JPH01500961A

JPH01500961A - ｍＲＮＡの翻訳

Info

Publication number: JPH01500961A
Application number: JP62503414A
Authority: JP
Inventors: ウィルソン，トマス　マイケル　オーブリー
Original assignee: ダイアテック、リミテッド
Priority date: 1986-06-04
Filing date: 1987-06-04
Publication date: 1989-04-06
Anticipated expiration: 2013-10-22
Also published as: ATE110412T1; DE3750422D1; WO1987007644A1; EP0270611B1; JPH10146197A; GB2199328A; GB2199328B; AU614062B2; DE3750422T2; GB8801508D0; GB8613481D0; JP2814433B2; US5891665A; AU7489687A; JP3658654B2; US5489527A; EP0270611A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ｍＲＮＡの翻訳本発明はｍＲＮＡの翻訳のエンハンサ−に関する。

真核生物及び原核生物が翻訳を開始するメカニズムは、一部共通の特徴を有しているが、他の点では異なっていることが知られている。真核生物のメツセージは機能上モノジストロニック（ｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎｉｃ　）であって〜翻訳は５′末端で始まり、この末端におけるキャップ構造（ｍ７Ｇ”　ｐｐｐ５’　Ｇ、、、）の存在によって促進される〔シャトキン、セル、第９巻、第６４５頁。

１９７６年（Ｓｈａｔｋｉｎ、　Ｃｅ１ｌ、　９．８４５　（１９７Ｂ））　。

原核生物のメツセージはポリジストロニック（ｐｏｌｙｃｊｓｔｒｏｎｉｃ）であって、５′末端以外の部位で開始しうるが、キャップの存在は翻訳促進に繋がらない。真核生物及び原核生物は双方ともコドンＡＵＧで翻訳を開始するが、但し原核生物はＧＵＧを利用することもできる。双方における翻訳は、開始コドン近くのある配列によって促進される。

原核生物の場合には、それは所謂シャインーダルガルノ（Ｓｈｌｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列（開始コドンより上流のプリンに富む３〜１０ヌクレオチドの領域）である。真核生物の場合には、それは（ＡＵＧ開始コドンのＡが＋１と表示される場合に）−３位のプリン及び＋４位のＧ残基であるが、更に効果的なチューニング（ｔｕｎｉｎｇ）のためには他の配列も加わる必要がある。これはスキャニング（ｓｃａｎｎｉｎｇ）モデルの１緩和”バージョン（”ｒｅｌａｘｅｄ −ｖｅｒｓｉｏｎ　）の一部であり　〔コザツク、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ１第１２巻、第８５７頁、１９８４年（ｋｏｚａｋ、　Ｎｕｃｌｅｔｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１２．８５７　（１９８４）））、それによって４ＯＳリポソームサブユニツトが真核生物ｍＲＮＡの５′末端で結合し、モデルの要求を満たす最初のＡＵＧと出会うまで、即ち６０Ｓサブユニ・ノドが４０５サブユニツトと結合してタンパク質合成が始まる時点まで、配列をスキャニングし続ける。この点については、下記コザックの文献を参考にすることができる：セル、第１ジツク・アシッズ・リサーチ、第９巻，第５２３３頁。

１９８１年；及びセル、第４４巻，第２８３頁。

１９８６年。

開始コドンの中及び近辺で必要なこれらの配列以外に、翻訳を複製の面で促進させることが知られた他のｍＲＮＡ領域は存在しない。

真核生物の転写において、′エンハンサー′領域として知られる配列は転写促進を図ることができる。

ＲＮＡウィルスは、正もしくは負の一重鎖ＲＮＡ又は二重鎖ＲＮＡを含んでいる。ＲＮＡウィルス群としては、大多数の植物ウィルス（９０％以上）、一部の動物ウィルス及び数種のバクテリオファージがある。

ＲＮＡウィルスの中で最も広く研究されたものの１つは、タバコモザイクウィルス（以後ＴＭＶと称される）である。ＴＭＶの完全ヌクレオチド配列が知られている〔ゲレットら，プロシーディングゆオブーナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス　ＵＳＡ，第７９巻，第５８１８頁，１９８２年（Ｇｏｅｌｅｔ　ｅｔ　ａｌ．、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆ　Ｎａｔｌｏｎａｌ　ＡｅａｄｅＩｙ　ｏｒ　５ｃ１ｅｎｃｅ　ＵＳＡ．　７９．　５８１８（１９ｇ２））　）　、　ＴＭＶ　ＲＮＡ（７）５’領域は鎖長７０ヌクレオチドのＲＮアーゼＴ１耐性断片として１９６５年に始めて単離されたが〔マンドリー、ツアイトシュリフト・フユール・フエレルブングスレーレ，第９７巻．第２８１頁，１９６５年（　Ｍｕｎｄｒｙ，　Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ　ｆｉｒＶｅｒｅｒｂｕｎｇｓｌｅｈｒｅ．　９７．　２８１　（１９６５）　）　）　、内部Ｇ残基を有していなかった〔マンデレル，ジャーナル・オブψバイオロジカル・ケミストリー、第２４３巻，第３６７１頁（Ｍａｎｄｅｌｅｓ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｌｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　２４３。

３８７１）　）。この領域〔以後、オメガと称される；マンプレス、ジャーナル・オブψモレキュラーやバイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｌｓｔｒｙ　）　＋第２４３巻．第３６７１頁〕は配列決定され〔リチャーズら，ヨーロピアンΦジャーナル中オブ・バイオケミストリー、第８４巻，第５１３頁。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　８４．　５１３　（１９７８））　）　、小麦麦芽リポソームと二重（ｄｌｓｏｍｅ）開始複合体を形成することが示された。１つのリポソームは、１２６キロドルトン（ＫＤａ）のタンパク質コード領域のＡＵＧ開始部位を占めており、第二のものは上流リーダー配列と結合している〔フイリボウィクズ（Ｐｌｌｌｐｏｖｉｃｚ）及びヘツニ（Ｈａｅｎｎｉ）　、プロシーディング・オブ費ナショナル・アカデミ−・オブーサイエンスＵＳＡ．第７６巻，第３１１１頁，１９７９年；コナルス力ら．ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、第１１４巻，第２２１頁。

１９８１年（Ｋｏｎａｒｓｋａ　ｅｔ　ａｌ．、　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＢｌｏｃｈｅｓｉｓｔｒｙ．　１１４．　２２１　（１９８１）　）　）　ｏ　リポソーム会合におけるオメガの役割を支持するもう１つの最近の証拠は、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）及び共同研究者の脱外波（ｕｎｅｏａｔｉｎｇ　）　／遺伝子発現データからきている〔ジャーナル・オブ・ゼネラル・パイロロジー，第６６巻，第１２０１頁，１９８５年（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

６Ｌ　１２（１１　（１９８５）　）及びＵＣＬＡシンポジウム、第５４巻，第１５９頁．１９８７年（υＣＬＡ　Ｓｙｇ＋ｐｏｓｉｕｓ＋．　５４．　１５９（１９８７））で差違検討されている〕。ＴＭＶ粒子が５′末端へのリポソームの結合及び３′末端方向へのそれらの翻訳移動によって脱外波されていることは、様々なインビトロ翻訳系で観察された。

