JPH0153870B2

JPH0153870B2 -

Info

Publication number: JPH0153870B2
Application number: JP10090483A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Ishii; Tetsuya Someno; Tadao Yamazaki; Takashi Maruyama; Hamao Umezawa
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1983-06-08
Filing date: 1983-06-08
Publication date: 1989-11-15
Also published as: JPS59227855A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は式〔〕〔式中Ｒは低級アルキル基を示す〕で表わされるアルギニナールジ低級アルキルアセ
タールに関する。

本発明のアルギニナールジ低級アルキルアセタ
ールは各種プロテアーゼ阻害剤、アフイニテイー
クロマトグラフイー用の基質の原料として有用で
ある。

ある種の放線菌（ストレプトミセス・ロゼウス
MA839−A1；FERM−P3017）によつて生産さ
れるロイペプチン（アセチル及びプロピオニル−
ロイシル−ロイシル−アルギニナール）が種々の
セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼに対
して強い阻害作用を有していることはすでに梅
沢、青柳らにより明らかにされている。〔ザ・ジ
ヤーナルオブアンチバイオチツクス22巻、
283ページ（1969年）他〕。このようなロイペプチ
ンに含まれているアルギニナールに着目し、その
アミノ酸配列をモデルとしたアルギニナール誘導
体がいくつか製造されており、いずれもプロテア
ーゼ阻害作用を有することが知られており（エン
ザイムインヒビターズオブマイクロバイア
ルオリジン、23ページ、梅沢浜夫著、東大出版
会、1972）、又、アフイニテイークロマトグラフ
イー用の基質として使用しうることも知られてい
る（特開昭55−37185号）。

このようなアルギニナール誘導体は、従来発酵
法により、又合成的にはアルギニンを原料として
製造されていた。

しかし、発酵法による場合は所望のアミノ酸配
列のアルギニナール誘導体を得ることはできな
い。又、アルギニンを原料とする方法は、例えば
アルギニンのカルボン酸基及びグアニジノ基のア
ミノ基を保護した後、反応、カルボン酸の保護基
除去、還元、アミノ基の保護基除去と極めて煩雑
な方法である。

しかるに本発明のアルギニナールジアルキルア
セタールを原料とする通常のペプチド化学の手法
によりアミノ酸やペプチドと直接反応させること
ができるので、極めて容易に所望のアミノ酸配列
のアルギニナール誘導体を得ることができるとい
う特徴を有する。

本発明において、低級アルキル基はC₁〜C₆の
アルキル基、好ましくはC₃〜C₅のアルキル基で
ある。

本発明化合物としては例えばアルギニナールの
ジ−ｎ−プロピルアセタール、ジ−ｎ−ブチルア
セタール、ジ−ｎ−ペンチルアセタールなどがあ
げられる。

次に本発明化合物の製法について説明する。

本発明化合物はロイペプチンのジアルキルアセ
タールにα−キモトリプシンや種々の酵素の混在
する市販のプロナーゼＥ（科研製薬(株)製）を37
℃付近で60〜100時間程度作用させた後シリカゲ
ルを担体としたカラムクロマトグラフイーに吸着
させ、次いで溶出することにより得ることができ
る。又、ロイペプチンのジアルキルアセタールに
サーモライシンを作用させて得られるロイシルア
ルギニナールジアルキルアセタールに、アミノペ
プチダーゼＭのようなエキソペプチダーゼを作用
させることによつても同様に得ることができる。

かくして得られたアルギニナールジアルキルア
セタールは、これ自体酸性基を有する樹脂に固定
した後加水分解してアルギニナールとすることに
よりトリプシン等のアフイニテイー樹脂になり得
るが、そのα−アミノ基にアミノ酸、ペプチドな
どを導入することにより、目的のプロテアーゼに
対する親和性の強いアフイニテイークロマト用の
基質を得ることができる。例えばアルギニナール
のα−アミノ基にフエニルアラニンを導入すると
カリクレインに対して極めて親和性が高い基質と
なる。

本発明のアルギニナールジアルキルアセタール
を利用してペプチド性アルギニナールを合成する
利点としては、(i)グアニジノ基中のアミノ基の保
護を必要としないこと、(ii)合成後、緩和な酸水解
でアセタールをアルデヒド基にすることができる
ことなどがあげられる。

