JPH10146197A - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

ポリペプチドの製造方法

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JPH10146197A JP9228371A JP22837197A JPH10146197A JP H10146197 A JPH10146197 A JP H10146197A JP 9228371 A JP9228371 A JP 9228371A JP 22837197 A JP22837197 A JP 22837197A JP H10146197 A JPH10146197 A JP H10146197A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】ｍＲＮＡの翻訳を増強するＲＮＡウイルスの
５′領域のリーダー配列を利用したポリペプチドの製造
方法の提供。 【構成】下記ｉ）、ｉｉ）及びｉｉｉ）を含む配列を有
するキメラｍＲＮＡ分子の翻訳によるポリペプチドの製
造方法： （ｉ）ＲＮＡウイルスの５′−非翻訳リーダー又はその
誘導体もしくは部分である翻訳増強配列（但し、プロウ
ムモザイクウイルスＲＮＡ ４の５′−非翻訳リーダー
配列を除く）、 （ｉｉ）開始コドン、及び （ｉｖ）上記ポリペプチドをエンコードするコード配列 但し、上記コード配列は翻訳増強配列が由来するＲＮＡ
ウイルスに非相同であり、上記翻訳増強配列、開始コド
ン及びコード配列間の関係は、キメラｍＲＮＡ分子の翻
訳が翻訳増強配列によって増強されるようなものであ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明はｍＲＮＡの翻訳のエンハンサーに
関する。
【０００２】真核生物及び原核生物が翻訳を開始するメ
カニズムは、一部共通の特徴を有しているが、他の点で
は異なっていることが知られている。真核生物のメッセ
ージは機能上モノシストロニック（monocistronic ）で
あって、翻訳は５′末端で始まり、この末端におけるキ
ャップ構造（ｍ７Ｇ５′ｐｐｐ５′Ｇ．．．）の存在に
よって促進される〔シャトキン，セル，第９巻，第６４
５頁，１９７６年（Shatkin, Cell, 9, 645 (1976)〕。
原核生物のメッセージはポリシストロニック（polycist
ronic)であって、５′末端以外の部位で開始しうるが、
キャップの存在は翻訳促進に繋がらない。真核生物及び
原核生物は双方ともコドンＡＵＧで翻訳を開始するが、
但し原核生物はＧＵＧを利用することもできる。双方に
おける翻訳は、開始コドン近くのある配列によって促進
される。原核生物の場合には、それは所謂シャイン‐ダ
ルガルノ（Shine-Dalgarno）配列（開始コドンより上流
のプリンに富む３〜１０ヌクレオチドの領域）である。
真核生物の場合には、それは（ＡＵＧ開始コドンのＡが
＋１と表示される場合に）−３位のプリン及び＋４位の
Ｇ残基であるが、更に効果的なチューニング（tuning）
のためには他の配列も加わる必要がある。これはスキャ
ニング（scanning）モデルの“緩和”バージョン（"rel
axed" version ）の一部であり〔コザック，ヌクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ，第１２巻，第８５７頁，１９
８４年（kozak, Nucleic Acids Research, 12, 857 (19
84))〕、それによって４０Ｓリボソームサブユニットが
真核生物ｍＲＮＡの５′末端で結合し、モデルの要求を
満たす最初のＡＵＧと出会うまで、即ち６０Ｓサブユニ
ットが４０Ｓサブユニットと結合してタンパク質合成が
始まる時点まで、配列をスキャニングし続ける。この点
については、下記コザックの文献を参考にすることがで
きる：セル，第１５巻，第１１０９頁，１９７８年；ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ，第９巻，第５２３３
頁，１９８１年；及びセル，第４４巻，第２８３頁，１
９８６年。
【０００３】開始コドンの中及び近辺で必要なこれらの
配列以外に、翻訳を複製の面で促進させることが知られ
た他のｍＲＮＡ領域は存在しない。真核生物の転写にお
いて、“エンハンサー”領域として知られる配列は転写
促進を図ることができる。ＲＮＡウイルスは、正もしく
は負の一重鎖ＲＮＡ又は二重鎖ＲＮＡを含んでいる。Ｒ
ＮＡウイルス群としては、大多数の植物ウイルス（９０
％以上）、一部の動物ウイルス及び数種のバクテリオフ
ァージがある。
【０００４】ＲＮＡウイルスの中で最も広く研究された
ものの１つは、タバコモザイクウイルス（以後ＴＭＶと
称される）である。ＴＭＶの完全ヌクレオチド配列が知
られている〔ゲレットら，プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ，第
７９巻，第５８１８頁，１９８２年（Goelet et al.,Pr
oceeding of National Academy of Science USA, 79, 5
818(1982)）〕。ＴＭＶ ＲＮＡの５′領域は鎖長７０
ヌクレオチドのＲＮアーゼＴ１耐性断片として１９６５
年に始めて単離されたが〔マンドリー，ツァイトシュリ
フト・フュール・フェレルブングスレーレ，第９７巻，
第２８１頁，１９６５年（ Mundry, Zeitschrift fur V
ererbungslehre, 97, 281 (1965) ）〕、内部Ｇ残基を
有していなかった〔マンデレル，ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー，第２４３巻，第３６７１
頁（Mandeles, Journal of Biological Chemistry, 24
3，3671）〕。この領域〔以後、オメガと称される；マ
ンデレス，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Journal of Molecular Biologi
cal Chemistry ），第２４３巻，第３６７１頁〕は配列
決定され〔リチャーズら，ヨーロピアン・ジャーナル・
オブ・バイオケミストリー，第８４巻，第５１３頁，１
９７８年（Richards et al., European Journal of Bio
chemistry, 84,513 (1978)）〕、小麦麦芽リボソームと
二重（disome）開始複合体を形成することが示された。
１つのリボソームは、１２６キロドルトン（ＫＤａ）の
タンパク質コード領域のＡＵＧ開始部位を占めており、
第二のものは上流リーダー配列と結合している〔フィリ
ポウィクズ（Filipowicz）及びヘッニ（Haenni），プロ
シーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンスＵＳＡ，第７６巻，第３１１１頁，１９７９
年；コナルスカら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー，第１１４巻，第２２１頁，１９８
１年（Konarska et al., European Journal of Biochem
istry, 114, 221 (1981) ）〕。リボソーム会合におけ
るオメガの役割を支持するもう１つの最近の証拠は、ウ
ィルソン（Wilson）及び共同研究者の脱外被（uncoatin
g ）／遺伝子発現データからきている〔ジャーナル・オ
ブ・ゼネラル・バイロロジー，第６６巻，第１２０１
