JPH029799B2 - - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
(1) 発明の分野
本出願は、1979年４月５日に出願し今は放棄さ
れている米国特許出願第27196号の部分継続出願
である1979年12月12日出願の米国特許出願第06／
102807号の部分継続出願である。
れている米国特許出願第27196号の部分継続出願
である1979年12月12日出願の米国特許出願第06／
102807号の部分継続出願である。
本発明は特異エステラーゼ活性を有する蛋白分
解酵素を使用する対応アルキルエステルへのα−
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンの選択
的エステル化方法に関する。
解酵素を使用する対応アルキルエステルへのα−
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンの選択
的エステル化方法に関する。
(2) 先行技術の説明
化学的手段によるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−
フエニルアラニンのエステル化は、米国特許第
3933781号および第4173562号中に記載されてい
る。化学的方法の欠点は、エステル化がアスパル
チルカルボキシル基そしてまたフエニルアラニン
カルボキシル基に生じて、次式 の望ましくない副生成物（以後、ジエステルとし
て示す）および次式 の望ましくない副生成物（以後、アスパルチルエ
ステルとして示す）が形成することである。
フエニルアラニンのエステル化は、米国特許第
3933781号および第4173562号中に記載されてい
る。化学的方法の欠点は、エステル化がアスパル
チルカルボキシル基そしてまたフエニルアラニン
カルボキシル基に生じて、次式 の望ましくない副生成物（以後、ジエステルとし
て示す）および次式 の望ましくない副生成物（以後、アスパルチルエ
ステルとして示す）が形成することである。
ジエステルおよびアスパルチルエステルは、所
望生成物を得るために精製工程により除去しなけ
ればならない。
望生成物を得るために精製工程により除去しなけ
ればならない。
従来の酵素エステル化方法は１個のアミノ酸の
エステル化を指向してきた。それらは、ジペプタ
イド、特に１個より多いカルボキシル基を有する
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンで
生じる選択的エステル化の問題には関係してこな
かつた。
エステル化を指向してきた。それらは、ジペプタ
イド、特に１個より多いカルボキシル基を有する
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンで
生じる選択的エステル化の問題には関係してこな
かつた。
たとえば、インガルス（Ingalls）等〔バイオ
テクノロジー、アンド、バイオエンジニアリング
（BIOTECHNOLOGY AND
BIOENGINEERING）17、1627〜1637（1975）
は、水、エタノールおよびグリセロールの溶媒系
において固定化キモトリプシンあるいは遊離の未
変化形におけるサブチリシン、カールスバーグを
使用する単一アミノ酸、Ｎ−アセチルチロシンの
エステル化を記載している。
テクノロジー、アンド、バイオエンジニアリング
（BIOTECHNOLOGY AND
BIOENGINEERING）17、1627〜1637（1975）
は、水、エタノールおよびグリセロールの溶媒系
において固定化キモトリプシンあるいは遊離の未
変化形におけるサブチリシン、カールスバーグを
使用する単一アミノ酸、Ｎ−アセチルチロシンの
エステル化を記載している。
グリバノフ（Klibanov）等〔バイオテクノロ
ジー、アンド、バイオエンジニアリング、19、
1351〜1361（1977）〕は、水および水不混和性溶
媒、クロロホルムの二層系において固定化キモト
リプシンを使用する単一アミノ酸、Ｎ−アセチル
トリプトフアンのエステル化を記載している。
ジー、アンド、バイオエンジニアリング、19、
1351〜1361（1977）〕は、水および水不混和性溶
媒、クロロホルムの二層系において固定化キモト
リプシンを使用する単一アミノ酸、Ｎ−アセチル
トリプトフアンのエステル化を記載している。
本発明の利点は、フエニルアラニン部分のカル
ボキシル基が単一層系中において酵素エステル化
により選択的にアルキル化されて、望ましくない
ジエステルおよびアスパルチルエステルを生成す
ることなしにα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニ
ルアラニンアルキルエステルを与えることにあ
る。これは、ジペプタイドとアルコールとを、セ
リンアルカリ性プロテイナーゼ、芳香族アミノ酸
に選択性を発揮するエステラーゼの存在下に接触
させることによつて達成される。
ボキシル基が単一層系中において酵素エステル化
により選択的にアルキル化されて、望ましくない
ジエステルおよびアスパルチルエステルを生成す
ることなしにα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニ
ルアラニンアルキルエステルを与えることにあ
