JPH01500164A - グラム陰性宿主細胞を使用する蛋白質の遺伝子工学的取得法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 グラム陽性宿主細胞を変周する 蛋白質の遺伝子工学的取得法 本発明は所望の蛋白質をコードする遺伝チクなくとも１つを有するベクターがそ の中に導入されるグラム婁性宿王細胞を変周し、該遺公子ｔ−転写し、かつ翻訳 する蛋白質の遺伝子工学的取得法に関する。

蛋白質の取得のための！！！云子玉子工学的方法でに長いこと公知でｂる。この ためには容易に培養可能であり、生産した蛋白質の取得を簡単な方法で行なりこ とのできる微生物を愛用するのが有利である。多く変周される微生＊はこの際Ｅ 、コリでらシ、これは非常に容易に培養可能でｂジ、かつその特性は十分に知ら れている。この微生物膜の欠点は、グラム虐性微生物として生じた蛋白質もしく はポリペプチドをしばしば周囲に出さず、場合によってはべりプラズマ中に放出 する。便って、後処理に手数がかかジ、微生物の破壊によってのみ行なうことが できる。

多数の蛋白質がダラム婁性菌中で分泌される。しかしながら、外膜を通る第２の トランスロケーション工程のために特異的な１ｍＭ蛋白質が分泌のために必要で あることが示さｎた。相応する構造遺伝子のクロー／ｌＫ３：、コリのペリジ２ ズマ中での該蛋白質の蔓榎に導びく。同じ効果がヘモフィルス・インクルエンデ エｇＡ−プロテアーゼに関しても記載されており、これは天然の宿主中では細胞 外に分泌さｎるが、これをＥ、コリ中でクローン化する時ペリプラズマ中で見い 出さｎる。更に複雑であるのはＥ、コリーヘモリシンの分泌でめる。ここでは唯 一のオペロン上にコードさｎる、全部で４つの異なる蛋白質成分が必要である。

従って、本発明の課題はグラム陰性宿主細＃＠金使用して蛋白質を遺伝子工学的 に取得する万沃金、この所望の蛋白質に：３その宿生？＃Ｅ胞中で形成ざ詐た後 、該細胞から放出さｎ１次いでこれを培地からｉ＃ｆｉ胞外で取得することがで さるように改良することでｂる。

この課題は、所産の蛋白質をコードする遺伝チクなくとも１つを有するベクター がその中に導入されるグラム陰性宿主細胞′ｆＩ：ｉ！２！用し、この遺伝子を 転写し、かつ翻訳することにより蛋白ｌＸを遺伝子工学的に取得する方法により 解決し、この方法は蛋白質の細胞外取得のために、これをコードする遺伝子をナ イセリア属の微生物からの工ｇＡ−プロテアーゼープレカーーサーｉ！Ｌ＠子を 有するベクター中に、このコードする遺伝子が工ｇＡ−プロテアーゼープレカー サー遺伝子の配列内に配置されるように挿入することを特徴とする。

人の粘反上で成長するナイセリア・ゴノルロエ−（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎ ｏｒｒｈｏｅａｅ　）及びナイセリア盛メニンイチジス（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　 ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　）のようなナイセリア属の種々の病原菌種は人工ｇ Ａ　ｉに関して特異的である細胞外プロテアーゼを放出する。この免役グログリ ンは工ｇＡ　２とともにそのような病原体での伝染に対して保護すべき分泌免投 性Ｏ主成分でるる。病原体でない、使用細菌種は全く工ｇＡ−プロテアーゼを生 産しない。

ナイセリア属の菌から得られた工ｇＡ−プロテアーゼ遺公子は意外な特性を示す 。形成さｎた工ｇＡ−プロテアーゼもしくはそのプレカーサーは天然の宿主中で 疋けでなく、異なるグラム陽性宿主細胞、例えばエンテロバクテリアツエー（Ｅ ｎｔｅｒＯｂａｃｔｓｒｉａｃｃａｅ　）中でも活発に分泌さｎる。大きなプレ カーサーをコードする唯一０遺伝子が異なる檜王細胞中でも工ｇＡ−プロテアー ゼの生産及び細胞外分泌のために十分でめる。分子量わずか１０６　ｋｄでめる 完成細胞外工ｇＡ−プロテアーゼよりほぼ６３　ｋｃｌ大きい、分子量１７０ｋ ｄを有するこのプレカーサーは、グラム陰性宿主細胞の膜を通る搬送の除に、か つＦｉ＃素の自己蛋白質分解活性による工程により該プレカーサー分子のいくつ かの部分が切断さｎて工ｇＡ−プロテアーゼの活性型になる。このブレカーサ− 蛋白質は５　ＫｂのＤＮＡ　−７ラグメントによりコードさする。