頁，１９８５年(Journal of General Virology，66, 12
01 (1985) ）及びＵＣＬＡシンポジウム，第５４巻，第
１５９頁，１９８７年(UCLA Symposium, 54, 159(198
7)）で差違検討されている〕。ＴＭＶ粒子が５′末端へ
のリボソームの結合及び３′末端方向へのそれらの翻訳
移動によって脱外被されていることは、様々なインビト
ロ翻訳系で観察された。
【０００５】ＲＮＡウイルスの５′領域はｍＲＮＡの翻
訳エンハンサーとして機能することが、ここに発見され
たのである。第一面として、本発明はウイルスＲＮＡの
最初の開始コドンまでのＲＮＡウイルスの５′‐リーダ
ー配列（又はその誘導体もしくは部分）を含むｍＲＮＡ
を提供するが、このｍＲＮＡはリーダー配列を供与する
ウイルスに由来しない下流配列も含んでいる。
【０００６】第二面として、本発明はウイルスＲＮＡの
最初の開始コドンまでのＲＮＡウイルスの５′‐リーダ
ー配列（又はその誘導体もしくは部分）と相補的なＤＮ
Ａ配列を提供する。
【０００７】第三面として、本発明は、プロモーター、
ウイルスＲＮＡの最初の開始コドンまでのＲＮＡウイル
スの５′‐リーダー配列（又はその誘導体もしくは部
分）と相補的な配列及び適切な開始コドンを含むオープ
ン読取枠を含んでいるＤＮＡ配列を提供する。本発明は
このようなＤＮＡ配列を含む発現ベクターをも提供す
る。
【０００８】第四面として、本発明は、ウイルスＲＮＡ
の最初の開始コドンまでのＲＮＡウイルスの５′‐リー
ダー配列（又はその誘導体もしくは部分）における、Ｒ
ＮＡとしての又は相補的ＤＮＡとしての、即ち５′‐リ
ーダーＲＮＡがｍＲＮＡと接続している場合のｍＲＮＡ
の翻訳のエンハンサーとしての用途を提供する。
【０００９】配列決定されたほとんどのＲＮＡウイルス
は、５′‐リーダー配列、即ち最初の開始コドンまでの
（但し、それを含まない）５′末端における配列を含ん
でいる。いずれのＲＮＡウイルスからの適切な５′‐リ
ーダー配列も、本発明の翻訳エンハンサーとして使用可
能である。
【００１０】前記のように、ＴＭＶの５′‐リーダー配
列＋ＡＵＧ開始コドンはオメガとして知られており、か
つそのヌクレオチド配列も公知であるため（リチャーズ
ら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー，第８４巻，第５１３頁，１９７８年）、ｃＤＮＡ
は合成することができる。ＴＭＶのオメガプライム
（Ω′，図１参照）配列は、本発明の好ましい翻訳エン
ハンサーを表わしている。
【００１１】下記のような他のＲＮＡウイルスの５′‐
リーダー配列による翻訳増強に関する情報も利用可能で
ある：カブ黄斑モザイクウイルスゲノムＲＮＡ（フィリ
ポウィクズ及びヘッニ，プロシーディング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７６
巻，第３１１１頁，１９７９年）、ブロウム（brome)モ
ザイクウイルスＲＮＡ３、アルファルファモザイクウイ
ルスＲＮＡ４（ゲレットら，プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第
７９巻，第５８１８頁，１９８２年）；ラウス肉腫ウイ
ルス〔ジェイ・エル・ダーリックス（J.L. Darlix)ら，
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１０巻，第５１
８３頁，１９８２年〕。
【００１２】いずれの具体的ケースにおいても、翻訳エ
ンハンサーとしての機能が調節されるもののそれが損わ
れないような方法で天然５′‐リーダー配列を変えるこ
とは、ほぼ確実に可能であろう。このような変異体は本
明細書において“誘導体”と呼ばれているが、天然配列
の誘導体及びそれらの翻訳エンハンサーとしての用途は
本発明の一部を構成している。天然５′‐リーダー配列
（又は誘導体配列）の一部のみが翻訳増強を起こすため
に必要とされるケースもあるであろう。配列のこのよう
な一部は本明細書において“部分”と呼ばれているが、
天然配列もしくはその誘導体の部分及びそれらの翻訳エ
ンハンサーとしての用途は本発明の一部を形成してい
る。
【００１３】いずれの具体的ケースにおいても、ＲＮＡ
ウイルスの５′‐リーダーのヌクレオチド配列の決定
は、公知かつ易利用性の技術を用いる当業者の技術的範
囲内にあるべきである。同様に、翻訳増強のために必要
な天然５′‐リーダー配列の一部及び修正もしくは削除
されうる配列の同定（即ち、天然配列の誘導体及び部分
の同定）は、ルーチン的実験により決定されうる問題で
ある。
【００１４】ＲＮＡウイルスの５′‐リーダー配列（又
はその誘導体もしくは部分）は、例えばＴ４ＲＮＡリガ
ーゼを用いて適切なｍＲＮＡの上流にそれらを結合させ
ることによって、それ自体を本発明の翻訳エンハンサー
として使用することができる。５′‐リーダー配列は下
流ｍＲＮＡの開始コドンのすぐ隣であってもよいし、又
は介在配列によってそれから離されていてもよい。しか
しながら、相補的ＤＮＡの形で５′‐リーダー配列を用
いることが好ましい。ｃＤＮＡは望ましいいかなる方法
でも得ることができる。しかしながら、問題の５′‐リ
ーダー配列の比較的短い鎖長を考慮すれば、ｃＤＮＡを
化学的に合成することが通常最も好都合であろう。ｃＤ
ＮＡは通常発現ベクターに組込まれる。発現ベクター
は、ベクター中に含まれているそれらのＤＮＡ配列を発
現させることができ、かつそのＤＮＡ配列がそれらの発
現を行なわせうる他の配列と作働可能に結合せしめられ
ているのであれば、いかなるベクターであってもよい。
発現ベクターは、プロモーター、ウイルスＲＮＡの最初
の開始コドンまでの（但しそれを含まない）ＲＮＡウイ
ルスの５′‐リーダー配列（又はその誘導体もしくは部
分）と相補的な配列及び適切な開始コドンを含むオープ
ン読取枠を有するＤＮＡ配列を通常含んでいる。オープ
ン読取枠は通常重要な１種以上のタンパク質についてコ
ードしている。発現ベクターは、ＤＮＡ配列が転写及び
翻訳により発現される宿主細胞中に安定的に又は一時的
に直接組込まれる。安定的発現の場合には、ベクターは
エピソームとして又は染色体ＤＮＡの必須部分として宿
主中で複製可能でなければならない。又は、発現ベクタ
ーはインビトロで転写させることができ、その際にはＲ
ＮＡが一時的発現のために細胞中に直接組込まれる。
【００１５】本発明の翻訳エンハンサーは、ｍＲＮＡの
翻訳能力を高めることが望まれるいかなる状況下におい
ても使用可能である。しかしながら、エンハンサーの効
果はそれが存在しなければ不十分にしか翻訳されないｍ
ＲＮＡの場合において最も著しいことに留意すべきであ
る。したがって、本発明のキャップもしくはエンハンサ
ー又は双方の付加は翻訳を促進させることになる。既に
キャップを有しているｍＲＮＡの場合であっても、本発
明のエンハンサーの効果はなお存在している。
【００１６】本発明の翻訳エンハンサーは、例えば植物
細胞、細菌及び動物細胞のような多数の異なるタイプの
発現系において有効であるが、但し特定のエンハンサー
は他の系よりむしろ１つの系とより適合するようであ
る。例えばインビトロ試験時におけるＴＭＶのオメガ配
列はウサギ網状赤血球溶解物系の場合よりも小麦麦芽系
及び大腸菌（Escherichia coli）の場合により大きな増
強性を示すようであるが、翻訳の増強自体は３種すべて
の系で観察される。特定のエンハンサーと特定の発現系
との適合性は、通常当業者の技術的範囲内に十分属する
事項であろう。
【００１７】一般的に、本発明の翻訳エンハンサーは、
農業を含む商業面に対する生物又は細胞系の価値がその
天然遺伝子又は人工産生遺伝子の１つの発現レベルによ
って決定される場合であれば、いずれにおいても利点を