る。これは、ジペプタイドとアルコールとを、セ
リンアルカリ性プロテイナーゼ、芳香族アミノ酸
に選択性を発揮するエステラーゼの存在下に接触
させることによつて達成される。
発明の要約
本発明は甘味料として有用であるα−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フエニルアラニンアルキルエステ
ルの製造法に関する。特に、本ジペプタイド、α
−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンは、
本ジペプタイドとアルコールとを、アルコール濃
度が酵素の加水分解作用を逆転させるのに充分な
濃度である水−アルコール溶媒系中、特異エステ
ラーゼ活性を有する蛋白分解酵素の存在において
接触させることによりエステル化される。特異エ
ステラーゼ活性とは、フエニルアラニン部分のカ
ルボキシル基を選択的にアルキル化する蛋白分解
酵素の能力を示す。かく製造されるα−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フエニルアラニンアルキルエステ
ルは、甘味料として有用である。この有用性は、
米国特許第3492131号中に記載されている。
パルチル−Ｌ−フエニルアラニンアルキルエステ
ルの製造法に関する。特に、本ジペプタイド、α
−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンは、
本ジペプタイドとアルコールとを、アルコール濃
度が酵素の加水分解作用を逆転させるのに充分な
濃度である水−アルコール溶媒系中、特異エステ
ラーゼ活性を有する蛋白分解酵素の存在において
接触させることによりエステル化される。特異エ
ステラーゼ活性とは、フエニルアラニン部分のカ
ルボキシル基を選択的にアルキル化する蛋白分解
酵素の能力を示す。かく製造されるα−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フエニルアラニンアルキルエステ
ルは、甘味料として有用である。この有用性は、
米国特許第3492131号中に記載されている。
他方、Ｎ−保護−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−
フエニルアラニンは、この方法によりエステル化
されて、対応のＮ−保護−α−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−フエニルアラニンアルキルエステルを与え
うる。Ｎ−保護基は通常の技術により除去でき
て、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニ
ンアルキルエステルを与える。本発明において用
いるのに好ましいＮ−保護基は、カルボベンゾキ
シ基である。
フエニルアラニンは、この方法によりエステル化
されて、対応のＮ−保護−α−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−フエニルアラニンアルキルエステルを与え
うる。Ｎ−保護基は通常の技術により除去でき
て、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニ
ンアルキルエステルを与える。本発明において用
いるのに好ましいＮ−保護基は、カルボベンゾキ
シ基である。
好ましい実施態様の説明
本発明は、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニ
ルアラニンまたはＮ−保護−α−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−フエニルアラニンとアルコールとを、特
異エステラーゼ活性を有する蛋白分解酵素の存在
において接触させることによりα−Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−フエニルアラニンを選択的にエステル
化する方法に関する。本ジペプタイドは、アルコ
ール濃度が加水分解活性を逆転させるのに充分な
濃度である水性アルコール媒質中で酵素に接触さ
れる。
ルアラニンまたはＮ−保護−α−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−フエニルアラニンとアルコールとを、特
異エステラーゼ活性を有する蛋白分解酵素の存在
において接触させることによりα−Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−フエニルアラニンを選択的にエステル
化する方法に関する。本ジペプタイドは、アルコ
ール濃度が加水分解活性を逆転させるのに充分な
濃度である水性アルコール媒質中で酵素に接触さ
れる。
本発明に従えば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−
フエニルアラニンまたはＮ−保護−α−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フエニルアラニンとアルコールと
を、アルコール濃度がセリンアルカリ性プロテイ
ナーゼの加水分解活性を逆転させるのに充分な濃
度である水性アルコール媒質中、セリンアルカリ
性プロテイナーゼのエステル化有効量の存在にお
