JPH0150718B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0150718B2 JPH0150718B2 JP61266446A JP26644686A JPH0150718B2 JP H0150718 B2 JPH0150718 B2 JP H0150718B2 JP 61266446 A JP61266446 A JP 61266446A JP 26644686 A JP26644686 A JP 26644686A JP H0150718 B2 JPH0150718 B2 JP H0150718B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- insulin
- protecting group
- group
- compound
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は人インシユリンの製造方法に関するも
のであり、詳しくはＢ鎖22位のアルギニンが保護
基で修飾されているインシユリン誘導体を保護基
の脱離処理に付して人インシユリンを得る製造方
法に関する。
のであり、詳しくはＢ鎖22位のアルギニンが保護
基で修飾されているインシユリン誘導体を保護基
の脱離処理に付して人インシユリンを得る製造方
法に関する。
インシユリンは糖尿病の治療薬として代替品の
ない貴重な薬物であり、現在主として牛インシユ
リンおよび豚インシユリンが治療に用いられてい
る。しかし、これらのインシユリンは構成アミノ
酸の一部が人インシユリンと異なつているため、
体内で抗体が産生されることがあり、抗体が産生
されるとそれ以後のインシユリンの治療効果が著
しく低下するなどの問題を生じる。したがつて、
工業的規模で行いうる人インシユリンの合成方法
の確立が強く望まれている。
ない貴重な薬物であり、現在主として牛インシユ
リンおよび豚インシユリンが治療に用いられてい
る。しかし、これらのインシユリンは構成アミノ
酸の一部が人インシユリンと異なつているため、
体内で抗体が産生されることがあり、抗体が産生
されるとそれ以後のインシユリンの治療効果が著
しく低下するなどの問題を生じる。したがつて、
工業的規模で行いうる人インシユリンの合成方法
の確立が強く望まれている。
豚インシユリンは人インシユリンとＢ鎖の30位
のアミノ酸が異なつているが、本発明者はこの相
違するＢ鎖30位のアミノ酸を人インシユリンの30
位アミノ酸であるスレオニンに置換する方法を発
見し、本発明を確立した。
のアミノ酸が異なつているが、本発明者はこの相
違するＢ鎖30位のアミノ酸を人インシユリンの30
位アミノ酸であるスレオニンに置換する方法を発
見し、本発明を確立した。
上記の方法によれば、人インシユリンとＢ鎖30
位のアミノ酸のみが異なる豚インシユリンを原料
に用いて人インシユリンを容易に合成することが
できる。このようにして得られる人インシユリン
が理想的な治療用インシユリンであることは論を
俟たない。
位のアミノ酸のみが異なる豚インシユリンを原料
に用いて人インシユリンを容易に合成することが
できる。このようにして得られる人インシユリン
が理想的な治療用インシユリンであることは論を
俟たない。
既に豚デスオクタペプチドインシユリンと人イ
ンシユリンオクタペプチドから人インシユリンを
得る試みはエム・エー・ルツテンベルグ（M.A.
Ruttenberg）によりサイエンス（Science）177
巻623頁（1972年）に、アール・オーベルマイヤ
ー（R.Obermeier）らによりサイリツシユリフ
ト・フユア・ヒジオロジツシエ・ヘミー（Z.
Physiol.Chem.）357巻759頁（1976年）に示され
ているが、何れも化学的手段によるものであり、
前者においては工程の最後にアルカリ処理を含
み、これに伴う副反応がさけられない。また後者
の場合は反応が非特異的で多くの副反応を生じる
ため、精製が複雑かつ困難となり収率も著しく低
い。従つて、工業的規模では到底行い得ない。
ンシユリンオクタペプチドから人インシユリンを
得る試みはエム・エー・ルツテンベルグ（M.A.
Ruttenberg）によりサイエンス（Science）177
巻623頁（1972年）に、アール・オーベルマイヤ
ー（R.Obermeier）らによりサイリツシユリフ
ト・フユア・ヒジオロジツシエ・ヘミー（Z.
