JPH01501064A - ワクチンとその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチンとその製法 技術分野 本発明は、ワクチンに関する。更に詳しくいうと、抗原部分と複合させると、そ の抗原に対する免疫応答を強めるような細菌鞭毛を含有するワクチンに関するも のである。

背景技術 ここでワクチンとは、抗原部分の懸濁液であって、それは一般的に感染体又は感 染体の一部からなり、身体に注射した時は、活動型免疫をつくるものと定義され る。

ワクチンを形成している抗原部分は微生物から精製されるような自然の産物、又 は合成産物、遺伝子工学で作った蛋白ペプチド又はそれに類似した産物でありう る。ここでアジュバントは、免疫原と混合して注射すると、免疫応答を増加させ るものと定義される。ハプテンは適当な抗体と選択的に反応するが、それ自身は 免疫原とならないものと定義される。一般のハプテンは、低分子物質であるが、 ある種の高分子物質もハプテンとして働きうる。複合は、ここでは、２つ以上の 分子の共有結合又はその他の型の結合を意味する。

６０年前に次の事が証明された。ジフテリャと破傷風のワクチンを化濃性細菌又 はその他の幾つかの物質を混合して投与すると、ジフテリャと破傷風に対する抗 毒素応答が増加する。その時以来、臨床家と免疫学者はアジュバントによって免 疫反応をあげ、よくある副作用を最小限にすることを試みて来た。

生合成及びＭ換えＤＮＡの技術はかつては作成不能であったエピトープを持つワ クチンを開発することを可能にした０例えば細菌のワクチンの候補には連鎖球菌 や、淋菌、手足０病、エイズ（ＨＩＶ−１＞、マラリャの抗原等と同じ形をして いる合成ペプチドが含まれている。

原虫症であるマラリャの研究はことに重要である。この疾患は全世界で年間２億 Å以上の人に影響を与える。

そして人間の死亡と労力低下を来たすという意味で最も重大な疾患である。遺伝 子工学的技術はマラリャ病原体の数種の蛋白を同定するのにもちいられてきたし 、現在ではそれらの蛋白のかなりの量を生産するのに用いられている。ことに寄 生体のスポロゾイト期からとった２０アミノ酸からなるペプチドは重要な抗原基 をもつことが判定されている。この特別なペプチドに対する抗体は注射後ただち に病原体を殺すことができる。不幸にしてこのベプトヂ自身は適当な免疫応答を おこすことはできない。

スポロゾイトペプチドに対する免疫応答を有効に起こせさるために、ペプチドは アジュバントと一緒に投与された。しかし現在のところこの方法で投与しても満 足な結果はえられていない、そこでハブテンエピトー１の免疫原性を増強するよ うな力があって毒性のないアジュバンドの開発が注目されている。さらにアジュ バントは普通のワクチンと共に用いた時に、より強力な、より持続的な応答をさ せることが要求されている。そのようなアジュバントは抗原の供給に限りがある 場合や、生産コストが高い場合に必要になってくる。

最近まではアジュバントの開発には経験的な方法しかなかった。多数の化合物が 免疫応答を変化させることが知られている。これらの化合物は物質としても、作 用にしても多岐にわたっている。このためにアジュバントの作用のメカニズムを なるべく単純に理解する試みがなされているがそれは複雑である。このメカニズ ムの解明は近年の免疫原の理解についての発展に比べるとはるかに遅れている。

このようにアジュバントは多種であるので、その分類は可能である６時にアジュ バントはその起源によって鉱物性、細菌性、植物性、合成、宿主産物などに分類 される。この分類による第一群は非細菌性で、アルミニューム化合物群である。

アルミニュームがアジュバントして最初に使われたのは１９２９年であった。そ れ以来、アルミニューム塩で沈殿させた抗原やアルミ化合物に混合または吸着さ せたＡＱが動物や入閣の免疫応答を高めるのに用いられてきた。アルミニューム 化合物やその類似物のアジュバントは次のメカニズムによって働くらしい。

すなわち抗原の分散が連化され、それによってマクロファージや泡状プントリッ ク細胞のような抗原供与細胞と抗原の接触時間が長びくことになる。

さらに免疫関与細胞がアジュバント注射域に引きよせられる。アルミニュームシ ュバントを兎に注射すると、７日後にアルミニューム粒子が兎のリンパ節に見出 されるようになる。また、その著明な作用として、抗原がリンパ節内のＴＡＢ胞 含有域に誘き寄せられている。アジュバントの力は流域リンパ節の炎症にも関連 していることが示されている。多くの研究によって、アルミ塩と共に投与された 抗原が体液性免疫をひきおこすことが確かめられているが、細胞性免疫はわずか に上昇するにすぎない。

水酸化アルミニウムはまた補体系を活性化するものとして記載されている。この 機作は免疫グロブリン産生やＢ＃［Ｈ胞の記憶と共に開廷炎症反応にも関与して いる。

アルミニューム化合物は非常に安全であるという記録があるために、それは現在 極めて一般化的に人間のアジュバントとして使用されている。しかし、それらに は問題がないわけではない、アルミニュームを含んだワクチンは時に開廷反応を ひきおこす、アルミニューム化合物がアレルギーを起こすことは臨床上またれで はあるが、それらはＴ４Ｂ胞依存性の機序によって注射開始にエオシン好性細胞 をひき寄せるといわれている。またそれらが抗原刺激をした後に注射された時に はＩｇＥ応答をおこすといわれている。またそれらはＩＱＥ応答に対するヘルパ ー作用をもつような担体特異的細胞群を刺激するともいわれている。さらに、ア ルミニューム含有ワクチンは乾燥するこてができない、そのため凍結して運搬し たり保存せざるをえないので、汚染の危険が伴う。

ｉ＆後に、最も重要なことであるが、アルミ化合物は病気の抵抗を必すしも常に うまくひきおこすわけではない。

従ってアルミニューム塩は強力な免疫原のアジュバントとしては身体の抵抗増強 に働くが、多くの感染に必要な形である細胞性免疫をひきおこすための、マラリ ャの合成ペプチドのような、弱い抗原にアジュバントとして加えてもあまり効果 がない。

アジュバントのもうひとつの大きな群として、細菌性のものがある。細菌性アジ ュバントは最近になって精製されたり、合成されなり（例、ムラミルペプチド、 リピドＡ）するようになった、そして宿主のメディエータ−（インターロイキン １および２）がクローン化されるようになって、化学的性質の判った産物が研究 のために提供されるようになった。最近１０年間に、百日咳菌、リボ多糖体、フ ロイント完全アジュバントの３つの細菌性アジュバントに含まれる活性成分の化 学的精製が著しく進歩した。