該プレカーサーは均質なアミノ末端リーダーペプチド、笑際のプロテアーゼ部及 び比較的大きなカルボキシ末端ヘルパ一部の３つの機能ドメインを形成する。

リーダーペプチドは工ｇＡ−プロテアーゼプレカーサーをペリプラズマスリット 中に導びき、内膜のシグナルペプチダーゼによりプレカーサーから除去される。

従って、工ｇＡ−グロテアーゼの搬送における開始工程は規則的なコー又はポス トトランスレーション法に等しく、ペリプラズマ蛋白質及び外膜蛋白質の多くは これに健がう。

第２■工程ＩＣｐいては、プロテアーゼ及びヘルパ一部カラなる残ったプレカー サー榎合体が外膜中に搬送され、かつ細胞外に放出さｎる。この工程の愼械的経 過は工ｇＡ−プロテアーゼープレカーサー複合体のヘルパー機能でｍ明すること ができる。アミノ末端ヘルパ一部は強く極性であり、こｎに対してカルボキシ末 端部はむしろ疎水性で６タ、膜積層にとって典型的な特Ｃａを示す。駅ヘルパー が外膜中で孔を形成し、その際親水性部がこの孔中に突き出すと−りことが、こ の観察から結果として優られた説明である。なおヘルパーと結合している央際の プロテアーゼ部は、次いでこの孔を通って押し出さｎ、細胞外にその活性配置を とる。

継続的な自己蛋白質分解工程は次いで工ｇＡ−プロテアーゼの完成した活性型を 細胞外環境に放出する。活性搬送に必要であるエネルギーはヘルパーの自己蛋白 質分解的切断に因る。

所望の蛋白質の細胞外取得のためにはナイセリア属の工ｇＡ−プロテアーゼを含 有するベクター中に、このコードする遺伝子を自体公知法で組み込む。該ＩｇＡ 　−プロテアーゼ遺伝子の配列は前記のように３つの主ドメインである、リーダ 一部、工ｇＡプロテアーゼ自体に関してコードする配列及びヘルパ一部からなる 。プロテアーゼをコードする範囲とへルノｆ−ドメインとの間、モジくハヘルパ ードメインの中に３つの天然の切断部位が存在することが、意外にも確認さｎた 。この第１図中に示した遺伝子配列中ａ、ｂ及びＣで示されている切断部位は次 のアミノ酸から形成されている：切断部位（ａＪ　：　Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ −８ｏｒ−Ｐｒ。

切断部位（ｂ）　：　Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｐｒ。

切断部位（ｃ）　：　Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ　０所 鼠■蛋白質に関してコードする配列を工ｇＡ−プロテアーゼの種々の範囲に組み 込むことが今や可能である。リーダ一部への挿入は、この部分が内膜を介する通 過の際に脱離されるので、考Ｎ、されない。

本発明による方法の変法は、所属の蛋白質に関してコードする遺伝子を工ｇＡ− プロテアーゼドメイン中に挿入することである。工ｇＡ−ゾロテアーゼープレカ ーサー遺伝子のプロテアーゼドメインの一定の位置に工ｇＡ−ノロテアーゼ活性 の破壊なしにこの組込みは可能でｂる。この場合、工ｇＡ−プレカーサー２表現 すると、この際所望の蛋白質がゾａテアーゼ部分Ｑ中４で存在する。

なお不活性な工ｇＡ−プロテアーゼ、もしくはそのプレカーサーが前記のような 方法で放出される。次いで所望の蛋白質が少なくとも部分的になお活性のプロテ アーゼに結合して存在する。プロテアーゼの分離はこのために好適なプロテアー ゼによるこのプロテアーゼの処理工程により、又は化学反応によ９行なわれる。

所望の蛋白質に関してコードする遺伝子を、活性工ｇＡ−プロテアーゼをもはや 形成することができず、こうして工ｇＡ−プロテアーゼ活性がもはや存在しない よりに、工ｇＡ−プロテアーゼードメイン中に挿入することもできる。この場合 、本発明による方法の有利な夫ｊ形は、同時に培養される、同じバクテリア中又 は異なるバクテリア中に、金工ｇＡ−プａテアーゼｆｆｉ＠子を有するベクター ｔ−婆人することでるる。所望の蛋白質と同時に形成さｎる工ｇＡ−プロテアー ゼは欠いて所望の蛋白質をヘルパーから、こりして膜から分離することができ、 こうして培養液から取得することを可能とする。

