JPH0150719B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0150719B2 JPH0150719B2 JP61266447A JP26644786A JPH0150719B2 JP H0150719 B2 JPH0150719 B2 JP H0150719B2 JP 61266447 A JP61266447 A JP 61266447A JP 26644786 A JP26644786 A JP 26644786A JP H0150719 B2 JPH0150719 B2 JP H0150719B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- insulin
- reaction
- protecting group
- compound
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は人インシユリンの製造方法に関するも
のである。本発明者らはトリプシンまたはカルボ
ニル側塩基性アミノ酸残基に特異性を示すトリプ
シン様酵素の作用によりデス−B30−インシユリ
ンに１〜100倍モル量のスレオニン誘導体を反応
させて、ついで得られる縮合物から保護基を除去
してインシユリンを得る方法を発見した。
のである。本発明者らはトリプシンまたはカルボ
ニル側塩基性アミノ酸残基に特異性を示すトリプ
シン様酵素の作用によりデス−B30−インシユリ
ンに１〜100倍モル量のスレオニン誘導体を反応
させて、ついで得られる縮合物から保護基を除去
してインシユリンを得る方法を発見した。
インシユリンは糖尿病の治療薬として代替品の
ない貴重な薬物であり、現在主として牛インシユ
リンおよび豚インシユリンが治療に用いられてい
る。しかし、これらのインシユリンは構成アミノ
酸の一部が人インシユリンと異なつているため、
体内で抗体が産生されることがあり、抗体が産生
されるとそれ以後のインシユリンの治療効果が著
しく低下するなどの問題を生じる。したがつて、
工業的規模で行ないうる人インシユリンの合成方
法の確立が強く望まれている。
ない貴重な薬物であり、現在主として牛インシユ
リンおよび豚インシユリンが治療に用いられてい
る。しかし、これらのインシユリンは構成アミノ
酸の一部が人インシユリンと異なつているため、
体内で抗体が産生されることがあり、抗体が産生
されるとそれ以後のインシユリンの治療効果が著
しく低下するなどの問題を生じる。したがつて、
工業的規模で行ないうる人インシユリンの合成方
法の確立が強く望まれている。
本発明者らの方法によれば、人インシユリンと
Ｂ鎖30位のアミノ酸のみが異なる豚インシユリン
を原料に用いて人インシユリンを容易に合成する
ことができる。このようにして得られる人インシ
ユリンが理想的な治療用インシユリンであること
は論を俟たない。
Ｂ鎖30位のアミノ酸のみが異なる豚インシユリン
を原料に用いて人インシユリンを容易に合成する
ことができる。このようにして得られる人インシ
ユリンが理想的な治療用インシユリンであること
は論を俟たない。
豚デスオクタペプチドインシユリンと人インシ
ユリンオクタペプチドから人インシユリンを得る
試みは、エム・エー・ルツテンベルグ（M.A.
Ruttenberg）がサイエンス（Science）177巻623
頁（1972年）に、およびアール・オーベルマイヤ
ー（R.Obermeier）らがサイツシユリフト・シユ
ア・ヒジオロジツシエ・ヘミー（Zeitschrift fu¨r
Physiologische Chemie）357巻759頁（1976年）
に発表しているように既になされているが、何れ
も化学的手段によるものであり、前者においては
工程の最後にアルカリ処理を含み、これに伴う副
反応がさけられない。また後者の場合は反応が非
特異的で多くの副反応を生じるため、精製が複雑
かつ困難となり収率も著しく低い。従つて、工業
的規模では到底行ない得ない。
ユリンオクタペプチドから人インシユリンを得る
試みは、エム・エー・ルツテンベルグ（M.A.
