JPH05279377A - 新規二糖類化合物及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記構造式（１）で示される二糖類化合物。
この化合物を微生物学的方法により製造する。 【化１】 【効果】 本発明化合物は新規物質であり、ビフィズス
菌を増殖させる効果のある糖としての食品分野への応用
や、輸液用の糖質としての医療分野への適用が期待され
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な二糖類化合物に関
し、詳しくはジフルクトース・ジアンヒドリド IIIから
微生物学的方法により製造される新規な二糖類化合物に
関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする問題点】近
年、オリゴ糖に代表されるように、機能性を有する糖類
の需要が高まりつつある。例えばジフルクトース・ジア
ンヒドリド III（ＤＦＡ III）は２個のフラクトース分
子が１、２′及び２、３′の間で脱水縮合した二糖類で
あり、ジャクソンらにより１９２９年に単離同定されて
いる（Ｂｕｒ．ｓｔａｎｄ．Ｊ．Ｒｅｓ．，３，２７，
１９２９）。

【０００３】ＤＦＡ IIIは、動物体内では代謝されず、
非発酵性の糖であるため、低カロリー甘味料として注目
されており、美容食等多方面に利用されることが予想さ
れている。ジャクソンらは、フルクトースを主成分とす
る多糖類であるイヌリンを酸加水分解することにより、
ＤＦＡ IIIを得ているが、収率はわずか２％弱であり、
このように化学的に生産する方法は効率的とは言えな
い。

【０００４】そこで近年、微生物学的方法を利用してイ
ヌリンからＤＦＡ IIIを製造する方法が提唱されてい
る。１９７２年に田中らにより、アルスロバクー・ウレ
アファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａ
ｆａｃｉｅｎｓ）の生産するイヌリン分解酵素を用いて
イヌリンからＤＦＡ IIIを生産させることが報告されて
いる（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｏｉｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２
８４，２４８，１９７２）。また田村らによりシュード
モナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）センスの生産するイヌリン分
解酵素を用いてイヌリンからＤＦＡ IIIを生産させるこ
とが提案されている（特開昭６３−２１９３７２号公
報）。

【０００５】ところで、これらのＤＦＡ IIIと同様に、
ＤＦＡ IIIを用いて製造される直鎖の二糖類についても
ビフィズス菌を増殖させる効果のある糖として食品分野
への応用や、輸液用の糖質として医療分野への適用が考
えられており、その製造法が種々検討されている（Ｔ．
Ｔａｎａｋａ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
７８，１２０１−１２０６（１９７５））。しかし、そ
れらの直鎖の二糖類の生産力は工業的に使用するには、
いまだ十分とはいえず、微生物を用いる方法によるＤＦ
Ａ IIIからの直鎖の二糖類の製造法については、経済的
に採用することは困難であり、効率的にＤＦＡ III等か
らの直鎖の二糖類を生産させる方法の提供が要望されて
きた。

【０００６】

【問題点を解決するための手段】そこで、本発明者ら
は、ＤＦＡ IIIから微生物学的方法で直鎖二糖類を製造
する方法について鋭意研究を勧める過程で、偶然にもア
ルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属す
る細菌，例えばアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＭＣＩ−２４９６（微工研
菌寄第１１２８８号（ＦＥＲＭＰ−１１２８８）、特開
平３−５９０９０号公報）由来のＤＦＡ III分解酵素が
ＤＦＡ IIIから全く新規な二糖類化合物を生産させるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明の要旨は、下記構造式（１）
で示される二糖類化合物及びその製造法に存する。

【０００８】

【化２】

【０００９】以下本発明を説明する。本発明の新規二糖
類化合物は、例えばＤＦＡ IIIを分解することにより生
産される。かかるＤＦＡ IIIは、ＤＦＡ III生成酵素生
産能を有する細菌由来の酵素をイヌリン等に作用させる
ことにより製造される。ＤＦＡ III生成酵素としては、
例えば（特開平１−２２５４９２号公報）に記載されて
いるようなアルスロバクター・イリシス（Ａｒｔｈｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ｉｌｉｃｉｓ）ＭＣＩ−２２９７（微工
研条寄第２２７９号（ＦＥＲＭＢＰ−２２７９）、アル
スロバクター・ウレアフェシエンス（前述）等があげら
れるが、特に好適なものとしては、アルスロバクター・
エスピー ＭＣＩ−２４９６（前述）の生産する酵素が
挙げられる。

【００１０】ＤＦＡ III生成酵素生産の細菌は、通常の
微生物が利用しうる栄養を含有する培地で培養すること
により容易に増殖させることができる。栄養源として
は、グルコース、水飴、テキストリン、シュークロー
ス、澱粉、糖蜜、動、植物油等を使用できる。また窒素
源として大豆粉、小麦胚芽、コーンスティープリカー、
綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモ
ニウム、硝酸ソーダ、尿素等を使用できる。その他、必
要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネ
シウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸、およびその他の
イオンを生成する無機塩類を添加することは有効であ
る。