ＲＮＡウィルスの５′領域はｍＲＮＡの翻訳エンｌ〜ンサーとして機能することが、ここに発見されたのである。

第一面として、本発明はウィルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウィルスの５′　−リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）を含むｍＲＮＡを提供するが、このｍＲＮＡはリーダー配列を供与するウィルスに由来しない下流配列も含んでいる。

第二面として、本発明はウィルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウィルスの５１−リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）と相補的なりＮＡ配列を提供する。

第三面として、本発明は、プロモーター、ウィルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウィルスの５′−リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）と相補的な配列及び適切な開始コドンを含むオーブン読取枠を含んでいるＤＮＡ配列を提供する。本発明はこのようなりＮＡ配列を含む発現ベクターをも提供する。

第四面として、本発明は、ウィルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウィルスの５′　−リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）における、ＲＮＡとしての又は相補的ＤＮＡとしての、即ち５′　−リーダーＲＮＡがｍＲＮＡと接続している場合のｍＲＮＡの翻訳のエンハンサ−としての用途を提供する。

配列決定されたほとんどのＲＮＡウィルスは、５′　−リーダー配列、即ち最初の開始コドンまでの（但し、それを含まない）５′末端における配列を含んでいる。いずれのＲＮＡウィルスからの適切な５′　−リーダー配列も、本発明の翻訳エンハンサ−として使用可能である。

前記のように、ＴＭＶの５′　−リーダー配列十ＡＵＧ開始コドンはオメガとして知られており、かつそのヌクレオチド配列も公知であるため（リチャーズら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、第８４巻、第５１３頁、１９７８年）　、ｃＤＮＡは合成することができる。Ｔ　Ｍ　Ｖのオメガプライム（Ω′、第１図参照）配列は、本発明の好ましい翻訳エンハンサ−を表わしている。

下記のような他のＲＮＡウィルスの５′　−リーダー配列による翻訳増強に関する情報も利用可能である：カブ黄斑モザイクウィルスゲノムＲＮＡ　（フィリポウィクズ及びヘツニ、プロシーディングψオブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７６巻。

第３１１１頁、１９７９年）、ブロウム（ｂｒｏｓｅ）モザイクウィルスＲＮＡ３、アルファルファモザイクウィルスＲＮＡ４　（ゲレットら、プロシーディング・オブｅナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７９巻、第５８１８頁、１９８２年）；ラウス肉腫ウィルス〔ジエイ・エル・ダーリックス（Ｊ、Ｌ、　Ｄａｒｌｉｘ）ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１Ｏ巻、第５１８３頁、１９８２年〕。

いずれの具体的ケースにおいても、翻訳エンハンサ−としての機能が調節されるもののそれが損われないような方法で天然５′　−リーダー配列を変えることは、はぼ確実に可能であろう。このような変異体は本明細書において“誘導体”と呼ばれているが、天然配列の誘導体及びそれらの翻訳エンハンサ−としての用途は本発明の一部を構成している。天然５′　−リーダー配列（又は誘導体配列）の一部のみが翻訳増強を起こすために必要とされるケースもあるであろう。配列のこのような一部は本明細書において“部分°と呼ばれているが、天然配列もしくはその誘導体の部分及びそれらの翻訳エンハンサ−としての用途は本発明の一部を形成している。

いずれの具体的ケースにおいても、ＲＮＡウィルスの５′　−リーダーのヌクレオチド配列の決定は、公知かつ５利用性の技術を用いる当業者の技術的範囲内にあるべきである。同様に、翻訳増強のために必要な天然５′　−リーダー配列の一部及び修正もしくは削除されうる配列の同定（即ち、天然配列の誘導体及び部分の同定）は、ルーチン的実験により決定されうる問題である。

ＲＮＡウィルスの５′　−リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）は、例えばＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて適切なｍＲＮＡの上流にそれらを結合させることによって、それ自体を本発明の翻訳エンハンサ−として使用することができる。５′　−リーダー配列は下流ｍＲＮＡの開始コドンのすぐ隣であってもよいし、又は介在配列によってそれから離されていてもよい。しかしながら、相補的ＤＮＡの形で５′　−リーダー配列を用いることが好ましい。ｃＤＮＡは望ましいいかなる方法でも得ることができる。しかしながら、問題の５′　−リーダー配列の比較的短い鎖長を考慮すれば、ＣＤＮＡを化学的に合成することが通常最も好都合であろう。ｃＤＮＡは通常発現ベクターに組込まれる。発現ベクターは、ベクター中に含まれているそれらのＤＮＡ配列を発現させることができ、かつそのＤＮＡ配列がそれらの発現を行なわせうる他の配列と作動可能に結合せしめられているのであれば、いかなるベクターであってもよい。発現ベクターは、プロモーター、ウィルスＲＮＡの最初の開始コドンまでの（但しそれを含まない）ＲＮＡウィルスの５′　−リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）と相補的な配列及び適切な開始コドンを含むオーブン読取枠を有するＤＮＡ配列を通常含んでいる。オーブン読取枠は通常重要な１種以上のタンパク質についてコードしている。

発現ベクターは、ＤＮＡ配列が転写及び翻訳により発現される宿主細胞中に安定的に又は一時的に直接組込まれる。安定的発現の場合には、ベクターはエピワームとして又は染色体ＤＮＡの必須部分として宿主中で複製可能でなければならない。又は、発現ベクターはインビトロで転写させることができ、その際にはＲＮＡが一時的発現のために細胞中に直接組込まれる。

本発明の翻訳エンハンサ−は、ｍＲＮＡの翻訳能力を高めることが望まれるいかなる状況下においても使用可能である。しかしながら、エンハンサ−の効果はそれが存在しなければ不十分にしか翻訳されないｍＲＮＡの場合において最も著しいことに留意すべきである。したがって、本発明のキャップもしくはエンハンサ −又は双方の付加は翻訳を促進させることになる。既にキャップを有しているｍＲＮＡの場合であっても、本発明のエンハンサ−の効果はなお存在している。

本発明の翻訳エンハンサ−は、例えば植物細胞、細菌及び動物細胞のような多数の異なるタイプの発現系において有効であるが、但し特定のエンハンサ−は他の系よりむしろ１つの系とより適合するようである。例えばインビトロ試験時におけるＴＭＶのオメガ配列はウサギ網状赤血球溶解物系の場合よりも小麦麦芽系及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ４ｃｈｉａ　ｃｏｌｊ）の場合により大きな増強性を示すようであるが、翻訳の増強自体は３種すべての系で観察される。特定のエンハンサ−と特定の発現系との適合性は、通常当業者の技術的範囲内に十分属する事項であろう。

一般的に、本発明の翻訳エンハンサ−は、農業を含む商業面に対する生物又は細胞系の価値がその天然遺伝子又は人工産生遺伝子の１つの発現レベルによって決定される場合であれば、いずれにおいても利点を生かしつつ用いることができる。