百日咳菌は、Ｔ細胞群の働きを介した細胞性免疫を変化させる作用があるので興 味が持たれている。リボ多糖体とフロイント完全アジュバントについては、アジ ュバントの活性成分が判明し、その合成がなされた。そのなめ（アジュバントの ）構造と機能の関係を研究することが可能になり、古くからあったアジュバント をモディファイし、毒性と治療性のより良い比率をもったアジュバントを作る可 能性をもたらした。

リボ多糖体とその各種誘導体（リビドＡを含む）は、リボゾームやその他の脂質 エマルジョンと併用することによって強力なアジュバントになることが見出され た。

人体に用いるために充分毒性を唾下させた誘導体がつくられるかどうかは確かで はない、フロイント完全アジュバントは多く実験研究における標準品となってい る。しかしそれは宿主が工具になったり死んでしまうような、重篤な開廷反応と 全身反応をひきおこす、それは人間には使用されない。

アジュバントはその推定作用機序によって分類されている。アジュバントは２つ 以上の作用をもつのでこの分類は不明確とならざるをえない、アジュバントは抗 原の限局化と分散に影響したり、マクロファージやリンパ球のような免疫系を完 成するための細胞に影響したりすることがある。アジュバントのもう一つの働き は抗原を保留することによって免疫応答を高めることである。アルミニューム化 合物や油脂エマルジョン、リボゾーム、合成ポリマー二このような働きがある。

リボ多糖体と、ムラミルペプチドはマクロファージ活性化を行うことによってそ の作用を発揮する。これに対して百日咳菌はマクロファージとリンパ球の両方に 影響を与える。免疫応答を高めるために、モノカインやリンホカインを使う方法 、抗原や担体、アジュバントを加工する方法など、免疫増強のための最近の目を 見はるようなアプローチの仕方が、このところ流行になっている。

マラリャの合成ペプチドのような小さい免疫原を太きな蛋白または他の担体の付 けて免疫応答を増加させることができる６分子の大きさと免疫原性に関する抗原 の複雑性との関係はその分子上の抗原決定基の数に影響する。

ランドシュタイナーは免疫応答を刺戟するためには、小型の基をより大きい（担 体の）分子に複合させることが必要であることを示して、上述の関係を始めて報 知した。

しかしこの必要性のメカニズムは、担体の効果が示され、また免疫原性が発揮さ れるためには分子上に最小＠２つの決定基の存在が必要であることが示されるま では明らかでなかった。それらの決定基はＴリンパ球と８９２８球にそれぞれ働 く担体決定基とハブテン決定基に相当する。しかし、Ｔ細胞依存性の体液性免疫 応答では、担体部分は単純な抗原性のみならず、Ｔ細胞の活性化にまで影響して いるのである。

ある抗原分子に抗原決定基を結合させると、ヘルパーＴ細胞のサプレッサーＴ細 胞をそれぞれ活性化する。その結果、免疫応答に影響を及ぼす、こような効果を 示すモデル系のひとつは、応答系（Ｃ５７Ｂｌ／６）と非応答系（ＤＢＡ／１） のマウスが合成テルポリマーである吏−グルタミン酸６０　ｔ、−アラニン３Ｏ −Ｌ−チロシン１０（ＧＡＴ）に対して遺伝的制御の下で行う体液性免疫応答で ある。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、このポリペ１チドに応答するがＤＢＡ／１マウ スはＧＡＴがメチル化牛血清アルブミン（ＭＢＳＡ＞と結合している場合にだけ 応答する。しかしこのマウスに、ＧＡＴ−ＭＢＳＡを免疫する前にＧＡＴを注射 するとＧＡＴに対する応答は検出されない、この説明は次の通りである。このこ とは、ＧＡＴは応答系マウスではヘルパーＴ細胞を刺戟できるが、非応答系マウ スではサプレッサーＴ紹胞だけが選択的に刺戟されるのだと説明されている。こ のようにサプレツ゛サーＴＭＪ胞が増加してしまうと、ＧＡＴ−ＭＢＳＡが与え られても、ＧＡＴに対する応答が妨げられる。しかし、最初の免疫がＧＡＴ−Ｍ ＢＳＡが使われれば担体部分がヘルパーＴ細胞の活性化をおこし、それがＧＡＴ で活性化されたサプレッサーＴｉ！ｌｉｔ胞の効果を打消してしまう。

天然の蛋白分子におる抗原決定基（複数）もヘルプ（援助）サプレッション（抑 制）に別々に役立っていることが証明されている。免疫原性のある担体を抗原に 複合させると、免疫応答の結果、この抗原に対する抗体のアイソタイプは、担体 結合前とは変る種々の莢膜細胞からとった精製多糖体は胸腺非依存性抗原である 。それは、この多糖体がいくつも繰り返した抗原決定基から成るという構造上の 性質をもっためである。そのような多糖体はこれらの細菌の防御抗原となってい るが、それに対応して産生される１９Ｍ抗体は疾患の予防にあまり役立っていな い、それ故、脳を髄膜炎菌と、ｂ型インフルエンザ桿菌の多糖体は、破傷風トキ ソイドのような蛋白質と複合される。それらの複合体はＤＦＩＡ依存性抗原とし て働き、多糖体部分に対するＩｇＧ応答および免疫記憶を誘導することができる 。同じ理由で、胸腺非依存性の多糖体を担体とする時は、胸腺依存性ＩＱＧ免疫 応答を必要とするマラリアなどの小型ペプチドの免疫原性を増強することはほと んどできない。

Ｆ　ｅｌｄｌａｎとＬｅｅの発表によると、サルモネラ菌の鞭毛抗原は典型的な 胸腺非依存性の抗原であって、強力な１９Ｍ応答をひきおこさせる。　（Ｆｅｌ ｄｍａｎ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ。

ｒ免疫応答における抗原構造とｉ２］ｗＡ由来細胞の必要性との関係Ｊ　Ｊ、　 ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　１３４巻１０３〜１１９頁１９７１年およびｔ、ｅｅ　ｅ ｔ　ａｌ、ｒ（り返し免疫におけるホスホリルニリンに対するモノクローン抗体 の減少と自然回復Ｊ　Ｊ、　Ｉｏｉｔｌｎ、　１１３巻１６４４〜１６４６頁１ ９７４年）この発表されたデータをみると、鞭毛はアジュバントとしての作用ま たはｌｌ２Ｉ腺依存性ＩｏＭ抗体応答が必要なマラリア・ペプチドなどの小型抗 原の担体となる能力は低いことがよく解るであろう。