本発明による方法の有利な央Ｂ形においては、所望の蛋白質ｔコードする遺伝子 配列を天然の切断部位＆！Ｌ）％φン及び／又は（Ｃ）の間にある工ｇＡ−プロ テアーゼープレカーサー遺伝子の遺伝子切断片中に挿入する。この場合、工ｇＡ −プロテアーゼの活性は保持され、かつ所望の蛋白質は両方ＣＡＭを通って放出 さｎｆｃ後、プレカーサーの処理において天然の脱離によりｆｒ２テアーゼから 分離さｎ１培地中に遊離して存在するから、これを培地から公知法で単離するこ とができる。

工ｇＡ−遺伝子のプロテアーゼドメイン中への組込みは工ｇＡ−プロテアーゼド メインの１部又は全体を破壊するよりに行なうこともできる。工ｇＡ−プロテア ーゼ活性の破壊により、グラム陰性細菌種の両方の膜を介して所望の蛋白質の放 出までは行なわれるが、膜に会合するヘルパーを酵素から分離するゾａテアーゼ 活性が欠けているので、所望の蛋白質はヘルパーに結合して浅ｐ１こうして＃１ 胞壁に会合する。本発明による方法のこの４Ｍ形は生ワクチンの製造に特に好適 である。

このようにして、例えば異面抗原はダラム嬢性倣生物の外展に結合し、抗体の虫 取に開用することができる。

所望の蓋白質の本発明による取得のためにはグラム陰性宿主細胞、特に工ンテロ バクテリアツエ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ　）の微生物は非常 ｉ（良好でおる。エシェリキアＡ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　）及びサルモネ ラ属（Ｓａ１ｍｏｎｅ’ｌｌａ　）■微生物を使用するのが有利でおる。Ｅ、コ リ、サルモネラ・チフイムリウム（Ｓａｌｍｏｎ−θｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒ ｉｕｍ　）及び弱毒化サルモネラ・テフイイ（Ｓａ１ｍｏｎｅ’ｌｌａ　ｔｙｐ ｈｉｉ　）の菌株を用いる実験は、これらの宿主細胞を用いて、天然宿主でめる Ｎ、デノルｏ　ニー　（ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　）におけるより１１ｉ！ｉい 工ｇＡ−プロテアーゼ活性が放出されることを示した。細胞外酵素が同一でろシ 、同じプレカーサーから工程ｔ−経るので、これらすべてのグラム陰性システム 中での工ｇＡ−ゾロテアーゼの分泌は同じ機能に因る。

本発明による方法は蛋白質の取得のために好適でるる。本発明による方法を用い て生理手釣又は治療上の活性の蛋白質を取得するのが轡に有利である。本発明に よる方法のもう１つの適用は、グラム鴎ａｍｍ性生接種物質中で通用するために 抗原エピトープを放出することにある。本発明による方法はシラスミドル工Ｐ１ ００を含有するＥ、コ’）　ＤＳＭ　３７７５を宿主細胞として用いて夾適する のが特に有利でるる。プラスミドル工ｐｉｏｏはシラスミドｐＢＲ５２２’６に ら誘導さｎ１工ｇＡ−プロテアーゼ−プレカーサーＯ全Ｒ弐子配列を有する。

本発明による方法に藺単に蛋白質を得ることを可能にする。宿主細胞として、容 易に培養可能であるグラム藻性菌ｔ−使用するにもかかわらず蛋白質は培地から 得ることができる。

本発明により９！用した工ｇＡ−プロテアーゼ−プレカーサーに関してコードす るＤＮＡ　−７ラグメントは塩基対４６０２の長さの唯一のｇＩＪ連開放ｍＡ取 り域を形成する、塩基対４８９９の全配列を有する。遺伝子配列は第１図ρ１ｃ ）わかる。

開放読み取り域の欝３コドンでめるＡＴＧ　−ｋｌ始コドン及びシャイン・ダル ガルノ配列に似た配列は１０４位に翻訳開始点を示す。該翻訳は４７００位でＴ ＡＡ　−オーカー終止コドンで終わる。翻訳開始シグナルＯ前のＡＴ−豊富域は プロモーターの典型的な特徴を示し、かつ工ｇＡ−プロテアーゼ遺伝子の転写を 指揮する。翻訳終止コドンＫｔｃ＜パリンドローム配列は転写ターミネータ−と して慟らく。