Physiol.Chem.）357巻759頁（1976年）に示され
ているが、何れも化学的手段によるものであり、
前者においては工程の最後にアルカリ処理を含
み、これに伴う副反応がさけられない。また後者
の場合は反応が非特異的で多くの副反応を生じる
ため、精製が複雑かつ困難となり収率も著しく低
い。従つて、工業的規模では到底行い得ない。
本発明者らの方法は酵素によるインシユリン合
成法で、公知の化学的手段によるものと異なり、
反応が特異的で副反応を生ぜずラセミ化が起きず
未反応原料も損傷なしに回収できるなどの利点を
有する。
成法で、公知の化学的手段によるものと異なり、
反応が特異的で副反応を生ぜずラセミ化が起きず
未反応原料も損傷なしに回収できるなどの利点を
有する。
上記の方法は、トリプシンまたはトリプシン様
酵素の作用により、Ｂ鎖22位のアルギニンが保護
基で修飾されておりＢ鎖30位のアミノ酸が欠けて
いるインシユリン（下記の一般式で表わさ
れ、以下化合物と記す）に下記の一般式で
表わされるＬ−スレオニン誘導体（以下化合物
と記す）を縮合させ、得られた化合物（下記の一
般式で表わされ、以下化合物と記
す）の保護基を除去することによりなる。
酵素の作用により、Ｂ鎖22位のアルギニンが保護
基で修飾されておりＢ鎖30位のアミノ酸が欠けて
いるインシユリン（下記の一般式で表わさ
れ、以下化合物と記す）に下記の一般式で
表わされるＬ−スレオニン誘導体（以下化合物
と記す）を縮合させ、得られた化合物（下記の一
般式で表わされ、以下化合物と記
す）の保護基を除去することによりなる。
（式中、R3はグアニジノ基の保護基を表わす。）
（式中、R1は水素、R2はカルボキシ基の保護基
を表わす。） （式中、R1、R2およびR3はそれぞれ前記と同意
義を表わす。） なお、上式に用いられているアミノ酸はすべて
Ｌ型であり、下記の意味を有する。
を表わす。） （式中、R1、R2およびR3はそれぞれ前記と同意
義を表わす。） なお、上式に用いられているアミノ酸はすべて
Ｌ型であり、下記の意味を有する。
Ala アラニン Arg アルギニン
Asp アスパラギン酸 Asn アスパラギン
Gln グルタミン Glu グルタミン酸
Gly グリシン His ヒスチジン
Ile イソロイシン Leu ロイシン
Lys リジン Pro プロリン
Phe フエニルアラニンSer セリン
Thr スレオニン Tyr チロシン
Val バリン Cys システイン
上記の化合物は、(1)先ず、豚より得たイン
シユリンを用いてそのＢ鎖22位に位置するアルギ
ニンのグアニジノ基に保護基を導入したのち酵素
を作用させて30位のアミノ酸を切断する、または
(2)豚よりえたインシユリンに酵素を作用させてデ
ス−B30−インシユリンとしたのち22位のアルギ
ニンのグアニジノ基を修飾することにより製造し
うる。
シユリンを用いてそのＢ鎖22位に位置するアルギ
ニンのグアニジノ基に保護基を導入したのち酵素
を作用させて30位のアミノ酸を切断する、または
(2)豚よりえたインシユリンに酵素を作用させてデ
ス−B30−インシユリンとしたのち22位のアルギ
ニンのグアニジノ基を修飾することにより製造し
うる。
グアニジノ基の保護基導入は、２，３−ブタジ
オン、１，２−シクロヘキサンジオン、フエニル
グリオキサール、２，４−ペンタジオンなどを、
必要に応じてホウ酸イオンの存在下に反応させて
実施する。詳細は生化学実験講座１ クンパク質
の化学（日本生化学会編、東京化学同人）34
−41頁に記載されている。
オン、１，２−シクロヘキサンジオン、フエニル
グリオキサール、２，４−ペンタジオンなどを、
必要に応じてホウ酸イオンの存在下に反応させて
実施する。詳細は生化学実験講座１ クンパク質
の化学（日本生化学会編、東京化学同人）34
−41頁に記載されている。
(1)の方法を行う場合はトリプシンでＢ鎖30位の
アミノ酸を切断するとよい。グアニジノ基の修飾
法は、エム・ローゼンブラツト（M.Rosenblatt）
らによりバイオケミストリー（Biochemistry）
17巻3188頁（1978年）に示されている。すなわ
ち、原料となるインシユリンの溶液に１，２−シ
クロヘキサンジオンを加え、0.2M硼酸塩（pH9）
存在下40℃で１〜４時間または室温で一晩反応さ
せた後クロマトグラフイー、透析法などで精製
し、得られた［N7，N8−（１，２−ジヒドロキ
シシクロヘキシレン−１，２）（以下DHCHと略
記）−アルギニン−B22］インシユリンに0.2M硼
酸塩−（pH8）存在下でトリプシンを加えて40℃
で１〜３日作用させ、化合物を得る。
アミノ酸を切断するとよい。グアニジノ基の修飾
法は、エム・ローゼンブラツト（M.Rosenblatt）
らによりバイオケミストリー（Biochemistry）
17巻3188頁（1978年）に示されている。すなわ
ち、原料となるインシユリンの溶液に１，２−シ
クロヘキサンジオンを加え、0.2M硼酸塩（pH9）
存在下40℃で１〜４時間または室温で一晩反応さ
せた後クロマトグラフイー、透析法などで精製
し、得られた［N7，N8−（１，２−ジヒドロキ
シシクロヘキシレン−１，２）（以下DHCHと略
記）−アルギニン−B22］インシユリンに0.2M硼
酸塩−（pH8）存在下でトリプシンを加えて40℃
で１〜３日作用させ、化合物を得る。
また(2)の方法により、例えば、カルボキシペプ
チターゼＡを用いて豚インシユリンよりデス−
B30−インシユリン（豚型）が得られる。この方
法は、イー・ダブリユー・シユミツト（E.W.