生かしつつ用いることができる。 (i) 遺伝子工学生物又は細胞系で商業的に有用なタン
パク質の産生に際して。 (ii) 酵素で触媒される中間代謝産物の産生速度が特定
酵素の合成速度を増加させることによって高められうる
ような発酵に際して。 (iii) ウイルス感染の影響がウイルス弱毒体との前接触
によって抑制させることができ、かつ保護を付与する成
分の産生レベルを増加させることにより保護レベルを高
めることが有利であるようなウイルス交差保護に際し
て。例えば植物は、ウイルス外被（coat）タンパク質に
ついてコードするＴＭＶ ＲＮＡ部分のｃＤＮＡコピー
を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium ）遺伝子工
学株にそれらを接触させることによってＴＭＶ感染から
保護することができる。植物ゲノムに挿入された細菌ｃ
ＤＮＡは、ウイルス自体による感染から植物を保護する
外被タンパク質を連続的に発現する。 (iv) 除草剤耐性等の性質が植物の中間代謝の人工的修
正によって付与されるような植物の遺伝子工学に際し
て。 (v) 例えば、部分的クローンの発現産物に対する抗体
を産生させることが望まれている場合における、遺伝子
の部分的クローンの発現に際して。
【００１８】本発明は下記実験操作によって更に詳細に
説明されている。実 験 ｍＲＮＡ 本発明の態様のキメラｍＲＮＡを、図１で示されている
ように、下記方法で産生した。ＴＭＶ ＲＮＡブルガレ
（vulgare ）株の配列を用いて（ゲレットら，プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンスＵＳＡ，第７９巻，第５８１８頁，１９８２
年）、１２６ｋＤａオープン読取枠のＡＵＧ開始コドン
の上流において５′キャップ（ｍ７Ｇｐｐｐ及び隣接Ｇ
残基）を含まない６７塩基配列に対して相補的なＤＮＡ
配列を含む８１塩基オリゴヌクレオチドを合成した。こ
の配列はオメガプライムと呼ばれている。ＨｉｎｄIII
部位をこのオリゴヌクレオチドの５′末端に組込み、か
つＳａｌＩ部位を３′末端に組込んだ。オメガプライム
配列の３′末端における１３塩基及びＳａｌＩ部位を含
む２０塩基の第二オリゴヌクレオチドを、第二鎖合成用
のプライマー（primer）として合成した。アニーリング
（annealing ）後、第二鎖合成はＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノウ断片を用いて完了させた。
【００１９】得られた二重鎖８１ｂｐ断片をＨｉｎｄII
I／ＳａｌＩで消化させて一重鎖付着端をもつ７７ｂｐ
断片を作成し、ｐＵＣ１９の対応部位に挿入した。合成
の結果ＴＭＶのオメガプライム配列が正しい向きをして
いるという事実は、ジデオキシ鎖ターミネーション法
〔サンガ（Sanger）ら，プロシーディング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７４
巻，第５４６３頁，１９７７年〕を用いた配列分析によ
って立証された。次いで、ＴＭＶのオメガプライムを含
む断片をプラスミドｐＪII１のＨｉｎｄIII／ＳａｌＩ
部位に組込み、ｐＪII１０１を得た。ｐＪII１は、Ｂａ
ｍＨＩ断片としてのアセンブリー（assembly）配列のＴ
ＭＶ源をｐＳＰ６４の対応部位に挿入し〔メルトン（Me
lton），ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１２
巻，第７０３５頁，１９８４年〕、かつＳｍａＩ部位を
ＢｇｌII部位に変えることにより〔スリートら，バイオ
ロジー，第１５５巻，第２９９頁，１９８６年（Sleat
et al., Virology, 155, 299 (1986) ）〕得られる。
【００２０】Ｔｎ９のクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を含むｐＣＭ１から
７７９ｂｐＳａｌＩ末端断片〔クローズ及びロドリゲ
ス，ジーン，第２０巻，第３０５頁，１９８２年（Clos
e and Rodriguez, Gene, 20, 305 (1982) ）〕をｐＪII
１及びｐＪII１０１のＳａｌＩ部位に組込み、それぞれ
ｐＪII２及びｐＪII１０２を得た。Ｔｎ５のネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼII遺伝子（ＮＰＴII）を含
むｐＫＮＲ‐Ｈからの１．２ｋｂ ＢｇｌII／ＳａｌＩ
断片〔ギャリーら，ジャーナル・オブ・バイテリオロジ
ー，第１６１巻，第１０３４頁，１９８５年(Gallie et
al., Journal of Bacteriology, 161, 1034 (198
5)）〕をクレノウ断片でブラント末端化し、ｐＪII１及
びｐＪII１０１のＡｃｃＩ部位に組込み、それぞれｐＪ
II３及びｐＪII１０３を得た。ＣＡＴ及びＮＰＴII双方
の正確な配向性は制限断片分析によって立証された。
【００２１】ｐＪII２及びｐＪII１０２をＢｇｌIIでか
つｐＪII３及びｐＪII１０３をＥｃｏＲＩで直鎖化後、
各々のＲＮＡ転写体をＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの使
用により産生した。各々のキャップ体も、キャップ転写
体の対応的産生を確保するＧｐｐｐＧ及びＳＰ６ポリメ
ラーゼの反応条件を用いて産生した。キャップ及び非キ
ャップ反応からのＲＮＡ並びにオメガ配列をもつ又はも
たない構造体に関する同量産生は、ホルムアルデヒド‐
アガロースゲルを変性させることによって立証された。
【００２２】同量の様々なＣＡＴ含有転写体及びＮＰＴ
II含有転写体を標準的反応条件下でウサギ網状赤血球溶
解物（ＭＤＬ）、小麦麦芽Ｓ‐３０（ＷＧ）及び大腸菌
Ｓ‐３０のインビトロ翻訳系に加えた。得られたポリペ
プチド産物を35Ｓ‐メチオニンで標識した。
【００２３】図２及び図３は、ＭＤＬ（図２，トラック
１〜１１）、ＷＧ（図２，トラック１２〜２２）及び大
腸菌（図３）からの翻訳産物のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析に
ついて示している。図２において、鋳型添加物は：トラ
ック１及び１２がＨ２Ｏ（内在性翻訳）；トラック２及
び１３がＢａｌII直鎖化ｐＪII１０２ＤＮＡ；トラック
３及び１４がＣＡＴ ＲＮＡ；トラック４及び１５がオ
メガプライム‐ＣＡＴＲＮＡ；トラック５及び１６が
５′キャップ‐ＣＡＴ ＲＮＡ；トラック６及び１７が
５′キャップ‐オメガプライム‐ＣＡＴ ＲＮＡ；トラ
ック７及び１８がＥｃｏＲＩ直鎖化ｐＪII１０３ＤＮ
Ａ；トラック８及び１９がＮＰＴII ＲＮＡ；トラック
９及び２０がオメガプライム‐ＮＰＴII ＲＮＡ；トラ
ック１０及び２１が５′キャップ‐ＮＰＴII ＲＮＡ；
トラック１１及び２２が５′キャップ‐オメガプライム
‐ＮＰＴII ＲＮＡであった。14Ｃ標識マーカータンパ
ク質〔アメルシャム・インターナショナル社（Amersham
International, plc ）〕はトラックＭに加えた。キロ
ドルトン（ｋＤａ）としてのそれらの各々の大きさは左
側に示されている。乾燥ゲルを室温で３日間オートラジ
オグラフィーに付した。図３において、鋳型添加物は：
トラック１がＨ２Ｏ（内在性翻訳）：トラック２がＢｇ
ｌII直鎖化ｐＪII１０２ ＤＮＡ；トラック３がＣＡＴ
ＲＮＡ；トラック４がオメガプライム‐ＣＡＴ ＲＮ
Ａ；トラック５が５′キャップ‐ＣＡＴＲＮＡ；トラッ
ク６が５′キャップ‐オメガプライム‐ＣＡＴ ＲＮ
Ａ；トラック７がＥｃｏＲＩ直鎖化ｐＪII１０３ ＤＮ
Ａ；トラック８がＮＰＴII ＲＮＡ；トラック９がオメ
ガプライム‐ＮＰＴII ＤＮＡ；トラック１０が５′キ