本発明のアルギニナールジアルキルアセタール
にアミノ酸残基等を導入するには、ペプチド化学
で一般的に使用されている方法、例えば (1) 酸ハライド法 (2) Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロ
フエノール、ペンタクロロフエノールなどを用
いる活性エステル法 (3) ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジメチル
アミノプロピルカルボジイミドなどを用いるカ
ルボジイミド法 (4) ジフエニルリン酸アジド、Ｎ−エトキシカル
ボニル−２−エトキシジヒドロキノリン、Ｎ−
エチル−５−フエニルイソオキサゾリウム−
3′−スルホネート６−クロロ−１−ｐ−クロロ
ベンゼンスルホニルオキシベンゾトリアゾール
などの縮合剤を用いる方法 (5) クロルギ酸エチル、クロルギ酸イソブチルな
どを用いる混合酸無水物法 (6) アジド法などの方法を利用すればよい。

以上の様な方法によりアミノ酸等の残基の導入
された化合物の精製はグアニジド基を含む化合物
の特徴として結晶化が困難なためシリカゲルを担
体としたカラムクロマトグラフイーで処理する方
法が簡便かつ効率的である。さらに必要に応じて
アミノ基の保護基ベンジルオキシカルボニル基
は、例えばメタノール等の溶媒中パラジウム黒な
どを用いる接触還元で除去すればよい。又、アセ
タールをアルデヒド基にするには、加水分解によ
り行えるが、水に不溶の場合には、メタノール、
エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジメチ
ルホルムアミドの様な水と混和する溶媒を用い、
塩酸、硫酸の様な鉱酸を用いて10〜60℃、好まし
くは25〜40℃で数時間反応させればよい。この場
合用いる酸の濃度は特に限定されないが、0.3〜
0.5規定になる様に調整することが好ましい。シ
リカゲルを担体とした薄層クロマトグラフイーで
原料の消失が認められた後、過剰の酸は弱塩基性
イオン交換樹脂、例えばDowex WGRで除去し
た後凍結乾燥等により目的とする化合物の塩を得
ることができる。

このようにして得られた化合物のアセタールを
加水分解してアルデヒドにすることにより種々の
プロテアーゼの阻害剤を得ることができる。

この加水分解は例えばPH１〜４好ましくは２〜
３の酸又は緩衝液を用い、20〜50℃好ましくは30
〜45℃、24時間〜120時間好ましくは48〜96時間
反応させればよい。用いる緩衝剤としては特に制
限はなく、塩酸、リン酸等の鉱酸及び酒石酸、ク
エン酸、乳酸、コハク酸、酢酸等の有機酸とこれ
らのナトリウム、カリウム塩からなる組成のもの
等があげられる。

このようにして得られる化合物としては例えば
フエニルアラニルアルギニナール、Ｎ−ベンジル
オキシカルボニル−プロリル−アルギニナールな
どがあげられる。

一方、アセタール化されているアルギニナール
誘導体を樹脂に結合させるためには、アミノ基の
保護基をペプチド化学で汎用される方法で除去し
た後、アミノ基を官能基として利用することによ
り種々の酸性基を有する水不溶性担体に結合させ
ればよい。本発明で使用される水不溶性担体とし
ては特に制限はなく例えばメタクリル酸−ジビニ
ルベンゼン共重合体などの酸性基を有するイオン
交換樹脂、カルボキシメチル基を有するセルロー
ス誘導体、さらにはセフアロース、アガロース、
デキストラン等の高分子多糖体にカルボン酸やス
ルホン酸の様な酸性基を導入したものがあげられ
る。

これらの水不溶性担体とアセタール化されてい
るアルギニナール誘導体を結合させる方法として
は、一般的にアフイニテイー樹脂を作成する時に
用いられる様な方法、例えばカルボキシアルキル
誘導体をスペーサーにもつアガロースに水溶性カ
ルボジイミドを作用させる方法、CHセフアロー
ス（フアルマシア社製）に水溶性カルボジイミ
ドを作用させる方法、あるいは市販の活性化され
ているCH−セフアロース（フアルマシア社
製）等を利用するのが有効である。