ヌクレオチド配列データの精確な評価は、１６９ｋｄの蛋白質を示す工ｇＡ−ノ 口テアーゼプレカーサーに関するアミノ酸１５３２の全体を示した（第１図）。

完全なプレカーサー配列はアミノ′ａｌｉｉの間隔で見い出された２つのシステ ィン基のみを有する。システィンの不伴在が多くの分泌蛋白質に関して特徴的で あるので、このことは輿娠深いことでめる。親水性プロフィールはいくつかの優 ｎた特徴茫有する規則的に１替するパターンを示す二アミノ末端の末端部の短か い疎水性配列は、アミノ末端のプラスの電荷４つ及び中央疎水性域１りｔ示す典 型的な分泌シグナルペプチドを形成する。このリーダーペプチドとして示した配 列の切断部位は位置−１及び＋１のアラニン基２つの間ＶＣおる（第１図）。プ レカーサーの第１次構造の最もきわだり特＠はプレカーサーの中央域の右側の着 るしく親水性の域２つ及びそのカルボキシ末端の短かい城である。

完成した細胞外工ｇＡ−プロテアーゼＶＣ相応する部分はプレカーサー分子■ア ミノ末端域中でリーダーペプチドに続いて存在する。゛ プロテアーゼ及びヘルパー間の境界域は種々のノロリ豊富域域を有し、これは人 工ｇＡ　１においてＮ、ゴノルロエーからの工ｇＡ−プロテアーゼの切断部位と 目だった配列一致を示す。第３図はａ％ｂ％　Ｃで示されるこれらの位置のアミ ノ酸配列を示す（第１図）、この位置はＩｇＡ−プロテアーゼの自己蛋白質分解 攻寧点である。これｔ−安定にするために、酵素での切断をトランスで行なった 。この目的のためにＭＳ２／工ｇＡ−プロテアーゼ融合蛋白質を調製用量でｒル 上で単離し、１′ＦＩ製した工ｇＡ−プロテアーゼ少量と共に恒温保持する。

種への工ｇＡ−プロテアーゼ融會坏と活性酵素との恒温保持は果原に特異的な分 解生成物に婆びいた。第２図に示した融合蛋白質ｆｐ　ｌ　８０は１２０　ｋｄ と６０ｋａを有する２つの主生ｇ物と４５　ｋｄ、とｉ　５　ｋａを有する２つ のより小さな生成物に切断された。対照の恒温保持は工ｇＡ−プロテアーゼでの 特異的反応に関して予期さＣていたようにマイナスでｂる。完成したプロテアー ゼに対して向いているモノクロン抗体の使用下に１２　Ｑ　ｋｄ−バンドはイム ノプロット中で反応する。

ｆｐ４２＃１合蛋白質（第２図）に向いた抗血清は６０ｋａ及び４５　ｋｄ生虫 取と、同様に１５ｋｄ生成物と交差反応を示す。１２０ｋ（ｌ生成物との交差反 応は融合蛋白質中のＭＳ２ポリメラーゼ部分に因る。このデータは部位（へ）及 び／又はφ）が実際に工ｇＡ−プロテアーゼの攻撃部位で６ＡＣとを支持する。

４５　ｋｄ及び１５ｋｄ生成物は多分部位（０）での部分的な消化により生じる （第２図）。この部位の他に他の域は融合蛋白質中でｘｇＡ−プロテアーゼの攻 撃部位として認められない。

内部ルカーサー攻撃部位に関する詳細なイン７オーメーシヨンは６０　ｋ（１９ ７所生成柳の７ミノ末端部列分析によシ得られる（第３図）。この蛋白質７ラグ メントはアクリルアミドグル中で融合バンドとして現わ瓜遺伝子地図によればプ レカーサーのカルボキシ末燗部を形成する（第１図〕。この分析は配列決定工程 １．２．４．５．７及び９〜１３ｉＣ関するあいまいでないデータを示す。部位 ８筐でのすべての他の工程ＫＦｊ４シては２つのアミノ酸の配列分析シグナルが 生じる。これら２つのアミノ酸のそれぞれは任意の位置で部位（転）もしくは部 位（１））の配列と一緒に！なる（第３図）。部位９〜１３は部位（ｂ）の７ミ ノ末端部列と一緒に電なる。

