JPH0191777A

JPH0191777A - レバンフラクトトランスフェラーゼの製造法

Info

Publication number: JPH0191777A
Application number: JP24588687A
Authority: JP
Inventors: Kokichi Tamura; 幸吉田村; Takashi Kuramoto; 倉本　隆志; Sumio Kitahata; 北畑　寿美雄
Original assignee: Maruzen Kasei Co Ltd
Current assignee: Maruzen Kasei Co Ltd
Priority date: 1987-10-01
Filing date: 1987-10-01
Publication date: 1989-04-11
Anticipated expiration: 2011-12-04
Also published as: JP2561100B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、レバンまたはフレインよりジ−ローフラクト
シルクラノース　２．６’：６．２’ジアンハイドライ
ドを生成させる酵素・レバンフラクトトランスフェラー
ゼの製造法に関するものである。

従来の技術レバンフラクトトランスフェラーゼは、多糖類・レバン
またはフレインを分解して下記構造式のジーＤ−７ラク
トシルフラノース　２，６’：６，２’アンハイドライ
ド（略称ＤＦＡＩ！／）を生成させる酵素である。

ＬＪ −ＩＱＤＦＡＩＶはフラクトースに似たされやかな甘味を有す
る物質である。したがって、レバンまたはフレインから
ＤＦＡＩＶを安価に製造することができれば、この物質
を甘味料として利用することが可能になるが、それに必
要なレバンフラクトトランスフェラーゼが従来は入手困
難であった。

従来、レバン７ラクトトランス７エラーゼはアースロバ
フタ−・ウレアファシェンスにより生産されることが知
られている（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｉｔｅｓｅｓ
ｒｃｈ、第９９巻。

１９７〜２０４頁、１００年）。しかしながら、アース
ロバクターーウレアファシエンスのレバンフラクトトラ
ンスフェラーゼ産生力は弱く、この菌を用いる方法によ
っテ高品質のレバン７ラクトトランスフエラーゼヲ経済
的に得ることは困難である。

発明が解決しようとする問題点したがって本発明の目的は、レバンフラクトトランスフ
ェラーゼを安価に且つ豊富に生産し得る方法を提供する
ことにある。

問題点を解決するための手段上記目的を達成するため、本発明者らは多くの微生物に
ついてレバンフラクトトランスフェラーゼ産生能の観点
からスクリーニングを行い、シュードモナス属に属する
一細菌すなわちシュードモナス・フルオレッセンスＭＺ
、　Ｎｏ、９４９　（微工研菌寄第９２３５号）がすぐ
れた性質を有することを知った。

本発明は上記知見に基づくものであって、フラクトース
のポリマーを含有する培地を用いてシュードモナス属に
属するレバン７ラクトトランスフエラーゼ生産菌を培養
し、培養物からレバンフラクトトランスフェラーゼを採
取することを特徴とするレバンフラクトトランスフェラ
ーゼの製造法を提供するものである。

上記ＭＺ　Ｎｏ、９４９株は、広島県尾道市の土壌より
分離されたものであって、その菌学的性質は次のとおり
である。

（ａ）形態 ■細胞の形および大きさ０．５〜０．７Ｘ２．０〜３．５μ重の桿菌■運動性：
あり。１本以上の極鞭毛を有する。

■胞子：なし ■グラム染色性：陰性 ■抗酸性：なしくｂ）生育 ■肉汁寒天斜面培養中程度の発育；透明；やや赤味を帯びる。

■肉汁液体培養：中程度の発育；表面に膜形成。

■肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない。

■リドマスミルク　：変化しない。

■ＢＣＰミルク　：変化しない。

（ｃ）生理的性質 ■硝酸塩の還元ニする。

■脱窒：しない。

■ＭＲテスト　：陰性 ■ｖｐテスト　：陰性 ■インドールの生成：なし ■硫化水素の生成：なしくＴＳＩ寒天培地）■デン粉の
加水分解：なし ■クエン酸の利用：あり　（クリステンセン培地）■無
機窒素源の利用硝酸塩およびアンモニウム塩を利用する。

［相］色素の生成：水溶性、蛍光性の色素を生成する。

■オキシダーゼ：陽性＠カタラーゼ：陽性 ■生育の範囲：ｐＨ４〜１０で生育する。

４℃、２７℃で生育する。３７℃で生育しない。

■酸素に対する態度：好気性［相］０−Ｆテスト　ニゲルコースを酸化する。

（ＨＨｈ　Ｌ　ｅｉｆｓｏｎ法） ■炭水化物の利用＝Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース
、トレハロース、イノシトーノ呟　Ｌ−バリン、ｐ−ヒ
ドロキシ安息香酸を利用する。シュクロース、ゲラニオ
ール、アセトアミド、エタノールを利用しない。