Schmitt）らによりホツペーセイラーズ、サイト
シユリフト、フユア・ヒジオロジツシエ・ヘミー
（Hoppe−Seyler′s Zeitschrift fu¨r
Physiologische Chemie）359巻799頁（1978年）
に記載されている。ついで、この豚由来のデス−
B30−インシユリンにおいて、Ｂ鎖22位のアルギ
ニン側鎖を修飾し、化合物を調製する。
チターゼＡを用いて豚インシユリンよりデス−
B30−インシユリン（豚型）が得られる。この方
法は、イー・ダブリユー・シユミツト（E.W.
Schmitt）らによりホツペーセイラーズ、サイト
シユリフト、フユア・ヒジオロジツシエ・ヘミー
（Hoppe−Seyler′s Zeitschrift fu¨r
Physiologische Chemie）359巻799頁（1978年）
に記載されている。ついで、この豚由来のデス−
B30−インシユリンにおいて、Ｂ鎖22位のアルギ
ニン側鎖を修飾し、化合物を調製する。
一般式で示されるＬ−スレオニン誘導体（以
下化合物と記す）は通常の化学的方法で合成さ
れるが、その側鎖官能基であるヒドロキシ基は保
護されていても保護されていなくてもよい。保護
する場合にはペプチド合成反応で通常用いうる保
護基などを用いるとよい。化合物のカルボキシ
基は保護されていることが必須で、通常用いられ
るカルボキシ基保護基を使用する。例えば、ｔ−
ブチルやベンジルなどのアルキルやアラルキルエ
ステル、アミド、アニリノなどの置換アミド、さ
らに塩などの形で修飾するとよい。
下化合物と記す）は通常の化学的方法で合成さ
れるが、その側鎖官能基であるヒドロキシ基は保
護されていても保護されていなくてもよい。保護
する場合にはペプチド合成反応で通常用いうる保
護基などを用いるとよい。化合物のカルボキシ
基は保護されていることが必須で、通常用いられ
るカルボキシ基保護基を使用する。例えば、ｔ−
ブチルやベンジルなどのアルキルやアラルキルエ
ステル、アミド、アニリノなどの置換アミド、さ
らに塩などの形で修飾するとよい。
上記の保護基の選択においては、それらの保護
基の導入または脱離処理について、インシユリン
が変性したり失活したりしないものを選択するこ
とを考慮すべきである。ペプチド合成に用いられ
る保護基については、エム・ボタンスツキーら
（M.Bodanszky et al.）のペプチドシンセシス
（Peptide Synthesis）第２版（1976年）（ジヨ
ン・ウイリー・アンド・サンズ（John Wiley
＆ Sons））に詳しく記載されている。
基の導入または脱離処理について、インシユリン
が変性したり失活したりしないものを選択するこ
とを考慮すべきである。ペプチド合成に用いられ
る保護基については、エム・ボタンスツキーら
（M.Bodanszky et al.）のペプチドシンセシス
（Peptide Synthesis）第２版（1976年）（ジヨ
ン・ウイリー・アンド・サンズ（John Wiley
＆ Sons））に詳しく記載されている。
なお、保護基の選択においては、一度の保護基
脱離処理によつて同時に除去できるものを選択す
ることが好ましいことは当然である。
脱離処理によつて同時に除去できるものを選択す
ることが好ましいことは当然である。
化合物と化合物の縮合反応はトリプシン
またはトリプシン様酵素のペプチド結合形成反応
に適した条件で行なわれる。pH5〜８、特に６〜
７付近が好ましく、反応温度は０〜50℃、とくに
20〜40℃がよい。化合物と化合物の濃度は
可能なかぎり高いことがのぞましい。さらに化合
物と化合物は１：１〜100：１のモル比で
反応させるのがよく、とくに20：１〜100：１付
近がよい。反応液には水と混合しうる適当な有機
溶媒を加える。有機溶媒の添加は、反応液中の水
の濃度を下げて、逆反応である加水分解反応を抑
えるだけでなく、化合物および化合物の溶
解性を著しく高める点で効果がある。有機溶媒と
しては、例えば、メタノール、エタノール、ジメ
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、グリ
セリンなどを単独でまたは組合せて用いる。とく
に０〜65％、とくに40〜60％の濃度で用いるとよ
い。一般に有機溶媒を用いる場合は、原料の溶解
度、酵素の変性や加水分解反応などを考慮して水
に対する割合を決定する。反応液の緩衝剤として
