JPH0153666B2

JPH0153666B2 -

Info

Publication number: JPH0153666B2
Application number: JP57175298A
Authority: JP
Inventors: Tetsuya Someno; Tadao Yamazaki; Shinichi Ishii; Tomio Takeuchi; Hamao Umezawa
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1982-10-07
Filing date: 1982-10-07
Publication date: 1989-11-15
Also published as: JPS5965066A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はプロテアーゼ吸着体に関する。

プロテアーゼの精製法として従来から用いられ
ている方法としては、硫酸塩、例えば硫酸マグネ
シウム、ペントナイトなどの沈澱剤を用いた沈澱
法、ケイ酸やシリカゲル、ヒドロキシルアパタイ
トなどを用いた吸着クロマト法およびプロテアー
ゼの電気的解離に関する性質を利用した陽或いは
陰イオン交換クロマト法など、又はそれらの組み
合せが知られている。一般に、これらの方法は精
製工程が多い程純度上昇が期待できるが、その反
面収率が低下する欠点がある。

さらに精製に長時間を要するため、この精製過
程でプロテアーゼ自身による自己消化ならびに共
存する他のプロテアーゼによる消化などによる酵
素の変質ならびに失活など、解決すべき重要な問
題が残されている。

近年プロテアーゼの優れた精製法として、プロ
テアーゼに親和力をもつリガンドを不溶性担体に
結合させた吸着体が開発され、この吸着体を用い
て酵素を精製する所謂アフイニテイクロマトグラ
フイーが選択性が高くしかも高収率で目的物を得
ることができることから優れた高純度プロテアー
ゼの精製法として注目されてきている。

具体例を述べれば、 (1) ウロキナーゼでは例えばａ）リジン又はアル
ギニン、又はこれらの誘導体をリガンドとする
方法（特公昭51−44193号、特公昭51−20596
号、特開昭51−95183号、特開昭51−35481〜
35483号、ｂ）胎盤組織等に含有されるウロキ
ナーゼ阻害因子をリガンドとする方法（特公昭
51−20597号、ｃ）ベンズグアニジン誘導体を
リガンドとする方法（特開昭53−88389号）が
ある。

(2) カリクレインでは、例えば牛組織中或いは人
血清中のカリクレイン阻害物質をリガンドとす
る方法（特開昭50−31017号） (3) トリプシンで代表される酵素ではａ）アルギ
ニンをリガンドとしたAP―セフアロースを用
いる方法（特開昭48−82083号）、ｂ）パラアミ
ノフエニルグアニジン、パラアミノベンズアミ
ジン、又はメタアミノベンズアミジンをリガン
ドとした方法〔アーチブ・ビオケミストリー・
アンド・ビオフイジツクス、154巻、501頁
（1973）〕などがある。

しかしながら従来のアフイニテイクロマトグラ
フイーでは、吸着体とプロテアーゼとの親和性が
弱く、例えば高濃度の塩類を含有するプロテアー
ゼ溶液によつてその吸着能は著しく低下し、予期
した収率が得られない。

又、動物組織中に存在するプロテアーゼ阻害物
質をリガンドとして用いる試みもみられるがこの
リガンドを多量に取得することは容易でなく到底
実用化できるものではない。

そこで本発明者らは大量に入手可能なリガンド
を用いたプロテアーゼ吸着体開発のため、種々の
リガンドを合成して検討した。その結果、Ｌ―ロ
イペプチンから誘導される下記一般式（）（式中Ａはフエニルグリシル基又はフエニルアラ
ニル基を示す）で表わされるアルギニナール誘導体がプロテアー
ゼを効率よく吸着し、かつPHの調整により容易に
目的とするプロテアーゼを脱着することを見い出
した。

本発明は上記知見に基づいて完成されたもので
ある。

本発明のプロテアーゼ吸着体を用いて精製しう
るプロテアーゼは特に制限されないが、トリプシ
ン、カリクレイン、プラスミン、トロンビンなど
が好ましい。

本発明で使用される水不溶性担体としては特に
制限はなく、例えばメタクリル酸―ジビニルベン
ゼン共重合体などの酸性イオン交換樹脂、カルボ
キシメチルセルロースなどの酸性基を有するセル
ロース誘導体、セフアロース、アガロース、デキ
ストランなどの高分子多糖体にカルボン酸基やス
ルホン酸基を導入したものなどがあげられるが、
高分子多糖体が好ましい。

これらの不溶性担体とＬ―アルギニナール誘導
体を結合させるには、例えば下記一般式（）（式中Ａはフエニルグリシル基、フエニルアラニ
ル基を、Ｒは低級アルキル基を示す）で表わされるＬ―アルギニナール誘導体をジアル
キルアセタール化したものなどアルギニナール部
のアルデヒド基が保護されたＬ―アルギニナール
誘導体に酸性基を活性化した上記の不溶性担体と
反応させ、その後アルデヒド基の保護基を除去す
ればよい。