おそらく、担体とアジュバントの境界点は明確ではないらしい、明らかに抗原の 担体部分は、その抗原の内在的アジュバント性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ａｄｊｕ ｖａｎｔｉｃｉｔｙ　）といわれる性質に寄与している。寛容原（ｔｏｌｅｒｏ ｇｅｎ　）を免疫原に変換するような、物質の能力を外来的アジュバント性（ｅ ｘｔｒｉｎｓｉｃ　ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ　）という、蛋白を凝集させた り、免疫原性のある担体や、ない担体に吸着させたりすることによって抗原を大 きくすると、そのアジュバント性は増強する。水酸化アルミニュウムやラテック ス粒子、ベントナイト、リポゾームは抗原を吸着し、免疫応答を盛んにするが、 そのような物はアジュバントと呼ばれる。しかし、アジュバントには抗原を凝集 する効果がみられるが、その効果はアジュバントの作用の一部にすぎない、その 作用は現在では極めて複雑なものであるとみなされている。

小型ペプチドなどのハプテンはアジュバントを使用しない限り強い免疫応答はひ きおこせない、最近入手可能なアジュバントは動物または人間の感染症における 防御に有効な免疫応答をひきおこすことはない、従って次のものが必要である。

それは動物又は人間に投与可能なワクチンである。しかもそのワクチンは動物ま たは人間の感染を防ぐようなペプチドまたはハプテンに対する強力な長続きする 免疫応答をひきおこさせるワクチンでなければならない。

発明の概要 本発明によってペプチドまたは小型ハブテンに対する人間または動物を、特に有 効に免疫するようなワクチンが提供される。この改良ワクチンはペプチドまたは 小型ハブテンに対し、持続的かつ高度な免疫応答を賦与する。

本発明は、ペプチドなどの小型のハプテンのよなう小さい抗原決定基に複合させ た細菌蛋白質を包含する０本発明に使用される細菌抗原は細菌鞭毛である。この 鞭毛はいかなる鞭毛細胞より由来したものであってもよい。

しかしサルモネラ種の鞭毛が優先的に選択される。しかしながら、個々の応用の ためにどのような鞭毛提供細菌を選択したらよいかは、その応用において要求さ れる特別の抗原によって興るのであって、本発明にとっては重要ではないと理解 されるべきである。この細菌鞭毛は天熱重合型であっても、再重合型であっても よい。

本発明はまた、複合化鞭毛とペプチドを、ブロックポリマーのようなアジュバン トと共に投与することも包含している１本発明のワクチンと共に用いることので きる選択されたアジュバントはエチレンジアミンのイニシエーター上に構築した 親水性ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）のポリマーを含んでいる。このＰＯＥのブ ロックには更に疎水性ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）が添加される。

ＰＯＰ　ＰＯＥ　ＦＯＥ　ＰＯＰ ここで ａはポリオキシエチレン（０２Ｈ４０）ａ　（ＰＯＥ）成分によって代表される 親水部分の数であって、その疎水部分はこの化合物の全分子量の約１０％から４ ０％を占めている。

ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６０）　ｂ　（Ｐ　ＯＰ　）から成る８ブロツク ・ニーポリマーの疎水部分は平均比分子量が約４０００から８０００ダルトンの 間にある。さらに： ｂはポリオキシプロビレ：／　（０３Ｈ６０）ｂ　（ＰＯＰ）部分の数であって 、この成分は８ブロツク・コーポリマー全分子量の約６０％から９０％となって いる。

鞭毛は非常に効果的なアジュバントおよび担体として用いることができる。それ はハプテンや薬品、ペプチドなどの小型抗原決定基に対する持続的で高力価、強 結合力の抗体をつくるような免疫応答に効果的なのである。

そのペプチドは合成または遺伝子工学のいずれで作られたものであってもよい、 遺伝子工学で作られたペプチドの例としては細菌マラリアについて得られたもの がある。

小型抗原決定基と鞭毛の複合体を含む改良ワクチンは強力で長期的なＩ１２１ｗ Ａ依存性■ｇＧ抗体の応答をひきおこすのに用いることができる。

従って、本発明のひとつの目的は小型免疫原の決定基に対する長期的かつ強力な 免疫応答を与えるのに特に効果的なワクチンを提供することにある。

本発明のもう一つの目的はマラリア病原体の感染から個体を守ることの可能な持 続的免疫応答をつくるために、マラリアの合成ペプチドの使用を可能ならしめる 有効なワクチンを提供することである。

本発明のもう一つの目的は、エイズの予防に効果的な免疫応答をつくるために、 エイズウィルスの合成ペプチドが使用できるようなワクチンを提供することであ る。

また、本発明のもう一つの目的はペプチドやハプテンのような小型免疫原決定基 に対する、強力で持続的なＩＱＧ応答をおこさせるために、動物または人間の免 疫系を刺戟することのできるワクチンを提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、人間または動物にとって毒性の極めて低いワクチン の提供である。　さらに本発明のもう一つの目的は、開始アレルギー反応をほと んどまたは全くおこさないようなワクチンの提供である。

本発明の次の目的は、乾燥可能なワクチンの提供である。

本発明のもう一つの目的はワクチン調製に使用可能なアジュバントの提供である 。

図面の簡単な説明 図１はサルモネラ鞭毛蛋白に複合させたトリニトロフェノール（ＴＮＰ）で免疫 したマウスにおける抗体力価を示したグラフである。

図２はサルモネラ鞭毛蛋白に複合させたトリニトロフェノール（ＴＮＰ）で免疫 したマウスの用量一応答を示したグラフである。

図３は、ＴＮＰ複合鶏卵アルブミン（ｈＥＡ）とＴＮＰ複合サルモネラ鞭毛蛋白 で免疫されたマウスの免疫応答を比較したものである。この図では、ボリホア３ ２：５　（Ｃｙ　＋ＲＸ社、アトランタ、ジョーシア）アジユバ発明の詳細な説 明 本発明は小型ペプチドなどのハゲテンに対する免疫を動物または人間に生じさせ るのに特に有用なワクチンを包含するものである６本発明によって、小型ペプチ ドまたはパブテンが微生物より得られた鞭毛と複合される。