はDHCH−アルギニン−B22の安定化の為に硼酸
塩が好適である。
またはトリプシン様酵素のペプチド結合形成反応
に適した条件で行なわれる。pH5〜８、特に６〜
７付近が好ましく、反応温度は０〜50℃、とくに
20〜40℃がよい。化合物と化合物の濃度は
可能なかぎり高いことがのぞましい。さらに化合
物と化合物は１：１〜100：１のモル比で
反応させるのがよく、とくに20：１〜100：１付
近がよい。反応液には水と混合しうる適当な有機
溶媒を加える。有機溶媒の添加は、反応液中の水
の濃度を下げて、逆反応である加水分解反応を抑
えるだけでなく、化合物および化合物の溶
解性を著しく高める点で効果がある。有機溶媒と
しては、例えば、メタノール、エタノール、ジメ
チルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、グリ
セリンなどを単独でまたは組合せて用いる。とく
に０〜65％、とくに40〜60％の濃度で用いるとよ
い。一般に有機溶媒を用いる場合は、原料の溶解
度、酵素の変性や加水分解反応などを考慮して水
に対する割合を決定する。反応液の緩衝剤として
はDHCH−アルギニン−B22の安定化の為に硼酸
塩が好適である。
本発明で使用する酵素は、各種動物および微生
物起源のトリプシンおよびトリプシン様酵素を含
む。後者の例としては、ストレプトマイセス属菌
から抽出分離されたトリプシン様酵素がある。同
酵素については森原らがアーカイブス・オブ・バ
イオケミストリー・アンド・バイオヒジクス
（Arch.Biochem.Biophys.）126巻971頁（1968年）
に、吉田らがエフイービーエス・レター（FEBS
Lett.）15巻129頁（1971年）に記載している。使
用する酵素は混在するキモトリプシンまたはキモ
トリプシン様の活性を除去する目的でトシル−Ｌ
−フエニルアラニンクロロメチルケトン（以下
TPCKと記す）などで処理することが望ましい。
物起源のトリプシンおよびトリプシン様酵素を含
む。後者の例としては、ストレプトマイセス属菌
から抽出分離されたトリプシン様酵素がある。同
酵素については森原らがアーカイブス・オブ・バ
イオケミストリー・アンド・バイオヒジクス
（Arch.Biochem.Biophys.）126巻971頁（1968年）
に、吉田らがエフイービーエス・レター（FEBS
Lett.）15巻129頁（1971年）に記載している。使
用する酵素は混在するキモトリプシンまたはキモ
トリプシン様の活性を除去する目的でトシル−Ｌ
−フエニルアラニンクロロメチルケトン（以下
TPCKと記す）などで処理することが望ましい。
反応液の酵素濃度は基質濃度や酵素の活性で異
なつてくるが、市販結晶トリプシンを用いる場合
は、１mg/ml〜10mg/ml付近がよい。酵素はその
まゝ用いてもよいし、適当な不溶性担体に結合又
は包含させた固定化酵素として用いてもよい。
なつてくるが、市販結晶トリプシンを用いる場合
は、１mg/ml〜10mg/ml付近がよい。酵素はその
まゝ用いてもよいし、適当な不溶性担体に結合又
は包含させた固定化酵素として用いてもよい。
反応時間は、反応条件により異なるが、通常は
酵素反応が平衡に達するに要する時間をとればよ
く、通常３〜72時間、多くの場合６〜24時間程度
である。
酵素反応が平衡に達するに要する時間をとればよ
く、通常３〜72時間、多くの場合６〜24時間程度
である。
反応終了後反応液から目的の化合物を採
取する方法は公知の種々の分離手段を用い行いう
る。例えば、反応液をゲル濾過にかけ未反応の化
合物および酵素を単離回収する。回収した化合
物および酵素はそのまゝ再使用できる。残部に
化合物とデス−B30−インシユリンが含ま
れる。化合物は凍結乾燥により得ることが
できるが、最終目的物質人インシユリンを得るた
めには、化合物を単離せずに、残部にアル
ギニン保護基の脱離処理を施したのち適当なクロ
マトグラフイーまたはゲル濾過に付す。生成した
Ｂ鎖末端スレオニンのカルボキシル基が保護され
たインシユリン誘導体とＢ鎖30位のアミノ酸が欠
けているインシユリン（以下デス−B30−インシ
ユリンと記す）が分離する。回収したデス−B30
−インシユリンは再びＢ鎖22位のアルギニンを修
飾し、原料化合物として使用することができ
る。最後にＢ鎖末端スレオニンのカルボキシ基の
保護基をはずし、最終の目的化合物であるインシ