ャップ‐ＮＰＴII ＲＮＡ；トラック１１が５′キャッ
プ‐オメガプライム‐ＮＰＴII ＲＮＡであった。14Ｃ
標識マーカータンパク質はトラックＭに加え、それらの
大きさ（ｋＤａ）は左側に示されている。乾燥ゲルを室
温で３日間オートラジオグラフィーに付した。大腸菌Ｓ
‐３０系は転写活性系であるが、天然大腸菌ＲＮＡポリ
メラーゼはＳＰ６プロモーターを認識しえないことに留
意すべきである。
【００２４】下記第１表はオメガプライム配列の促進効
果について示している。図２及び図３に示されたゲルか
らゾーンを取出し、翻訳産物の各バンドにおける放射能
を測定し、オメガプライム配列を含まないＲＮＡからの
放射能に対して各々の場合データを標準化した。この方
法でデータを表現すると、キャップ単独による何らかの
促進効果は除かれ、オメガプライム配列の促進効果のみ
が示される。
【００２５】 第１表 ｍＲＮＡ ＷＧ ＭＤＬ 大腸菌 ＣＡＴ １ １ １ オメガプライム‐ＣＡＴ １０ １．２ １１ ＧｐｐｐＧ‐ＣＡＴ １ １ １ ＧｐｐｐＧ‐オメガプライム‐ＣＡＴ ３．８ ２．２ ２．７ ＮＰＴII １ １ １ オメガプライム‐ＮＰＴII ７１ １７．８ ７４ ＧｐｐｐＧ‐ＮＰＴII １ １ １ ＧｐｐｐＧ‐オメガプライム‐ＮＰＴII ９．５ １．５ ９．６
【００２６】考 察 ＴＭＶのオメガプライム領域の存在は、キャップ又は非
キャップ状態でＣＡＴ又はＮＰＴII配列を含む転写体の
発現を促進させる。促進は翻訳効率の悪いＮＰＴII転写
体の場合に最も著しい。このように、ＮＰＴII遺伝子を
含むＴｎ５断片は、ＮＰＴII遺伝子のＡＵＧ開始コドン
のすぐ上流に更にＡＵＧを有している。しかも“コザッ
ク則（Kozak rule）”（これに関するコザックの論文参
照）によれば、ＮＰＴII開始コドン近辺の領域は翻訳開
始能の乏しいシグナルを構成していることを示唆する。
ＷＧ及びＭＤＬの場合（図２，第８列及び第１９列）で
観察されるように、キャップ又はオメガプライムのない
ＮＰＴII転写体はほとんど機能していない。キャップ又
はオメガプライムの付加は翻訳を改善するが、オメガプ
ライムの存在はキャップ単独の存在よりも優れた促進効
果を有している。大腸菌翻訳メカニズムは、キャップ依
存性ではないものの、オメガプライム配列の存在によっ
て著しく促進される（図３，第４、６、９及び１１
列）。大腸菌の場合において、ＣＡＴ又はＮＰＴII ｍ
ＲＮＡ上のオメガプライム配列にキャップを付加しても
その翻訳をほとんど促進しなかったが、一方キャップＣ
ＡＴ又はＮＰＴII ｍＲＮＡにオメガプライムを付加す
ると著しく増強された。
【００２７】ＣＡＴ遺伝子ｍＲＮＡは、たとえキャップ
又はオメガプライム配列を有していない場合であって
も、真核生物系においてはより効果的に機能する。５′
末端から最初のＡＵＧはＣＡＴの開始コドンであって、
開始コドン中の及びその近辺の配列は“コザック則”に
十分合致している。このことは、更に著しく低いｍＲＮ
Ａ濃度が利用可能な35Ｓ‐メチオニンプールの消費を妨
ぐために必要とされるＭＤＬ系の場合に最も明らかであ
る。その際に驚くべきことではないが、ＣＡＴｍＲＮＡ
におけるオメガプライム配列の存在は促進的でなかっ
た。ＭＤＬはＷＧほどキャップ依存的でないと考えられ
るが、しかしながら、ＮＰＴII転写体上におけるキャッ
プの存在はわずかに促進効果を有しており（図２，第８
列及び第１０列）、一方ＣＡＴ転写体上におけるその存
在はさほど効果がなかった（図２，第３列及び第５
列）。ＣＡＴ ｍＲＮＡ単独ではＷＧ系において著しく
低い活性しかなかった。結論として、キャップもしくは
オメガプライム配列の存在又は双方の存在は非常に促進
的であった（図２，第１４〜１７列）。ＷＧにおいて、
ＮＰＴII ｍＲＮＡ上のオメガプライム配列にキャップ
を付加しても（図２，第２０列及び第２２列）、その翻
訳をほとんど促進しなかったが、一方キャップ又は非キ
ャップＮＰＴII ｍＲＮＡにオメガプライムを付加する
と（図２，第１９列及び第２１列）著しく増強された。
【００２８】したがって、オメガプライム配列の存在は
真核生物系（ＭＤＬ及びＷＧ）及び原核生物系双方にお
いて翻訳を増強する。このことはＴＭＶ粒子の脱外被能
と一致し、ＲＮＡは真核生物又は原核生物の翻訳メカニ
ズムによって翻訳される。オメガプライム配列は、キャ
ップ単独の存在の場合よりも転写体の発現に関して通常
高い促進効果を有している。しかも、オメガプライム配
列は、例えば原核生物系及びある程度ＭＤＬ系におい
て、キャッピング（capping ）では効果のない条件下で
翻訳を増強する。
【００２９】継続実験操作 ＣＡＴ ｍＲＮＡ及びオメガプライムリーダー配列の誘
導体もしくは部分を含むキメラＲＮＡ構造体を前記と同
様の方法で作成したが、最初の合成ＤＮＡ配列は必要な
ＲＮＡを生じうるように選択しておいた。図４に示され
ているように、５つの欠失体（Δ１〜Δ５と表記されて
いる）、１つのＡ→Ｃトランスバージョン体（transver
sion）及び１つの〔Ｃ，Ａ〕ｎ→〔Ｕ〕ｎ置換体（subs
titution）があった。
【００３０】ＣＡＴ ｍＲＮＡを含む別のキメラＲＮＡ
構造体を、ＴＭＶ（Ｕ１，ブルガレ（vulgare ）又は普
通株）以外の下記ウイルスの５′‐リーダー配列を用い
て同様の方法で作成した：ＴＭＶのトマト株（ＳＰＳ単
離物）、カブ黄斑モザイクウイルス（ＴＹＭＶ）、ブロ
ウムモザイクウイルスＲＮＡ３（ＢＭＶ３）、ラウス肉
腫ウイルス部分リーダー（ＲＳＶ）及びアルファルファ
モザイクウイルスＲＮＡ４（ＡｌＭＶ４）。合成された
最初のＤＮＡ配列及び制限部位地図は図５〜図９にそれ
ぞれ示されている。
【００３１】ＲＮＡ構造体の他の１組を同様の方法で製
造したが、但しＣＡＴの代わりに大腸菌リポーター遺伝
子β‐グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を用いた。用いられ
たリーダー配列は、ポリリンカー（比較目的用）もしく
はＵ１オメガ（即ち、ＴＭＶからのオメガプライム）又
はオメガプライムの誘導体もしくは部分、及び前記のよ
うな他のウイルスのリーダーであった。ＧＵＳ遺伝子
は、人工的に“良好な”コザックの配列関係（context
）（第９表参照）又は天然の“悪い”コザックの配列
関係において ｐＲＡＪ２３５／２４０からのＳａｌＩ
断片として用いた〔ジェファーソン（Jefferson ）ら，
プロシーディンクギ・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第８４４７頁，１
９８６年〕。リーダー配列及び制限部位地図は図１０〜
図１３に示されている。リポーター遺伝子の発現は、ジ
ェファーソンら，プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第
８４４７頁，１９８６年に記載されているような螢光測
定法により調べた。
【００３２】前記３つのインビトロ翻訳系に加えて、下
記２つのインビボ系を用いたゼノパス・ラエビス（Xeno
pus laevis）卵母細胞の微量注入及びタバコ〔ニコチア
ナ・タバクム（Nicotiana tabacum ）のキサンチ（Xant
hi）種〕葉肉原形質体のエレクトロポレーション（elec
troporation)。それぞれの操作は下記のとおりであっ
た：各合成ＳＰ６ ｍＲＮＡ（又はそれらの対応ＤＮＡ
鋳型）２ｎｇを標準的方法〔コルマン・エー，ハーメス
・ビー・デー及びヒギンズ・エス・ジェイ（編集），転
写及び翻訳：実用的アプローチ，ＩＲＬプレス，オック
スフォード，第２７１頁，１９８４年（Colman A. In H
ames, B.D. and Higgins, S.J.(eds.), Transcription