ここでＲとしては、例えばブチル基などがあげ
られる。

不溶性担体中の酸性基の活性化方法としては公
知の方法、例えばアガロースに臭化シアンを作用
させる方法、カルボキシアルキル誘導体をスペー
サーにもつアガロースに水溶性カルボジイミドを
作用させる方法、CH―セフアロース（フアルマ
シア社製）に水溶性カルボジイミドを作用させる
方法などが使用できる。

アルデヒド基の保護されたＬ―アルギニナール
誘導体と活性化不溶性担体との反応は、例えば水
溶性カルボジイミドを作用させる場合には溶媒
中、PH３〜７、好ましくは４〜６、温度25〜45
℃、好ましくは35〜40℃で10〜30時間、好ましく
は15〜25時間反応させればよい。ここで用いる溶
媒としてはPH３〜７を保持できる塩溶液若しくは
緩衝液からなる０〜50％のジメチルホルムアミド
溶液又はジオキサン溶液などがあげられる。

得られた反応物からアルデヒド基の保護基を除
去するにはPH１〜４、好ましくは２〜３の緩衝液
中、温度20〜50℃、好ましくは30〜45℃、24〜
120時間、好ましくは48〜96時間加水分解すれば
よい。ここで用いる緩衝液としては塩酸、リン酸
などの鉱酸及び酒石酸、クエン酸、乳酸、コハク
酸、酢酸などの有機酸と、これらのナトリウム、
カリウム塩などからなる組成のものなどがあげら
れる。

以上のような方法によつて得られたプロテアー
ゼ吸着体を用い、種々のプロテアーゼを得るに
は、例えば次のようにすればよい。ここでは尿カ
リクレインの精製法について説明する。

先ず、該吸着体をカラムに充填してPH５〜10、
好ましくはPH６〜８とする。この場合、イオン強
度は特に制限されないが、0.025〜0.5Mの緩衝液
であらかじめ平衡化しておくことが好ましい。こ
こで用いる緩衝液としては、例えばリン酸ソーダ
ーリン酸、リン酸カリウム―リン酸、酢酸ソーダ
ー酢酸、トリスヒドロキシアミノメタン―塩酸な
どがあげられる。

その後PH５〜10、好ましくは６〜８に調整した
粗尿カリクレイン水溶液を該吸着体カラムに通し
て該吸着体に尿カリクレインを吸着させる。次い
で尿カリクレインを吸着した該吸着体を上記緩衝
液で洗浄した後、PH１〜４、好ましくはPH２〜３
の酸溶液、水溶性塩溶液もしくは緩衝液で尿カリ
クレインを溶出させることにより高純度の尿カリ
クレイン水溶液が得られる。ここで使用する酸溶
液としては例えばクエン酸、酒石酸、乳酸、コハ
ク酸、酢酸、リン酸、塩酸などの水溶液などがあ
げられる。水溶性塩溶液としては例えば塩化ナト
リウム―塩酸水溶液、塩化カリウム―塩酸水溶
液、硫酸ソーダー硫酸水溶液などがあげられる。
又、緩衝液としてはリン酸ソーダーリン酸水溶
液、リン酸カリウム―リン酸水溶液、クエン酸―
クエン酸ナトリウム水溶液、コハク酸―ホウ砂、
乳酸―乳酸ナトリウム、酢酸―酢酸ナトリウム、
酒石酸―酒石酸ナトリウムなどがあげられる。

なお、本発明方法はカラム式のほか、バツチ式
で行つてもよい。

本発明のプロテアーゼ吸着体製造の際に使用す
るアルデヒド基の保護されたＬ―アルギニナール
誘導体は例えば次の方法により製造することがで
きる。即ち、アミノ基の保護されたフエニルグリ
シン又はフエニルアラニンの活性エステルとアル
デヒド基を保護したＬ―ロイペプチンをサーモラ
イシンで加水分解して得た、アルデヒド基の保護
されたＬ―ロイシル―Ｌ―アルギニナール（特開
昭55−37185、実施例１参照）とを溶媒中で縮合
させた後、接触還元を行つてアミノ基の保護基を
除去することにより得ることができる。ここで使
用されるＮ―保護基としてはベンジルオキシカル
ボニル基、ｐ―メトキシベンジルオキシカルボニ
ル基などの接触還元で除去できる保護基があげら
れる。活性エステルとしては、Ｎ―ヒドロキシス
クシンイミドエステル、ｐ―ニトロフエニルエス
テル、２，４，５―トリフロロフエニルエステル
などの使用が簡便であり望ましい。又、縮合に用
いられる溶媒は通常用いられる溶媒で特に差しつ
かえはない。又、接触還元は、例えばメタノール
などの溶媒中、パラジウム黒などを用いて常法で
行うことができる。