この鞭毛はいかなる微生物から由来したものであってもよい、しかしサルモネラ 種の鞭毛が優先的に選択される。

しかしながら、各々の応用にためにどのような鞭毛提供菌を選択したらよいかは 、その応用において要求される特定の抗原によって異るので、本発明にとっては 重要でないと理解されるべきである。

１本の鞭毛をもつ細菌、何本かの鞭毛をもつ細菌および表面全体の鞭毛が生えて いる細菌がある。Ｉ５菌鞭毛は直径１ｏから３５μｍで時には１ｏから１５μｍ の長さをもっている。ＩＳＥ！菌細胞の直径と同じ長さであることが多い、多く の細菌鞭毛は、規則的で均等なカール（湾曲）があって、その波長は２．５μｍ である。

細菌鞭毛の本体は蛋白質であるが鞭毛をｐＨ３の酸性にすると互に等しいモノマ ーのサブユニットになる。これはフラジェリンと呼ばれ、多くの菌種では分子量 ４０゜０００である。ＤＨと塩濃度を適当にするとフラジェリンモノマーは自然 に再会合し、処理前の鞭毛と同じ構造、すなわち自然の鞭毛と同じ波長のくりか えしカールをもったものを形成する。

本発明の実施にあたっては、自然形または種々の固定票で固定した無処理の（フ ラジェリンにしていない）鞭毛が使用される。この他にも再会合させたフラジェ リンが本発明の実施に使用される０本発明の本質的な内容は次の通りであると確 信する二上記の調製品はフラジェリ７分子より成るポリマーを含んでおり、その フラジェリン分子は、幾何学的パターンによって規則的に区切られ、それぞれの 微生物によく見られるような鞭毛の構造を延長した形をしているものである。

抗原は哺乳動物に投与された時に抗体産生をおこすような物質である０本発明に 従って使用可能な抗原の代表者は蛋白質、糖蛋白および核蛋白であって、それら はペプチドホルモン、血清蛋白、補体蛋白、凝固因子、ウィルスや細菌の産物の ようなものである。ウィルスや細菌の産物は、生物（ｏｒｇａｎｉｓｌ）が酵素 分解によって生じた化合物であってもよいし、普通の技術としてよく知られるよ うになった組換えＤＮＡ技術によって作られた生物成分であってもよい、つぎの りストに代表的な抗原の一部を示す。

ｐｒｏｔｅｉｎｓ　蛋白質　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　糖蛋白質ｎｕｃｌｅ ｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　核蛋　ｐｅｐｔ　ｉｄｅ崩ｎ１ｏｎｅｓ　ペプチドホルモ ンｓｅｒｕｍ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　血清蛋白　ｃｏｍｐｌｅｗｎｔ　ｐｒｏｔｅ ｉｎｓ　Ｉ体蛋白ｃｏａｇｕｌａｔｉｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　凝固因子　１ｉｃｒ ｏｂｉｏｃｉｄａｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　＆ｌ生物産生物ｖｉｒａｌ　ｐｒｏｄ Ｌｌｃｔｓ　ウィルス産物ｈａｃｔｅｒｉａｌ　ｐｒｏｄＬＩｃ！Ｓ　ａ菌属生 物ｔｕｎｇａ＋　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　真菌産物　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｉｍｕｎｏ ｇｅｎｓ　詩興免疫原ａｌｂｕｉｉｎ　アルブミン　ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　 アンギオテンシンｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ　ブラジキニンｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ　 力ルチトニンｃａｒｃｉｎｏｅｍｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇａｎ　腰痛胎児抗原 　ｃｈｏｒ　１ＯＥｆｆｉｏｔｒｏｐ　ｉｎ　：Ｆリオマモトロピンｃｈｏｒｉ ｏｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ　：７リオゴナドト口ビン　Ｃ０ｒｔｉＣＯｔｒｏ ｐｉｎ　：フルチコトロピンｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ　エリスロポエチン 　ｒａｃｔｏｒ　■　第■因子ｆｉｂｒｉｎｏｇｉｎ　フィブリノシフ　ａｌｐ ｈａ−２−Ｈｇｌｏｂｕｌｉｎ　アル７ｙ−２−Ｈグロブリンｆｏｌｌｉｔｒｏ ｐｉｎ　フオリトロピン　Ｇａ５ｔｒｉｎ　ガストリンｇａｓｔｒｉｎ　５ｕｌ ｆａｔｅ　ガストリン砿酸塩　ｇｌｕｃａｇｏｎ　グルカゴンｇｏｎａｔｉｏｔ ｒｏｐ１ｎ　ゴナドトロピン　ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ　ハプトグロビンＨｅＤ ａｔｉｔｉｓ　Ｂ　５ｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇｅｎ肝炎（ウィルス）表在抗原 　ｉａｍｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ　免疫グロブリン１ｎｓｕｌｉｎ　インシュリ ン　１ｉｐｏｔｒｏｐｉｎ　リボトロピン圓１ａｎｏｔｒｏｐｉｎ　メラノトロ ピン　ｏｘｙｔｏｃｉｎ　オキシトシンｐａｒｃｒｅｏｚｙｍｉｎ　パンクレオ チミ７　ｐｌａｃｅｌ’１ｔａｌ　＋ａｃｔｏｇｅｎ　胎２ラクトゲンｐｒａｔ ｈｒｙｉｎ　プラスミン　ｐｒｏａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　プロアンギオテンシ ンｐｒｏＩａｃｔｉｎ　プロラクチン　Ｓｏ＆］１０ｔｒｏｐｉｎ　ソマトトロ ピン５Ｏ１ａｔＯＩｌａｄｉｎ　ソマトマシン　ｓｃｍｔｏｓｔａｔ　ｉｎ　ソ マトスタチンｔｈｒｙｒｏｔｒｏｐｔｎ　スリロトロピン　ｖａｓｏｔＯｃｉｎ 　ハプトシンｔｈ％１ｍｏｐｏｉｅｔ　ｉｎ　サイモボエチン　ｖａｓｏｐｒａ ｓｓｉｎ　バゾルッシンａｌｐｈａ−１−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｋ７１− −１−７：ト所イン　ａｌｐｈａ−２−Ｈｇｌｏｂｕｌ　ｉｎ　アル７ｒ−２− Ｈグ鴻uリン ｒＮｅｌｉｎ　ミニリン　Ｂｅｌ　ｉｎ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ミニリ フ１Ｍｊｕｌｉ白ハプテンは、免疫原生担体に結合させてを椎動物に注入した時 に、ハプテンに特異的な抗体の産生を促すものである１代表的なハプテンはニス トロジエンやコーチシンのようなステロイド化合物、低分子ペプチド、そして次 のような低分子生物化合物および薬品である。：抗生物や化学療法剤、工業汚染 物質、香料、食品添加物、食品夾雑物、またそれらの代謝産物や誘導物質。