【００１１】キクイモ、ゴボウ等のイヌリン含有量の高
い植物の抽出液及び／又はイヌリンを唯一の炭素源とし
て含む溶液中でＤＦＡ III生成酵素生産の細菌、例え
ば、アルスロバクター・エスピー ＭＣＩ−２４９６由
来のイヌリン分解酵素を作用させる。その際、該細菌そ
のものを作用させてもよいし、また該細菌から該酵素を
抽出し、そのまま、あるいは固定化等を行い作用させて
も良い。

【００１２】細菌そのものを作用させる場合、例えば、
炭素源としてのイヌリンを約１〜１０％含有し、その
他、窒素源として、大豆粉、小麦胚芽、コーンスティー
プリカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、
硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等、更に、必要に
応じナトリウム、カリウム、マグネシウム、コバルト、
塩素、燐酸、硫酸、及びその他のイオンを生成する事の
できる無機塩類等を添加した培地に本菌を接種し振とう
培養を行う。この際、培養温度は２０〜３７℃が、ま
た、培養時間は１２〜１２０時間が好適である。得られ
た培養液を遠心分離により除菌し、その上清中の酵素を
加熱処理により失活させる。そして濃縮を行い、例えば
これを活性炭カラムに吸着させる。蒸留水でフルクトー
スを溶出させた後、５％エタノール水溶液にて溶出を行
う。この画分にＤＦＡ IIIが得られるので、その画分を
濃縮乾固すると所期のＤＦＡ IIIを得ることができる。

【００１３】また酵素を作用させる場合、例えば、前記
方法により培養を行った培養液を遠心分離機より除菌
し、得られた濾液を作用させてもよいし、或いは該濾液
をさらに硫安（６５％飽和）を加え塩析を行い、析出し
た沈殿物を遠心分離により取得し少量の水に懸濁させた
後、透析を行い、得られる粗酵素液を作用させてもよ
い。この培養濾液又は粗酵素液を例えば、ｐＨ６．０に
調整した０．０１−０．１Ｍのリン酸緩衝液中で約５％
以上の濃度のイヌリンに３０〜６０℃で３０分以上作用
させること等によって所期のＤＦＡ IIIが得られる。

【００１４】もとより、精製酵素を作用させてもよく、
かかる精製酵素は例えば、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒ
ｌ ６５０Ｍ，ＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカ
ラム（東ソー製）によるイオン交換クロマトグラフィー
にて精製を行った後、ＴｏｙｏｐｅａｒｌＨＷ５５Ｆ
（東ソー社製）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを
行うことにより、電気泳動により単一バンドを示す酵素
標品を得ることができる。

【００１５】次に本発明の新規二糖類化合物の製造法に
ついて説明する。本発明の新規二糖類化合物の生産は、
ＤＦＡ IIIにＤＦＡ III分解酵素を作用させることによ
り行われる。ＤＦＡ III分解酵素は、ＤＦＡ III生成酵
素生産菌の菌体内酵素を用いる。ＤＦＡ III生成酵素生
産菌は、それ自体公知のＤＦＡ III生成酵素生産菌であ
れば良い。例えば、前述のようなアルスロバクター・イ
リシス ＭＣＩ−２２９７、アルスロバクター・ウレア
ファシエンス等があげられるが、特に好適なものとして
は、アルスロバクター・エスピー ＭＣＩ−２４９６
（前述）の菌株が挙げられる。菌体は、上記の培養法に
より培養し、遠心分離などにより集菌し、菌体を破砕
し、抽出液を得る。抽出液を６０℃で処理することで混
入するβ−フルクトフラノシダーゼを失活させ（Ｔ．Ｔ
ａｎａｋａ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７
８，１２０１−１２０６（１９７５））、ＤＦＡ III分
解酵素を得る。得られたＤＦＡ III分解酵素をＤＦＡ I
IIに作用させる。

【００１６】酵素を作用させる場合、粗酵素液として菌
体抽出液を６０℃で処理後、そのまま用いても良いし、
また固定化して用いても良い。もとより、精製酵素を作
用させてもよく、かかる精製酵素は例えば、ＤＥＡＥ−
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ，ＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌ ６５０Ｍカラム（東ソー製）によるイオン交換ク
ロマトグラフィーにて精製を行った後、Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌＨＷ５５Ｆ（東ソー製）を用いてゲル濾過クロマト
グラフィーを行うことにより、電気泳動により単一バン
ドを示す酵素標品を得ることができる。