なお、アミノ基の保護されたフエニルグリシン
又はフエニルアラニンとアルデヒド基の保護され
たＬ―ロイシル―Ｌ―アルギニナールとの縮合
は、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、エ
チルジメチルアミノプロピルカルボジイミドなど
のカルボジイミド類を単独で用いる方法又は、Ｎ
―ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ―ヒドロキ
シスクシンイミド、Ｎ―ヒドロキシ―５―ノルボ
ルネン―２，３―ジカルボキサミドなどと組み合
わせて用いる方法、あるいはジフエニルホスホリ
ルアジド、１―エトキシカルボニル―２―エトキ
シ―１，２―ジヒドロキノリンなどの縮合剤を用
いる方法などのペプチド結合形成に一般的に用い
られる方法によつても行うことができる。

次に本発明を実施例及び実験例により具体的に
説明する。

実施例１Ｌ―フエニルアラニル―Ｌ―ロイシル―Ｌ―ア
ルギニナールセフアロースの調製 (1) Ｎ―ベンジルオキシカルボニル―Ｌ―フエニ
ルアラニンＮ―ヒドロキシスクシンイミドエス
テル240mgおよび、特開昭55−37185で記載した
方法で得られたＬ―ロイシル―Ｌ―アルギニナ
ールジブチルアセタール塩酸塩220mgを氷冷下
Ｎ，N′―ジメチルホルムアミド10mlに溶解し
次いで、70mlのトリエチルアミンを加え、室温
でさらに20時間、撹拌を行う。溶媒を減圧で留
去した後、シリカゲルを担体とするカラムクロ
マトグラフイーに附し、ブタノール；酢酸ブチ
ル：酢酸：水＝４：２：１：１（ｖ／ｖ）で展
開し、Rf0.8の坂口試薬陽性の画分を減圧で濃
縮し、Ｎ―ベンジルオキシカルボニル―Ｌ―フ
エニルアラニル―Ｌ―ロイシル―Ｌ―アルギニ
ナールジブチルアセタール塩酸塩150mgを得た。

〔α〕²⁹ ₅₇₈＝−25.5゜（Ｃ＝0.4ACOH） m.p.＝88〜91℃（分解） FD―MS；ｍ／ｚ＝683（Ｍ＋Ｈ）⁺（100％、
684（39.3％） (2) 得られた粉末120mgをメタノール10mlに溶解
し、パラジウム黒を用いて２時間接触還元を行
つた。反応終了後パラジウム黒を除去し、溶媒
を留去してＬ―フエニルアラニル―Ｌ―ロイシ
ル―Ｌ―アルギニナールジブチルアセタール塩
酸塩70mgを得た。

Rf；0.3（(1)の展開溶媒と同じ）〔α〕²⁷ ₅₇₈＝−11.2゜（Ｃ＝0.7、ACOH） m.p.＝82〜84℃ FD―MS；ｍ／ｚ＝549（Ｍ＋Ｈ）⁺（100％）、
550（38.6％）、551（8.7％） (3) 得られたＬ―フエニルアラニル―Ｌ―ロイシ
ル―Ｌ―アルギニナールジブチルアセタール塩
酸塩50mgを0.1Mモルホリノエタンスルホン酸
25ml及びジオキサン25mlの混液に懸濁させPHを
５に調整し、次いでCH―セフアロース4B
15mlを加え、撹拌しながら１時間かけて全量
500mgの水溶性カルボジイミドを加え、37℃で
20時間撹拌する。樹脂を水で洗滌後0.2Mクエ
ン酸ソーダ緩衝液50mlPH2.5で40℃60時間浸漬
させたのち、緩衝液を除去し、水洗をくり返し
標記樹脂15mlを得た。

実施例２Ｄ，Ｌ―フエニルグリシル―Ｌ―ロイシル―Ｌ
―アルギニナールセフアロースの調製Ｎ―ベンジルオキシカルボニル―Ｄ，Ｌ―フエ
ニルグリシンＮ―ヒドロキシスクシンイミドエス
テル210mgおよびＬ―ロイシル―Ｌ―アルギニナ
ールジブチルアセタール塩酸塩200mgおよび、ト
リエチルアミン62μを実施例１と同様に10mlの
Ｎ，N′―ジメチルホルムアミド中で反応させ、
次いで実施例１と同様な処理をし、Ｎ―ベンジル
オキシカルボニル―Ｄ，Ｌ―フエニルグリシル―
Ｌ―ロイシル―Ｌ―アルギニナールジブチルアセ
タール塩酸塩を130mg得た。