（１）　遺伝子工学生物又は細胞系で商業的に有用なタンパク質の産生に際して。

（１１）酵素で触媒される中間代謝産物の産生速度が特定酵素の合成速度を増加させることによって高められうるような発酵に際して。

（ｉｉｉ）ウィルス感染の影響がウィルス弱毒体との前接触によって抑制させることができ、かつ保護を付与する成分の産生レベルを増加させることにより保護レベルを高めることが有利であるようなウィルス交差保護に際して。例えば植物は、ウィルス外被（ｃｏａｔ）タンパク質ニついてコードするＴ　Ｍ　Ｖ　ＲＮ　Ａ部分のｃＤＮＡコピーを含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｆｕａ　）遺伝子工学株にそれらを接触させることによってＴＭＶ感染から保護することができる。植物ゲノムに挿入された細菌ｃＤＮＡは、ウィルス自体による感染から植物を保護する外被タンパク質を連続的に発現する。

（１ｖ）除草剤耐性等の性質が植物の中間代謝の人工的修正によって付与されるような植物の遺伝子工学に際して。

（Ｖ）　例えば、部分的クローンの発現産物に対する抗体を産生させることが望まれている場合における、遺伝子の部分的クローンの発現に際して。

本発明は下記実験操作によって更に詳細に説明されている。

本発明の態様のキメラｍＲＮＡを、第１図で示されているように、下記方法で産生じた。

ＴＭＶ　ＲＮＡプルガレ（ｖｕ！ｇａｒｅ　）株の配列を用いて（ゲレットら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ争すイエンスＵＳＡ、第７９巻、第５８１８頁、１９８２年）　、１２６ｋＤａオーブン読取枠のＡＵＧ開始コドンの上流において５′キヤツプ（ｍ７Ｇｐｐｐ及び隣接Ｇ残基）を含まない６７塩基配列に対して相補的なりＮＡ配列を含む８１塩基オリゴヌクレオチドを合成した。この配列はオメガプライムと呼ばれている。Ｂｉｎｄｍ部位をこのオリゴヌクレオチドの５′末端に組込み、かつ５ａ１１部位を３′末端に組込んだ。オメガプライム配列の３′末端における１３塩基及び５ａ１１部位を含む２０塩基の第二オリゴヌクレオチドを、第二鎖合成用のプライマー（ｐｒｌｇｅｒ）として合成した。アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ　）後、第二鎖合成はＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片を用いて完了させた。

得られた二重鎖８１ｂｐ断片をＨｉｎｄｍ／５ａｉｌで消化させて一重鎖付着端をもつ７９ｂｐ断片を作成し、ｐＵｃ１９の対応部位に挿入した。合成の結果ＴＭＶのオメガプライム配列が正しい向きをしているという事実は、ジデオキシ鎖ターミネーション法〔サンゴ（Ｓａｎｇｅｔ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７４巻、第５４６３頁。

１９７７年〕を用いた配列分析によって立証された。次いで、ＴＭＶのオメガプライムを含む断片をプラスミドｐＪＩ１１のＨｉｎｄｍ／５ａｉ１部位に組込み、ｐＪｌｌｌｏｌを得た。ｐＪＩｌｌは、ＢａｍＨＩ断片としてのアセンブリー（ａｓｓｅｍｂｌｙ）配列のＴＭＶ源をｐＳＰ６４の対応部位に挿入し〔メルトン（Ｍａｌｔｏｎ）　。

ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１２巻、第７０３５頁、１９８４年〕、かつｓｍａ１部位をＢｇ１ｍ部位に変えることにより〔スリードら、バイオロジー、第１５５巻、第２９９頁、１９８６年（Ｓｌｅａｔｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１５５．２９９　（１９８Ｇ）　）　）得られる。

Ｔｎ９のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を含むｐｃＭｌから７７９ｂｐＳａｉｌ末端断片〔クローズ及びロドリゲス、ジーン。

第２０巻、第３０５頁、１９８２年（Ｃ１ｏｓｅ　ａｎｄＲｏｄｒｉｇｕｅｚ、　Ｇｅｎｅ、　２０．３０５　（１９ｇ２）　）　）をｐＪＩｌｌ及びｐＪＩｌｌｏｌの５ａｌＩ部位に組込み、それぞれｐＪＩＩ２及びｐＪＩ１１０２を得た。Ｔｎ５のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■遺伝子（ＮＰＴＩＩ）を含むｐＫＮＲ−Ｈからの１．２ｋｂ　Ｂｇｌｎ／５ａｉｌ断片〔ギャリーら、ジャーナル・オブ・パイテリオロジー、第１６１巻、第１０３４頁、１９８５年（Ｇａｌｌｉｅ　ｅｔａｔ、、　ＪｏｕｒｎａＩ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　１６１．１０３４　（１９ε５））〕をクフレノウ片でプラント末端化し、ｐＪＩｌｌ及びｐＪＩｌｌｏｌのＡｃｃＩ部位に組込み、それぞれｐＪＩＩ３及びｐＪＩ１１０３を得た。ＣＡＴ及びＮＰＴＩＩ双方の正確な配向性は制限断片分析によって立証された。

ｐＪＩＩ２及びｐＪＩ１１０２をＢｇｌｌｌでかつｐＪＩＩ３及びｐＪＩ１１０３をＥｃｏＲＩで直鎖化後、各々のＲＮＡ転写体をＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼの使用のより産生じた。各々のキャップ体も、キャップ転写体の対応的産生を確保するＧｐｐｐＧ及びＳＰ６ポリメラーゼの反応条件を用いて産生じた。キャップ及び非キャップ反応からのＲＮＡ並びにオメガ配列をもつ又はもたない構造体に関する同量産生は、ホルムアルデヒド−アガロースゲルを変性させることによって立証された。

同量の様々なＣＡＴ含有転写体及びＮＰＴｎ含有転写体を標準的反応条件下でウサギ網状赤血球溶解物（ＭＤＬ）　、小麦麦芽Ｓ−３０（ＷＧ）及び大腸菌５− ３０のインビトロ翻訳系に加えた。得られたポリペプチド産物を３５Ｓ−メチオニンで標識した。

第２図及び第３図は、ＭＤＬ（第２図、トラック１〜１１）、ＷＧ（第２図、トラック１２〜２２）及び大腸菌（第３図）からの翻訳産物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析について示している。第２図において、鋳型添加物はニドラック１及び１２がＨ２Ｏ（内在性翻訳）；トラック２及び１３がＢａ１Ｕ直鎖化ｐＪＩ１１０２ＤＮＡ；）ラック３及び１４がＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック４及び１５がオメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック５及び１６が５′キャップ−ＣＡＴ　ＲＮＡ；）ラック６及び１７が５′キャップ−オメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック７及び１８がＥｃｏＲＩ直鎖化ｐＪＩ１１０３ＤＮＡ　、）ラック８及び１９がＮＰＴｎ　ＲＮＡ、）ラック９及び２０がオメガプライム−ＮＰＴｎ　ＲＮＡ。

トラック１０及び２１が５′キャップ−ＮＰＴｎＲＮＡ、）ラック１１及び２２が５′キャップ−オメガプライム−ＮＰＴＩＩ　ＲＮＡであった。１４Ｃ標識マーカータンパク質〔アメルシャム・インターナショナル社（Ａｍｅｒｓｈａｉ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　ｐｉｅ　）　）はトラックＭに加えた。キロドルトン（ｋＤａ）としてのそれらの各々の大きさは左側に示されている。乾燥ゲルを室温で３日間才っトラジオグラフィーに付した。第３図において、鋳型添加物はニドラック１がＨ２Ｏ（内在性翻訳）ニドラック２がＢｇｌｎ直鎖化ｐＪＩ１１０２　ＤＮＡ；）ラック３がＣＡＴ　ＲＮＡ；トラック４がオメガプライム −ＣＡＴ　ＲＮＡ、）ラック５が５′キャップ−ＣＡＴＲＮＡ　、　トラック６が５′キャップ−オメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ、）ラック７がＥｃｏＲＩ直鎖化ｐＪＩ１１０３　ＤＮＡ；）ラック８がＮＰＴＩｒ　ＲＮＡ。