【００１７】ＤＦＡ III分解酵素をＤＦＡ IIIに作用さ
せる場合、例えばｐＨ６．０に調整した０．０１−０．
１Ｍのリン酸緩衝液中で約０．５％以上に濃度のＤＦＡ
IIIに３０〜７０℃で１０分以上活用させること等によ
って反応液中に所期の新規二糖類化合物が得られる。得
られた反応液から、常法に従い、カラムクロマトグラフ
ィー等の処理により、本発明の新規二糖類化合物を単
離、精製することができる。

【００１８】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明の方法をさらに
具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り
これらに限定されるものではない。 実施例１ イヌリン７％、イーストエクストラクト０．２％、マグ
ネシウム０．０５％、塩化カリウム０．０５％、リン酸
一カリウム０．０５％、塩化第二鉄０．００１％を含ん
だ培地１５００ｍｌをｐＨ７．０に調整して３００ｍｌ
ずつ２Ｌの肩付きフラスコに分注し、１２０℃２０分間
蒸気滅菌した。この滅菌した培養液にアルスロバクター
・エスピーＭＣＩ−２４９６菌を同様の培地で２０時間
培養したものを２ｍｌ接種し、１６０ｒｐｍで３０℃、
７２時間培養した。培養液の６６０ｎｍでのＯＤは約３
０であった。培養終了後遠心分離により菌体を除去し、
培養濾液を得た。得られた培養濾液を１００℃で１０分
間加熱処理することにより、酵素を失活させ、約１００
ｍｌにまで減圧濃縮した。この液は活性炭カラム（活性
炭５００ｇとセライトＮＯ５３５ ５００ｇの混合物を
蒸留水にて充填）に吸着させ、蒸留水５リットルを流し
たのち５％エタノール水溶液で溶出した。溶出ピークを
集めて減圧濃縮にて乾固して、ＤＦＡ IIIの粉末を得
た。また培養終了後遠心分離により集めた菌体を６７ｍ
Ｍ、リン酸二水素カリウム−リン酸一ナトリウム リン
酸緩衝液（ｐＨ６．９２）で２回洗浄しその１／１０量
に、６０ｍｌのリン酸緩衝液を加え、超音波で菌体を破
砕する。破砕液から遠心分離により菌体を除去し、菌体
抽出液を得る。菌体抽出液を６０℃で２０分間処理し、
ＤＦＡIII 分解酵素の粗酵素液を得た。

【００１９】熱処理粗酵素液６０ｍｌを等量の２％ＤＦ
Ａ III（Ｔｏｔａｌ １．２ｇ）を含む０．１Ｍリン酸
一ナトリウム−リン酸二ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）と混合し、３７℃で２４時間反応させた。この反応
液を沸騰水中で１０分間熱処理した後、約２５ｍｌにな
るまで濃縮した。シリカゲル６０（２３０−４００メッ
シュ、メルク社製）を用い、ｎ−プロパノール：酢酸エ
チル：水（７：９：４ｖ／ｖ）を溶媒として、カラムク
ロマトグラフィー（カラム：２．２×８５ｃｍ）に供し
た。

【００２０】溶出ピークを集めて減圧濃縮し、メタノー
ルで２回晶析を行ない、新規二糖類化合物を０．４５ｇ
得た。かくして得られた新規二糖類化合物の以下の性状
が明らかになった。 質量分析（ＦＤ−ＭＡＳ） ＭＨ⁺ ＝３４３，（Ｍ＋Ｎ
ａ）⁺ ＝３６５ 分子式 Ｃ₁₂Ｈ₂₂Ｏ₁₁ 水素核磁気共鳴スペクトル（Ｈ−ＮＭＲ，５００ＭＨ
ｚ，重水 溶媒，ＴＳＰ（３−（トリメチルシリル）プ
ロピオン酸−ｄ₄ ナトリウム塩）を標準物質とした）
図１参照 炭素核磁気共鳴スペクトル（¹³Ｃ−ＮＭＲ，５００ＭＨ
ｚ，重水 溶媒，ＴＳＰを標準物質とした） 図２参照 以上の性状により以下の構造式が決定された。

【００２１】

【化３】

【００２２】

【発明の効果】本発明の二糖類化合物は新規化合物であ
り、ＤＦＡ III同様、ビフィズス菌を増殖させる効果の
ある糖としての食品分野への応用や、輸液用糖質として
の医療分野への適用が期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の二糖類化合物の水素核磁気共鳴スペク
トル（ ¹Ｈ−ＮＭＲ）のケミカルシフトを表わす図面で
ある。

【図２】本発明の二糖類化合物の炭素核磁気共鳴スペク
トル（¹³Ｃ−ＮＭＲ）のケミカルシフトを表わす図面で
ある。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記構造式（１）で示される二糖類化合
   物。 【化１】
2. 【請求項２】 ジフルクトース・ジアンヒドリド IIIに
   ジフルクトース・ジアンヒドリド III分解酵素を作用さ
   せることを特徴とする請求項１記載の二糖類化合物の製
   造方法。