and Translation : A practical Approach, IRL Press,
Oxford, 271(1984)）〕に従い３０のバッチ中の第６期
のＸ．ラエビス卵母細胞の細胞質に微量注入した。卵母
細胞を修正バース塩水（Modified Barths' Saline, MB
S）中で１８時間インキュベートし、しかる後蒸留水で
簡単に洗浄した。ゼノパス卵母細胞の抽出物は、１０ｍ
Ｍ ＤＴＴ（１７μリットル／卵母細胞）含有のｐＨ
７．４の０．２５ＭトリスＨＣｌ中に各サンプルを再懸
濁し、しかる後１５秒間超音波処理することによって調
製した。不溶性物質を１５分間の微量遠心分離によって
除去し、卵母細胞と同数得られた抽出物画分を公表され
た方法でＣＡＴ又はＧＵＳ活性について分析した（ＣＡ
Ｔ：ガリーら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第
１５巻，第３２５７頁，１９８７年）；ＧＵＳ：ジェフ
ァーソンら，プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第８４
４７頁，１９８６年）。
【００３３】葉肉原形質体をＮ．タバクム（キサンチ
種）の葉から分離し、０．７Ｍマンニトール中で保存し
た。原形質体（１０6 ）を６０ｘｇで３分間遠心分離
し、ＲＮＡ（８μｇ）含有の氷冷０．７Ｍマンニトール
１ml中に再懸濁し、エレクトロポレーション用セルに移
し、セルに５０ｎＦコンデンサーを取付けることによっ
て単一電圧パルス（２．５ｋＶ／cm）を加えた。パルス
は速い立上り時間（１μｓ以下）を有しかつ半減時間約
５μｓの指数減衰性を有していた。エレクトロポレーシ
ョン処理原形質体を０〜４℃で１０分間保存した。０．
７Ｍマンニトール１０mlを加え、原形質体を６０ｘｇで
３分間の遠心分離によって回収した。次いで原形質体を
培地中に再懸濁し、９cm径ペトリ皿中２５℃で２１時間
インキュベートした。
【００３４】エレクトロポレーション処理原形質体の各
サンプルを、ＣＡＴアッセイの場合には２ｍＭロイペプ
チン及び１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）含有の
ｐＨ７．４のの０．２５ＭトリスＨＣｌ又はＧＵＳアッ
セイの場合には１０ｍＭ ２‐メルカプトエタノール含
有のｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム１５０μリ
ットル中で沈降させ、再懸濁し、超音波処理した。抽出
物を室温又は４℃において１０，０００ｘｇで１０分間
微量遠心分離した。
【００３５】図１４は、エレクトロポレーション処理タ
バコ原形質体中におけるキャップ又は非キャップＣＡＴ
ＲＮＡの発現に関してのオメガプライムの効果につい
て示している。各原スポットは５×１０4 の生存原形質
体に相当する抽出物を含んでいた。各サンプルに関する
基質（14Ｃ‐クロラムフェニコール）からそのモノアセ
チル化体（左側に表示）への変換率（％）はトラックの
上部に示されている。エレクトロポレーション処理ＲＮ
Ａ又は標準は：トラック１がＲＮＡなし（偽物）；トラ
ック２がＣＡＴ ＲＮＡ；トラック３がオメガプライム
‐ＣＡＴ ＲＮＡ；トラック４が５′キャップ‐ＣＡＴ
ＲＮＡ；トラック５が５′キャップ‐オメガプライム
‐ＣＡＴ ＲＮＡ；トラック６がトラック１の同量抽出
物に加えられた０．１単位の精製ＣＡＴ酵素；トラック
７が０．１単位の精製ＣＡＴ酵素単独であった。乾燥ｔ
ｌｃプレートを２日間オートラジオグラフィーに付した
後、除去し、モノアセチル化産物（３‐Ａｃ／１‐Ａ
ｃ）に相当する14Ｃ標識スポット中の放射能について測
定したが、変換率％データは抽出物中の関連ＣＡＴ活性
を表わしている。オメガプライム（＋／５′キャップ）
はＣＡＴ ＲＮＡ発現に関して最も促進的であった。
【００３６】図１５は、Ｘ．ラエビス卵母細胞中に微量
注入されたキャップ又は非キャップＣＡＴ ＲＮＡの発
現に関するオメガプライムの効果について示している。
同量の各ＣＡＴ ＲＮＡ構造体又は直鎖ＤＮＡ鋳型（２
ｎｇ）を完全に卵母細胞１個当たりで注入した。同量の
卵母細胞抽出物（０．３×細胞に相当する）を他に言及
のない限り各ケースにおいて分析した。14Ｃ‐クロラム
フェニコールからそのモノアセチル化体への変換体
（％）は各トラックの上部に示されている。トラック５
及び６において、ジアセチル化体への変換率（％）は＊
で示されている。微量注入されたＲＮＡ又は標準は：ト
ラック１がＲＮＡなし（偽物）；トラック２がＢｇｌII
直鎖化ｐＪII１０２；トラック３がＣＡＴ ＲＮＡ；ト
ラック４がオメガプライム‐ＣＡＴ ＲＮＡ；トラック
５が５′キャップ‐ＣＡＴ ＲＮＡ；トラック６が５′
キャップ‐オメガプライム‐ＣＡＴ ＲＮＡ；トラック
７が２０倍希釈抽出物であること以外はトラック５と同
様；トラック８が２０倍希釈されていること以外はトラ
ック６と同様；トラック９がトラック１の同量抽出物に
加えられた０．１単位の精製ＣＡＴ酵素；トラック１０
が０．１単位の精製ＣＡＴ酵素単独であった。乾燥ｔｌ
ｃプレートを室温で１８時間オートラジオグラフィーに
付した後、関連14Ｃ標識スポットを取出してカウントし
た。
【００３７】下記表は更に得られた結果について示して
いる。 第２表 オメガプライムによる翻訳増強に関する欠失及び他の配列変更の効果：ＲＮＡ 微量注入ゼノパス卵母細胞中におけるクロラムフェニコールアセチルトランスフ ェラーゼ発現 注入されたＲＮＡ 14Ｃ‐クロラムフェニコールから１‐及び３‐ モノアセチル化体への変換率％ なし（偽物） ０．１ ＣＡＴ ４．５ オメガプライムＣＡＴ ３４．２ Δ１‐ＣＡＴ １７．２ Δ２‐ＣＡＴ ９．７ Δ３‐ＣＡＴ １７．６ Δ４‐ＣＡＴ １４．６ Δ５‐ＣＡＴ １７．９ Ａ→Ｃトランスバージョン‐ＣＡＴ １５．７ 〔Ｃ，Ａ〕ｎ→〔Ｕ〕ｎ置換‐ＣＡＴ ３４．３ ０．１単位ＣＡＴ（純粋酵母） １．２ すべてのＲＮＡはキャップされていなかった。
【００３８】上記結果は、オメガプライムがＣＡＴの翻
訳を促進させることを示している。欠失体１〜５は、こ
の効果を完全に消失させることなく低下させている。同
様のことがＡ→Ｃトランスバージョン体にもあてはま
る。〔Ｕ〕ｎ置換体は、あるとしてもほとんど効果をも
っていない。
【００３９】 第３表 ゼノパス卵母細胞中へのｍＲＮＡの微量注入後におけるクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ発現レベルに関する様々なウイルスからの非翻訳５ ′‐リーダー配列の効果 注入されたＲＮＡ 14Ｃ‐クロラムフェニコールから１‐及び３‐ モノアセチル化体への変換率％ なし（偽物） ０．１ ＣＡＴ ６．３ オメガＵ１ ＣＡＴ ４６．５ オメガ（ＳＰＳ）ＣＡＴ ３５．８ ＴＹＭＶ ＣＡＴ １．３ ＢＭＶ３ ＣＡＴ ５．０ ＲＳＶ ＣＡＴ ５．４ ＡｌＭＶ４ ６．７ ０．１単位ＣＡＴ（純粋酵素） １．３ すべてのＲＮＡはキャップされていなかった。オメガＵ
１はＴＭＶ（ブルガレ）の標準株に由来する。オメガＳ
ＰＳはＴＭＶのトマト株に由来する。 ＴＹＭＶ：カブ黄斑モザイクウイルスリーダー ＢＭＶ３：ブロウムモザイクウイルスＲＮＡ３ ＲＳＶ：ラウス肉腫ウイルスからの部分リーダー配列 ＡｌＭＶ４：アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４
【００４０】前記結果は、ＴＭＶ Ｕ１由来オメガプラ
イムがこの系においてＣＡＴ ＲＮＡの翻訳を促進する
ことを示している。ＴＭＶトマト株オメガプライムも同
様であるが、但しやや劣っている。他のウイルスリーダ
ーはさほど又は全く効果がなく、ＴＹＭＶリーダーは阻