トラック９がオメガプライム−ＮＰＴＩＩ　ＤＮＡ、）ラック１０が５′キ＋　ツブ−ＮＰＴｎ　ＲＮＡ；）ラック１１が５′キャップ−オメガプライム−ＮＰＴｎＲＮＡであった。１４Ｃ標識マーカータンパク質はトラックＭに加え、それらの大きさくｋＤａ）は左側に示されている。乾燥ゲルを室温で３日間オートラジオグラフィーに付した。大腸菌５−３０系は転写活性系であるが、天然大腸菌ＲＮＡポリメラーゼはＳＰ６プロモーターを認識しえないことに留意すべきである。

下記第１表はオメガプライム配列の促進効果について示している。第２図及び第３図に示されたゲルからゾーンを取出し、翻訳産物の各バンドにおける放射能を測定し、オメガプライム配列を含まないＲＮＡからの放射能に対して各々の場合データを標準化した。この方法でデータを表現すると、キャップ単独による何らかの促進効果は除かれ、オメガプライム配列の促進効果のみが示される。

第１表ＣＡＴ　１　１　１オメガプライム−ＣＡＴ　１０　１．２　１１ＧｐｐｐＧ−ＣＡＴ　１　１　１ＧｐｐｐＧ−オメガプライム−ＣＡＴ　３．８２．２　２．７ＮＰＴｎ　１　１　１オメガプライム−ＮＰＴｎ　７１　１７．８７４ＧｐｐｐＧ−ＮＰＴＩＩ　１　１　１ＧｐｐｐＧ−オメガプライム−ＮＰＴＩＩ　９．５　１．５　９．６考察ＴＭＶのオメガプライム領域の存在は、キャップ又は非キャップ状態でＣＡＴ又はＮＰＴｎ配列を含む転写体の発現を促進させる。促進は翻訳効率の悪いＮＰＴ１１転写体の場合に最も著しい。このように、ＮＰＴＩＩ遺伝子を含むＴｎ５断片は、ＮＰＴｎ遺伝子のＡＵＧ開始コドンのすぐ上流に更にＡＵＧを有している。しかも“コザツク則（Ｋｏｚａｋ　ｒｕｌｅ）　’　（これに関するコザックの論文参照）によれば、ＮＰＴｎ開始コドン近辺の領域は翻訳開始能の乏しいシグナルを構成していることを示唆する。

ＷＧ及びＭＤＬの場合（第２図、第８列及び第１９列）で観察されるように、キャップ又はオメガプライムのないＮＰＴ１１転写体はほとんど機能していない。

キャップ又はオメガプライムの付加は翻訳を改善するが、オメガプライムの存在はキャップ単独の存在よりも優れた促進効果を有している。大腸菌翻訳メカニズムは、キャップ依存性ではないものの、オメガプライム配列の存在によって著しく促進される（第３図、第４．６．９及び１１列）。大腸菌の場合において、ＣＡＴ又はＮＰＴＵｍＲＮＡ上のオメガプライム配列にキャップを付加してもその翻訳をほとんど促進しなかったが、一方キャップＣＡＴ又はＮＰＴＩＩ　ｍＲＮＡにオメガプライムを付加すると著しく増強された。

ＣＡＴ遺伝子ｍＲＮＡは、たとえキャップ又はオメガプライム配列を有していない場合であっても、真核生物系においてはより効果的に機能する。５′末端から最初のＡＵＧはＣＡＴの開始コドンであって、開始コドン中の及びその近辺の配列は゛コザック則°に十分合致している。このことは、更に著しく低いｍＲＮＡ濃度が利用可能な３５Ｓ−メチオニンプールの消費を妨ぐために必要とされるＭＤＬ系の場合に最も明らかである。その際に驚くべきことではないが、ＣＡＴ　ｍＲＮＡにおけるオメガプライム配列の存在は促進的でなかった。ＭＤＬはＷＧはどキャップ依存的でないと考えられるが、しかしながら、ＮＰＴＩＩ転写体上におけるキャップの存在はわずかに促進効果を有しており（第２図、第８列及び第１０列）、一方ＣＡＴ転写体上におけるその存在はさほど効果がなかった（第２図、第３列及び第５列）。

ＣＡＴ　ｍＲＮＡ単独ではＷＧ系において著しく低い活性しかなかった。結論として、キャップもしくはオメガプライム配列の存在又は双方の存在は非常に促進的であった（第２図、第１４〜１７列）。ＷＧにおいて、ＮＰＴＩＩ　ｍＲＮＡ上のオメガプライム配列にキャップを付加しても（第２図、第２０列及び第２２列）、その翻訳をほとんど促進しなかったが、一方キャップ又は非キャップＮＰＴＩＩ　ｍＲＮＡにオメガプライムを付加すると（第２図、第１９列及び第２１列）著しく増強された。

したがって、オメガプライム配列の存在は真核生物系（ＭＤＬ及びＷＧ）及び原核生物系双方において翻訳を増強する。このことはＴＭＶ粒子の脱外技能と一致し、ＲＮＡは真核生物又は原核生物の翻訳メカニズムによって翻訳される。オメガプライム配列は、キャップ単独の存在の場合よりも転写体の発現に関して通常高い促進効果を有している。しかも、オメガプライム配列は、例えば原核生物系及びある程度ＭＤＬ系において、キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ　）では効果のない条件下で翻訳を増強する。

継続実験操作ＣＡＴ　ｍＲＮＡ及びオメガプライムリーダー配列の誘導体もしくは部分を含むキメラＲＮＡ構遺体を前記と同様の方法で作成したが、最初の合成りＮＡ配列は必要なＲＮＡを生じうるように選択しておいた。第４図に示されているように、５つの欠失体（Δ１〜Δ５と表記されている）、１つのＡ−Ｃ）ランスバージョン体（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ）及び１つの（Ｃ，Ａ）　−［Ｕ）　置ｎ　ｎ操体（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）があった。