いて接触させることからなる、α−Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−フエニルアラニンのエステル化方法が
提供される。Ｎ−保護−α−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−フエニルアラニンをエステル化するときに
は、Ｎ−保護基をエステル化に引続いて除去し
て、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニ
ンアルキルエステルを得る。
フエニルアラニンまたはＮ−保護−α−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フエニルアラニンとアルコールと
を、アルコール濃度がセリンアルカリ性プロテイ
ナーゼの加水分解活性を逆転させるのに充分な濃
度である水性アルコール媒質中、セリンアルカリ
性プロテイナーゼのエステル化有効量の存在にお
いて接触させることからなる、α−Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−フエニルアラニンのエステル化方法が
提供される。Ｎ−保護−α−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−フエニルアラニンをエステル化するときに
は、Ｎ−保護基をエステル化に引続いて除去し
て、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニ
ンアルキルエステルを得る。
好ましいアルコールは、次式
Ｒ−OH
〔式中、Ｒは炭素原子１〜７個を有する低級アル
キルである〕によつて示される。それら低級アル
キルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペ
ンチル、ヘキシル、ヘプチルおよびそれらの分枝
鎖異性体により例示される。
キルである〕によつて示される。それら低級アル
キルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペ
ンチル、ヘキシル、ヘプチルおよびそれらの分枝
鎖異性体により例示される。
α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン
のアミノ基は、普通に使用される保護基により保
護しうる。そのような基は、アリール−低級アル
キル基、たとえば随意にハロゲン、ニトロ、低級
アルキルまたは低級アルコキシにより置換されて
いてもよいジフエニルメチルまたはトリフエニル
メチル基、たとえば；ベンズヒドリル、トリチル
およびジーパラーメトキシベンズヒドリル；アシ
ル基、たとえばホルミル、トリフルオロアセチ
ル、フタロイル、ベンゼンスルフエニルおよびｏ
−ニトロフエニルスルフエニル；炭酸またはチオ
炭酸に由来する基、たとえば芳香族基が随意にハ
ロゲン原子、ニトロ基あるいは低級アルキル、低
級アルコキシまたは低級カルボアルコキシ基より
置換されていてもよいカルボベンゾキシ基、たと
えばカルボベンゾキシ、ｐ−ブロモカルボベンゾ
キシまたはｐ−クロロカルボベンゾキシ、ｐ−ニ
トロカルボベンゾキシおよびｐ−メトキシカルボ
ベンゾキシ；着色ベンジルオキシカルボニル基、
たとえばｐ−フエニルアゾベンジルオキシカルボ
ニルおよびｐ−（ｐ−メトキシフエニルアゾ）ベ
ンジルオキシカルボニル、トリルオキシカルボニ
ル、２−フエニル−２−プロポキシカルボニル、
２−トリル−２−プロポキシカルボニルおよび２
−（パラビフエニリル）−２−プロポキシカルボニ
ル；および脂肪族オキシカルボニル基、たとえば
ｔ−ブトキシカルボニル、アルキルオキシカルボ
ニル、シクロペンチルオキシカルボニル、ｔ−ア
ミルオキシカルボニルを包含するが、それらに限
定されない。本発明に用いるための特に好ましい
Ｎ−保護基は、カルボベンゾキシ基である。
のアミノ基は、普通に使用される保護基により保
護しうる。そのような基は、アリール−低級アル
キル基、たとえば随意にハロゲン、ニトロ、低級
アルキルまたは低級アルコキシにより置換されて
いてもよいジフエニルメチルまたはトリフエニル
メチル基、たとえば；ベンズヒドリル、トリチル
およびジーパラーメトキシベンズヒドリル；アシ
ル基、たとえばホルミル、トリフルオロアセチ
ル、フタロイル、ベンゼンスルフエニルおよびｏ
−ニトロフエニルスルフエニル；炭酸またはチオ
炭酸に由来する基、たとえば芳香族基が随意にハ
ロゲン原子、ニトロ基あるいは低級アルキル、低
級アルコキシまたは低級カルボアルコキシ基より
置換されていてもよいカルボベンゾキシ基、たと
えばカルボベンゾキシ、ｐ−ブロモカルボベンゾ
キシまたはｐ−クロロカルボベンゾキシ、ｐ−ニ
トロカルボベンゾキシおよびｐ−メトキシカルボ
ベンゾキシ；着色ベンジルオキシカルボニル基、
たとえばｐ−フエニルアゾベンジルオキシカルボ
ニルおよびｐ−（ｐ−メトキシフエニルアゾ）ベ
ンジルオキシカルボニル、トリルオキシカルボニ
ル、２−フエニル−２−プロポキシカルボニル、
２−トリル−２−プロポキシカルボニルおよび２
−（パラビフエニリル）−２−プロポキシカルボニ
ル；および脂肪族オキシカルボニル基、たとえば
ｔ−ブトキシカルボニル、アルキルオキシカルボ
ニル、シクロペンチルオキシカルボニル、ｔ−ア
