   ってこれらの数は０または自然数であり、これらの関係
   は ｎ＋ｍ≧２ ０．００１≦（ｐ＋ｑ）／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｒ＋ｐ＋ｑ）
   ≦０．５０であり、平均分子量が２，０００〜１，００
   ０，０００であるポリサクシンイミド誘導体〔 I 〕と
   生理活性蛋白とを結合せしめた蛋白質−ポリサクシンイ
   ミド複合体を製造するにあたり、生理活性蛋白のメルカ
   プト基もしくは生理活性蛋白に新たに導入したメルカプ
   ト基と、ポリサクシンイミド誘導体〔 I 〕のメルカプ
   ト基を利用してポリサクシンイミド誘導体〔 I 〕と生
   理活性蛋白とを結合せしめることを特徴とする前記蛋白
   質−ポリサクシンイミド複合体の製法。 （７）生理活性蛋白およびポリサクシンイミド誘導体〔
   I 〕のメルカプト基を利用して結合する方法がメルカ
   プト基を有する生理活性蛋白、またはアミノ基に架橋基
   を介してメルカプト基を導入した生理活性蛋白と、Ｚ＝
   Ｚ′であるポリサクシンイミド誘導体〔 I 〕とを反応
   させる方法である特許請求の範囲第６項記載の蛋白質−
   ポリサクシンイミド複合体の製法。 （８）生理活性蛋白およびポリサクシンイミド誘導体〔
   I 〕のメルカプト基を利用して結合する方法がメルカ
   プト基を有する生理活性蛋白のメルカプト基にＺ′基を
   導入して−ＳＺ′基とするか、または生理活性蛋白のア
   ミノ基に架橋基を介して−ＳＺ′基を導入し、次いでこ
   のようにして得られた−ＳＺ′基を有するかまたは架橋
   基を介して−ＳＺ′基を導入された生理活性蛋白と、Ｚ
   ＝水素原子であるポリサクシンイミド誘導体〔 I 〕と
   を反応させる方法である特許請求の範囲第６項記載の蛋
   白質−ポリサクシンイミド複合体の製法。 （９）生理活性蛋白およびポリサクシンイミド誘導体〔
   I 〕のメルカプト基を利用して結合する方法が、メル
   カプト基を有する生理活性蛋白またはアミノ基に架橋基
   を介してメルカプト基を導入した生理活性蛋白と、メル
   カプト基を有する（Ｚ＝水素原子である）ポリサクシン
   イミド誘導体とのいずれか一方を、それが有するメルカ
   プト基に対して、過剰の架橋剤と反応せしめ、次いで他
   方と反応させる方法である特許請求の範囲第６項記載の
   蛋白質−ポリサクシンイミド複合体の製法。 （１０）生理活性蛋白およびポリサクシンイミド誘導体
   〔 I 〕のメルカプト基を利用して結合する方法が、ア
   ミノ基に、メルカプト基と反応し得る官能基を架橋基を
   介して導入した生理活性蛋白と、Ｚ＝水素原子であるポ
   リサクシンイミド誘導体を反応させる方法である特許請
   求の範囲第６項記載の蛋白質−ポリサクシンイミド複合
   体の製法。