ユリンを得る。
取する方法は公知の種々の分離手段を用い行いう
る。例えば、反応液をゲル濾過にかけ未反応の化
合物および酵素を単離回収する。回収した化合
物および酵素はそのまゝ再使用できる。残部に
化合物とデス−B30−インシユリンが含ま
れる。化合物は凍結乾燥により得ることが
できるが、最終目的物質人インシユリンを得るた
めには、化合物を単離せずに、残部にアル
ギニン保護基の脱離処理を施したのち適当なクロ
マトグラフイーまたはゲル濾過に付す。生成した
Ｂ鎖末端スレオニンのカルボキシル基が保護され
たインシユリン誘導体とＢ鎖30位のアミノ酸が欠
けているインシユリン（以下デス−B30−インシ
ユリンと記す）が分離する。回収したデス−B30
−インシユリンは再びＢ鎖22位のアルギニンを修
飾し、原料化合物として使用することができ
る。最後にＢ鎖末端スレオニンのカルボキシ基の
保護基をはずし、最終の目的化合物であるインシ
ユリンを得る。
保護基の脱離方法は用いる保護基により異なる
が、通常の脱離方法に準じて行えばよく、例え
ば、グアニジノ基のDHCH基脱離は1Mヒドロキ
シルアミン（pH7）存在下37℃で１晩放置して行
う。また、ヒドロキシ基やカルボキシル基の保護
基として使用されるｔ−ブチル基はカチオン捕捉
剤（例えば、アニソール）の存在下トリフルオロ
酢酸で処理すると脱離する。前記のように単一の
脱離処理で除去できる保護基を側鎖官能基および
スレオニンのカルボキシ基の保護に用いると脱離
処理が簡単で収率も向上する。カルボキシル末端
がその他のエステル、アミド、置換アミド、塩な
どになつている場合も、適当な加水分解処理や脱
塩操作により、保護基を除去できる。
が、通常の脱離方法に準じて行えばよく、例え
ば、グアニジノ基のDHCH基脱離は1Mヒドロキ
シルアミン（pH7）存在下37℃で１晩放置して行
う。また、ヒドロキシ基やカルボキシル基の保護
基として使用されるｔ−ブチル基はカチオン捕捉
剤（例えば、アニソール）の存在下トリフルオロ
酢酸で処理すると脱離する。前記のように単一の
脱離処理で除去できる保護基を側鎖官能基および
スレオニンのカルボキシ基の保護に用いると脱離
処理が簡単で収率も向上する。カルボキシル末端
がその他のエステル、アミド、置換アミド、塩な
どになつている場合も、適当な加水分解処理や脱
塩操作により、保護基を除去できる。
化合物は上記の如く、人インシユリンに
変換でき、得られた人インシユリンは先に記載し
たように血糖降下作用を有する糖尿病治療薬とし
て有用である。
変換でき、得られた人インシユリンは先に記載し
たように血糖降下作用を有する糖尿病治療薬とし
て有用である。
豚インシユリンより得た人インシユリンはマウ
スにおいて豚インシユリンと同等の血糖降下作用
を有することが認められる。
スにおいて豚インシユリンと同等の血糖降下作用
を有することが認められる。
化合物より得た人インシユリンは、市販
の豚インシユリンや牛インシユリンと同様に製剤
化し、人に投与される。すなわち、塩化亜鉛など
を加えて安定な亜鉛複合体としたり、リン酸水素
ナトリウムや酢酸ナトリウム等の緩衝剤を加えた
り、等張液とするため塩化ナトリウムを加えるな
ど、さらにクレゾール、フエノール、パラオキシ
安息香酸アルキルエステル（例えば、メチル、エ
チル、プロピル、ブチルエステルなど）などの防
腐剤を加えるなどの市販のインシユリン製剤に用
いられる様々な調製法を利用して注射剤とする。
の豚インシユリンや牛インシユリンと同様に製剤
化し、人に投与される。すなわち、塩化亜鉛など
を加えて安定な亜鉛複合体としたり、リン酸水素
ナトリウムや酢酸ナトリウム等の緩衝剤を加えた
り、等張液とするため塩化ナトリウムを加えるな
ど、さらにクレゾール、フエノール、パラオキシ
安息香酸アルキルエステル（例えば、メチル、エ
チル、プロピル、ブチルエステルなど）などの防
腐剤を加えるなどの市販のインシユリン製剤に用
いられる様々な調製法を利用して注射剤とする。
かかる注射剤の投与量は患者の症状に応じて
種々異なるが、市販のインシユリン製剤の投与と
同様に行えばよく、成人１日約１〜100単位を投
与するとよい。
種々異なるが、市販のインシユリン製剤の投与と
同様に行えばよく、成人１日約１〜100単位を投
与するとよい。
以下に実施例において、本発明化合物の製造例
を示すが、これら実施例は本発明を何ら限定する
ものではない。