Ruttenberg）がサイエンス（Science）177巻623
頁（1972年）に、およびアール・オーベルマイヤ
ー（R.Obermeier）らがサイツシユリフト・シユ
ア・ヒジオロジツシエ・ヘミー（Zeitschrift fu¨r
Physiologische Chemie）357巻759頁（1976年）
に発表しているように既になされているが、何れ
も化学的手段によるものであり、前者においては
工程の最後にアルカリ処理を含み、これに伴う副
反応がさけられない。また後者の場合は反応が非
特異的で多くの副反応を生じるため、精製が複雑
かつ困難となり収率も著しく低い。従つて、工業
的規模では到底行ない得ない。
一方、本発明者らの方法はデス−B30−インシ
ユリンとＬ−スレオニン誘導体とを酵素反応によ
り縮合させてインシユリンを得る方法で、公知の
化学的手段による方法とは異なり、反応が特異的
で副反応も生ぜず、ラセミ化も起きず、未反応原
料を損なわずに回収できる、等の利点を有する。
ユリンとＬ−スレオニン誘導体とを酵素反応によ
り縮合させてインシユリンを得る方法で、公知の
化学的手段による方法とは異なり、反応が特異的
で副反応も生ぜず、ラセミ化も起きず、未反応原
料を損なわずに回収できる、等の利点を有する。
さらに同方法では、１〜100倍モル量のＬ−ス
レオニン誘導体を用いることにより、通常の酵素
反応では当然起きるＢ鎖22位のアルギニンのカル
ボニル側切断が防止され、したがつて通常の酵素
反応では必須であるアルギニン側鎖への保護基導
入が不必要である。
レオニン誘導体を用いることにより、通常の酵素
反応では当然起きるＢ鎖22位のアルギニンのカル
ボニル側切断が防止され、したがつて通常の酵素
反応では必須であるアルギニン側鎖への保護基導
入が不必要である。
同方法は、トリプシンまたはカルボニル側塩基
性アミノ酸残基に特異性を示すトリプシン様酵素
の存在下に、Ｂ鎖30位のアミノ酸が欠けたデス−
B30−インシユリン（以下化合物と記す）に１
〜100倍モル量のＬ−スレオニン誘導体（以下化
合物と記す）を反応させ、ついで得られる縮合
物から保護基を除去することよりなる。化合物
は下記の一般式で表わされる。
性アミノ酸残基に特異性を示すトリプシン様酵素
の存在下に、Ｂ鎖30位のアミノ酸が欠けたデス−
B30−インシユリン（以下化合物と記す）に１
〜100倍モル量のＬ−スレオニン誘導体（以下化
合物と記す）を反応させ、ついで得られる縮合
物から保護基を除去することよりなる。化合物
は下記の一般式で表わされる。
（式中、R1は水素またはヒドロキシ基の保護基、
R2はカルボキシル基の保護基をそれぞれ表わ
す。） 上記の化合物は豚起源のインシユリンにカル
ボキシペプチターゼＡを作用させることにより得
られ、例えば、イ・ダブリユー・シユミツト（E.
W.Schmitt）らがホツペーセイラーズ・サイトシ
ユリフト・フユア・ヒジオロジツシエ・ヘミー
（Hoppe−Seyler′s Zeitschrift fu¨r
Physciologische Chemie）359巻799頁（1978年）
に記載している方法により製造できる。またアク
ロモバクター・リテイカス（Achromobacter
lyticus）が産生するリジンに特異性を有し、リ
ジンのカルボニル側を切断する酵素を用いても容
易に製造することができる。同酵素の分離および
性状については、正木らがアグリカルチユラル・
アンド・バイオロジカル・ケミストリー
（Agricultural and Biological Chemistry）42巻
1443頁（1978年）に発表しており、同論文におい
ては上記性状を有する酵素をプロテアーゼと称
している。
R2はカルボキシル基の保護基をそれぞれ表わ
す。） 上記の化合物は豚起源のインシユリンにカル
ボキシペプチターゼＡを作用させることにより得
られ、例えば、イ・ダブリユー・シユミツト（E.