ミルオキシカルボニルを包含するが、それらに限
定されない。本発明に用いるための特に好ましい
Ｎ−保護基は、カルボベンゾキシ基である。
アミノ基はまた、アミノ基とジケトンたとえば
ベンゾイルアセトンまたはアセチルアセトンとの
反応により得られるエナミン形成によつて保護す
ることができる。
ベンゾイルアセトンまたはアセチルアセトンとの
反応により得られるエナミン形成によつて保護す
ることができる。
保護基は、たとえば水素添加分解（たとえば、
パラジウム黒触媒の存在における）、酢酸中にお
けるハロゲン化水素酸（たとえば臭化水素酸、フ
ツ化水素酸または塩酸）での処理、またはトリフ
ルオロ酢酸での処理のような反応により便宜に除
去される。
パラジウム黒触媒の存在における）、酢酸中にお
けるハロゲン化水素酸（たとえば臭化水素酸、フ
ツ化水素酸または塩酸）での処理、またはトリフ
ルオロ酢酸での処理のような反応により便宜に除
去される。
エステル結合を形成する反応は、酵素活性を維
持するPHを有する水性バツフアー−アルコール溶
液中で行なうことができる。これはセリンアルカ
リ性プロテイナーゼについてPH約４から７までで
ある。典型的なバツフアーは、ピロリン酸ナトリ
ウムバツフアー溶液、クエン酸バツフアー溶液、
酢酸バツフアー溶液またはトリス−HClバツフア
ー溶液を包含する。
持するPHを有する水性バツフアー−アルコール溶
液中で行なうことができる。これはセリンアルカ
リ性プロテイナーゼについてPH約４から７までで
ある。典型的なバツフアーは、ピロリン酸ナトリ
ウムバツフアー溶液、クエン酸バツフアー溶液、
酢酸バツフアー溶液またはトリス−HClバツフア
ー溶液を包含する。
本発明において使用するエステラーゼは、セリ
ンアルカリ性プロテイナーゼである。それら酵素
は高いエステラーゼ活性を発揮し、そして芳香族
アミノ酸に対し選択的に作用する。典型的なセリ
ンアルカリ性プロテイナーゼはサブチリシン、お
よびバチルス（Bacillus）、アスペルギルス
（Aspergillus）、ストレプトマイセス
（Streptomyces）、ペニシリウム（Penicillium）
およびアースロバクター（Arthrobacter）の各
種菌株からのアルカリ性プロテイナーゼを包含す
る。好ましいセリンアルカリ性プロテイナーゼは
商業的に入手しうるサブチリシン、カールスバー
グである。酵素の触媒量、好ましくはα−Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−フエニルアラニンまたはＮ−保
護−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニ
ン１ミリモル当り10〜500nｇが反応工程におい
て使用される。カルシウム塩をまた、酵素活性を
助けるために加えうる。
ンアルカリ性プロテイナーゼである。それら酵素
は高いエステラーゼ活性を発揮し、そして芳香族
アミノ酸に対し選択的に作用する。典型的なセリ
ンアルカリ性プロテイナーゼはサブチリシン、お
よびバチルス（Bacillus）、アスペルギルス
（Aspergillus）、ストレプトマイセス
（Streptomyces）、ペニシリウム（Penicillium）
およびアースロバクター（Arthrobacter）の各
種菌株からのアルカリ性プロテイナーゼを包含す
る。好ましいセリンアルカリ性プロテイナーゼは
商業的に入手しうるサブチリシン、カールスバー
グである。酵素の触媒量、好ましくはα−Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−フエニルアラニンまたはＮ−保
護−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニ
ン１ミリモル当り10〜500nｇが反応工程におい
て使用される。カルシウム塩をまた、酵素活性を
助けるために加えうる。
酵素は、遊離状態で存在しえ、あるいは適当な
支持体たとえば多孔性ガラス、ポリアクリルアミ
ドゲル、カルボキシメチルセルロースまたはアミ
ノエチルセルロースに結合させることにより固定
しうる。“インモビライズド、エンザイムズ
（IMMOBILIZED ENZYMS）”44巻、メソオ
ズ、イン、エンザイモロジー（METHODS IN
ENZYMOLOGY）、エデイシヨン、クラウス、
モスバツク（ed.Klaus Mosback）は、酵素固定
化の各種方法を講述している。
支持体たとえば多孔性ガラス、ポリアクリルアミ
ドゲル、カルボキシメチルセルロースまたはアミ
ノエチルセルロースに結合させることにより固定
しうる。“インモビライズド、エンザイムズ
（IMMOBILIZED ENZYMS）”44巻、メソオ
ズ、イン、エンザイモロジー（METHODS IN
ENZYMOLOGY）、エデイシヨン、クラウス、
モスバツク（ed.Klaus Mosback）は、酵素固定
化の各種方法を講述している。
使用する反応温度は通常10〜50℃の範囲内であ
り、それは酵素活性を維持するのに充分である。
好ましい範囲は20〜40℃である。
り、それは酵素活性を維持するのに充分である。
好ましい範囲は20〜40℃である。
反応は、アルコール濃度が酵素のエステラーゼ
活性を逆転させるのに充分な濃度である水および
アルコールの媒質中で行なわれる。アルコール濃
度は、10〜90％（容量）でありうる。望ましいア