ＣＡＴ　ｍＲＮＡを含む別のキメラＲＮＡ構遺体を、ＴＭＶ　（Ｕｌ、プルガレ（ｖｕｌｇａｒｅ　）又は普通株）以外の下記ウィルスの５′　−リーダー配列を用いて同様の方法で作成した：　ＴＭＶのトマト株（ＳＰＳ単離物）、カブ黄斑モザイクウィルス（ＴＹＭＶ）　、ブロウムモザイクウイルスＲＮＡ３　（ＢＭＶ３）　、ラウス肉腫ウィルス部分リーダー（ＲＳ　Ｖ）及びアルファルファモザイクウィルスＲＮＡ４　（ＡＩＭＶ４）。合成された最初のＤＮＡ配列及び制限部位地図は第５図〜第９図にそれぞれ示されている。゛ＲＮＡＮ遺構の他の１組を同様の方法で製造したが、但しＣＡＴＯ代わりに大腸菌リポータ−遺伝子β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を用いた。用いられたリーダー配列は、ポリリンカー（比較目的用）もしくはＵ１オメガ（即ち、ＴＭＶからのオメガプライム）又はオメガプライムの誘導体もしくは部分、及び前記のような他のウィルスのリーダーであった。ＧＵＳ遺伝子は、人工的に“良好な”コザックの配列関係（ｃｏｎｔｅｘｔ　）　（第９表参照）又は天然の°悪い”コザックの配列関係においてｐＲＡＪ２３５／２４０からの５ａｌｌ断片として用いた〔ジェファーソンＣＪｅｒｒｅｒｓｏｎ　）ら、プロシーディンクギ拳オブ Φナショナル・アカデミ一番オブψサイエンスＵＳＡ、第８３巻、第８４４７頁、１９８６年〕。リーダー配列及び制限部位地図は第１０〜第１３図に示されている。リポータ−遺伝子の発現は、ジェファーソンら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８３巻、第８４４７頁。

１９８６年に記載されているような螢光測定法により調べた。

前記３つのインビトロ翻訳系に加えて、下記２つのインビボ系を用いたゼノバス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ）卵母細胞の微量注入及びタバコ〔ニコチアナ・タバクム（Ｎｌｃｏｔｉａｎａ　Ｔａｂａｅｕｍ　）のキサンチ（Ｘａｎｔｈｉ）種〕葉肉原形質体のエレクトロポレーシヨン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｌｏｎ）。

それぞれの操作は下記のとおりであった：各合成ＳＰ６　ｍＲＮＡ（又はそれらの対応ＤＮＡ鋳型）２ｎｇを標準的方法〔コルマン・ニー、バーメス・ビー・デー及びヒギンズ・ニス・ジェイ（編集）、転写及び翻訳：実用的アプローチ、ＩＲＬプレス、オックスフォード、第２７１頁、１９８４年（Ｃｏｌｍａｎ　Ａ、　Ｉｎｎａｍｅｓ、　Ｂ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｈｌｇｇｉｎｓ、　Ｓ、Ｊ、（ｅｄｓ、）、　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ１ｏｎａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　：　Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｌ）ｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。

０ｘｒｏｒｄ、　２７１　（１９Ｂ４））　）に従い３０のバッチ中の第６期のＸ、ラエビス卵母細胞の細胞質に微量注入した。卵母細胞を修正パース塩水（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｂａｒｔｈｓ’　５ａ１１ｎｅ、　ＭＢＳ）中で１８時間インキュベートし、しかる後蒸留水で簡単に洗浄した。ゼノパス卵母細胞の抽出物は、１０ｍＭＤＴＴ（１７μｇ／卵母細胞）含有のｐＨ７，４の０．２５ＭトリスＨＣＩ中に各サンプルを再懸濁し、しかる後１５秒間超音波処理することによって調製した。

不溶性物質を１５分間の微量遠心分離によって除去し、卵母細胞と同数得られた抽出物画分を公表された方法でＣＡＴ又はＧＵＳ活性について分析した（ＣＡＴ　：ガリーら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１５巻。

第３２５７頁、１９８７年）；ＧＵＳ：ジェファーソンら、プロシーディング・オブ・ナショナル拳アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８３巻、ｍ８４４７頁。

１９８６年）。

葉肉原形質体をＮ、タバクム（キサンチ種）の葉から分離し、０．７Ｍマンニトール中で保存した。原形質体（１０６）を６０ｘｇで３分間遠心分離し、ＲＮＡ　（８μｇ）含有の水冷０．７Ｍマンニトール１ｍｌ中に再懸濁し、エレクトロポレーション用セルに移し、セルに５０ｎＦコンデンサーを取付けることによって単一電圧パルス（２，５ｋＶ／ｃｍ）を加えた。パルスは速い立上り時間（１ μｓ以下）を有しかつ半減時間的５μｓの指数減衰性を有していた。エレクトロポレーション処理原形質体を０〜４℃で１０分間保存した。０．７Ｍマンニトール１０ｍ１を加え、原形質体を６０ｘｇで３分間の遠心分離によって回収した。

次いで原形質体を培地中に再懸濁し、９ｃｍ径ペトリ皿中２５℃で２１時間インキュベートした。

エレクトロポレーション処理原形質体の各サンプルを、ＣＡＴアッセイの場合には２　ｍ　Ｍロイペプチン及び１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）含有のｐＨ７，４のの０．２５ＭトリスＨＣＩ又はＧＵＳアッセイの場合には１０ｍＭ２ −メルカプトエタノール含有のｐＨ７、０の５０　ｍ　Ｍリン酸ナトリウム１５０μｇ中で沈降させ、再懸濁し、超音波処理した。抽出物を室温又は４℃において１０．ＯＯＯｘｇで１０分間微量遠心分離した。

第１４図は、エレクトロポレーション処理タバコ原形質体中におけるキャップ又は非キャップＣＡＴ　ＲＮＡの発現に関してのオメガプライムの効果について示している。各原スポットは５Ｘ１０’の生存原形質体に相当する抽出物を含んでいた。各サンプルに関する基質（１４Ｃ−クロラムフェニコール）からそのモノアセチル化体（左側に表示）への変換率（％）はトラックの上部に示されている。エレクトロポレーション処理ＲＮＡ又は標準はニドラック１がＲＮＡなしく偽物）；トラック２がＣＡＴ　ＲＮＡ、）ラック３がオメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ、）ラック４が５′キャップ−ＣＡＴＲＮＡ　、　トラック５が５′キャップ−オメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ、）ラック６がトラック１の同量抽出物に加えられた０、１単位の精製ＣＡＴ酵素；トラック７が０．１単位の精製ＣＡＴ酵素単独であった。乾燥ｔｌｃプレートを２日間オートラジオグラフィーに付した後、除去し、モノアセチル化産物（３−Ａｃ／１−Ａｃ）に相当する１４Ｃ標忠スポツト中の放射能について測定したが、変換率％データは抽出物中の関連ＣＡＴ活性を表わしている。オメガプライム（＋１５’キヤツプ）はＣＡＴ　ＲＮＡ発現に関して最も促進的であった。

第１５図は、Ｘ、チェビス卵母細胞中に微量注入されたキャップ又は非キャップＣＡＴ　ＲＮＡの発現に関するオメガプライムの効果について示している。同量の各ＣＡＴ　ＲＮＡ構遺構文体直鎖ＤＮＡ鋳型（２ｎｇ）を完全に卵母細胞１個当たりで注入した。同量の卵母細胞抽出物（０，３Ｘ細胞に相当する）を他に言及のない限り各ケースにおいて分析した。１４Ｃ−クロラムフェニコールからそのモノアセチル化体への変換体（％）は各トラックの上部に示されている。トラック５及び６において、ジアセチル化体への変換率（％）は　で示されている。