W.Schmitt）らがホツペーセイラーズ・サイトシ
ユリフト・フユア・ヒジオロジツシエ・ヘミー
（Hoppe−Seyler′s Zeitschrift fu¨r
Physciologische Chemie）359巻799頁（1978年）
に記載している方法により製造できる。またアク
ロモバクター・リテイカス（Achromobacter
lyticus）が産生するリジンに特異性を有し、リ
ジンのカルボニル側を切断する酵素を用いても容
易に製造することができる。同酵素の分離および
性状については、正木らがアグリカルチユラル・
アンド・バイオロジカル・ケミストリー
（Agricultural and Biological Chemistry）42巻
1443頁（1978年）に発表しており、同論文におい
ては上記性状を有する酵素をプロテアーゼと称
している。
化合物は、その側鎖官能基であるヒドロキシ
基が保護されていなくとも反応に供しうるが、保
護基を導入するならは、ペプチド合成反応で通常
利用される保護基、例えば、ｔ−ブチル、ベンジ
ル、アセチルなどを用いるとよい。また、化合物
のカルボキシル基は保護されていることが必要
で、通常用いられるカルボキシル基の保護基を使
用すればよい。例えば、ｔ−ブチル、ベンジルな
どのアルキルおよびアラルキルエステルの形で修
飾する。
基が保護されていなくとも反応に供しうるが、保
護基を導入するならは、ペプチド合成反応で通常
利用される保護基、例えば、ｔ−ブチル、ベンジ
ル、アセチルなどを用いるとよい。また、化合物
のカルボキシル基は保護されていることが必要
で、通常用いられるカルボキシル基の保護基を使
用すればよい。例えば、ｔ−ブチル、ベンジルな
どのアルキルおよびアラルキルエステルの形で修
飾する。
上記の保護基の選択においては、それらの保護
基の導入または除去処理において、インシユリン
を変性したり失活したりしないものを選択するよ
う考慮すべきである。ペプチド合成に用いる保護
基については、エム・ボダンスツキー（M.
Bodanszky）らがペプチド・シンセシス
（Peptide Synthesis）第２版（1976年）（ジヨ
ン・ウイリー・アンド・サンズ（John Wiley＆
Sons））に詳しく記載している。
基の導入または除去処理において、インシユリン
を変性したり失活したりしないものを選択するよ
う考慮すべきである。ペプチド合成に用いる保護
基については、エム・ボダンスツキー（M.
Bodanszky）らがペプチド・シンセシス
（Peptide Synthesis）第２版（1976年）（ジヨ
ン・ウイリー・アンド・サンズ（John Wiley＆
Sons））に詳しく記載している。
なお、保護基の選択においては、一回の保護基
脱離操作により同時に除去できるものを選ぶのが
好ましいことは論を俟たない。
脱離操作により同時に除去できるものを選ぶのが
好ましいことは論を俟たない。
同方法で使用する酵素は、トリプシンまたは各
種動植物および微生物起源のカルボキシル側塩基
性アミノ酸に特異性を示すトリプシン様酵素など
を含む。トリプシン様酵素としては、例えば、ス
トレプトマイセス属菌から抽出分離された酵素が
ある。同酵素については森原らがアーキバス・オ
ブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフイジ
クス（Arch.Biochem.Biophys.）126巻971頁
（1968年）に、吉田らがエフイービーエス・レタ
ーズ（FEBS Lett.）15巻129頁（1971年）に記載
している。使用する酵素は混在するキモトリプシ
ンまたはキモトリプシン様の活性を除去する目的
でトシル−Ｌ−フエニルアラニンクロロメチルケ
トン（TPCK）などで処理するとよい。
種動植物および微生物起源のカルボキシル側塩基
性アミノ酸に特異性を示すトリプシン様酵素など
を含む。トリプシン様酵素としては、例えば、ス
トレプトマイセス属菌から抽出分離された酵素が
ある。同酵素については森原らがアーキバス・オ
ブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフイジ
クス（Arch.Biochem.Biophys.）126巻971頁
（1968年）に、吉田らがエフイービーエス・レタ
ーズ（FEBS Lett.）15巻129頁（1971年）に記載
している。使用する酵素は混在するキモトリプシ
ンまたはキモトリプシン様の活性を除去する目的
でトシル−Ｌ−フエニルアラニンクロロメチルケ