害的であるかもしれない。
【００４１】 第４表 小麦麦芽無細胞系におけるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ ｍＲＮＡのインビトロ翻訳に関する５′キャップのある又はない様々な５′非翻 訳リーダー配列の効果（下記結果は、ＣＡＴ ｍＲＮＡ単独よりも何倍促進的で あるかを示すため、未修正ＣＡＴ ｍＲＮＡリーダー配列を１．０として標準化 された） 付加されたＲＮＡ 非キャップ体 キャップ体 ＣＡＴ １．０ １．０ オメガプライムＣＡＴ ２．８ ３．７ Δ１‐ＣＡＴ １．２ ０．６ Δ２‐ＣＡＴ ２．０ １．８ Δ３‐ＣＡＴ １．５ １．３ Δ４‐ＣＡＴ ３．０ １．５ Δ５‐ＣＡＴ １．５ ０．７ Ａ→Ｃトランスバージョン‐ＣＡＴ ３．３ ２．９ 〔Ｃ，Ａ〕ｎ→〔Ｕ〕ｎ置換‐ＣＡＴ ２．１ ３．４ ＴＭＶ トマト株オメガプライム‐ＣＡＴ １．７ ３．０ ＴＹＭＶ‐ＣＡＴ ０．３ ３．０ ＢＭＶ３‐ＣＡＴ １．４ ２．８ ＲＳＶ‐ＣＡＴ ０．６ ２．５ ＡｌＭＶ４‐ＣＡＴ ２．１ ２．３ 注：これらの数値は、ＣＡＴメッセージの５′末端の様
々な配列の付加によって生じる翻訳の促進率を比較した
ものである。翻訳はキャップのある又はキャップのない
メッセージに関して行なわれた。各欄は（第２表及び第
３表のように）独立したゲルから切除回収された放射性
ＣＡＴタンパク質の収率を示している。各バンドを切出
し、カウントし、かつｍＲＮＡが未修正ＣＡＴメッセー
ジであるバンドに対して標準化した。前記結果は、オメ
ガプライムが５′キャップの存在又は非存在下でこの系
において促進させることを示している。他のウイルスリ
ーダー配列及びオメガプライムの誘導体もしくは部分は
翻訳を様々な程度に増強させるが、但しオメガプライム
自体よりも有意に優れているケースはまれである。
【００４２】 第５表 大腸菌無細胞系中でのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｍＲ ＮＡのインビトロ翻訳に関する、すべて５′キャップ構造以外の様々な非翻訳リ ーダー配列の効果 付加されたＲＮＡ 非キャップ体 ＣＡＴ １．０ オメガプライムＣＡＴ ９．０ Δ１‐ＣＡＴ ３．３ Δ２‐ＣＡＴ ２．５ Δ３‐ＣＡＴ ６．３ Δ４‐ＣＡＴ ４．２ Δ５‐ＣＡＴ ３．８ Ａ→Ｃトランスバージョン ＣＡＴ ４．１ 〔Ｃ，Ａ〕ｎ→〔Ｕ〕ｎ置換 ＣＡＴ １．９ ＴＭＶ トマト株オメガ ＣＡＴ ６．６ ＴＹＭＶ ＣＡＴ ０．２ ＢＭＶ３ ＣＡＴ ３．７ ＲＳＶ ＣＡＴ １．５ ＡｌＭＶ４ ＣＡＴ １．４ 上記結果は、オメガプライム、その誘導体の一部及びト
マト株オメガプライムが翻訳を最大に促進させることを
示している。他の配列も大半は、但し異なる程度で促進
させる。大腸菌は翻訳のために５′キャップを要しな
い。
【００４３】 第６表 タバコ原形質体中にエレクトロポレーションされたβ‐グルクロニダーゼｍＲ ＮＡ（ｐＲＡＪ２３５／２４０由来）の翻訳に関する様々なリーダーの効果 用いられた 原形質体抽出物中のタンパク質 促進 ＧＵＳｍＲＮＡ １μｇ当たりで１分間に切断さ 倍率 構造体* た４‐メチルウンベリフェリル グルクロニド（ナノモル） 〔ブランク〕（ｍＲＮＡなし）非キャップリーダー ２３５〔ＳＰ６転写体， ポリリンカーリーダー〕 ＜０．０１ １ オメガプライム（Ｕ１）‐２３５ ０．２５ ＞２５ オメガプライム（ＳＰＳ）‐２３５ ０．１５ ＞１５ ＴＹＭＶ‐２３５ ＜０．０１ − ＡｌＭＶ４‐２３５ ＜０．０１ − ＢＭＶ３‐２３５ ＜０．０１ − ＲＳＶ‐２３５ ＜０．０１ −キャップリーダー キャップ２３５ ０．０３ １ 〔ＳＰ６転写体ポリリンカーリーダー〕 キャップオメガプライム‐２３５ ０．５４ １８ キャップオメガプライム(SPS)‐２３５ ０．４３ １４ キャップＴＹＭＶ‐２３５ ＜０．０１ − キャップＡｌＭＶ４‐２３５ ０．２３ ８ キャップＢＭＶ３‐２３５ ０．２３ ８ キャップＲＳＶ‐２３５ ０．２１ ７ キャップΔ１‐２３５ ０．５５ １８ キャップΔ２‐２３５ ０．５０ １７ キャップΔ３‐２３５ ０．３２ １１ キャップΔ４‐２３５ ０．５４ １８ キャップΔ５‐２３５ ０．５４ １８ キャップＡ→Ｃトランスバージョン‐235 ０．６９ ２３ キャップ〔Ｃ，Ａ〕ｎ→〔Ｕ〕ｎ置換-235 ＜０．０１ （ブランク値は他のすべての値から引かれる） （＊構造体は５′キャップのある又はない“悪い”ＧＵＳ外来（ｅｘ）ｐＲＡＪ ２３５／２４０であった）
【００４４】すべてのｍＲＮＡ構造体を８μｇ／mlでエ
レクトロポレーション処理し、洗浄された原形質体を
（ガリーら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，第１
５巻，第３２５７頁，１９８７年）記載のように２０時
間インキュベートした。
【００４５】“悪い”コザック構造体（２３５）リーダ
ーの配列は下記のとおりである：
【化１】
【００４６】ポリリンカー中へのオメガプライムの挿入
は下記のとおりである：
【化２】
【００４７】＊この箇所におけるオメガプライムは下記
のとおりである：
【化３】 及び欠失オメガプライム誘導体等がしかるべく後に続
く。
【００４８】子牛プレプロキモシン又はチキンプレリゾ
チームをコードするメッセンジャーＲＮＡを、ＴＭＶ
５′末端配列（オメガプライム）を付加させて又はさせ
ないでインビトロ合成した。ｍＲＮＡをウサギ網状赤血
球（ＭＤＬ）、小麦麦芽（ＷＧ）又は大腸菌（ＥＣ）由
来の系でインビトロ翻訳させた。
【００４９】プラスミドｐＪII６及びｐＪII７（図１
６）をプラスミドｐＳＴ６４ＣＴ、ｐＳＰ６４ＬＴ〔ス
リート（Sleat)ら，バイロロジー，第１５５巻，第２９
９頁，１９８６年〕及びｐＪII１０１の成分を用いて作
成した。ｐＪII６及びｐＪII７は、Ｍ１３ ｍｐ１１由
来ポリリンカー配列に隣接するバクテリオファージＳＰ
６ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む転写プラス
ミドｐＳＰ６４〔メルトン（Melton) ，１９８４年〕の
誘導体である。ｐＳＰ６４ＣＴ及びｐＳＰ６４ＬＴのプ
レプロキモシン及びプレリゾチームコード領域をそれぞ
れＨｉｎｄIII断片として取出し、ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノウ断片でブラント末端化し、ｐＪII１０１の
ＨｉｎｃII部位に組込んでクローニングし、それぞれｐ
ＪII１０６及びｐＪII１０７を得た（図１６）。これら
の構造体は、５′末端オメガプライム配列をもつメッセ
ンジャー（messenger-sense ）プレプロキモシン及びプ
レリゾチーム転写体の合成を指示させるために用いた。
親プラスミドｐＳＰ６４ＣＴ及びｐＳＰ６４ＬＴはオメ
ガプライムのないｍＲＮＡの合成のための鋳型であっ
た。
【００５０】結果は下記第７表に示されている。 第７表 ８０Ｓ‐及び７０Ｓ‐リボソームに基づく翻訳系における２種の真核生成物ｍ ＲＮＡの発現に関するオメガプライムの効果 ゲル精製ポリペプチド中へのＬ‐〔35Ｓ〕‐メチオニンの取込み量（ｃｐｍ） 無細胞系 ＣＰＭ（相対的促進度） ＭＤＬ ＷＧ 大腸菌 ＳＰ６転写体 プレリゾチーム 5040(1.0) 3730(1.0) 0 (1.0) オメガプライムプレリゾチーム 5290(1.0) 10240(2.8) 1030( ) プレプロキモシン 2470(1.0) 1110(1.0) 0 (1.0) オメガプライムプレプロキモシン 7280(3.0) 10010(9.1) 2180( )
【００５１】前記方法と同様の方法で、様々なキメラＲ
ＮＡ構造体を、ＮＰＴIIコード領域、及びオメガプライ