細菌培養物から鞭毛を調整する方法は多数開発されている。そしてそれは昔通一 般の技術としてよく知られている０選ばれた方法はＫ　ｏｂａｙａｓｈｉ、Ｒ１ ｎｋｅｎ　、ａｎｄＫｏｆｆｌｅｒ　ＡｒＣｈ　、　Ｂｉｏｃｈｅｏ　Ｂ１１１ ）ｈａｓ、８４゜３４２−３６２　（１９５９）の方法を改変したもので、次に 述べるものである。　腸チフス菌ＴＹ２株を運動用寒天培地で増殖させる。よく 運動する菌は最もよく鞭毛を作っているので、そのような運動菌を選択しなけれ ばならない、菌は次に菌を２０吏のトリブチケース・ソーイブロスに接種し、ロ グ増殖期の終りになるまで、約３０時間、３７℃にインキニーベートする。この 時点でホ菌する。遠心によって集菌する：しかし過度の剪断力がかからないよう に注意しなければならない０次に振盪機によって２０分間はげしく振とうして、 菌から鞭毛を分離する。菌体を破損しないように鞭毛を折りとるような剪断力を つくる。他の混合機や装置も同様に充分使用できる。

次に、鞭毛を分画遠心によって菌体と分離する。標準的な研究室の遠心機で約２ ０００　ｒｐｌで遠心して除去する。鞭毛は３０．ＯＯＯｒｐｍの超遠心で集め る０次に鞭毛を再浮遊させ、超遠心機で再遠心して可溶性の夾雑物を除く、大型 の夾雑物は、鞭毛の透明な沈澱物の底に黒丸を作るだろう、この物質を物理的に 除去し捨てる。２０ｆＬの培養菌からえられる最終産物は約１００ｍｇの精製鞭 毛となる筈である。

フラジェリンは非固定鞭毛なｐＨ２まで酸性化し、２夜おいて作られる。この処 理によって、鞭毛蛋白は分子量３０，０００フラジエリンのモノマーに解離する 。このモノマーを中性ＥＩＨに２４時間以上おくと、重合型の鞭毛に再び組立て られる。再重合フラジェリンはアジュバント活性と小型抗原部分のための担体能 力を自然の鞭毛とほぼ同じくらい持っている。フラジェリンモノマーまたはフラ ジェリンの酵素分解で生じた断片は、効果がはるかに低い。

抗原パブテンまたはペプチド部分は公知の技術となっている標準方法の一つによ って鞭毛に化学的に複合することができる。最も簡単で効果的な方法の一つは、 グルタルアルデヒドの使用である。グルタルアルデヒドは二価の架橋剤で、ペプ チド鞭毛に共有結合させ、さらに鞭毛調整品を固定する。他の化学的架橋剤また はジニトロフルオロベンゼンのような化学抗原も有効である。

鞭毛に結合される抗原量は個々の応用例で異っており、本発明の重要な点ではな い、どちらかといえばフラジェるのが適当である。

複合鞭毛調整品は透析、遠心、または他の標準的方法で精製できる。できた物は 次に約１００μｇ　／ｎｌの濃度になるよう食塩水に再浮遊させる。この調製品 を１から１００μＱの注射という低用量で有効である。いろいろの状況でも、１ ０μＱの用量によって満足な応答がおこる。この物質は静脈内、皮下、筋肉内、 腹腔内など普通の経路で注射可能である。皮下または筋肉内投与が多くのワクチ ンの目的のために最も一般的に用いられる。

−例をあげると、ジニトロフェノールを複合させた腸チフス菌鞭毛の２０μＱを 注射するとＤＮＰハプテンに特異的なＩＱＧ抗体の力価が注射後第１週の終りに 上り、数ケ月間持続する。

鞭毛と鞭毛に結合された抗原部分に対する免疫応答は普通に期待されるより長く 持続する。￥ｉ毛注射量の約９０から９５％は分解され、２４時間以内に排泄さ れる。

その一部が開廷リンパ節の胚中心に長期間保留される。

この抗原が胚中心にあるなめに、抗体産性も長期間持続するのだと確信している 。

本発明は従来入手可能なものよりも多くの長所をもっている。それは注射部位に 極くわずかしか炎症を起こさせないし、すべて生体内で分解される。この点、油 エマルジョンやアルミニュームのような菌属塩とは全く異るものである。産生さ れる抗体の大部分は補体結合性の■ＱＧであって、それはマラリア、スポロゾイ トその他の重要な感染を防禦するのに必要な抗体である。産物は安定で、ことに グルタルアルデヒドなどの固定剤で調整しであるときは安定である。それは乾燥 可能であり、室温で保存できる０食塩水に溶解剤調整しても凍結すれば数週間、 室温でら数日間安定である。

感染後宿主に時に感染しうるような生ワクチンとは異って、このワクチン調製品 は重合蛋白質と極く微量の多糖体を含むだけである。

本発明に従って調整されたワクチンでは、うないし５００μｇの用量を選ぶこと ができる。￥１毛蛋白に複合する抗原によって、またワクチンを受ける動物また は人間の免疫状況によってｆｉｆｌの用量を選択することができる。

本発明のワクチンは、さらに免疫応答を増強させるためにアジュバントと共に投 与することを包含している。

本発明のワクチンと共に用いるアジュバントとして選ばれたもｆ）　ＣＩ）Ｏｌ ｙｐｈＯｒｅ　ＴＭ　３２　：　５　、ＣｙｔＲｘ社。

アトランタ、ジョーシア）はブロックコーポリマーであって、エチレンジアミン イニシェークーの上に構築された親水ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）のポリマー である。

親水性のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）のブロックに更に疎水性のポリオキシプ ロピレン（ＰＯＰ）を添加すると、次のような一般式で示される８ブロックコー ボリマＨ１，１ｄｒｏｐｈｏｂｅ　Ｈｇｄｒｏｐｈｉｌｅ　−一−−−−−−− −−−４Ｈ１，１ｄｒｏｐｈｏｂｅＰＵＰ　ＰＯＥ　ＰＯＥ　ＰＯＰ　’ ここで ａはポリオキシエチレン（Ｃ２Ｈ４ｏ）ａ　（ＰＯＥ）成分によって代表される 親木部分の数であって、その疎水部分はこの化合物の全分子量の約１０％から４ ０％を占めている。

ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６０）ｂ　（ＰＯＰ）から成る８ブロツク・コー ポリマーの疎水部分は平均比分子量が４０００から９０００ダルトンの間にある 。さらにｂはポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈａ　Ｏ）ｂ　（ＰＯＰ）部分の数で あって、この成分は８ブロツク・コーポリマーの全分子量の約６０％から９０％ となっている。

選択されたアジュバントは次の化学式をもつ疎水　親水　疎水 ＨＬＪｄｒｏｐｈｏｂａ具−一−Ｈｇｄｒｏｐｈｆｌｅ　−一−４Ｈｇｄｒｏｐ ｈｏｂｓここでａは約５で、ｂは約３２に等しい。

本発明が構成するワクチンと共に使用可能なもう一つのコーポリマーは、次の化 学式をもっている。

ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）ｂ　（Ｃ３Ｈ６０）ａ（Ｃ２Ｈ４０）　ｂ　Ｈ ここで、疎水基（Ｃ３Ｈａ　Ｏ）の分子量は約２０００から５０００であり、こ の化合物の全分子量は約２３００から６０００である。（ＣｙＲｘ社、アトラン タ、ジョーシア） 選択されたアジュバントは次の化学式をもっている。

ＨＯ（Ｃ２Ｈ４０）　ｂ　（Ｃ３Ｈａ　Ｏ）　ａ（Ｃ２ＨａＯ）ｂＨ ここで疎水基（Ｃ３Ｈ６０）の分子量は約４３００で親水基（Ｃ２Ｈ４０）ａの 重ｉ組成は約１０％である。

（Ｃｙ　Ｒｘ社、アトランタ、ジョーシア）４つの作用基をもつエチレンジアミ ンのインシエーターの上にエチレンオキサイドとグロビレオキサイドを、塩基性 触媒と高温高圧の下で縮合させることによって、ポリマーブロックが形成される 。ポリマー形成のため、各コーポリマーに結合するモノマー単位の数には、統計 学的変動がある。えられる分子量は各調整品におけるコーポリマー分子の平均分 子量から推定される。これらのブロックコーポリマー調整のさらに詳しい記述が 米国特許Ｎｏ、２，６７４，６１９と２，９７９，５２８に記載されている。（ また次のものも見よ： ″Ａ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｂｌｏｃｋ　Ｐｏ１ｙｒａｅｒＳｕｒｆａｃｔａｎ ｔｓ”　、　５ｃｈ１１ｏ１ｋａ　、ｌ　、　Ｒ，、Ｊ　。

Ａｎ　、　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｎｉｓｔｓ　−Ｓｏｃ、　、　５４　：　１１Ｏ−１ １６（１９７７）　ａｎｄ　Ｂｌｏｃｋ　ａｎｄ　Ｇｒａｆｔ　Ｃｏｐｏｌｙｍ ｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｖｏｌｕｌｌｅ　２　ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｒ，Ｊ。

Ｃｅｒｅｓａ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、＜１ ９７６）　’ｈ旧ｃｈ　ａｒｅ　１ｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ　ｈｅｒｅｉｎ　ｂ ｙｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　、　）本発明に含まれるワクチンは８ブロツクコーポリ マーと混合して人間又は動物に投与される１本発明のワクチンと混合投与するア ジュバントの適量は約０．１１１ｇから５．ＣＨｌ（＋の間であって最適量は約 ０．５から２ＪΩである。

小型ハプテンに対する生物の免疫応答増強についての本発明の応用を次の実施例 で説明する。昔通の技術による他の応用例についてら明瞭であり、本発明はこれ らの特殊な実施例に限定されないと考えていただきたい。

実施例　工 腸チフス菌ＴＹ２株で運動性寒天培地で増殖させる。

よく運動する菌は最もよく鞭毛を作っているので、そのような運動面を選択しな ければならない１次に菌を２０史のトリブチケース・ソーイブロスに接種し、ロ グ増殖期の終りになるまで、約３０時間、３７℃にインキニーベントする。この 時点でホルムアルデヒド・を０．３％懸濁液になるまで加えて殺菌する：しかし 過度の剪断力がかからないよう注意しなければならない０次に＠組機によって２ ０分間はげしく振とうして、菌から鞭毛を分離する。菌体を破壊しないように鞭 毛を折りとるような剪断力をつくる。他の混合機や装置も同様に充分使用できる 。

次に鞭毛を分画遠心によって菌体と分離する。菌体は標準的な研究室の遠心機で 約２０００　ｒｐｎで遠心して除去する。￥１毛は３０．０ＯＯｒｐ１１の超遠 心で集める０次に鞭毛を再浮遊させ、超遠心機で再遠心して可溶性の夾雑物を除 く、大型の夾雑物は鞭毛の透明な沈澱物の底に、黒丸をつくるだろう、この物質 を物理的に除去しすてる。

２０更の培養菌からえられる最終産物は約１１００ＩＩの精製鞭毛となる筈であ る。

実施例　■ フラジェリンは非固定鞭毛をｐ　８２ｍで酸性化し、２夜おいて作る。この処理 によって鞭毛蛋白は分子量３０゜０００の７ラジエリンのモノマーに解離する。

このモノマーを中性ｐＨに２４時間以上おくと、重合型の鞭毛に再Ｍ築される。

実施例　■ グルタルアルデヒドは二価の架橋剤で、ペプチドを鞭毛に共有結合させ、さらに 鞭毛調整品を固定する。活性基を蛋白に複合させる方法は標準的方法の一つとし て公知の技術となっている。他の化学的架橋剤またはジニトロフルオロベンゼン のような化学抗原も有効である。

実施例　■ 複合鞭毛調整品は透析、遠心、または他の標準的方法で精製できる。できた物は 次に約１００μｇ／ｍｌの濃度になるよう食塩水に再浮遊させる。この調整品は １から１００μ９の注射という低用量で有効である。いろいろの状況でも、１０ μＱの用量によって満足な応答がおこる。この物質は静脈内、皮下、筋肉内、腹 腔内など普通の経路で注射可能である。皮下または筋肉内投与が多くのワクチン の目的のために最も一般的に用いられる。