トン（TPCK）などで処理するとよい。
化合物と化合物の縮合反応は上記の酵素の
ペプチド結合形成反応に適した条件で行なわれ
る。pHは５〜８、特に６〜７付近が好ましく、
反応温度は０〜50℃、とくに20〜40℃がよい。化
合物と化合物の濃度は可能なかぎり高いこと
がのぞましい。さらに化合物と化合物は１：
１〜100：１のモル比で反応させるのがよく、と
くに20：１〜１〜100：１付近がよい。反応液に
は水と混合しうる適当な有機溶媒を加える。有機
溶媒の添加は、反応液中の水の濃度を下げて、逆
反応である加水分解反応を抑えるだけでなく、化
合物および化合物の溶解性を著しく高める点
で効果がある。有機溶媒としては、例えば、メタ
ノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジ
メチルスルホキシド、グリセリンなどを単独でま
たは組合せて用いる。とくに０〜65％、とくに40
〜60％の濃度で用いるとよい。一般に、有機溶媒
を用いる場合は、原料の溶解度、酵素の変性や加
水分解反応などを考慮して水に対する割合を決定
する。反応液の緩衝剤としては、トリスヒドロキ
シメチルアミノメタン（トリス）や炭酸塩などが
用いられる。
ペプチド結合形成反応に適した条件で行なわれ
る。pHは５〜８、特に６〜７付近が好ましく、
反応温度は０〜50℃、とくに20〜40℃がよい。化
合物と化合物の濃度は可能なかぎり高いこと
がのぞましい。さらに化合物と化合物は１：
１〜100：１のモル比で反応させるのがよく、と
くに20：１〜１〜100：１付近がよい。反応液に
は水と混合しうる適当な有機溶媒を加える。有機
溶媒の添加は、反応液中の水の濃度を下げて、逆
反応である加水分解反応を抑えるだけでなく、化
合物および化合物の溶解性を著しく高める点
で効果がある。有機溶媒としては、例えば、メタ
ノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジ
メチルスルホキシド、グリセリンなどを単独でま
たは組合せて用いる。とくに０〜65％、とくに40
〜60％の濃度で用いるとよい。一般に、有機溶媒
を用いる場合は、原料の溶解度、酵素の変性や加
水分解反応などを考慮して水に対する割合を決定
する。反応液の緩衝剤としては、トリスヒドロキ
シメチルアミノメタン（トリス）や炭酸塩などが
用いられる。
反応液の酵素濃度は基質濃度や酵素の活性で異
なつてくるが、市販結晶トリプシンを用いる場合
は１mg/ml〜10mg/ml付近がよい。酵素はそのまま
用いてもよいし、適当な不溶性担体に結合又は包
含させた固定化酵素として用いてもよい。
なつてくるが、市販結晶トリプシンを用いる場合
は１mg/ml〜10mg/ml付近がよい。酵素はそのまま
用いてもよいし、適当な不溶性担体に結合又は包
含させた固定化酵素として用いてもよい。
反応時間は、反応条件により異なるが、通常は
酵素反応が平衝に達するに要する時間をとればよ
く、通常３〜72時間、多くの場合６〜24時間程度
である。
酵素反応が平衝に達するに要する時間をとればよ
く、通常３〜72時間、多くの場合６〜24時間程度
である。
反応終了後はペプチドの分離法として通常用い
られる方法を組合せて利用し、Ｂ鎖30位スレオニ
ンがカルボキシル基に保護基を有しかつヒドロキ
シ基に保護基を有していてもよい人インシユリン
を得、ついで目的とする人インシユリンを得る。
られる方法を組合せて利用し、Ｂ鎖30位スレオニ
ンがカルボキシル基に保護基を有しかつヒドロキ
シ基に保護基を有していてもよい人インシユリン
を得、ついで目的とする人インシユリンを得る。
例えば、反応終了後反応液をゲル濾過にかけ、
未反応の化合物および酵素を単離回収する。回
収した化合物および酵素はそのまま再使用が可
能である。残部を適当なクロマトグラフイーに付
し、生成したＢ鎖30位スレオニンがカルボキシル
基に保護基を有しかつヒドロキシ基に保護基を有
していてもよい人インシユリンと未反応デス−
B30−インシユリンを分離する。後者は化合物
として再使用できる。前者は更に保護基脱離反応
に付し、人インシユリンとする。
未反応の化合物および酵素を単離回収する。回
収した化合物および酵素はそのまま再使用が可
能である。残部を適当なクロマトグラフイーに付
し、生成したＢ鎖30位スレオニンがカルボキシル
基に保護基を有しかつヒドロキシ基に保護基を有
していてもよい人インシユリンと未反応デス−
B30−インシユリンを分離する。後者は化合物