ム、２つのタンデム（tandem）オメガプライム領域、長
鎖（７７塩基）“ジャンク（junk) ”リーダー（ポリリ
ンカー）配列もしくは中央オメガプライムと一緒の“ジ
ャンク”を用いて作成した。構造体は図１７に示されて
おり、結果は下記第８表に示されている。
【００５２】
【表１】
【００５３】これは、ランダムポリリンカー配列が８０
Ｓリボソーム系においてオメガプライムの代わりになら
ず、原核生物（７０Ｓ）系でのみわずかに代わりになる
ことを示している。２つのタンデムオメガプライムのみ
が７０Ｓ発現に寄与する（例えば、オメガプライムの単
一コピー）。
【００５４】β‐グルクロニダーゼｍＲＮＡ（ＧＵＳ
ｍＲＮＡ）の発現に対するオメガプライムの効果に関し
て第６表（前掲）に掲示されたデータを更に拡張するた
めに、別の一連の構造体として開始コドン（ＡＵＧ）近
辺の配列関係が修正されたＧＵＳ遺伝子を用いた。下記
の“良好な配列関係”をもつリーダー：
【００５５】
【化４】 を含むプラスミドｐＲＡＪ２７５は、ＧＵＳのこのバー
ジョンのための供給源であった。オメガプライム及び様
々な他のリーダー構造体を前記のようにＨｉｎｄIII／
ＳａｌＩ部位に挿入した。ｐＲＡＪ２７５構造体の詳細
は下記のとおりである：
【００５６】ｐＲＡＪ２７５はｐＲＡＪ２５５の誘導体
であって（ジェファーソンら，プロシーディング・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，
第８３巻，第８４４７頁，１９８６年）、ここにおいて
ＧＵＳの５′配列は連続的（progressive ）ＢＡＬ３１
削除によって除去され、コザック〔ミクロバイオロジー
・レビューズ，第４７巻，第１頁，１９８３年（microb
iology Reviews, 47,1 (1983) ）〕により規定された
“コンセンサス（consensus ）”翻訳イニシエーターを
構成していた合成オリゴヌクレオチドで置き換えられて
いる。このプラスミドはイニシエーターＡＴＧコドンに
位置する特有のＮｃｏＩ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を有して
おり、その周囲配列関係はＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＴＣ
である。イニシエータ近辺の配列関係は所定量のｍＲＮ
Ａの翻訳産物レベルに関して十分な効果を発揮しうるこ
とが、インビトロ及びインビボ双方で示された。この構
造はこの効果を最大化させるために調整された。それは
ｐＵＣ１９におけるＳａｌＩ‐ＥｃｏＲＩ断片として与
えられた。
【００５７】５′キャップ又は非キャップ転写体を前記
のようにタバコ原形質体中にエレクトロポレーション
し、ＧＵＳ発現レベルを抽出物中で測定した。非キャッ
プＲＮＡもＭＤＬまたはＷＧ無細胞翻訳系に加え、合成
されたＧＵＳタンパク質レベルは図２及び図３（第１
表）のように放射性ゲルバンドを切取ってカウントする
ことによって測定した。結果は第９表に示されている。
【００５８】
【表２】
【００５９】
【表３】
【００６０】ＲＮＡ構造体の別の１組を、大腸菌リポー
ター遺伝子β‐グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）及び更に誘
導トリプトファン（Ｔｒｐ）プロモーターを用いて、前
記と同様の方法により作成した。Ｔｒｐプロモーターは
ファルマシア社（PharmaciaLtd.）から購入し、制限エ
ンドヌクレアーゼ消化、補充、サブクローニング等の慣
用的技術により修正し、３′‐ＨｉｎｄIII部位（図１
８）及びブラント５′末端を作出した。次いで、この二
重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片をＳＰ６プロモーター（インビ
ボの大腸菌中では作働しない）及び重要な５′‐リーダ
ー構造の間で様々なリーダー‐リポーター（ＧＵＳ）遺
伝子プラスミド中に挿入した。
【００６１】得られたプラスミドＤＮＡは標準的方法に
よりコンピテント（competent ）大腸菌細胞を形質転換
させるために用いたが、Ｔｒｐプロモーターは現場で誘
導されて、キメラリーダー‐リポーターｍＲＮＡを産出
した。転写開始点はＨｉｎｄIII部位（ＡＡＧＣＴＴ）
中のＧに対応する。
【００６２】形質転換された大腸菌細胞中における転写
体の発現は、分光測定法により調べた（ジェファーソン
ら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンスＵＳＡ，第８３巻，第８４４７頁，
１９８６年）。結果（第１０表）は、ＧＵＳ発現がオメ
ガプライムの存在により及びある程度オメガプライムの
他のリーダー配列もしくは誘導体により、コザック配列
関係の“良好な”又は“悪い”構造体のいずれかからイ
ンビボで増強されたことを示している。
【００６３】 第１０表 安定な形質転換大腸菌細胞中Ｔｒｐプロモーター によりコントロールされた発現 ｐ‐ニトロフェニルグルクロニドの およその相対的分光測定変換倍率 ２３５‐ＧＵＳ （“悪い”配列関係） １ オメガプライム２３５ ＧＵＳ ７ｘ ２７５‐ＧＵＳ （“良好な”配列関係） １ オメガプライム‐２７５‐ ＧＵＳ（“良好”な配列関係） ８ｘ Δ１‐２７５‐ＧＵＳ ５‐８ｘ Δ２‐２７５‐ＧＵＳ （７５ｘ：確認予定） Δ３‐２７５‐ＧＵＳ （７５ｘ：確認予定） Δ４‐２７５‐ＧＵＳ ５‐８ｘ Δ５‐２７５‐ＧＵＳ ５‐８ｘ Ａ→Ｃ２７５ ＧＵＳ （７５ｘ：確認予定） 〔Ｃ，Ａ〕ｎ→〔Ｕ〕ｎ ２７５ ＧＵＳ ５ｘ ＴＹＭＶ ２７５ ＧＵＳ ３‐４ｘ ＡｌＭＶ４ ２７５ ＧＵＳ ３‐４ｘ ＢＭＶ３ ２７５ ＧＵＳ １‐２ｘ ＲＳＶ ２７５ ＧＵＳ １‐２ｘ （上記結果はポリリンカーリーダーのみを含む各々のＧＵＳ構造体に対して標 準化された）
【００６４】結 論 オメガプライムは、現場でＴｒｐプロモーターを用いた
場合に、プラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌中で
のＧＵＳ ＲＮＡのインビボ発現を増強する。継続実験
は超らせん二重鎖ｐＵＣ１９ ＤＮＡを用いて行なわれ
たが、これはカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭ
Ｖ）３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼターミネ
ーター〔アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agro
bacterium tumefaciens ）由来〕及びそれらの中間にＣ
ＡＴ ＤＮＡ（●，塗りつぶし三角）もしくはオメガプ
ライムＣＡＴ ＤＮＡ（○，△）のいずれかを有するよ
うに修正されている。
【００６５】構造体（図１９）は二元ベクター系から作
成したが〔ベバン（Bevan ），ヌクレイック・アシッズ
・リサーチ，第１２巻，第８７１１頁，１９８４年〕、
その場合においてＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＮｏ
ｓターミネーターをＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩ部位で
切除し、プラスミドｐＵＣ１９に挿入することによって
ｐＵＣ３５Ｓ Ｎｏｓを得た。
【００６６】構造体ｐＵＣ３５ＳＣＡＴＮｏｓ及びｐＵ
Ｃ３５ＳオメガプライムＣＡＴＮｏｓは、ＣＡＴ又はオ
メガプライムＣＡＴをそれぞれＢａｍＨＩ部位でプラス
ミド中に挿入することによって作成した。
【００６７】様々な量のプラスミドＤＮＡ（μｇ／ml）