微量注入されたＲＮＡ又は標準はニドラック１がＲＮＡなしく偽物）；トラック２がＢｇｌｌＩ直鎮化ｐＪＩ１１０２；）ラック３がＣＡＴ　ＲＮＡ、）ラック４がオメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ；）ラック５が５′キャップ−ＣＡＴ　ＲＮＡ、）ラック６が５′キャップ−オメガプライム−ＣＡＴ　ＲＮＡ、トラック７が２０倍希釈抽出物であること以外はトラック５と同様；トラック８が２０倍希釈されていること以外はトラック６と同様；トラック９がトラック１の同量抽出物に加えられた０、１単位の精製ＣＡＴ酵素；トラック１０が０．１単位の精製ＣＡＴ酵素単独であった。乾燥ｔｌｃプレートを室温で１８時間オートラジオグラフィーに付した後、関連１４ｃ標識スポツトを取出してカウントした。

下記表は更に得られた結果について示している。

第２表オメガプライムによる翻訳増強に関する欠失及び他の配列変更の効果：ＲＮＡＷＬｆｆｉ注入ゼノパス卵母細胞中におけるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ発現注入されたＲＮＡ　１４Ｃ−クロラムフェニコールから１−及び３−モノアセチル化体への変換率％なしく偽物）０．１ＣＡＴ　４．５オメガプライムＣＡＴ　３４．２ Δ１−ＣＡＴ　１７．２ Δ２−ＣＡＴ　９．　７ Δ３−ＣＡＴ　１７．６ Δ４−ＣＡＴ　１４．　６ Δ５−ＣＡＴ　１７．　９Ａ−４Ｃ）ランスバージョン−ＣＡＴ　１５．７ＥＣ，Ａ）　−［Ｕ）　置換− ＣＡＴ　３４．３ｎ　ｎ０．１単位ＣＡＴ　（純粋酵母）１．２すべてのＲＮＡはキャップされていなかった。

上記結果は、オメガプライムがＣＡＴの翻訳を促進させることを示している。欠失体１〜５は、この効果を完全に消失させることなく低下させている。同様のことがＡ→Ｃトランスバージョン体にもあてはまる。〔Ｕ）ｎ置換体は、あるとしてもほとんど効果をもっていない。

第３表イノバス卵母細胞中へのｍＲＮＡの微量注入後におけるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ発現レベルに関する様々なウィルスからの非翻訳５′ 　−リーダー配列の効果注入されたＲＮＡ　’Ｃ−クロラムフェニコールから１−及び３−モノアセチル化体への変換率％なしく偽物）０．１ＣＡＴ　６．３オメガＵＩ　ＣＡＴ　４６．５オメガ（ＳＰＳ）ＣＡＴ　３５．８ＴＹＭＶ　ＣＡＴ　１．　３ＢＭＶ３　ＣＡＴ　５．　０Ｒ３Ｖ　ＣＡＴ　Ｓ、４Ａ］ＭＶ４　６．７０．１単位ＣＡＴ　（純粋酵素）１．３すべてのＲＮＡはキャップされていなかった。

オメガＵ１はＴＭＶ（プルガレ）の標準株に由来する。

オメガＳＰＳはＴＭＶのトマト株に由来する。

ＴＹＭＶ　：カブ黄斑モザイクウィルスリーダーＢＭＶ３：ブロウムモザイクウイルスＲＮＡ　３ＲＳＶ　ニラウス肉腫ウィルスからの部分リーダー配列ＡＩＭＶ４．アルファルファモザイクウィルスＲＮＡ４前記結果は、ＴＭＶＵＩ由来オメガプライムがこの系においてＣＡＴ　ＲＮＡの翻訳を促進することを示している。ＴＭＶ　トマト株オメガプライムも同様であるが、但しやや劣っている。他のウィルスリーダーはさほど又は全く効果がなく、ＴＹＭＶリーダーは阻害的であるかもしれない。

第４表小麦麦芽無細胞系におけるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｍＲＮＡのインビトロ翻訳に関する５′キヤツプのある又はない様々な５′非翻訳リーダー配列の効果（下記結果は、ＣＡＴ　ｍＲＮＡ単独よりも何倍促進的であるかを示すため、未修正ＣＡＴｍＲＮＡリーダー配列を１．０として標準化された）付加されたＲＮＡ　非キャップ体　キャップ体ＣＡＴ　１．０　１．０オメガプライムＣＡＴ　２．８　３．７Ａ−Ｃ）ランスバージョン置換−ＣＡＴ　２．１　３．４ＴＭｖ　トマト株オメガプライム−ＣＡＴ　１．７　３．ＯＴＹＭＶ−ＣＡＴ　Ｏ，３３、ＯＢＭＶ３−ＣＡＴ　１．４　２．８Ｒ３Ｖ−ＣＡＴ　Ｏ，６２，５ＡＩＭＶ４−ＣＡＴ　２．１　２．３注：これらの数値は、ＣＡＴメツセージの５′末端の様々な配列の付加によって生じる翻訳の促進率を比較したものである。翻訳はキャップのある又はキャップのないメツセージに関して行なわれた。各欄は（第２表及び第３表のように）独立したゲルから切除回収された放射性ＣＡＴタンパク質の収率を示している。各バンドを切出し、カウントし、かつｍＲＮＡが未修正ＣＡＴメツセージであるバンドに対して標準化した。

前記結果は、オメガプライムが５′キヤツプの存在又は非存在下でこの系において促進させることを示している。他のウィルスリーダー配列及びオメガプライムの誘導体もしくは部分は翻訳を様々な程度に増強させるが、但しオメガプライム自体よりも有意に優れているケースはまれである。

第５表大腸菌無細胞系中でのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｍＲＮＡのインビトロ翻訳に関する、すべて５′キヤツプ構造以外の様々な非翻訳リーダー配列の効果付加されたＲＮＡ　非キャップ体ＣＡＴ　１．０オメガプライムＣＡＴ　９．０ Δ１−ＣＡＴ　３．３ Δ２−ＣＡＴ　２，５ Δ３−ＣＡＴ　５，３ Δ４−ＣＡＴ　４．２ Δ５−ＣＡＴ　３，８Ａ−４ＣトランスバージＥ！：／　ＣＡＴ　４．　１〔Ｃ，Ａ）　−（Ｕ）　置換　ＣＡＴ　１．９ｎ　２−２一１Ｔ　）７ト株オメガ　ＣＡＴ　６．　６ＴＹＭＶ　ＣＡＴ　Ｏ，２ μＭＶ３　ＣＡＴ　３．７Ｒ５Ｖ　ＣＡＴ　１．５Ａ］ＭＶ４　ＣＡＴ　１．４上記結果は、オメガプライム、その誘導体の一部及びトマト株オメガプライムが翻訳を最大に促進させることを示している。他の配列も大半は、但し異なる程度で促進させる。大腸菌は翻訳のために５′キヤツプを要しない。

第６表タバコ原形質体中にエレクトロポレーションされたβ−グルクロニダーゼｍＲＮＡ　（ｐＲＡＪ　２３５／２４０由来）の翻訳に関する様々なリーダーの効果用いられた　原形質体抽出物中のタンパク質　促進ＧＵＳｍＲＮＡ　１μｇ当たりで１分間に切断さ　倍率構造体＊　た４−メチルウンベリフェリルグルクロニド（ナノモル）［ブランク］（ｍＲＮＡなし）非キャップリーダー２３５　［ＳＰ６転写体。