Rf；0.8（実施例１(1)と同溶媒）〔α〕²⁶ ₅₇₈＝−16.3゜（Ｃ＝0.5、ACOH） m.p.＝84〜87℃ FD―MS；ｍ／ｚ＝669（Ｍ＋Ｈ）⁺（100％）、
670（48.2％）、671（12.7％）、595
（15.7％）得られた粉末110mgをメタノール10mlに溶解し、
パラジウム黒を用いて２時間接触還元を行つた。
反応終了後、パラジウム黒を除去し、溶媒を留去
してＤ，Ｌ―フエニルグリシル―Ｌ―ロイシル―
Ｌ―アルギニナールジブチルアセタール塩酸塩60
mgを得た。

Rf；0.3（実施例１(1)と同溶媒）〔α〕²⁶ ₅₇₈＝−17.2゜（Ｃ＝0.6、ACOH） m.p.＝70〜75℃ FD―MS；ｍ／ｚ＝535（Ｍ＋Ｈ）⁺（100％）、
536（23.9％）、537（5.6％）、461（4.8
％）得られたＤ，Ｌ―フエニルグリシル―Ｌ―ロイ
シル―Ｌ―アルギニナールジブチルアセタール塩
酸塩50mgを用い実施例１と同様の操作を行い標記
樹脂15mlを得た。

実施例３Ｄ―フエニルアラニル―Ｌ―ロイシル―Ｌ―ア
ルギニナールセフアロースの調製Ｎ―ベンジルオキシカルボニル―Ｄ―フエニル
アラニンＮ―ヒドロキシスクシンイミドエステル
218mgおよび、Ｌ―ロイシル―Ｌ―アルギニナー
ルジブチルアセタール塩酸塩200mgおよび、トリ
エチルアミン62μを実施例１と同様に10mlの
Ｎ，N′―ジメチルホルムアミド中で反応させ、
実施例１と同様な処理をし、吸湿性粉末状のＮ―
ベンジルオキシカルボニル―Ｄ―フエニルアラニ
ル―Ｌ―ロイシル―Ｌ―アルギニナールジブチル
アセタール塩酸塩を125mg得た。

Rf；0.8（実施例１(1)と同溶媒）〔α〕²⁶ ₅₇₈＝−17.3゜（Ｃ＝0.8、ACOH） FD―MS；ｍ／ｚ＝683（Ｍ＋Ｈ）⁺（100％）、
684（40.5％）、685（10.6％）、609（5.5
％）得られた粉末105mgを実施例１と同様に接触還
元を行い吸湿性粉末状のＤ―フエニルアラニル―
Ｌ―ロイシル―Ｌ―アルギニナールジブチルアセ
タール塩酸塩55mgを得た。

Rf；0.3（実施例１と同溶媒）〔α〕²⁶ ₅₇₈＝−34.6゜（Ｃ＝0.8、ACOH） FD―MS；ｍ／ｚ＝549（Ｍ＋Ｈ）⁺（100％）、
550（28.9％）、551（6.5％）、447（3.8
％）実験例１実施例１により調製したプロテアーゼ吸着体10
mlをカラムに充填し、PH7.5に調整した50mMト
リスヒドロキシメタン―塩酸緩衝液で充分に緩衝
化を行つた。その後PH7.5に調整した力価500カリ
クレイン単位の粗製人尿カリクレイン（比活性
1.7カリクレイン単位／mg蛋白）含有溶液をその
カラムに通過させ、該吸着体に人尿カリクレイン
を吸着させた。次いで上記緩衝液でカラムを洗滌
した後、0.2Mのクエン酸を用いてカラムに吸着
した人尿カリクレインを脱着させ、力価424.4カ
リクレイン単位（比活性13.3カリクレイン単位／
mg蛋白）を得た。回収率は85％であり、比活性は
約８倍上昇した。

実験例２実施例２で調製したプロテアーゼ吸着体10mlを
カラムに充填し、PH8.2に調整した。50mMトリ
スヒドロキシメタン―塩酸緩衝液（0.02M塩化カ
ルシウム含有）で充分に緩衝化を行つた。その
後、同緩衝液２mlに溶解した活性トリブシン含量
75％の市販トリプシン10mgを吸着させた。次いで
上記緩衝液で、カラムを洗滌した後、0.1M酢酸
を用いてカラムに吸着したトリプシンを脱着させ
た。活性はベンゾイル―Ｌ―アルギニンエチルエ
ステルを基質に用い測定した。精製されたトリプ
シンは純度95％であり回収率は91％であつた。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（式中Ａはフエニルグリシル基又はフエニルアラ
ニル基を示す）で表わされるアルギニナール誘導体が水不溶性担
体に結合してなるプロテアーゼ吸着体。２一般式（式中Ａはフエニルグリシル基又はフエニルアラ
ニル基を示し、Ｒは低級アルキル基を示す）で表わされるアルギニナールジアルキルアセター
ル誘導体。