として再使用できる。前者は更に保護基脱離反応
に付し、人インシユリンとする。
保護基の脱離方法は用いる保護基によつて異な
るが、通常の脱離方法に準じて行えばよく、例え
ば、ヒドロキシ基やカルボキシル基の保護基とし
て使用されるｔ−ブチル基は、カチオン捕捉剤
（例えばアニソール）の存在下トリフルオロ酢酸
で処理すると脱離する。前者のように単一の脱離
処理で除去できる保護基をスレオニンの側鎖官能
基およびカルボキシル基の保護に用いると、脱離
処理が簡単で収率も向上する。カルボキシル末端
がその他のエステルになつている場合も適当な加
水分解処理により保護基を除去できる。
るが、通常の脱離方法に準じて行えばよく、例え
ば、ヒドロキシ基やカルボキシル基の保護基とし
て使用されるｔ−ブチル基は、カチオン捕捉剤
（例えばアニソール）の存在下トリフルオロ酢酸
で処理すると脱離する。前者のように単一の脱離
処理で除去できる保護基をスレオニンの側鎖官能
基およびカルボキシル基の保護に用いると、脱離
処理が簡単で収率も向上する。カルボキシル末端
がその他のエステルになつている場合も適当な加
水分解処理により保護基を除去できる。
本発明のＢ鎖30位スレオニンがカルボキシル基
に保護基を有しかつヒドロキシ基に保護基を有し
ていてもよい人インシユリンから得られるインシ
ユリンは先に記載したように血糖降下作用を有す
る糖尿病治療薬としてまたは試薬として有用であ
る。本発明者らの方法で豚インシユリンより合成
した人インシユリンはマウスに対する血糖降下作
用試験において牛インシユリンと同等の効果を示
した。
に保護基を有しかつヒドロキシ基に保護基を有し
ていてもよい人インシユリンから得られるインシ
ユリンは先に記載したように血糖降下作用を有す
る糖尿病治療薬としてまたは試薬として有用であ
る。本発明者らの方法で豚インシユリンより合成
した人インシユリンはマウスに対する血糖降下作
用試験において牛インシユリンと同等の効果を示
した。
本発明化合物より合成した人インシユリンは、
市販の豚インシユリンや牛インシユリンと同様に
製剤化し、人に投与される。すなわち、塩化亜鉛
などを加えて亜鉛複合体にしたり、リン酸水素ナ
トリウムや酢酸ナトリウム等の緩衝剤を加えたり
等張剤とするため塩化ナトリウムを加えるなど、
さらに、クレゾール、フエノール、パラオキシ安
息香酸アルキルエステル（例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチルエステルなど）などの防腐
剤を加えるなどの市販インシユリン製剤に用いら
れる調製法を利用し、注射剤を製造する。かかる
注射剤の投与量は患者の症状に応じて異なるが、
市販のインシユリン製剤の投与と同様に行なえば
よく、成人１日約１〜100単位を投与するように
するとよい。
市販の豚インシユリンや牛インシユリンと同様に
製剤化し、人に投与される。すなわち、塩化亜鉛
などを加えて亜鉛複合体にしたり、リン酸水素ナ
トリウムや酢酸ナトリウム等の緩衝剤を加えたり
等張剤とするため塩化ナトリウムを加えるなど、
さらに、クレゾール、フエノール、パラオキシ安
息香酸アルキルエステル（例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチルエステルなど）などの防腐
剤を加えるなどの市販インシユリン製剤に用いら
れる調製法を利用し、注射剤を製造する。かかる
注射剤の投与量は患者の症状に応じて異なるが、
市販のインシユリン製剤の投与と同様に行なえば
よく、成人１日約１〜100単位を投与するように
するとよい。
以下に実施例において、本発明化合物の製造例
を示すが、実施例は本発明を何ら限定するもので
ない。
を示すが、実施例は本発明を何ら限定するもので
ない。
なお、実施例で用いる略号は下記の意味を表わ
す。
す。
Alaアラニン Ile イソロイシン
Argアルギニン Leu ロイシン
Asnアスパラギン Lys リジン
Aspアスパラギン酸Phe フエニルアラニ
ン CySO3Hシステイン酸 Pro プロリン Gluグルタミン酸 Ser セリン Glnグルタミン Thr スレオニン Glyグリシン Tyr チロシン Hisヒスチジン Val バリン OBut ｔ−ブチルエステル残基 また、デス−B30−インシユリンとはインシユ
リンＢ鎖の30位アミノ酸が欠損しているインシユ
リン、例えば、豚インシユリンではアラニンが欠
損しているインシユリンをいう。