ポリリンカーリーダー）　＜０．０１　１オメガプライム（Ｕｌ） −２３５０，２５＞２５オメガプライム（ＳＰＳ）　。

−２３５０，１５＞１５ＴＹＭＶ−２３５＜０．０１　− ＡＩＭＶ４−２３５　＜０．０１　− ＢＭＶ３−２３５　＜０．０１　− Ｒ３Ｖ−２３５＜０．０１　− キャップリーダーキャップ２３５　Ｃ３Ｐ６転写体ポリリンカーリーダー）　０．０３　１キヤツプオメガプライム −２３５０，５４１８キヤツプオメガプライム（ＳＰＳ）−２３５０，４３１４キャップＴＹＭＶ−２３５＜０．０１　−キャップＡＩＭＶ４−２３５　０．２３　８キャップＢＭＶ３−２３５　０．２３　８キャップＲＳＶ−２３５０，２１７キヤツプΔ１−２３５　０．５５　１８キャップΔ２−２３５　０．５０　１７キヤツプΔ３−２３５　０．３２　１１キャップΔ４−２３５　０．５４　１８キャップΔ５−２３５　０．５４　１８キヤツプＡ→Ｃトランスバージョン−２３５，０，６９２３キヤツプｌ”ｃ、Ａ）　→ （Ｕ）　置換　＜０．０１（ブランク値は他のすべての値から引かれる）（＊構造体は５′キヤツプのある又はない“悪い。

ＧＵＳ外来（ｅｘ）ｐＲＡＪ　（２３５／２４０）であった）すべてのｍＲＮＡ構造体を８μｇ　／　ｍｌでエレクトロボレーシラン処理し、洗浄された原形質体を（ガリーら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１５巻、第３２５７頁、１９８７年）記載のように２０時間インキ下記のとおりである：ポリリンカー中へのオメガプライムの挿入は下記のとおりであるニーの箇所におけるオメガプライムは下記のとおりである：ｕＡＵ　ＵＵＵ　ｕＡｃ　ＡＡＣＡＡＬＩ　ＵＡＣＣＡＡ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＡＡＣＡＡＣＡＬＩＵＡＣＡ　Ａｕｕ　八ｃｕ　Ａｕｕ　ｕＡｃ　＾υυ　ＵＡＣＡ及び欠失オメガプライムオ導体等がしかるべく後に続く。

子牛プレプロキモシン又はチキンプレリゾチームをコードするメツセンジャーＲＮＡを、ＴＭＶ５’末端配列（オメガプライム）を付加させて又はさせないでインビトロ合成した。ｍＲＮＡをウサギ網状赤血球（ＭＤＬ）、小麦麦芽（ＷＧ）又は大腸菌（Ｅ　Ｃ）由来の系でインビトロ翻訳させた。

プラスミドｐＪｆｆ６及びｐＪＩＴ７（第１６図）をプラスミドｐＳＴ６４ＣＴ、ｐＳＰ６４ＬＴ　［スリード（Ｓｌｅａｔ）ら、パイロロジー、第１５５巻、第２９９頁。

１９８６年〕及びｐＪＩｌｌｏｌの成分を用いて作成した。

ｐＪＩＩ６及びｐＪＩＩ７は、Ｍ　１３　ｍ　ｐ　１１由来ポリリン力−配列に隣接するバクテリオファージ５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む転写プラスミドｐｓＰ６４　［メルトン０１ａｌｔｏｎ）　、１９８４年〕の誘導体である。ｐＳＰ６４ＣＴ及びｐＳＰ６４ＬＴのプレプロキモシン及びプレリゾチームコード領域をそれぞれＨｉｎｄｍ断片として取出し、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片でプラント末端化し、ｐＪＩｌｌｏｌのＨｉｎｃｎ部位に組込んでクローニングし、それぞれｐＪＩＩ６及びｐＪＩＩ７を得た（第１６図）。

これらの構造体は、５′末末端オメガプライム列をもつメツセンジャー（冒ｅｓｓｅｎｇｅｒ−ｓｅｎｓｅ　）プレプロキモシン及びプレリゾチーム転写体の合成を指示させるために用いた。親プラスミドｐＳＰ６４ＣＴ及びｐＳＰ６４ＬＴはオメガプライムのないｍＲＮＡの合成のための鋳型であった。

結果は下記第７表に示されている。

第７表８０Ｓ−及び７０Ｓ−リポソームに基づく翻訳系におｊする２種の真核生成物ｍＲＮＡの発現に関するオメガプライムの効果ゲル精製ポリペプチド中へのＬ−Ｃ３５Ｓ、ｌ　−メチオニンの取込み量（ｃｐｍ）無細胞系　ＣＰＭ（相対的促進度）ＭＤＬ　ＷＧ　大腸菌ＳＰ６転写体プレリゾチーム　５０４０（１，０）　３７３０（１，０）　０　（１，０）オメガプライムプレリゾチーム　５２９０（１，０）　１０２４０（２，８）　１０３０（）プレプロキモシン　２４７０（１，０）　１１１０（１，０）　Ｏ（１，０）オメガプライムプレプロキモシン　７２８０（３，０）　１００１０（９，１）　２１８０（）前記方法と同様の方法で、様々なキメラＲＮＡ構遺体を、ＮＰＴｎコード領域、及びオメガプライム、２つのタンデム（ｔａｎｄｅｍ）オメガプライム領域、長鎖（７７塩基）“ジャンク（ｊｕｎｋ）　”　リーダー（ポリリンカー）配列もしくは中央オメガプライムと一緒の“ジャンク°を用いて作成した。構造体は第１７図に示されており、結果は下記第８表に示されている。

これは、ランダムポリリンカー配列が８ＯＳリポソーム系においてオメガプライムの代わりにならず、原核生物（７０Ｓ）系でのみわずかに代わりになることを示している。２つのタンデムオメガプライムのみが７０Ｓ発現に寄与する（例えば、オメガプライムの単一コピー）。

β−グルクロニダーゼｍＲＮＡ　（ＧＵＳ　ｍＲＮＡ）の発現に対するオメガプライムの効果に関して第６表（前掲）に掲示されたデータを更に拡張するために、別の一連の構造体として開始コドン（ＡＵＧ）近辺の配列関係が修正されたＧＵＳ遺伝子を用いた。下記の“良好な配列関係°をもつリーダー：鶴ＳＰ６二五迂　シエＩを含むプラスミドｐＲＡＪ２７５は、ＧＵＳのこのバージョンのための供給源であった。オメガプライム及び様々な他のリーダー構造体を前記のようにＨｉｎｄｎＩ／５ａ１１部位に挿入した。ｐＲＡＪ２７５構造体の詳細は下記のとおりである：（ジェファーソンら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、ｉ８３巻。

第８４４７頁、１９８６年）、ここにおいてＧＵＳの５′配列は連続的（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ　）　Ｂ　Ａ　Ｌ　３１削除によって除去され、コザック〔ミクロバイオロジー・レビューズ、第４７巻、第１頁、１９８３年（ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ、　４７．１　（１９８３）　）　）により規定された“コンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　）　”翻訳イニシエーターを構成していた合成オリゴヌクレオチドで置き換えられている。このプラスミドはイニシエーターＡＴＧコドンに位置する特有のＮｃｏＩ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を有しており、その周囲配列関係はＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＴＣである。