便って、蛋白質配列の異種性は２りの部位欽）及び（ｂ）ｔ−工ｇＡ−プロテア ーゼのための攻撃部位としてり用することを保証する。

Ｎ、ゴノルロエーの培養上澄液から製造された完成詑Ａ−プロテアーゼは、１０ ６／１０９ｋａ二重バンドをアクリルアミドグル中で形成する異種蛋白質である という観察は、部位（ト）又は部位（ｂ）に相応する児成工ｇＡ−プａテアーゼ の異種カルボキシ末端により説明することができる。部位（ト）及び（（９）間 の間隔を橋渡しする３　ｋｄペプチドセグメントは両方の形の分子量における差 異に関与しているのであろり。

粗培養上澄中には付加的なバンド１２１　Ｍが示されており、これは工ｇＡ−ノ 口テアーゼに属する。このバンドは抗プロテアーゼ血清とではなく、融合蛋白質 ｆｐ　４２に対する抗血清と交差反応し、このことは１２１ｋ（Ｌ蛋白質がヘル パーの境界部を有していることを示した。

その大きさにより、中間生成物のカルボキシ末端は工ｇＡ−プロテアーゼ−プレ カーサーの内部攻寧点の１つである部位（ｃ）　（′ｉｇ１図）ｌＣｉＥ［に存 在する。

＃ｌ胞外工ｇＡ−プロテアーゼの３つの型の比較ｊｉｔｔ−成長するＥ、コリ培 地中で測定した。これらの実験の結果は成長段階の早期においては１２１　ｋｄ 中間生成物が王で６るということを示す。成長の時間と共に酵素が果筐る時、王 に１０９　ｋｄ中間生成物が、次いで工ｇＡ−プロテアーゼの児ｇ１０６ｋａ型 を検出することができる。このことは藁分子中間生成物の児底＃素へのゆっくり としたに換を意味する。いくつかの工ｇＡ−）ロチアーゼ調剤中に主要クラクシ ョンとして官有される、分子量１０９ｋａの中間生成物は長期間の貯臓後に低分 子量の形にゆつく夕と変換するということとこの観察は一致する。

この実験は、ヘルパーの極性部が少なくとも工ｇＡ　−プロテアーゼ自体と共に 細胞外分泌されるということを示す。イムノブロットにより内部切断位（ｂ）及 び（Ｑ）の間に存在する、ヘルパーの小さい１２ｋａ部分は拠際に細胞外環境中 に工ｇＡ−プロテアーゼと一緒に遊離される。この域の極性特性は工ｇＡ−プロ テアーゼの細胞外分泌に特に重要であるということが推論される。

ナイセリア属の微生物の病原性は場合によジエｇＡ　−プロテアーゼの形成に起 因するとも、しわれる。従って、これらの微生物に起因する電い病気の治療０た めの可能性は、プレカーサーをもはや切断することができないように、すなわち その固有の切１！ｆｒ部位がもはや感知されず、こうして有讐作用に関与する活 性−素がもはや生じることができないように工ｇＡ−プロテアーゼ−プレカーサ ーの切断部を遮蔽することにある。

プレカーサーの切断部を遮蔽するためには、切断部位り、中）及び／又は（ｅ） ’を構底するアミノ酸配列と結合性の物質、特にこのアミノ酸配列に向いた抗藻 を使用するのが有利である。

も９１りの可能性は、ペプチド鶏似物質の添加により工ｇＡ−プロテアーゼ０４ ；）ＪＷｒ位を遮蔽することで６り、このペプチド腿似物質は切断部位の配列に 関してわずかに変性したアミノ酸配列を有し、こりしてこ扛は切断部に積層する が、切断さｎず、こうして切断部位についたまま離れない。

次の実厖例ンこより本発明を図面と関連させて詳説する。

第１図はＮ、ゴノルロエー株ＭＳｉｉの工ｇＡ−プロテアーゼのヌクレオチド配 列及びアミノ酸配列を示す。

開放読み取シ域から誘導されたアミノ酸配列はＩｇＡ　−プロテアーゼのプレカ ーサーを包含する。ヌクレオチド配列はｐ工Ｐ１００中のクローン化したＤＮＡ 　−７ラグメントの重なったセグメントの分析から判明した全データから得られ た。この際マキサム（Ｍａｘａｍ　）及びイルバー）　（Ｇ１１ｂｅｒｔ　）に よる方法、並びにデンガー（Ｓａｎｇｅｒ　）等による方法１−２用した。