ルコール濃度は30〜70％（容量）である。より好
ましいアルコール濃度は、50〜60％であつて、60
％アルコール（容量）が最適である。
活性を逆転させるのに充分な濃度である水および
アルコールの媒質中で行なわれる。アルコール濃
度は、10〜90％（容量）でありうる。望ましいア
ルコール濃度は30〜70％（容量）である。より好
ましいアルコール濃度は、50〜60％であつて、60
％アルコール（容量）が最適である。
本発明の特に好ましい態様においては、セリン
アルカリ性プロテイナーゼはサブチリシン、カー
ルスバーグ、特異エステラーゼ活性を有するプロ
テイナーゼであり、そしてアルコールは60％（容
量）の濃度で存在するメタノールである。水−ア
ルコール混合物は5.0ｍＭ塩化カルシウムを含有
し、そしてPH5.0を有し、そして反応は25℃の温
度で行なわれる。
アルカリ性プロテイナーゼはサブチリシン、カー
ルスバーグ、特異エステラーゼ活性を有するプロ
テイナーゼであり、そしてアルコールは60％（容
量）の濃度で存在するメタノールである。水−ア
ルコール混合物は5.0ｍＭ塩化カルシウムを含有
し、そしてPH5.0を有し、そして反応は25℃の温
度で行なわれる。
反応はそれらの条件下に終了まで円滑に進行す
る。好ましい反応時間は１から260時間までであ
る。より好ましい反応時間は１〜90時間である。
反応生成物は、反応系から標準クロマトグラフイ
技術およびこの技術分野において認識されている
他の方法により便宜に分離される。
る。好ましい反応時間は１から260時間までであ
る。より好ましい反応時間は１〜90時間である。
反応生成物は、反応系から標準クロマトグラフイ
技術およびこの技術分野において認識されている
他の方法により便宜に分離される。
本発明は以下の実施例からより完全になるであ
ろう。それらの実施例は説明の目的で示したもの
であり、そして物質および方法の両者において多
くの変形がこの技術分野において熟練している者
には明らかであるので、精神および範囲のいずれ
においても本発明を限定するものとは考えられる
べきでない。実施例において、他に特定しない限
り、温度は摂氏度（℃）で示し、物質の量は重量
部で示す。重量部と容量部との間の関係はグラム
とミリリツトルとの間に存在する関係に等しい。
ろう。それらの実施例は説明の目的で示したもの
であり、そして物質および方法の両者において多
くの変形がこの技術分野において熟練している者
には明らかであるので、精神および範囲のいずれ
においても本発明を限定するものとは考えられる
べきでない。実施例において、他に特定しない限
り、温度は摂氏度（℃）で示し、物質の量は重量
部で示す。重量部と容量部との間の関係はグラム
とミリリツトルとの間に存在する関係に等しい。
例 １
サブチリシン、カールスバーグ〔プロテアー
ゼ、タイプ、シグマ、ケミカル、カンパニー
（Sigma Chemical Co.）〕を蒸留水に40mg／mlの
濃度に溶かし、そして蒸留水に対し５℃で透析す
る。酵素溶液0.1容量部を、α−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−フエニルアラニン0.0056重量部を含有す
る水性メタノール溶液0.9容量部と混合する。水
性メタノール溶液は、メタノール0.6容量部を
0.33M酢酸ナトリウム0.075容量部、0.33M酢酸
0.225容量部および2.5M塩化カルシウム0.002容量
部と混合することにより製造する。酵素を加える
前に、水性メタノール溶液は、α−Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−フエニルアラニンを分散させるため
に、１分間超音波処理する。全体PHは希塩酸でPH
5.0に調節する。酵素４mg／ml、5.0ｍＭ塩化カル
シウム、0.1M酢酸バツフアー、60％メタノール、
および0.02Mα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニ
ルアラニンを含有する最終反応混合物を約25℃で
連続振盪しつつ４日間反応せしめる。反応混合物
をセフアデツクス（Sephadex）LH−20カラム
に通して、酵素をジペプタイドから分離する。ジ
ペプタイド画分を貯え、そして次式 のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン
メチルエステルを沈澱および精製するために、米
国特許第3798207号および第4173562号に従いハロ
ゲン化水素で処理する。
ゼ、タイプ、シグマ、ケミカル、カンパニー
（Sigma Chemical Co.）〕を蒸留水に40mg／mlの
濃度に溶かし、そして蒸留水に対し５℃で透析す
る。酵素溶液0.1容量部を、α−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−フエニルアラニン0.0056重量部を含有す
る水性メタノール溶液0.9容量部と混合する。水
性メタノール溶液は、メタノール0.6容量部を
0.33M酢酸ナトリウム0.075容量部、0.33M酢酸
0.225容量部および2.5M塩化カルシウム0.002容量
部と混合することにより製造する。酵素を加える