ン CySO3Hシステイン酸 Pro プロリン Gluグルタミン酸 Ser セリン Glnグルタミン Thr スレオニン Glyグリシン Tyr チロシン Hisヒスチジン Val バリン OBut ｔ−ブチルエステル残基 また、デス−B30−インシユリンとはインシユ
リンＢ鎖の30位アミノ酸が欠損しているインシユ
リン、例えば、豚インシユリンではアラニンが欠
損しているインシユリンをいう。
実施例 １
(1) デス−B30−インシユリン（豚型）
豚インシユリン500mgを0.1M炭酸水素アンモ
ニウム（pH8.3）100mlに溶解し、結晶カルボ
キシペプチターゼＡ（ワーシングトン社製、ジ
イソプロピルフルオロホスヘート処理、49u/
mg）５mgを添加して室温で８時間反応させる。
アラニンの生成量が0.77M／1Mインシユリン
のときに反応を止め、反応物を凍結乾燥後、
0.5M酢酸に溶解し超微細粒のセフアデツクス
G50（商品名）のカラム（3.5×95cm）に吸着さ
せ、0.5M酢酸で１フラクシヨンあたり11.5ml
で溶出する。フラクシヨンの40〜60番を集め凍
結乾燥し標記化合物460mgを得る。収率92％。
ニウム（pH8.3）100mlに溶解し、結晶カルボ
キシペプチターゼＡ（ワーシングトン社製、ジ
イソプロピルフルオロホスヘート処理、49u/
mg）５mgを添加して室温で８時間反応させる。
アラニンの生成量が0.77M／1Mインシユリン
のときに反応を止め、反応物を凍結乾燥後、
0.5M酢酸に溶解し超微細粒のセフアデツクス
G50（商品名）のカラム（3.5×95cm）に吸着さ
せ、0.5M酢酸で１フラクシヨンあたり11.5ml
で溶出する。フラクシヨンの40〜60番を集め凍
結乾燥し標記化合物460mgを得る。収率92％。
生成物を酸加水分解（6M塩酸、110℃、24時
間）に付して得たアミノ酸分析値は下記のとお
りである。括弧内の数値は理論値を示す。以下
においても同様。
間）に付して得たアミノ酸分析値は下記のとお
りである。括弧内の数値は理論値を示す。以下
においても同様。
Lys 1.00(1)、His 1.91(2)、
Arg 0.95(1)、Asp 3.21(3)、
Thr 2.09(2)、Ser 2.97(3)、
Glu 7.35(7)、Gly 4.29(4)、
Ala 1.26(1)、CySO3H 5.94(6)、
Val 3.86(4)、Ile 1.55(2)、
Leu 6.53(6)、Tyr 4.08(4)、
Phe 3.22(3)、Pro 1.2(1)。
(2) ［B30−Thr−OBUt］−インシユリン（豚
型） (1)の生成物100mg（10mM）とＬ−スレオニ
ン−ｔ−ブチルエステル154mg（500mM）エタ
ノール／ジメチルホルムアミド混液（１：１）
1.05mlに溶解し、結晶トリプシン（ワーシング
トン社製、３回再結晶）４mgを含有する0.5M
硼酸塩緩衝液（pH6.5）0.75mlと混合する。な
お、この混合液にはトシル−Ｌ−フエニルアラ
ニンクロロメチルケトン（以下TPCKと記す）
が最終濃度0.01mMで含有されるようにしてお
く。同混合液を37℃で１晩保つ。高速液体クロ
マトグラフイーにより目的化合物の生成を確認
し収率を求めると75％であつた。混合液を氷酢
酸で酸性としたのち超微細粒のセフアデツクス
G50（商品名）のカラム（4.2×130cm）でゲル
濾過を行ない、トリプシン含有分画、標記イン
シユリン誘導体を含有する分画、Ｌ−スレオニ
ン−ｔ−ブチルエステル含有分画に分ける。酵
素活性およびニンヒドリン反応を測定し、トリ
プシンおよびスレオニンｔ−ブチルエステルは
各々50％回収されることが確認された。インシ
ユリン誘導体を含有する分画を凍結乾燥し、標
記化合物の粗粉末89mgを得る。
型） (1)の生成物100mg（10mM）とＬ−スレオニ
ン−ｔ−ブチルエステル154mg（500mM）エタ
ノール／ジメチルホルムアミド混液（１：１）
1.05mlに溶解し、結晶トリプシン（ワーシング
トン社製、３回再結晶）４mgを含有する0.5M
硼酸塩緩衝液（pH6.5）0.75mlと混合する。な
お、この混合液にはトシル−Ｌ−フエニルアラ
ニンクロロメチルケトン（以下TPCKと記す）
が最終濃度0.01mMで含有されるようにしてお
く。同混合液を37℃で１晩保つ。高速液体クロ
マトグラフイーにより目的化合物の生成を確認
し収率を求めると75％であつた。混合液を氷酢
酸で酸性としたのち超微細粒のセフアデツクス
G50（商品名）のカラム（4.2×130cm）でゲル
濾過を行ない、トリプシン含有分画、標記イン
シユリン誘導体を含有する分画、Ｌ−スレオニ