実施例　Ｖ トリニトロフェノールハプテンに対する抗体の定量にはＥＬＩＳＡ法を用いる。

それは本来Ｓ　ａｕｎｄｅｒｓによって発表された方法の改変法である。（次の ものも見よ。

５ａｕｎｄｅｒＳ　、　Ｇ、　Ｃ，、ｒ固定系酵素免疫的アッセイ法および選ば れた実施法」、臨床検査室における免疫学測定法、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ　 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ｐｌ）、１１１−１１２．１９７９＞。

この測定法では、蛋白として牛血清アルブミンを、蛋白の変性を防ぐためにハイ ドロゲルを、付着体としてプラスチック支持体を使用し、また蛋白と界面活性剤 を使うことによって、バックグラウンドの上昇と感度低下をもたらしやすい蛋白 の非特異的吸着を防ぐ、抗原をＢＳＡでコートした９６六マイクロタイタープレ ートに結合させるためにはグルタルアルデヒドを使用する。未結合グルタルアル デヒドは洗滌除去する。プレートに加えた抗原はグルタルアルデヒドの遊離アル デヒド基を介してプレートに結合する。

残存アルデヒド基をリジンでブロックすると、プレートは使用可能になる。この プレートに種々に稀釈した抗血清を加えてインキニーベートし、洗滌後ペルオキ シダーゼ複合羊抗マウスｒｇ　ＧＪ？？ＩＱ　Ｇのサブクラスのような第二抗体 を加える。プレートを洗って、基質（たとえばペルオキシダーゼならばオルトフ ェニレンジアミン）を加える。その結果生じた４９２ｉｒｍでの吸光度を’ｒｉ ｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ光度計で読む、バックグラウンドの最大０・ Ｄ、の１／３ないし１／２を生じるのに必要な抗血清の稀釈項数を計算して抗体 力価とする。このときに、サンフルと同時に対照抗血清を比較することによって 補正値を出す、このようにすれば、異った日時での測定が可能になる。Ｏ，Ｄ、 対血清稀釈の曲線分析すると、各血清の比較的なアビディティが推定できる。

実施例　■ 次の実験では鞭毛あたり平均４個のＴ　Ｎ　Ｐ分子をつけた２５μ９の鞭毛をマ ウスの後肢足に投与する。ＴＮＰ−複合鞭毛は０．５ｉ１での食塩水に入れて投 与した。

ＴＮＰ特異抗体を投与後８日、１９日、３０日、５０日。

９０日で測した。この実験結果を図１に示す、これで見られるように、ＴＮＰ複 合鞭毛に対する免疫応答は９０日後でもなお著明に高い、ＴＮＰ複合卵白アルブ ミンのような昔通のＴＮＰ複合体を与えた場合は、持続期間が短く抗体力価はす っと低い、ハプテンを可溶性蛋白担体に統合させた場合は、動物は通常はそのハ プテンに対する検出可能な抗体を産生じない。

実施例　■ ＴＮＰ−複合抗原の種々量をマウスに投与して、容量、応答の関係をみる。フラ ジェリン（分子量約４０．０００）あなり平均４個のＴＮＰ分子をつけた鞭毛を マウスの後肢足たに投与する。ＴＮＰ−複合鞭毛は０．５ｍｌの食塩水に入れて 投与する。マウス当り投与したＴＮＰ−複合鞭もの濃度は４μ９．１０μ９．２ ５μ９．５０μ９である。ＴＮＰ−複合鞭毛抗体を投与後８日と１９日に測定す る。その結果を図２に示す。

実施例　ＩＸ ＴＮＰ−複合ニワトリ卵白アルブミンと（ｈＥＡ）とＴＮＰ−複合細菌鞭毛に対 するマウスの免疫応答の比較を図３に示す、この実験では、鞭毛の場合と同様に 反応基としてトリニトロベンゼンスルフォンａ（ＴＮＢＳ）用いて、ＴＮＰ複合 ｈＥＡを作成した。１００μｇのＴＮＰ複合ｈＥＡ又は２５μｇのＴＮＰ複合鞭 毛をマウス後肢足跡に投与した。ＴＮＰ複合複合蛋白投与後日０日実施例Ｖと同 様に抗体力価を測定する０図３に示すように抗体力価を測定するとＴＮＰ複合鞭 毛はＴＮＰ複合ｈＥＡよりも著明に強い免疫応答をひきおこしている。この実験 で投与されなＴＮＰ−ｈ　ＥＡの量はＴＮＰ複合鞭毛量の４倍量であったことは 特に注意すべきである。

（１００μｇのＴＮＰ−ｈＥＡ対２５μＱのＴＮＰ複合鞭毛）。

実施例　Ｘ 実施例ＩＸで用いたのと同じ調製品に１．０ＩＱのポリフォアＴＭ３２：５アジ ュバント（ＣｙｔＲｘ社、アトランタ、ジョーシア）を加えてマウスに投与する 。１００μＱのＴＮＰ複合ｈＥＡ又は２５μＱのＴＮＰ複合鞭毛をマウスの後肢 足践に投与する。アジュバントと共にＴＮＰ複合蛋白を投与した１０日後に、実 施例Ｖと同様に抗体力価を測定する。その実験結果を図３にまとめて示す、それ によると、アジュバントはＴＮＰ複合ｈＥＡとＴＮＰ複合社毛鞭毛ずれに対する 抗体の応答も増加している。しかし、ＴＮＰ複合鞭毛はＴＮＰ−ｈ　ＥＡよりも 著明に高い免疫応答をひきおこしている。

前述の事実は本発明の一部の具体化に過ぎず、本発明の精神と鯰囲から外れるこ となしに多数の改変又は変更があるうろことを了解すべきである。

２５μＱのＴＮＰ−鞭毛による免疫 免疫後日数 ＴＮＰ複合化鞭毛に対する投与量依存性応答投与量（μｇ） Ｆｉａ、２ 袖釈 Ｆｉｇ、　３ 国際調査報告 １１１１′１ｌａｌｌＲａｌ　ａｔｏ＋：ζ”””＝　ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２ ０５６