イニシエータ近辺の配列関係は所定量のｍＲＮＡの翻訳産物レベルに関して十分な効果を発揮しうろことが、インビトロ及びインビボ双方で示された。この構造はこの効果を最大化させるために調整された。それはｐＵｃ１９におけるＳａ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片として与えられた。

５′キヤツプ又は非キャップ転写体を前記のようにタバコ原形質体中にエレクトロポレーションし、ＧＵＳ発現レベルを抽出物中で測定した。

非キャップＲＮＡもＭＤＬまたはＷＧ無細胞翻訳系に加え、合成されたＧＵＳタンパク質レベルは第２図及び第３図（第１表）のように放射性ゲルバンドを切取ってカウントすることによって測定した。結果は第９表に示されている。

端子　０　−０　［Ｆ］ＲＮＡ構遺体の別の１組を、大腸菌リポータ−遺伝子β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）及び更に誘導トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーターを用いて、前記と同様の方法により作成した。Ｔｒｐプロモーターはファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｌａ　Ｌｔｄ、）から購入し、制限エンドヌクレアーゼ消化、補充、サブクローニング等の慣用的技術により修正し、３’　−ＨｌｎｄＩＩ［部位（第１８図）及びプラント５′末端を作出した。次いで、この二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片をＳＰ６プロモーター（インビボの大腸菌中では作動しない）及び重要な５′　− リーダー構造の間で様々なリーダー−リポータ−（ＧＵＳ）遺伝子プラスミド中に挿入した。

得られたプラスミドＤＮＡは標準的方法によりコンピテント（ｃｏ＋ａｐｅｔｅｎｔ　）大腸菌細胞を形質転換させるために用いたが、Ｔｒｐプロモーターは現場で誘導されて、キメラリーダー−リポータ−ｍＲＮＡを産出した。転写開始点はＨｉｎｄｍ部位（ＡＡＧＣＴＴ）中のＧに対応する。

形質転換された大腸菌細胞中における転写体の発現は、分光測定法により調べた（ジェファーソンら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８３巻、第８４４７頁、１９８６年）。

結果（第１０表）は、ＧＵＳ発現がオメガプライムの存在により及びある程度オメガプライムの他のリーダー配列もしくは跣導体により、コザック配列関係の“ 良好な′又は”悪い″構造体のいずれかからインビボで増強されたことを示している。

第１０表安定な形質転換大腸菌細胞中Ｔｒｐプロモーターによりコントロールされた発現ｐ−ニトロフェニルグルクロニドのおよその相対的分光測定変換倍率２３５−ＧＵＳ（“悪い′配列関係）　１オメガプライム２３５ＧＵＳ　７ｘ２７５−ＧＵＳ（“良好な′配列関係）　１オメガプライム−２７５− ＧＵＳ　（“良好°な配列関係）　８ｘΔ１−２７５−ＧＵＳ　５−８ｘ Δ２−２７５−ＧＵＳ　（７５ｘ：確認予定）Δ３−２７５−ＧＵＳ　（７５ｘ　：確認予定）Δ４−２７５−ＧＵＳ　５−８ｘ Δ５−２７５−ＧＵＳ　５−８ｘＡ−４Ｃ２７５ＧＵＳ　（７５ｘ　：確認予定）（Ｃ，Ａ）　−（Ｕ）　ｎ２７５　ＧＵＳ　５ｘＴＹＭＶ　２７５　ＧＵＳ　３−４３ −４ｘＡＩ　２７５　ＧＵＳ　３−４３−４ｘＢ　２７５　ＧＵＳ　１−２ｘＲ５Ｖ　２７５　ＧＵＳ　１−２Ｘ（上記結果はポリリンカーリーダーのみを含む各々のＧＵＳ構造体に対して標準化された）結論オメガプライムは、現場でＴｒｐプロモーターを用いた場合に、プラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌中でのＧＵＳ　ＲＮＡのインビボ発現を増強する。

継続実験は超らせん二重鎖１）ＵＣｌ３　ＤＮＡを用いて行なわれたが、これはカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ツバリンシンターゼターミネータ−〔アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｒａｃ４ｅｎｓ　）由来〕及びそれらの中間にＣＡＴ　ＤＮＡ　（・、ム）もしくはオメガプライムＣＡＴ　ＤＮＡ　（０，Δ）のいずれかを有するように修正されている。

構造体（第２０図）は二元ベクター系から作成したが〔ベバン（Ｂｅｖａｎ　）　、ヌクレイツク書アシッズ・リサーチ、第１２巻、第８７１１頁、１９８４年〕、その場合においてＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＮｏｓターミネータ−をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲ１部位で切除し、プラスミドｐＵｃ１９に挿入することによって１２．１３．１４．１５．１６，１７．１８．１９１２０１２１．２２ωω　、・　嶌−０，８６１、Φ　壷　１・９４手続補正書（方式）昭和６３年１２月２２８１、事件の表示ＰＣＴ／ＧＢ　８７１００３９０２、発明の名称ｍＲＮＡの翻訳３、補正をする者事件との関係　特許出願人ダイアチック、リミテッド４、代　理　人　（郵便番号１００）東京都千代田区丸の内三丁目２番３号電話東京（２１１）２３２１大代表昭　和　６３年　１１月　１７日（発送日　昭和６３年１１月２２日）６、補正の対象特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の特許出願人の欄、明細書及び請求の範囲、及び図面の翻訳文、委任状。

７、補正の内容（１）　別紙の通り。

国際調査報告ｌｍｓ＋ａｔ＋ｅ＋″ｌＡ＃ｍｍ１．ｅｓｌｌｖ＠Ｃ”７Ｇｍ８７１００：００２１＋＋１ψ中−＾峠嘘１１−ｍ　Ｉ＋ｅ　ｐ（τ／ＧＢ　８７１００２９０　３

Claims

【特許請求の範囲】

１．ウイルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウイルスの５′−リーダー配列（又はその誘導体もしくは部分）における、ＲＮＡとしての又は相補的ＤＮＡとしての、即ち５′−リーダーがｍＲＮＡと接続している場合のｍＲＮＡの翻訳のエンハンサーとしての用途。
２．ＲＮＡウイルスが植物ウイルスである、請求項１に記載の用途。
３．植物ウイルスがタバコモザイクウイルスである、請求項２に記載の用途。
４．５′−リーダー配列が本明細書に記載されているオメガプライム又はその誘導体もしくは部分である、請求項３に記載の用途。
５．５′−リーダー配列が５′キャップを含んでいる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の用途。
６．請求項１〜５のいずれか一項に記載されている５′−リーダー配列及び該リーダー配列を供与するウイルス由来ではない下流の配列を含むｍＲＮＡ。
７．請求項１〜４のいずれか一項に記載されている５′−リーダー配列に対して相補的なＤＮＡ配列。
８．プロモーター、請求項１〜４のいずれか一項に記載されている５′−リーダー配列に対して相補的な配列、及び適切な開始コドンを含むオーブン読取枠を含んでいるＤＮＡ配列。
９．転写を増強させるために用いられる配列を含む、請求項９に記載のＤＮＡ配列。
１０．請求項８又は９に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
１１．請求項８又は９に記載のＤＮＡ配列を自己の細胞中に組込んでおり、その結果オープン読取枠でコードされているタンパク質の発現が高められる生物体。