ン−ｔ−ブチルエステル含有分画に分ける。酵
素活性およびニンヒドリン反応を測定し、トリ
プシンおよびスレオニンｔ−ブチルエステルは
各々50％回収されることが確認された。インシ
ユリン誘導体を含有する分画を凍結乾燥し、標
記化合物の粗粉末89mgを得る。
次いで、0.01Mトリス緩衝液（pH7.6）と7M
尿素で緩衝化したDEAE−セフアデツクスA25
（商品名）のカラム（1.9×24.5cm）に上記生成
物を４℃でかけ、上記緩衝液を800ml流したの
ち食塩濃度0.3Mまで直線的に濃度勾配をつけ
た溶出を行ない、0.08〜0.09M濃度付近の分画
Ａと0.13〜0.14M濃度付近の分画Ｂを順次送
る。各分画を直ちに３〜４日間冷所で0.01M酢
酸アンモニウム溶液に対して透析した後凍結乾
燥し、分画Ａより粉末35mgを、分画Ｂより27mg
を得る。高速液体クロマトグラフイーおよびポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により、前者が
標記化合物であり後者がデス−B30−インシユ
リン（豚型）と標記化合物の混合物であること
が確認された。
尿素で緩衝化したDEAE−セフアデツクスA25
（商品名）のカラム（1.9×24.5cm）に上記生成
物を４℃でかけ、上記緩衝液を800ml流したの
ち食塩濃度0.3Mまで直線的に濃度勾配をつけ
た溶出を行ない、0.08〜0.09M濃度付近の分画
Ａと0.13〜0.14M濃度付近の分画Ｂを順次送
る。各分画を直ちに３〜４日間冷所で0.01M酢
酸アンモニウム溶液に対して透析した後凍結乾
燥し、分画Ａより粉末35mgを、分画Ｂより27mg
を得る。高速液体クロマトグラフイーおよびポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により、前者が
標記化合物であり後者がデス−B30−インシユ
リン（豚型）と標記化合物の混合物であること
が確認された。
標記化合物の高速液体クロマトグラフイーお
よびポリアクリルアミドゲル電気泳動による測
定値を以下に示す。
よびポリアクリルアミドゲル電気泳動による測
定値を以下に示す。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（pH8；10
％ゲル；18.1mA／cm2；泳動時間100分）： 移動距離4.3cm。
％ゲル；18.1mA／cm2；泳動時間100分）： 移動距離4.3cm。
高速液体クロマトグラフイー［ヌクレオシル
（Nucleosil）7C18（商品名）（Macherey−
Nagel社製）；４mm×50mm（プレカラム）およ
び４mm×250mm（メインカラム）；32％アセトニ
トリル−バツフアー溶液（5mMリン酸、
5mM・ｎ−ブチルスルホン酸ナトリウム、
50mM硫酸ナトリウム、pH3.0）；流速：毎分
２ml］：保持時間13.2分。
（Nucleosil）7C18（商品名）（Macherey−
Nagel社製）；４mm×50mm（プレカラム）およ
び４mm×250mm（メインカラム）；32％アセトニ
トリル−バツフアー溶液（5mMリン酸、
5mM・ｎ−ブチルスルホン酸ナトリウム、
50mM硫酸ナトリウム、pH3.0）；流速：毎分
２ml］：保持時間13.2分。
(3) 人インシユリン
アニソール0.2mlを含むトリフルオロ酢酸２
mlを上記(2)で得た化合物30mgに加え、室温で30
分保つ。窒素気流中でトリフルオロ酢酸を除
き、1N酢酸２mlの存在下、エーテル15mlでア
ニソールを抽出した後、酢酸部を凍結乾燥し標
記化合物28mgを得る。原料の純度を77％とする
と収率43％である。
mlを上記(2)で得た化合物30mgに加え、室温で30
分保つ。窒素気流中でトリフルオロ酢酸を除
き、1N酢酸２mlの存在下、エーテル15mlでア
ニソールを抽出した後、酢酸部を凍結乾燥し標
記化合物28mgを得る。原料の純度を77％とする
と収率43％である。
本品はアミノ酸分析値、スラブゲル電気泳
動、高速液体クロマトグラムにより標記化合物
と同定した。
動、高速液体クロマトグラムにより標記化合物
と同定した。
(1)と同様の条件で行なつたアミノ酸分析の結果
は下記のとおりである。
は下記のとおりである。
Lys 1.00(1)、His 1.89(2)、
Arg 0.87(1)、Asp 3.32(3)、
Thr 3.16(3)、Ser 2.99(3)、
Glu 7.35(7)、Pro 1.29(1)、