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．抗原に複合された最近フラジェリンの有効量より構成されるワクチン。
2. ２．前記細菌鞭毛がサルモネラ菌種より単離されている請求の範囲第１項記載の ワクチン。
3. ３．前記サルモネラ菌種が腸チフス菌である請求の範囲第２項記載のワクチン。
4. ４．前記抗原がハプテン、薬剤、ペプチド、蛋白質、多糖体、脂質、糖脂質およ び糖ペプチドから成る群より選択されている請求の範囲第１項記載のワクチン。
5. ５．前記抗原がマラリア寄生体に由来する請求範囲第１項記載のワクチン。
6. ６．前記抗原がヒト免疫不全症ウィルスに由来する請求範囲第１項記載のワクチ ン。
7. ７．前記鞭毛が重合フラジェリンより成る請求範囲第１項記載のワクチン。
8. ８．前記ワクチンがアジュバントと共に投与される請求範囲第１項記載のワクチ ン。
9. ９．前記アジュバントが次の化学式をもつ請求範囲第８項記載のワクチン。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ａはポリオキシエチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（ＰＯＥ）成分によって代表 される親水部分の数であって、その疎水部分はこの化合物の全分子量の約１０％ から４０％を占めている。 ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）から成る８ブロック・コーポ リマーの疎水部分は平均総分子量が約５０００から７０００ダルトンの間にある 。さらにｂはポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）部分の数であっ て、この成分は８ブロック・コーポリマーの全分子量の約６０％から９０％とな っている。
10. １０．前記アジュバントが次の化学式をもつ請求範囲第８項記載のワクチン。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでａは約５に等しく、ｂは約３２に等しい。
11. １１．前記アジュバントが次の化学式をもつ請求範囲第８項記載のワクチン。 ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ ここで、疎水基（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量は約２０００から５０００で、前記コン パウンドの分子量は約２３００と６０００の間である。
12. １２．前記アジュバントが次の化学式をもつ請求範囲第８項記載のワクチン。 ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ ここで疎水基（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量は約４３００で、親水基（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ の重量組成は約１０％である。
13. １３．抗原に結合した細菌鞭毛の有効量を投与する段階を含む、人間または動物 の免疫方法。
14. １４．前記細菌鞭毛がサルモネラ菌種より単離される請求範囲第１３項に記載の 方法。
15. １５．前記サルモネラ菌種が腸チフス菌である請求範囲第１４項に記載の方法。
16. １６．上記抗原がハプテン、薬剤、ペプチド、蛋白、多糖体、脂質、糖脂質およ び糖ペプチドから成る群より選択される請求範囲第１３項に記載の方法。
17. １７．上記抗原がマラリア寄生体に由来する請求範囲第１３項に記載の方法。
18. １８．上記抗原がヒト免疫不全症ウィルスに由来する請求範囲第１３項に記載の 方法。
19. １９．上記鞭毛が再複合フラジェリンで構成される請求範囲第１３項に記載の方 法。
20. ２０．上記ワクチンがアジュバントと共に投与される請求範囲第１３項に記載の 方法。
21. ２１．上記アジュバントが次の化学式をもつ請求範囲第２０項に記載の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ａはポリオキシエチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（ＰＯＥ）成分によって代表 される親水部分の数であって、その疎水部分はこの化合物の全分子量の約１０％ から４０％を占めている。 ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）から成る８ブロック・コーポ リマーの疎水部分は平均総分子量が約５０００から７０００ダルトンの間にある 。さらに ｂはポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）部分の数であって、この 成分は８ブロック・コーポリマーの全分子量の約６０％から９０％となっている 。
22. ２２．上記アジュバントが次の化学式をもつ請求範囲第２０項に記載の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでａは約５に等しく、ｂは約３２に等しい。
23. ２３．前記アジュバントが次の化学式をもつ請求範囲第２０項に記載の方法。 ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ ここで、疎水基（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量は約２０００から５０００の間であり、 この化合物の全分子量は約２３００から６０００の間である。
24. ２４．前記アジュバントが次の化学式をもつ請求範囲第２０項に記載の方法。 ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ ここで疎水基（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量は約４３００で親水基（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａの 重量組成は約１０％である。
25. ２５．下記（ａ），（ｂ）を包含する改良ワクチンの製造方法。 （ａ）細菌由来フラジェリン蛋白の単離法、および（ｂ）上記の鞭毛を抗原に複 合させる方法。
26. ２６．上記細菌鞭毛をサルモネラ細菌から単離する請求範囲第２５項に記載の方 法。
27. ２７．上記サルモネラ菌種が腸チフス菌である請求範囲第２６項に記載の方法。
28. ２８．上記抗原がハプテン、薬剤、ペプチド、蛋白、多糖体、脂質、糖脂質およ び糖ペプチドから成る群より選択される請求範囲第２５項に記載の方法。
29. ２９．上記抗原がマラリア寄生体に由来する請求範囲第２５項に記載の方法。
30. ３０．上記抗原がヒト免疫不全症ウイルスに由来する請求範囲第２５項に記載の 方法。
31. ３１．上記鞭毛が再複合フラジェリンで構成される請求範囲第２５項に記載の方 法。
32. ３２．上記ワクチンがアジュバントと共に投与される請求範囲第２５項に記載の 方法。
33. ３３．上記アジュバントが次の化学式をもつ請求範囲第３２項に記載の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ａはポリオシエチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（ＰＯＥ）成分によって代表さ れる親水部分の数であって、その疎水部分はこの化合物の全分子量の約１０％か ら４０％を占めている。 ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）から成る８ブロック・コーポ リマーの疎水部分は平均総分子量が約５０００から７０００ダルトンの間にある 。更に、ｂはポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）部分の数であっ て、この成分は８ブロック・コーポリマーの全分子量の約６０％から９０％とな っている。
34. ３４．上記アジュバントが次の化学式をもつ請求範囲第３２項に記載の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここでａは５に、ｂは３２に等しい。
35. ３５．前記アジュバントが次の化学式をもつ請求範囲第３２項に記載の方法。 ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ ここで、疎水基（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量は約２０００から５０００の間であり、 この化合物の全分子量は約２３００から６０００である。
36. ３６．前記アジュバントが次の化学式をもつ請求範囲第３２項に記載の方法。 ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ａ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｂＨ ここで疎水基（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量は約４３００で親水基（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａの 重量組成は約１０％である。
37. ３７．次の化学式をもつコーポリマーを包含するワクチンアジュバント。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ａはポリオキシエチレン（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（ＰＯＥ）成分によって代表 される親水部分の数であって、その疎水部分はこの化合物の全分子量の約１０％ から４０％を占めている。 ポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）から成る８ブロック・コーポ リマーの疎水部分は平均総分子量が約５０００から７０００ダルトンの間にある 、さらに； ｂはポリオキシプロピレン（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（ＰＯＰ）部分の数であって、この 成分は８ブロック・ユーポリマーの全分子量の約６０％から９０％の間となって いる。
38. ３８．前記アジュバントが次の化学式をもつ請求範囲第３７項記載のワクチエン アジュバント。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ａは５に、ｂは３２に等しい。