を示すが、これら実施例は本発明を何ら限定する
ものではない。
なお、実施例で用いる略号は下記の意味を表わ
す。
す。
OBut ｔ−ブチルエステル
実施例 １
(1) 豚由来デス−B30−インシユリン
豚インシユリン500mgを0.1M炭酸水素アンモ
ニウム水溶液（pH8.3）100mlに溶解し、結晶
カルボキシペプチターゼＡ（ワーシングトン社
製、ジイソプロピルフルオロホスフエート処
理、49u／mg）５mgを添加して室温で８時間反
応させる。アラニンの生成量は0.77M／1Mイ
ンシユリンである。
ニウム水溶液（pH8.3）100mlに溶解し、結晶
カルボキシペプチターゼＡ（ワーシングトン社
製、ジイソプロピルフルオロホスフエート処
理、49u／mg）５mgを添加して室温で８時間反
応させる。アラニンの生成量は0.77M／1Mイ
ンシユリンである。
反応物を凍結乾燥した後0.5M酢酸に溶解し、
セフアデツクスG50（商品名）（超微細粒）にカ
ラム（3.5×95cm）にかけ、0.5M酢酸で溶出す
る。１フラクシヨンあたり11.5mlで、第40から
60番目のフラクシヨンを集め凍結乾燥して標記
化合物460mgを集める。収率92％。
セフアデツクスG50（商品名）（超微細粒）にカ
ラム（3.5×95cm）にかけ、0.5M酢酸で溶出す
る。１フラクシヨンあたり11.5mlで、第40から
60番目のフラクシヨンを集め凍結乾燥して標記
化合物460mgを集める。収率92％。
6N塩酸で110℃、24時間加水分解したアミノ
酸分析値は下記のとおりである。括弧内の数値
は理論値を表わす。上記の加水分解条件および
表示方法は以下の実施例においても同様であ
る。
酸分析値は下記のとおりである。括弧内の数値
は理論値を表わす。上記の加水分解条件および
表示方法は以下の実施例においても同様であ
る。
Lys1.00(1)、His1.91(2)、Arg0.95(1)、
Asp3.21(3)、Thr2.09(2)、Ser2.97(3)、
Glu7.35(7)、Pro1.25(1)、Gly4.29(4)、
Ala1.26(1)、Val3.86(4)、Ile1.55(2)、
Leu6.53(6)、Tyr4.08(4)、Phe3.22(3)、
(2) 豚由来［B22−Arg（DHCH）］−デス−B30
−インシユリン 上記生成物200mgを0.25M硼酸塩緩衝液
（pH9）1.7mlに溶解し１，２−シクロヘキサン
ジオン45mgを加え室温で１晩保つ。氷酢酸で酸
性とした後、セフアデツクスG50（商品名）（超
微細粒）のカラム（６×85cm）にかけ0.5M酢
酸で溶出する。
−インシユリン 上記生成物200mgを0.25M硼酸塩緩衝液
（pH9）1.7mlに溶解し１，２−シクロヘキサン
ジオン45mgを加え室温で１晩保つ。氷酢酸で酸
性とした後、セフアデツクスG50（商品名）（超
微細粒）のカラム（６×85cm）にかけ0.5M酢
酸で溶出する。
280nmの吸収を測定し、対応部を集めて凍結
乾燥し標記化合物168mgを得る。収率84％。な
お、高速液体クロマトグラフイー、スラブ電気
泳動により、アルギニンがほゞ100％DHCH修
飾されていることが確認された。
乾燥し標記化合物168mgを得る。収率84％。な
お、高速液体クロマトグラフイー、スラブ電気
泳動により、アルギニンがほゞ100％DHCH修
飾されていることが確認された。
アミノ酸分析値
Lys1.00(1)、His2.07(2)、Arg*0.27(1)、
Asp3.21(3)、Thr2.05(2)、Ser2.98(3)、
Glu7.19(7)、Pro1.23(1)、Gly3.91(4)、
Ala1.29(1)、Val3.99(4)、Ile1.57(2)、
Leu6.57(6)、Tyr3.48(4)、Phe3.16(3)。
＊加水分解時はDHCH−Argのほゞ20％がArg
に分解されたと考えられる（バシイ
（Patthy）ら、ジヤーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリイ（J.Biol.Chem.）250
巻557頁（1975年））。
に分解されたと考えられる（バシイ
（Patthy）ら、ジヤーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリイ（J.Biol.Chem.）250
巻557頁（1975年））。