第２図はヌクレオチド−及びアミノ酸配列Ｑ１＃性を示す。工ｇＡ−プロテアー ゼ遺伝子■転写（−４３、−３５及び−１０〕及び翻訳（ＳＤ）の開始のための シグナルは太い鍼で示した。転写の終止ｌＣＦ３４与するパリンドロームは太い 矢印を下に記した。工ｇＡ−プロテアーゼのアミノ末端シグナル配列はわくに入 れた。成長した工ｇＡ−プロテアーゼのアミノ末端は蓋白質配列決定によジ分析 さｎた。部位←）、（ｂ）及び（Ｑ）は工ｇＡ−プロテアーゼの内部切断部を示 す（第３図及び第６図も参照）。切断さｎたペゾチド帖合（矢印により示される ）は蛋白質配列決定によシ決められ、この−データと＃ｆｊ導されたアミノ酸配 列との一致は星印で示した。全プレカーサーの唯二つのシスティン基をわくで囲 んだ。

第３図は工ｇＡ−プロテアーゼ及びその遺伝子の物理的特性を示す。Ａ；　Ｅ、 コリ中のゴノコツケン（Ｇｏｎｏ−ｃｏｃｃｅｎ　）工ｇＡ−プロテアーゼの合 成及び分泌に作用するｐ工Ｐ　１００挿入の制限地図。Ｂ　；　ｐＫＸ表現シス テムと共に製造した工ｇＡ−プロテアーゼプレカーサーの融合蛋白質。濃く太い 線は表現システムのアミノ末端ＭＳ２ポリメラーゼキャリヤーを示し、中窒の線 は融合蛋白質中に含有されているプレカーサーの相応する部分に関連する。キャ リヤーとブレカーサ一部分の境界は表現ベクターが結合した、工ｇＡ−プロテア ーゼ遺伝子中の部位に相当する。Ｃ；プレカーサーの直線地図で８る。塗シつぶ した部分はリーダーペゾチドでｂす、中窒部分はプロテアーゼドメインでめり、 かつ交差＋１ＪＩＺ）部分はヘルパードメインである。矢印は内部工ｇＡ−プロ テアーゼ切断位（ａｓｂ及びＣ）１＆：示す。

（ＳＨ）はプレカーサー中の唯２つのシスティンの位置に関連し、（Ｘ）は外膜 の仮定Ｑトランスロケーションシグナルの位置を示す。Ｄ；プレカーサーの第１ 久構造のヒドロパシーグロットでるる。

第４図は工ｇＡ−プロテアーゼに関する攻撃位置及び蛋白質配列分析を示す、Ａ ：人工ｇＡ　ｉ中のＩｇＡ−プロテアーゼ切断部のアミノ酸配列及び工ｇＡ−プ ロテアーゼプレカーサー中の攻撃点の配列（第１及び第２図と比較）。Ｂ；融合 蛋白質ｆｐ１８０ｏｔ７７断の原に精製した工ｇＡ−グロテアーゼと共に生じた ６Ｑ　ｋｃＬ生底虫取アミン末端配列分析。配列決定データの定量的評価は、生 成物の８０チが切断部（ｂ）での切断から生じ、わずかに２０チが切断部（転） での切断により生じたことを示す。

第５図は工ｇＡ−プロテアーゼの超生産のためのベクターの製造を示す。このた めには工ｇＡ−プロテアーゼプレカーサーの完全な遺伝子をｐＥ！−表現システ ム■　−制御下に製造した。シラスミドＩ）ＥＸ　ｌ　０００はＭＳ２Ｓ２−ボ リメラーゼ／工−プロテアーゼプレカーサー−ハイグリッド蛋白質の細胞同形底 に導ひく。細胞外鈑送の経過において、この融合蛋白質の切断及び培養土漬液中 での工ｇＡ−プロテアーゼ及びα−蛋白質の遊離に至る。

第６図はダラム蕨性菌からの蛋白質の分泌のためのシステムにおける茨机シグナ ル並びに工ｇＡ−プロテアーゼドメインの交換金示す。ＩＩｉｇａ　、　ｐ　ｉ ｇａ及びＨｉｇａは工鉢−プロチアーゼプレカーサーのドメインｆｃ表わす。Ｐ ｉｇａは工ｇＡ−プロテアーゼ遺伝子の当初■プロモーターを示し、これは得成 されたハイグリッド蛋白質中で抗ＭＡのプロモーター（Ｐａ）と交換された。Ｉ ａは内膜を通る鍜送に必要である、抗［Ａのリーダーペゾチドｔ−表わす。