Gly 4.39(4)、Ala 1.26(1)、
CySO3H 4.6(6)、Val 3.93(4)、
Ile 1.61(2)、Leu 6.51(6)、
Tyr 3.68(4)、Phe 3.19(3)。
スラブゲル電気泳動（pH8；10％ゲル；
18.1mA／cm2；泳動時間100分）：移動距離6.0cm。
高速液体クロマトグラフイー［ヌクレオシル
（Nucleosil）7C18（商品名）（Macherey−Nagel
社製）；４mm×50mm（プレカラム）および４mm×
250mm（メインカラム）；32％アセトニトリルバツ
フアー溶液（5mMリン酸、5mM・ｎ−ブチルス
ルホン酸ナトリウム、50mM硫酸ナトリウム、
pH3.0）；流速：毎分２ml］：保持時間4.97分。
18.1mA／cm2；泳動時間100分）：移動距離6.0cm。
高速液体クロマトグラフイー［ヌクレオシル
（Nucleosil）7C18（商品名）（Macherey−Nagel
社製）；４mm×50mm（プレカラム）および４mm×
250mm（メインカラム）；32％アセトニトリルバツ
フアー溶液（5mMリン酸、5mM・ｎ−ブチルス
ルホン酸ナトリウム、50mM硫酸ナトリウム、
pH3.0）；流速：毎分２ml］：保持時間4.97分。
Claims (1)
- １ Ｂ鎖30位スレオニンがカルボキシル基に保護
基を有しかつヒドロキシ基に保護基を有していて
もよい人インシユリンを保護基の脱離処理に付し
て人インシユリンを得ることを特徴とする人イン
シユリンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61266447A JPS62116598A (ja) | 1981-10-30 | 1986-11-07 | インシユリン誘導体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56175030A JPS57155997A (en) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | Insulin derivative |
| JP61266447A JPS62116598A (ja) | 1981-10-30 | 1986-11-07 | インシユリン誘導体の製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56175030A Division JPS57155997A (en) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | Insulin derivative |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62116598A JPS62116598A (ja) | 1987-05-28 |
| JPH0150719B2 true JPH0150719B2 (ja) | 1989-10-31 |
Family
ID=26496421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61266447A Granted JPS62116598A (ja) | 1981-10-30 | 1986-11-07 | インシユリン誘導体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62116598A (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2460753A1 (de) * | 1974-12-21 | 1976-06-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von humaninsulin |
| JPS54135789A (en) * | 1978-04-13 | 1979-10-22 | Nippon Soda Co Ltd | Preparation of human insulin |
-
1986
- 1986-11-07 JP JP61266447A patent/JPS62116598A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62116598A (ja) | 1987-05-28 |
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