(3) 豚由来（B22−Arg（DHCH）、B30−Thr−
OBut］−インシユリン (2)の生産物97.8mg（10mM）とＬ−スレオニ
ンｔ−ブチルエステル酢酸塩211mg（500mM）
をエタノール／ジメチルホルムアミド混液
（１：１、ｖ／ｖ）1.08mlに溶解し、結晶トリ
プシン（ワーシングトン社製、３回再結晶）、
4.2mgおよび最終濃度が0.01mMになるように
TPCKを含んだ0.5M硼酸塩緩衝液（pH7.5）
0.72mlと混合し37℃で１晩保つ。最後のpHは
6.5であつた。
OBut］−インシユリン (2)の生産物97.8mg（10mM）とＬ−スレオニ
ンｔ−ブチルエステル酢酸塩211mg（500mM）
をエタノール／ジメチルホルムアミド混液
（１：１、ｖ／ｖ）1.08mlに溶解し、結晶トリ
プシン（ワーシングトン社製、３回再結晶）、
4.2mgおよび最終濃度が0.01mMになるように
TPCKを含んだ0.5M硼酸塩緩衝液（pH7.5）
0.72mlと混合し37℃で１晩保つ。最後のpHは
6.5であつた。
氷酢酸で酸性とした後、セフアデツクスG50
（商品名）（超微細粒）のカラムでゲル濾過を行
い、酵素活性、280nmの紫外線吸収度、ニンヒ
ドリン反応によりトリプシン部、インシユリン
部、スレオニン誘導体部に分ける（第１図参
照）。回収したＬ−スレオニンｔ−ブチルエス
テルは約50％であつた。インシユリン部を凍結
乾燥し、標記化合物87mgを得た。
（商品名）（超微細粒）のカラムでゲル濾過を行
い、酵素活性、280nmの紫外線吸収度、ニンヒ
ドリン反応によりトリプシン部、インシユリン
部、スレオニン誘導体部に分ける（第１図参
照）。回収したＬ−スレオニンｔ−ブチルエス
テルは約50％であつた。インシユリン部を凍結
乾燥し、標記化合物87mgを得た。
(4) 豚由来［B30−Thr−OBut］−インシユリン
上記(3)の生成物85mgを1Mヒドロキシアミン
（pH7）7.5mlに溶解し、窒素ガス置換を行い28
℃で１晩保つたのち0.01Mトリス緩衝液
（pH7.4）に対して冷所で透析する。次いで7M
尿素含有の0.01Mトリス緩衝液（pH7.4）で緩
衝化したDEAE−セフアデツクスA25（商品名）
のカラム（1.9×24.5cm）により４℃でクロマ
トグラフイを行う。上記緩衝液800mlを流した
のち食塩濃度を0.3Mまで上げる濃度勾配溶出
を行い、0.08〜0.09M濃度付近の分画Ａと0.13
〜0.14M濃度付近の分画Ｂを得る。各分画を直
ちに0.01M酢酸アンモニウム溶液に対して冷所
で透析し、３−４日間続けたのち凍結乾燥す
る。分画Ａより30mg、分画Ｂより25mgの粉末を
得る。高速液体クロマトグラフイー・ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で前者が標記化合物で
あり、後者がデス−B30−インシユリン（豚
型）と豚インシユリンの混合物であることが確
認された。
（pH7）7.5mlに溶解し、窒素ガス置換を行い28
℃で１晩保つたのち0.01Mトリス緩衝液
（pH7.4）に対して冷所で透析する。次いで7M
尿素含有の0.01Mトリス緩衝液（pH7.4）で緩
衝化したDEAE−セフアデツクスA25（商品名）
のカラム（1.9×24.5cm）により４℃でクロマ
トグラフイを行う。上記緩衝液800mlを流した
のち食塩濃度を0.3Mまで上げる濃度勾配溶出
を行い、0.08〜0.09M濃度付近の分画Ａと0.13
〜0.14M濃度付近の分画Ｂを得る。各分画を直
ちに0.01M酢酸アンモニウム溶液に対して冷所
で透析し、３−４日間続けたのち凍結乾燥す
る。分画Ａより30mg、分画Ｂより25mgの粉末を
得る。高速液体クロマトグラフイー・ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で前者が標記化合物で
あり、後者がデス−B30−インシユリン（豚
型）と豚インシユリンの混合物であることが確
認された。
(5) 人インシユリンの製造
(4)の生成物28mgにアニソール0.2mlを含むト
リフルオロ酢酸２mlを加え、室温で30分保つ。
窒素気流中でトリフルオロ酢酸を除去したのち
1N酢酸２mlを加えエーテル15mlでアニソール
を抽出する。酢酸部を凍結乾燥し標記化合物26
mgを得る。原料の豚由来デス−B30−インシユ
リンの純度を77％とすると収率38％である。本