第７図はゴノコツケン株（Ｇｏｎｏｋｏｋｋｅｎｓｔａｅｍｍｅ　）　Ｒ１６（ タイ７’ｌ）、５１４（タイプ２〕及び７４（タイプ１）の部分的に配列決定し た工ｇＡ−プロテアーゼ遺伝子切断片をゴノコツケン株ＭＳｉｉの工ｇＡ　−プ ロテアーゼ遺伝子中の相応する遺伝子切断片と比較する。比較した配列切断片は ヌクレオチド部位１０７９〜２１４０．２４１０〜２５７１及び３０１１〜３１ ７２を包含する。図面中にはそのうちのヌクレオチドの置換も示すそれぞれの範 囲が示されている。ヌクレオチド位は第１図中で確定されている。配列決定した 遺伝子切断片中で個々のプロテアーゼ遺伝子間に全体で３〜６％の配列差が検出 された。

例　１ 工ｇＡ−プロテアーゼの超生産及び培養上澄液中への搬送の最適化 工ｇＡ−プロテアーゼーゾレヵーサーの完全な遺伝子と１４Ｓ２−ポリメラーゼ 遺伝子とをｐＥＸ−表現システム中で合成オリゴヌクレオチドを用いて融合した （第５図〕。生じたプラスミドｐＥＸ１０００に工ｇＡ−プロテアーゼーゾレカ ーサーの全アミノ戚配列と結合したＭＳ２−ポリメラーゼのアミノ末端のアミノ 酸９９１固からなる大きなハイグリッド蛋白質の表現のために宿主細胞の細胞質 に導入した。この融合蛋白質は分泌の間に蛋白質分解により切断さｎ１培地上澄 液中にｘｇＡ−プロテアーゼ並びに中間生＃：物を遊離する。分泌されるヘルパ ーのセグメント中のわずかなアミノ酸の欠失により、工ｇＡ−プロテアーゼ分泌 の効率も品質も著しく上昇する（第１表参照）。

第１表は種々のバクテリア種の工ｇＡ−プロテアーゼ分泌並びに表現シグナルの 変化の影響並びに工ｇＡ−プロテアーゼの遺伝子中での改変を比較したものであ る。

蛋白質ｔは５ＤＳ−ポリアクリルアミドデル及びウェスタンプロット分析により 測定した。

Ｎ、ｉノルロエーＭＳ１１　０．０５弓し／ｌｐ工Ｐ１００（］！：、コリ）　 −−［１，０５ｐＥＸ１０００　−　−　０．５ ｐＪＬＸ１０００．Ａ５１　Ａｒ１１Ａａｎ−８ｅｒ４］Ｊ””）　０．５ＰＥ Ｘ１０　ＤＯ−Ｒ９ＦＥａｒ−Ｇナエｍｅ−Ｐｒｏ（９′５）０−５ｐＥＸ１０ ００．Ａ３６　Ａｌａ−Ｇｌｙ−工ｍｅ−Ｐｒｏ（１０７７’　０　、２ｐＥｘ １０９０　ＨＥ１１，１０８１　０．５ｐｘｘ１０８０　１０８［）１０８３０ −７ｐＥＸ１０７０　１０８［：ｈ−１０８４２−ＯｐＥＸ１０７２　１０５チ ー１１］８４２．０ｐＥＸ１０７３　１０４ト１０８４２．０例　２ 工ｇＡ−プロテアーゼープレカーサー中へのオリゴペゾチドＱ刊込み及び培養上 澄液中への搬送ｊ！を公子工学的方法を使用して工ｇ人−プロチアーゼのＲ伝子 中に３ケ所で長さ１２ｂＰの合ｇ　ＤＮＡ−二本鎖を組み込んだ。このことは蛋 白質の翻訳の後、それぞれ４つの付加的なアミノ酸挿入に相応する。これらの３ ケ所すべての挿入（第１表参照）は工ｇＡ−プロテアーゼの搬送及び酵素的活性 に全く影ｔｉＩ′ｆｔ示さない。プラスミドル肛１０００．Ａ５１、−０Ｒ９及 び−０Ａ３６に関しては（Ｒ５図及び第１表参照）、バクテリアの上澄中に当初 のクロンｐ工Ｐ１００Ｋおけると同じエジーゾロテアーゼの中間坏及び同じ最終 状態が表われる。ｐＥＸ　Ｉ　Ｄ　００　、　Ａ　３６中の挿入オリゴペゾチド は切断位（ｂ）及び（Ｃ）の関に存在し、こうして自己蛋白質分解の後１２ｈａ 切断生成物と共に可溶性で媒体中に放出される。