得られた化合物は、アセタール部分を先に述べ
た方法で加水分解することにより容易にアルギニ
ナールとすることができる。

このようにして得られるものとしては例えばフ
エニルアラニル−アルギニナールセフアロースな
どがあげられる。

以下実施例について本発明を具体的に説明す
る。

なお実施例における薄層クロマトグラフイーの
Rf値はすべてメルク社製薄層板、シリカゲル
60F254プレート0.25mmを使用し、展開溶媒ｎ−ブ
タノール；酢酸ブチル；酢酸；水＝４：２：１：
１で展開し、測定した。

施光度の測定は水銀ランプ578nｍで行つた。

また化合物の確認はフイールドデソープシヨン
マススペクトロメトリーで行つた。

実施例１Ｄ，Ｌ−アルギニナールジブチルアセタール塩
酸塩の調製特開昭55−37185に記載した方法で得られたロ
イペプチンジブチルアセタール塩酸塩25ｇを0.02
モル塩化カルシウムおよび0.02モル塩化マンガン
を含む0.1モルＮ−エチルモルホリン−塩酸緩衝
液（PH8.0、1000ml）に懸濁させ次いでプロナー
ゼＥを1.25ｇ添加して37℃で72時間撹拌を行つ
た。反応液をHP20 （500ml）に通導し、水洗
後50％エタノールで溶出を行い坂口試薬陽性画分
を分取してアルギニナールジブチルアセタール塩
酸塩4.8ｇを得た。

〔α〕²⁵ ₅₇₈＋0.5゜（Ｃ＝０、８、酢酸） m.p.164〜166℃ FD−MS；289（Ｍ＋Ｈ）⁺ 実施例２Ｄ，Ｌ−アルギニナールジブチルアセタール塩
酸塩の調製実施例１と同様に、ロイペプチンジブチルアセ
タール塩酸塩500mgを0.02モル塩化カルシウム及
び0.02モル塩化マンガンを含む0.1モルＮ−エチ
ルモルホリン−塩酸緩衝液（PH9.0、20ml）に懸
濁させ、次いでストレプトミセス・グリセウス・
プロテアーゼＡを25mg添加して37℃で96時間撹拌
を行つた。反応液を実施例１と同様にHP20（10
ml）処理を行い標記粉末47mgを得た。

実施例３特開昭55−37185で記載した方法で得られたＬ
−ロイシル−Ｄ，Ｌ−アルギニナールジブチルア
セタール塩酸塩500mgを実施例１と同様の緩衝液
20mlに懸濁させ、次いでプロナーゼＥを25mg添加
して37℃で72時間撹拌を行なつた後、実施例１と
同様にHP20（10ml）処理を行ない標記粉末125mg
を得た。

参考例１ (1) Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フエニ
ルアラニル−Ｄ，Ｌ−アルギニナールジブチル
アセタール塩酸塩の製造Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フエニ
ルアラニンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル480mgおよび実施例１で得られたＤ，Ｌ−
アルギニナールジブチルアセタール塩酸塩288
mgを氷冷下50％Ｎ，N′−ジメチルホルムアミ
ド水溶液10mlに溶解し、次いで70μのトリエ
チルアミンを加えさらに室温で８時間撹拌を行
なつた。溶媒を減圧で留去した後シリカゲルを
担体としたカラムクロマトグラフイーに附しブ
タノール；酢酸ブチル；酢酸；水＝４：２：
１：１（ｖ／ｖ）で展開しRf0.7の坂口試薬陽性
画分を減圧で濃縮し標記化合物300mgを得た。

〔α〕²⁹ ₅₇₈−8.3゜（Ｃ＝0.4、AcOH） FD−MS；ｍ／ｚ＝570（Ｍ＋Ｈ）⁺（100％）、
571（32.8％）、572（5.6％）、573（1.6％）、462
（4.9％）、463（1.2％） (2) Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−フエニ
ルアラニル−Ｄ，Ｌ−アルギニナール塩酸塩の
製造得られたＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−フエニルアラニル−Ｄ，Ｌ−アルギニナール
ジブチルアセタール塩酸塩100mgを１規定塩酸
（１容）；アセトニトリル（２容）の混液で37
℃、２時間加水分解を行ない、水20mlを加え弱
塩基性イオン交換樹脂Dowex WGR（OHタイ
プ）で中和した。水溶液を凍結乾燥し、標記粉
末72mgを得た。