品はアミノ酸分析値、スラブゲル電気泳動、高
速液体クロマトグラムより標記の化合物と同定
された。
リフルオロ酢酸２mlを加え、室温で30分保つ。
窒素気流中でトリフルオロ酢酸を除去したのち
1N酢酸２mlを加えエーテル15mlでアニソール
を抽出する。酢酸部を凍結乾燥し標記化合物26
mgを得る。原料の豚由来デス−B30−インシユ
リンの純度を77％とすると収率38％である。本
品はアミノ酸分析値、スラブゲル電気泳動、高
速液体クロマトグラムより標記の化合物と同定
された。
アミノ酸分析値
Lys1.00(1)、His1.85(2)、Arg0.93(1)、
Asp3.21(3)、Thr2.94(3)、Ser2.96(3)、
Glu7.23(7)、Pro1.23(1)、Gly4.27(4)、
Ala1.19(1)、Val3.89(4)、Ile1.56(2)、
Leu6.57(6)、Tyr3.78(4)、Phe3.18(3)。
第１図は豚由来［B22−Arg（DHCH）、B30−
Thr−OBut］−インシユリンを分離する際のカラ
ムクロマトグラフイーによる流出パターンを示
す。
Thr−OBut］−インシユリンを分離する際のカラ
ムクロマトグラフイーによる流出パターンを示
す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の一般式で表わされるＢ鎖22位のアルギ
ニンが保護基で修飾されているインシユリン誘導
体を保護基の脱離処理に付して人インシユリンを
得ることを特徴とする人インシユリンの製造方
法。 （式中、R1は水素、R2はカルボキシ基の保護基、
R3はグアニジノ基の保護基をそれぞれ表わす。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61266446A JPS62116597A (ja) | 1981-10-30 | 1986-11-07 | 人インシユリンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56175029A JPS57118546A (en) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | Insulin derivative |
| JP61266446A JPS62116597A (ja) | 1981-10-30 | 1986-11-07 | 人インシユリンの製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56175029A Division JPS57118546A (en) | 1981-10-30 | 1981-10-30 | Insulin derivative |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62116597A JPS62116597A (ja) | 1987-05-28 |
| JPH0150718B2 true JPH0150718B2 (ja) | 1989-10-31 |
Family
ID=26496420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61266446A Granted JPS62116597A (ja) | 1981-10-30 | 1986-11-07 | 人インシユリンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62116597A (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2460753A1 (de) * | 1974-12-21 | 1976-06-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von humaninsulin |
-
1986
- 1986-11-07 JP JP61266446A patent/JPS62116597A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62116597A (ja) | 1987-05-28 |
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