前に、水性メタノール溶液は、α−Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−フエニルアラニンを分散させるため
に、１分間超音波処理する。全体PHは希塩酸でPH
5.0に調節する。酵素４mg／ml、5.0ｍＭ塩化カル
シウム、0.1M酢酸バツフアー、60％メタノール、
および0.02Mα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニ
ルアラニンを含有する最終反応混合物を約25℃で
連続振盪しつつ４日間反応せしめる。反応混合物
をセフアデツクス（Sephadex）LH−20カラム
に通して、酵素をジペプタイドから分離する。ジ
ペプタイド画分を貯え、そして次式 のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン
メチルエステルを沈澱および精製するために、米
国特許第3798207号および第4173562号に従いハロ
ゲン化水素で処理する。
例 ２
固定化酵素の触媒として使用することを除いて
は、例１の方法を繰返す。酵素は、臭化シアン活
性化DEAEセルロースに共有的に固定化される。
DEAEセルロース〔予め膨潤、DE52、ワツトマ
ン（Whatman）〕は、その0.075重量部を0.1M重
炭酸ナトリウムで洗滌し、ついで臭化シアン溶液
（25mg／ml）３容量部と反応させることにより活
性化される。PHは2M水酸化ナトリウムで11.0に
調節および維持され、そして25℃で６分間緩和に
撹拌される。ゲルを過し、そして0.1M重炭酸
ナトリウム100容量部で洗滌する。0.1M重炭酸ナ
トリウム0.25容量部に溶かし、そして同じバツフ
アーに対し５℃で４時間透析したサブチリシン、
カールスバーグ0.025重量部を、密封ポリプロピ
レンチユーブ中（アルゴン下）、臭化シアン活性
化ゲルと、５℃で17時間混合する。結合した酵素
をついで蒸留水で洗滌し、そして1Mエタノール
アミン（PH9.0）５容量部と緩和に撹拌しつつ25
℃で２時間反応させる。ゲルを蒸留水で２回洗滌
し、そして蒸留水0.3容量部に再懸濁する。この
固定化酵素懸濁液を、最終反応混合物が例１にお
けると等しい濃度の物質を含有するように、水／
メタノール混合物0.7容量部と混合する。反応は、
固定化酵素を生成物の精製に先立つて遠心分離に
より除去することを除いて、例１における如くに
行なう。
は、例１の方法を繰返す。酵素は、臭化シアン活
性化DEAEセルロースに共有的に固定化される。
DEAEセルロース〔予め膨潤、DE52、ワツトマ
ン（Whatman）〕は、その0.075重量部を0.1M重
炭酸ナトリウムで洗滌し、ついで臭化シアン溶液
（25mg／ml）３容量部と反応させることにより活
性化される。PHは2M水酸化ナトリウムで11.0に
調節および維持され、そして25℃で６分間緩和に
撹拌される。ゲルを過し、そして0.1M重炭酸
ナトリウム100容量部で洗滌する。0.1M重炭酸ナ
トリウム0.25容量部に溶かし、そして同じバツフ
アーに対し５℃で４時間透析したサブチリシン、
カールスバーグ0.025重量部を、密封ポリプロピ
レンチユーブ中（アルゴン下）、臭化シアン活性
化ゲルと、５℃で17時間混合する。結合した酵素
をついで蒸留水で洗滌し、そして1Mエタノール
アミン（PH9.0）５容量部と緩和に撹拌しつつ25
℃で２時間反応させる。ゲルを蒸留水で２回洗滌
し、そして蒸留水0.3容量部に再懸濁する。この
固定化酵素懸濁液を、最終反応混合物が例１にお
けると等しい濃度の物質を含有するように、水／
メタノール混合物0.7容量部と混合する。反応は、
固定化酵素を生成物の精製に先立つて遠心分離に
より除去することを除いて、例１における如くに
行なう。
例 ３
例１および２のメタノールの均等量のエタノー
ルへの置換、およびそれらに記載された方法の実
質的な遂行は、次式 のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン
エチルエステルを生成する。
ルへの置換、およびそれらに記載された方法の実
質的な遂行は、次式 のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン
エチルエステルを生成する。
例 ４
例１および２のα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
エニルアラニンのＮ−カルボベンゾキシ−α−Ｌ
−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン0.0125重
量部への置換、およびそれらに記載された方法の
実質的な繰返しは、Ｎ−カルボベンゾキシ−α−
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチル
エステルを提供する。ベルグマン（M.
Bergmann）およびツエルバス（L.Zervas）の方
法〔ベリヒテ（Ber.）65：1192（1932）〕によるこ
の化合物の還元は、Ｎ−保護カルボベンゾキシ基
を除去して、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニ
ルアラニンメチルエステルを与える。
エニルアラニンのＮ−カルボベンゾキシ−α−Ｌ
−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニン0.0125重