例　３　− 表現シグナル及びプロテアーゼ−ドメインの置換工ｇＡ　−ｆ　ｏ　ｆアーゼ− プレカーサー蛋白質のカルボ午シ末端の６０　ｋｄθ大きさのヘルパードメイン はプロテアーゼ−ドメインを外膜を介して搬送するために必要である。蛋白質分 泌においてヘルパーの基本的な、１！義を強化するために、プロテアーゼ−ドメ インＰ　””％　フＯモー１−Ｐ　Ｉｇ＆＆Ｕシｆｆｋｇ列Ｌ　ｉｇａの大部分 を遺伝子工学的方法でｆｔ袂した。この変換は（１）選公子茨挽のためのシグナ ル、（ｎ）細西内膜を介する蛋白質搬送のためのＰａ１シグナル配列Ｌａを含有 している７シグメントに対して行なわれる。更にこの７ラグメントは抗原Ａａに 関してコードする配列ａｌｌ）　’ｔ−供給する。ヘルパー配列Ｈ１ｇａとの並 進的融合は、組換えＥ、コリ測胞の培養上澄液中に約３６　ｋａのヘルパー特異 的蛋白質バンドの検出を可能とした。このためにモノクロン抗体′？ｔｇ！用し た。従来、この予期した大きさの完全な融合蛋白質を検出することはできなかっ た。

組換えクロンの全細胞溶解物中に４５　ｋａのヘルパー特異的蛋白質の検出が達 せられたが、その培養上澄液中ではなかった。この観察から、３６ｋｄの大きさ のヘルパー特異的蛋白質は４５　ｋａヘルパーバンドの分解生成物でｂると判明 した。この記載した分解は従来組挨Ｅ−コリ細胞において観察さｎただｉで・天 然の宿主においてではなかった。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、１ 、　’　４１１９９ ：ｌ　ＭＥ　：１至圭■！＝二＝■＝！弓当若邑＝圭■＝ＦＩＧ、４ ＩｇＡ−プロテアーゼに関する切断部位：ＩｇＡｌ抗体 ？ｈｒ−Ｐｒｏ−９ｅｔ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ− Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｐｒ。

ｌ９Ａ−プロテア−ｊｔａ）＋ Ｘｑｋ−プロテアーゼ−（ｂｌ　ｉ ＺｇＡ−プロテア−ｔｌｃ）＋ ６　Ｑ　ｋｄ切断片のＮＨ２末端配列：ＦＩＧ、５ １９Ａ−プロテアーゼ・オーバープロデューサー；を 国際調査報告 ｍｌ″ｍｌ□１ＰＣＴ／ＥＰ８７１００３５６

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．所望の蛋白質をコードする遺伝子少なくとも１つを有するベクターがその中 に導入されるグラム陰性宿主細胞を使用し、この遺伝子を転写し、かつ翻訳する ことにより蛋白質を遺伝子工学的に取得する方法において、該蛋白質の細胞外取 得のために、これをコードする遺伝子をナイセリア属の微生物からのＩｇＡ−プ ロテアーゼープレカーサー遺伝子を含有するベクター中に、このコードする遺伝 子がＩｇＡ−プロテアーゼープレカーサー遺伝子の配列内に位置するように挿入 することを特徴とするグラム陰性宿主細胞を使用する蛋白質の遺伝子工学的取得 法。
2. ２．コードする遺伝子を、ＩｇＡ−プロテアーゼに関してコードする遺伝子セグ メントを破壊しないように挿入する請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．ＩｇＡ−プロテアーゼプレカーサー蛋白質の天然の切断部位間にあるＩｇＡ −プロテアーゼープレカーサー遺伝子の部位に、コードする遺伝子を挿入する請 求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
4. ４．コードする遺伝子をＩｇＡ−プロテアーゼに関してコードする遺伝子セグメ ント中に挿入する請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．更に、同時に培養されている同じ宿主細胞又は他の宿主細胞にＩｇＡ−プロ テアーゼをコードするベクターを導入する請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．膜に付着する蛋白質の遊離を特異的なプロテアーゼ、特にＩｇＡ−プロテア ーゼの添加により又は化学薬剤により行なり請求の範囲第４項記載の方法。
7. ７．宿主細胞としてエンテロバクテリアシエーの微生物を使用する請求の範囲第 １項から第６項までのいずれか１項記載の方法。
8. ８．Ｅ．コリ、ＤＳＭ３７７５中に含まれているプラスミドｐＩＰ１００
9. ９．Ｅ．コリＤＳＭ３７７５発明の詳細な説明