Ｏアルギニンの脱炭酸：陽性［相］グロトカテキン酸の分解：オルト型の開裂以上の
諸性状をバージエイのマニュアル・オブ・デターミネイ
ティブ・バクテリオロジー、第３版（１９７４）の記載
と照合することにより、本菌がシュードモナス・フルオ
レッセンス［ミグラ　１８９５］であることを確認した
。

本発明を実施する場合に用いる培地としては、７うクト
ースのポリマーを酵素誘導基質として含有させることを
除けば、特殊なものを必要としない。シュードモナス属
細菌の培養に通常使用される培地、すなわちグルコース
等の炭素源および酵母エキス、ペプトン等の有機窒素源
、その他硝酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マン
ガンなどの無機塩類等を基本成分として適宜組合せたｐ
Ｈ５〜８程度の培地を用いることができる。培地に含有
させるフラクトースのポリマーとしては、レバン、フレ
イン等を用いることができ、その好適濃度は０．０１〜
３０％、特に好ましくは１〜５％である。

培養は、シュードモナス属細菌培養の常法に従って行う
ことができる。目的とする酵素は菌体外に生産される。

生産は菌の対数増殖期に始まり、定常期にほぼ最大生産
量に達するので、通常は定常期に達したあと適当な時期
に培養を打切る。

培養終了後は直ちに遠心分離して菌体を除去する。

シュードモナス菌はβ−フラクトシダーゼを生産しない
ので、菌体を除いただけの培養液でも粗酵素液として利
用できるが、これを酵素精製の常法に従って精製すれば
、より活性が強く、利用し易いレバンフラクトトランス
フェラーゼを得ることができる。

得られるレバンフラクトトランスフェラーゼは安定で、
冷蔵庫で数カ月間保存可能であり、冷凍庫中ならばさら
に長期間保存することができる。

発明の効果後記実施例が実証するように、本発明の製法によればア
ースロバ、フタ−属細菌を用いる従来の製法よりもはる
かに高い収率でレバン７ラクトトランス７エラーゼが得
られ、したがってこの酵素を安価に且つ豊富に提供する
ことが可能になる。

実施例以下、実施例を示して本発明を説明する。なお、各側に
おいて示した酵素活性は、次の方法により測定したもの
である。

酵素活性測定法：適当に希釈した酵素液１鳳１と２％レ
バン溶液（ｐＨ６，０の０．１Ｍ酢酸緩衝液使用）１ｍ
ｌとを混合し、４０℃で１時間反応させたのち、生成し
たＤＦＡＩＶを高速液体クロマトグラフィーで定量する
。

１分間に１μモルのＤＦＡＩＶを生成させる酵素量を、
１単位とする。なお、高速液体クロマトグラフィーの条
件は次のとおりである。

カラム：　５ｈｏｄｅｘ　Ｎｉｌ　ｐｘｋ　Ｊ−４１１
キャリヤー：アセトニトリル／水（８５／１５）流速：
　１　、Ｏｎｌ／　ｍｉｎカラム温度：４０℃ 検出：ＲＩ実施例　ルレバン　１％、ペプトン　１％、Ｋ、ＨＰｏ、０．１％
、ＮａＮ０，０．５％、Ｍ［ＳＯ４”７ＨｚＯｏ、ｏｓ
％、およびＭｎＣＩｓ　・４　Ｈｚ８　０　、０２％を
含むｐＨ７，０の培地１００ｍ１を５００ｍ１容の坂ロ
コルベンに分注し、１２０°Ｃで１５分間加熱滅菌した
。冷却後、シュードモナス・フルオレッセンスＭＺ　Ｎ
ｏ、９４９を１白金耳植菌し、２７℃で４日間振とう培
養した。培養終了後、遠心分離して培養液から菌体を除
き、粗酵素液を得た。

その酵素活性は１１．６単位／１００ｍ１であった。

比較のためシュードモナス菌にかえてアースロバフタ−
・ウレアファシェンスを用い、他は同様にして得られた
粗酵素液の酵素活性は、１．０単位／１００ｍ１であっ
た。

実施例　２レバンにかえて同量のフレインを含有させた培地を用い
たほかは実施例１と同様にして、粗酵素液を得た。

その酵素活性は１２．０単位／１００ｍ１であった。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）フラクトースのポリマーを含有する培地を用いて
シュードモナス属に属するレバンフラクトトランスフェ
ラーゼ生産菌を培養し、培養物からレバンフラクトトラ
ンスフェラーゼを採取することを特徴とするレバンフラ
クトトランスフェラーゼの製造法。
（２）レバンフラクトトランスフェラーゼ生産菌として
シュードモナス・フルオレッセンスＭＺＮｏ．９４９（
微工研菌寄第９２３５号）を用いる特許請求の範囲第１
項記載の製造法。
（３）フラクトースのポリマーとしてレバンまたはフレ
インを含有する培地を用いる特許請求の範囲第１項記載
の製造法。