量部への置換、およびそれらに記載された方法の
実質的な繰返しは、Ｎ−カルボベンゾキシ−α−
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニンメチル
エステルを提供する。ベルグマン（M.
Bergmann）およびツエルバス（L.Zervas）の方
法〔ベリヒテ（Ber.）65：1192（1932）〕によるこ
の化合物の還元は、Ｎ−保護カルボベンゾキシ基
を除去して、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニ
ルアラニンメチルエステルを与える。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニ
ンまたはＮ−保護−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−
フエニルアラニンを、有効量のセリンアルカリ性
プロテイナーゼの存在下にこのプロテイナーゼの
加水分解活性を逆転させるのに充分なアルコール
濃度を有する水性アルコール媒質中PH４〜７で、
アルコールと接触させ、場合により、Ｎ−保護基
を除去することを特徴とするα−Ｌ−アスパルチ
ル−Ｌ−フエニルアラニン アルキルエステルの
製造方法。 ２ セリンアルカリ性プロテイナーゼがサブチリ
シン カールスバーグである特許請求の範囲第１
項の方法。 ３ アルコールが10〜90％の濃度のメタノールで
ある特許請求の範囲第１項の方法。 ４ セリンアルカリ性プロテイナーゼがサブチリ
シン カールスバーグである特許請求の範囲第３
項の方法。 ５ α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエニルアラニ
ンとメタノールとを、メタノール濃度が60％の水
性メタノール媒質中PH5.0でサブチリシン カー
ルスバーグの存在下に接触させることからなる特
許請求の範囲第１項の方法。 ６ Ｎ−保護−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フエ
ニルアラニンとアルコールとを、有効量のセリン
アルカリ性プロテイナーゼの存在下にこのプロテ
イナーゼの加水分解活性を逆転させるのに充分な
アルコール濃度を有する水性アルコール媒質中PH
４〜７で接触させ、ついでＮ−保護基を除去する
ことからなる特許請求の範囲第１項の方法。 ７ セリンアルカリ性プロテイナーゼがサブチリ
シン カールスバーグである特許請求の範囲第６
項の方法。 ８ アルコールが10〜90％の濃度のメタノールで
ある特許請求の範囲第６項の方法。 ９ セリンアルカリ性プロテイナーゼがサブチリ
シン カールスバーグである特許請求の範囲第８
項の方法。 １０ Ｎ−カルボベンゾキシ−α−Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−フエニルアラニンとメタノールとを、
メタノール濃度が60％の水性メタノール媒質中PH
5.0でサブチリシン カールスバーグの存在下に
接触させ、ついでカルボベンゾキシ保護基を除去
することからなる特許請求の範囲第１項の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/183,556 US4293648A (en) | 1979-12-12 | 1980-09-02 | Process for esterification of α-L-aspartyl-L-phenylalanine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57115196A JPS57115196A (en) | 1982-07-17 |
| JPH029799B2 true JPH029799B2 (ja) | 1990-03-05 |
Family
ID=22673315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56137102A Granted JPS57115196A (en) | 1980-09-02 | 1981-09-02 | Esterification of alpha-l-aspartyl-l- phenylalanine |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4293648A (ja) |
| JP (1) | JPS57115196A (ja) |
| AU (1) | AU558330B2 (ja) |
| BE (1) | BE890189A (ja) |
| CA (1) | CA1161381A (ja) |
| CH (1) | CH651067A5 (ja) |
| DE (1) | DE3134807A1 (ja) |
| ES (1) | ES8206624A1 (ja) |
| FR (1) | FR2489321A1 (ja) |
| GB (1) | GB2084156B (ja) |
| IE (1) | IE51537B1 (ja) |
| NL (1) | NL8104079A (ja) |