を前記のように原形質体にエレクトロポレーション処理
し、細胞を２５℃で６時間（○，●）又は２６時間イン
キュベートし、溶離させて、（前記のような）ＣＡＴア
ッセイを行なった。
【００６８】図２０に示された結果は、図示された１０
０〜１５０μｇの超らせんプラスミドＤＮＡの注入をう
けた細胞はオメガプライムが構造体中に存在している場
合（△，○）にＣＡＴ発現を増強させていた（２倍）こ
とを示している。
【００６９】これらの結果は、安定的形質転換原性（tr
ansgenic）植物中での遺伝子発現がプロモーター（イン
ビボ転写用）及び翻訳オープン読取枠の間へのオメガプ
ライム配列の挿入によって同様に増強されるであろうと
いうことを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の態様のキメラｍＲＮＡを産生する方法
を示す。
【図２】ＭＤＬ（トラック１〜１１）及びＷＧ（トラッ
ク１２〜２２）からの翻訳産物のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析
の結果を示す。
【図３】大腸菌からの翻訳産物のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析
の結果を示す。
【図４】ＣＡＴ ｍＲＮＡ及びオメガプライムリーダー
配列の誘導体もしくは部分を含むキメラＲＮＡ構造体を
作成する方法を示す。
【図５】ＣＡＴ ｍＲＮＡを含むキメラＲＮＡ構造体
を、下記ウイルスの５′‐リーダー配列を用いて作成し
た：ＴＭＶのトマト株（ＳＰＳ単離物）。合成された最
初のＤＮＡ配列及び制限部位地図を示す。
【図６】ＣＡＴ ｍＲＮＡを含むキメラＲＮＡ構造体
を、下記ウイルスの５′‐リーダー配列を用いて作成し
た：カブ黄斑モザイクウイルス（ＴＹＭＶ）。合成され
た最初のＤＮＡ配列及び制限部位地図を示す。
【図７】ＣＡＴ ｍＲＮＡを含むキメラＲＮＡ構造体
を、下記ウイルスの５′‐リーダー配列を用いて作成し
た：ブロウムモザイクウイルスＲＮＡ３（ＢＭＶ３）。
合成された最初のＤＮＡ配列及び制限部位地図を示す。
【図８】ＣＡＴ ｍＲＮＡを含むキメラＲＮＡ構造体
を、下記ウイルスの５′‐リーダー配列を用いて作成し
た：ラウス肉腫ウイルス部分リーダー（ＲＳＶ）。合成
された最初のＤＮＡ配列及び制限部位地図を示す。
【図９】ＣＡＴ ｍＲＮＡを含むキメラＲＮＡ構造体
を、下記ウイルスの５′‐リーダー配列を用いて作成し
た：アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ４（ＡｌＭ
Ｖ４）。合成された最初のＤＮＡ配列及び制限部位地図
を示す。
【図１０】リーダー配列及び制限部位地図を示す。
【図１１】リーダー配列及び制限部位地図を示す。
【図１２】リーダー配列及び制限部位地図を示す。
【図１３】リーダー配列及び制限部位地図を示す。
【図１４】エレクトロポレーション処理タバコ原形質体
中におけるキャップ又は非キャップＣＡＴ ＲＮＡの発
現に関してのオメガプライムの効果について示す。
【図１５】Ｘ．ラエビス卵母細胞中に微量注入されたキ
ャップ又は非キャップＣＡＴ ＲＮＡの発現に関するオ
メガプライムの効果について示す。
【図１６】プラスミドｐＪII６及びｐＪII７を示す。
【図１７】様々なキメラＲＮＡ構造体を示す。
【図１８】３′‐ＨｉｎｄIII部位を示す。
【図１９】構造体ｐＵＣ３５Ｓ Ｎｏｓを示す。
【図２０】ＣＡＴアッセイの結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】キメラｍＲＮＡ分子を作製するための、下
    記のｉ）、ii）、iii)及び（iv）を含む配列を有するＤ
    ＮＡの転写と、ポリペプチドを作製するための、上記キ
    メラＲＮＡ分子の翻訳とによる、ポリペプチドの製造方
    法： （ｉ）プロモーター （ii）ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー配列又は
    その誘導体もしくは部分の配列に相補的な翻訳増強配列
    （但し、ブロウムモザイクウイルスＲＮＡ ４の５′‐
    非翻訳リーダー配列を除く）、 (iii)開始コドン、及び （iv）プロモーターのコントロール下にある、上記ポリ
    ペプチドをエンコードするコード配列 但し、上記コード配列は翻訳増強配列が由来するＲＮＡ
    ウイルスに非相同であり、上記プロモーター、翻訳増強
    配列、開始コドン及びコード配列間の関係は、ＤＮＡの
    転写でキメラｍＲＮＡ分子が作製されるようなもので、
    その翻訳は翻訳増強配列に相当するその部分によって増
    強される。
  2. 【請求項２】ＤＮＡが転写エンハンサー配列をも含む、
    請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー配
    列が植物ウイルス由来である、請求項１又は２に記載の
    方法。
  4. 【請求項４】ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー配
    列がタバコモザイクウイルスのオメガプライム（Ω′）
    配列又はその誘導体もしくは部分である、請求項３に記
    載の方法。
  5. 【請求項５】ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー配
    列がアルファルファモザイクウイルスＲＮＡ ４由来で
    ある、請求項３に記載の方法。
  6. 【請求項６】ＤＮＡがヒト又は動物を除いた生物体の細
    胞中に組込まれている、請求項１〜５のいずれか一項に
    記載の方法。
  7. 【請求項７】下記のｉ）、ii）及びiii)を含む配列を有
    するキメラｍＲＮＡ分子の翻訳によるポリペプチドの製
    造方法： （ｉ）ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー又はその
    誘導体もしくは部分である翻訳増強配列（但し、ブロウ
    ムモザイクウイルスＲＮＡ ４の５′‐非翻訳リーダー
    配列を除く）、 （ii）開始コドン、及び （iv）上記ポリペプチドをエンコードするコード配列 但し、上記コード配列は翻訳増強配列が由来するＲＮＡ
    ウイルスに非相同であり、上記翻訳増強配列、開始コド
    ン及びコード配列間の関係は、キメラｍＲＮＡ分子の翻
    訳が翻訳増強配列によって増強されるようなものであ
    る。
  8. 【請求項８】キメラｍＲＮＡが相補的ＤＮＡ由来であ
    る、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー配
    列が植物ウイルス由来である、請求項７又８に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー
    配列がタバコモザイクウイルスのオメガプライム
    （Ω′）配列又はその誘導体もしくは部分である、請求
    項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】ＲＮＡウイルスの５′‐非翻訳リーダー
    配列がアルファルファモザイクウイルスＲＮＡ ４由来
    である、請求項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】５′キャップが、翻訳増強配列の上流に
    あるキメラｍＲＮＡにつけられている、請求項７〜１１
    のいずれか一項に記載の方法。
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