Rf；0.43〜0.65^*（展開条件は前述）〔α〕²⁶ ₅₇₈＋9.0（Ｃ＝0.5、MeOH） FD−MS；ｍ／z440（Ｍ＋Ｈ）⁺（100％）、441
（43.1％）、442（4.9％）＊参考天然ロイペプチンRf：0.41〜0.28ロイ
ペプチンは前記薄層クロマトグラフイーの条
件で３スポツトを与える。

(3) Ｌ−フエニルアラニル−Ｄ，Ｌ−アルギニナ
ールセフアロースの調製 (1)で得られたＮ−ベンジルオキシカルボニル
−Ｌ−フエニルアラニル−Ｄ，Ｌ−アルギニナ
ールジブチルアセタール塩酸塩130mgを10mlの
メタノールに溶解しパラジウム黒を用いて４時
間接触還元を行なつた。反応終了後パラジウム
黒を除去し、溶媒を減圧で留去して、Ｌ−フエ
ニルアラニル−Ｄ，Ｌ−アルギニナールジブチ
ルアセタール塩酸塩の粉末を97mg得た。得られ
た粉末を0.1モル−モルホリノエタンスルホン
酸30mlおよび、ジオキサン30mlの混液に懸濁さ
せ、次いでCH−セフアロース 4B（フアルマ
シア社製）20mlを加え、PHを５に調整した。次
いで37℃水浴上で撹拌しながら全量１ｇの水溶
性カルボジイミドを１時間にわたり加えさらに
20時間撹拌した。樹脂をグラスフイルターにう
つし、十分に水で洗滌後100mlの0.2モル−クエ
ン酸ソーダ緩衝液、PH2.5で40℃、60時間浸漬
させた。次いで緩衝液を除去し、水洗を行ない
標記樹脂20mlを得た。

参考例２Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−プロリル
−Ｌ−アルギニナール塩酸塩の製造Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−プロリン
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル415mgお
よびＤ，Ｌ−アルギニナールジブチルアセタール
塩酸塩324mgおよびトリエチルアミン140μを実
施例２と同様に10mlの50％Ｎ，N′−ジメチルホ
ルムアミド水溶液中で反応させ、参考例１(1)と同
様な処理し、145mgの標記化合物の粉末を得た。

Rf；0.8（実施例２と同溶媒）〔α〕²⁴ ₅₇₈−60.3゜（Ｃ＝0.3、MeOH）得られた粉末100mgを参考例１(2)と同様な処理
を行ない標記粉末73mgを得た。

Rf；0.53〜0.41 〔α〕²⁶ ₅₇₈−77.7゜（Ｃ＝0.5、MeOH） FD−MS；ｍ／ｚ＝390（Ｍ＋Ｈ）⁺（100％）、391
（26.7％）、372（21.6％）実験例１参考例１により調製したプロテアーゼ吸着体10
mlをカラムに充填し、PH7.5に調整した0.1M塩化
ナトリウムを含む、0.1Mトリスヒドロキシメタ
ン−塩酸緩衝液で充分に緩衝化を行なつた。その
後PH7.5に調整した力価782カリクレイン単位の粗
製人尿カリクレイン（比活性2.4カリクレイン単
位／mg蛋白）含有溶液をカラムに通過させ、該吸
着体に人尿カリクレインを吸着させた。次いで上
記緩衝液でカラムを洗滌した後、10ｍＭのロイペ
プチンを含む上記緩衝液を用いてカラムに吸着し
た人尿カリクレインを脱着させ、次いで溶出液に
20ｍＭ相当の水素化ホウ素ナトリウムを加えて、
活性測定を行ない力価564カリクレイン単位（比
活性54.2カリクレイン単位／mg蛋白）を得た。回
収率は、72％であり、比活性は約23倍上昇した。

Claims

【特許請求の範囲】１式〔式中Ｒは低級アルキル基を示す〕で表わされるアルギニナールジ低級アルキルアセ
タール。