| SE (1) | SE450709B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0532999U (ja) * | 1991-10-02 | 1993-04-30 | ブラザー工業株式会社 | 金属粉末成形体の脱脂焼結用トレー |
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| US4664988A (en) * | 1984-04-06 | 1987-05-12 | Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Fuel cell electrode substrate incorporating separator as an intercooler and process for preparation thereof |
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| US6627431B1 (en) * | 2000-05-12 | 2003-09-30 | The Nutrasweet Company | Chemoenzymatic synthesis of neotame |
-
1980
- 1980-09-02 US US06/183,556 patent/US4293648A/en not_active Expired - Lifetime
-
1981
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- 1981-09-01 CA CA000384993A patent/CA1161381A/en not_active Expired
- 1981-09-01 SE SE8105155A patent/SE450709B/sv not_active IP Right Cessation
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- 1981-09-01 IE IE2014/81A patent/IE51537B1/en not_active IP Right Cessation
- 1981-09-01 FR FR8116652A patent/FR2489321A1/fr active Granted
- 1981-09-02 BE BE0/205845A patent/BE890189A/fr not_active IP Right Cessation
- 1981-09-02 NL NL8104079A patent/NL8104079A/nl active Search and Examination
- 1981-09-02 CH CH5647/81A patent/CH651067A5/de not_active IP Right Cessation
- 1981-09-02 DE DE19813134807 patent/DE3134807A1/de active Granted
- 1981-09-02 JP JP56137102A patent/JPS57115196A/ja active Granted
- 1981-09-04 AU AU74957/81A patent/AU558330B2/en not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0532999U (ja) * | 1991-10-02 | 1993-04-30 | ブラザー工業株式会社 | 金属粉末成形体の脱脂焼結用トレー |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES505105A0 (es) | 1982-08-16 |
| FR2489321A1 (fr) | 1982-03-05 |
| JPS57115196A (en) | 1982-07-17 |
| CA1161381A (en) | 1984-01-31 |
| ES8206624A1 (es) | 1982-08-16 |
| FR2489321B1 (ja) | 1984-10-19 |
| SE450709B (sv) | 1987-07-20 |
| IE812014L (en) | 1982-03-02 |
| DE3134807C2 (ja) | 1990-06-28 |
| IE51537B1 (en) | 1987-01-07 |
| NL8104079A (nl) | 1982-04-01 |
| CH651067A5 (de) | 1985-08-30 |
| DE3134807A1 (de) | 1982-05-06 |
| SE8105155L (sv) | 1982-03-03 |
| GB2084156B (en) | 1983-09-21 |
| GB2084156A (en) | 1982-04-07 |
| AU558330B2 (en) | 1987-01-29 |
| BE890189A (fr) | 1982-03-02 |
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| AU7495781A (en) | 1982-03-25 |
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